Tannic Acid

“点击蓝字 关注我们丁娅中国药科大学教授，博士生导师，博士。2007 年于南京大学化学化工学院分析化学专业获博士学位，2008 年起在南京大学生命科学学院从事生物学博士后研究，2013 年赴美国 University of Massachusetts-Amherst 化学系做访问学者。长期从事药物分析新材料和新技术领域研究，在 Angew Chem Inter Ed, Adv Drug Delivery Rev, Coord Chem Rev, Adv Funct Mater, Nano Today, ACS Nano, Nano Lett, Acta Pharm Sin B, Anal Chem, Biomaterials 等高水平学术期刊发表 SCI 论文 70 余篇，授权专利 10 余项。获高等学校科学研究优秀成果奖·自然科学奖一等奖、江苏省科学技术奖三等奖；获评江苏省优秀博士论文指导教师。《有机光谱分析》教材编委。主持国家自然科学基金项目 4 项、江苏省重点研发计划 1 项、其他省部级基金项目 5 项。担任《中国药科大学学报》《药学学报》编委，J Pharm Anal 青年编委，Chin Chem Lett 通讯编委，中国医药生物技术协会纳米生物技术分会常务委员，中国生物材料学会影像材料和技术分会委员，中国抗癌协会纳米肿瘤学专业委员会委员，中国医药生物技术协会药物分析技术专委会委员。基于金属有机框架的 siRNA 递送系统研究进展PPS 罗子江 #，赵一涵 #，丁娅 *（中国药科大学药学院，江苏 南京 210009）[摘要]：小干扰 RNA（siRNA）介导的 RNA 干扰（RNAi）技术已被广泛研究，但其临床应用仍面临挑战，包括药代动力学性质不佳、易发生酶降解、细胞摄取率低和非特异性基因沉默等问题。开发具有高沉默效率、良好生物相容性且易于功能化的 siRNA 递送载体，对于推动 siRNA 疗法的临床转化至关重要。综述了一种极具潜力的非病毒载体——金属有机框架（MOF）在 siRNA 递送方面的最新研究进展，旨在为高效 siRNA 递送平台的设计提供思路与参考。1RNA 干扰研究概况随着基因组测序和生物信息学技术的飞速发展，2015 年精准医疗被提出，标志着医疗领域进入了一个新的时代 [1-2]。通过对癌症患者基因组进行测序和分析，可以精准识别致病基因，实现个体化癌症治疗，从而最大限度地提高治疗效果，并降低毒副作用。在精准医疗领域，RNA 干扰（RNA interference，RNAi）技术已发展成为一种有效的细胞内基因敲低手段，在多种疾病的临床前研究或临床治疗中得到广泛应用，包括恶性肿瘤、乙型肝炎、肥胖及多发性神经病变等 [3-6]。1998 年的一项研究揭示了小干扰 RNA（short interfering RNA，siRNA）在降低靶基因表达水平方面的有效性。双链 RNA（double stranded RNA，dsRNA）或短发夹 RNA（short hairpin RNA，shRNA）被摄取入胞后，被核糖核酸内切酶（dicer enzyme，简称 Dicer）切割成长度为 21 至 25 个碱基对的 siRNA[7]。这些 siRNA 作为 RNAi 技术的效应分子，在细胞质中与 Ago 蛋白等结合，形成 RNA诱导沉默复合体（RNA-induced silencing complex，RISC）。在 ATP 的激活下，siRNA 发生解旋，反义链根据碱基互补配对原则，特异性地识别并切割靶基因 RNA，实现基因沉默 [8]（见图 1）。通过化学修饰和特定序列设计，siRNA 疗法能够高效且特异地降解多种靶标 mRNA。这一过程依赖于 ATP 供能，通过自然的生物调节途径发挥降解作用，显著抑制特定基因的表达。因此，siRNA 疗法以其高度的特异性、高效性及安全性等优势而备受关注 [9]，并有望广泛应用于多种疾病的治疗。2018 年，美国食品药品监督管理局（FDA）批准了首个 siRNA 药物Onpattro ™（patisiran），用于治疗转甲状腺素蛋白淀粉样变性的多发性神经病 [10]。然而，由于 siRNA带负电荷且相对分子质量较大（约 10 000），穿透细胞膜的能力受到严重限制。即使少量 siRNA 进入细胞质后，也难以从内涵体中逃逸并发挥作用。同时，在生理条件下，裸露的 siRNA 易被核酸酶降解，稳定性差且半衰期短（小于 15 min），难以在靶细胞中累积并发挥作用 [11]。因此，siRNA 药物需要通过载体来提高其稳定性和细胞内浓度。其中，病毒载体具有较高转染效率 [12]，但工艺复杂且存在潜在的生物危险性，而非病毒载体通常制备工艺简单、安全可控，得到广泛的研究与发展 [13]。目前，常用的非病毒载体包括脂质体或脂质类似物、聚合物、无机纳米粒，以及功能性偶联物等[14]。目前上市的 4 种 siRNA 药物中，除 1 种以脂质体作为载体外，其余均采用 N-乙酰半乳糖胺载体，可以形成多糖-siRNA 单缀合物，实现向肝细胞的特异性递送。然而，无论是脂质体还是 N-乙酰半乳糖胺载体，在面对非肝细胞递送的需求方面仍缺乏优势。此外，由于非病毒载体仍存在靶向性差、不易降解、体内稳定性差，以及疾病治疗范围窄等缺点，无法同时克服 siRNA 体内递送所面临的多重挑战，限制了此类药物的临床转化 [15]。因此，理想的 siRNA 载体应同时具备以下特征：1）在体循环中保持 siRNA的稳定性；2）能克服血液和细胞膜屏障，精准递送siRNA 至靶细胞；3）快速从内涵体逃逸并实现高效基因沉默；4）具有良好的生物安全性 [16-17]。2基于金属有机框架的 siRNA 递送系统的构建 策略金属有机框架（metal-organic framework，MOF）是由有机配体和金属离子（或纳米簇）配位自组装而成的具有高比表面积的多孔材料，例如沸石咪唑酯骨架结构（zeolitic imidazolate framework，ZIF）、MIL（materials of Institute Lavoisier）系列框架、UiO（University of Oslo）系列材料、多孔配位网络（porous coordination network，PCN）等 [18]。迄今，锌、铜、铁、铬、铝、锆等多种金属离子均可作为MOF的中心离子。具有可供配位的官能团（如芳香羧酸类和含氮杂环类等）的有机物常作为 MOF的有机配体参与组装 [19]。MOF 因其制备工艺简单、生物可降解以及生物相容性良好等优点，在药物递送方面应用广泛。与其他非病毒纳米载体相比，MOF 在递送siRNA 方面也表现出显著优势：1）MOF 结构可调性强，有助于装载符合 siRNA 尺寸和理化性质的颗粒，保护 siRNA 免受酶降解；2）高孔隙率和高比表面积赋予了 MOF 负载 siRNA 的潜力，且表面易于功能化，可促进核酸被细胞摄取；3）MOF 结构大多具有酸敏感性，在肿瘤微环境或溶酶体条件下实现 siRNA 的可控释放；4）基于 MOF 中含氮杂环配体的质子海绵效应，可促进核酸从内涵体逃逸，提高转染效率；5）MOF 具备优异的生物相容性和可降解性，可实现体内用药的安全性 [20-22]。 本文总结了 MOF 在 siRNA 递送方面的最新研究进展，包括 MOF 与 siRNA 相互作用机制、MOF对 siRNA 的包载方式，以及 MOF-siRNA 递送系统在除肿瘤外其他疾病治疗中的探索，旨在为高效siRNA 递送平台的设计提供思路与参考。2.1 金属有机框架与 siRNA 相互作用机制脂质体、聚合物等非病毒载体递送 siRNA 时，通常通过静电相互作用来包封 siRNA[23-24]，稳定性受电荷影响，难以实现可控释放。MOF 除静电相互作用外，还可通过金属配位作用、主-客体相互作用、π-π 堆积等多种方式有效负载 siRNA 分子 [25]。2.1.1 静电相互作用  由于 siRNA 带负电荷，阳离子聚合物或脂质通常通过静电吸附的方式来包封siRNA[26-27]，从而显著提高转染效率。然而，基于静电吸附的高电荷纳米载体，容易在生理条件下与其他生物大分子形成电解质聚集体，或与血清或血浆蛋白发生非特异性相互作用 [28]，造成 RNA 泄漏。为获得稳定的递送载体，需要考虑影响复合颗粒的尺寸、分散度、稳定性，以及制备工艺参数，如pH值、反应浓度、载体-siRNA 比率等。MOF 具有较弱的正电性、尺寸适宜且分散均匀，同时具备生理稳定性和生物相容性，因此是 siRNA 递送的良好载体。其中，MOF 负载 siRNA 最常见的策略是通过超声等物理方式将 siRNA 包载入 MOF 多孔框架中 [29]。同时，该多孔框架对 siRNA 产生物理限制，稳定其结构的同时包封率显著增加。因此，相较于阳离子聚合物等载体，MOF 制备工艺简单，具有优异的稳定性、生物相容性和生物可降解性。2.1.2 金属配位作用  仅依赖于静电作用的阳离子递送载体包封效率低且易导致细胞毒性，从而限制其临床应用。近年来，基于非静电相互作用的包封策略被广泛研究，如配位键作用和氢键作用。MOF表面和内部的金属离子（Ca2+、Zn2+、Fe3+）可与RNA 磷酸基团发生配位作用，稳定其结构。例如，MIL 家族表面的 Fe3+ 可与低氧诱导因子（HIF）-2α siRNA 的磷酸基团通过氢键和多个配位键作用形成复合物，保护 HIF-2α siRNA 免受核酸酶的降解 [30]。此外，UiO 表面 Zr3+ 的空轨道也可以与 siRNA 骨架上的磷酸残基形成多个配位键，从而将 siRNA 成功结合至颗粒表面。MIL 和 UiO 家族在表现出较高的 siRNA 包封效率的同时，仍保持物理和化学稳定性，并在系统给药后表现出良好的生物安全性 [31]。2.1.3 主-客体相互作用  主-客体相互作用通常发生在多孔 MOF 材料中，通过固体核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）化学位移变化结果，可观察到 MOF 材料与 siRNA 客体分子之间的空间联系[32]。当具有多重拓扑孔道结构的 MOF 与 siRNA 分子的尺寸精确匹配时，可实现更加稳定的负载 [33-34]。例如，Zr-MOF 的六角形介孔通道可通过主-客体相互作用容纳直径为 3 nm 的 siRNA 分子 [35]，通过分子模拟技术，在 Zr-MOF 孔模型中展示了 siRNA 分子能量最小化的最终构型，在热力学上进一步证明了 MOF 孔道对 siRNA 的稳定作用。2.1.4 π-π 堆积  除了上述 3 种相互作用外，π-π 堆积也是 MOF 与 siRNA 的一种独特的相互作用机制。π-π 堆积是一种广泛存在于天然或合成材料中的非共价相互作用，特指涉及含有 π 键的芳香族基团的相互作用 [36]。根据芳香环排列的位置与相互作用方式不同，可将 π-π 堆积分为 3 类：边对面结构、偏移堆叠，以及面对面堆叠。其中前 2 种堆叠方式能量较低，具有结构稳定性，因此是 π-π 堆积的主要形式 [37]。根据不同的配体类型，可将 MOF 分为芳香羧酸类和含氮杂环类 [38]，由于 π-π 堆积在维持材料结构稳定性方面具有重要作用，因此芳香羧酸类 MOF 通常通过 π-π 堆积方式自组装并实现药物递送。另外，含氮杂环的卟啉类 MOF 也通过 π-π 堆积作用结合带负电荷的 siRNA，从而将 siRNA 包载于 MOF 中 [39]。金属配位作用、π-π 堆积方式和主-客体相互作用是 MOF 用于 siRNA 递送的独特方式，为显著提高 siRNA 的体内稳定性提供了新的作用模式。为了开发更多适用于递送 siRNA 的 MOF，未来的研究可集中于材料结构优化和制备工艺简化等方面，以提高 siRNA 递送的稳定性与高效性，达到精准靶向与可控释放的目的。2.2 MOF 对 siRNA 的包载方法 众所周知，药物递送载体的理化特性，如组成、尺寸、电荷和形貌，在组织渗透和聚集方面起着关键作用 [40]。一般情况下，小尺寸、刚性的载体具有较高的组织通透性，而大尺寸、柔性的载体则具有更好的组织蓄积和滞留能力。为解决上述不同特性之间的矛盾，同时增强组织渗透和蓄积能力，对 MOF 性能的控制不能仅局限于其尺寸、电荷和孔隙率的准确程度，还需要考虑其表面的生物亲和力和体内代谢行为的相关影响。因此，MOF 的可控合成和载药方法对于药物递送效率至关重要。目前，MOF 的可控合成和载药方法主要包括一锅法、两步法和生物矿化法。2.2.1 一锅法  一锅法是一种简单、高效、快速的方法，被广泛应用于 MOF 合成和药物负载 [41]。通过控制 MOF 的反应时间、反应体系浓度、温度及 pH值，可以有效调控颗粒的成核大小和速率，从而调节颗粒的尺寸 [42-43]。在综合考虑 MOF 尺寸、电荷、形貌及表面功能化对其性质的影响后，有研究通过简便、快速、合理的一锅法，在温和的条件下成功将 siRNA 药物包封在 2-甲基咪唑（MIM）和锌离子组成的 MOF 材料中，并包封在海藻酸钠（SA）纳米粒中，制得递送系统 SA@MOF-siRNA，用于小鼠结肠炎治疗（见图 2）[44]。该系统具有高包封率（＞ 80%）和渗透性，可以穿透肠道黏膜层，在肠道疾病治疗领域具备转化潜力。此外，活性物质作为配体直接参与 MOF 的合成，可以提高递送系统的治疗效果。例如，有学者以抗氧化剂单宁酸（tannic acid，TA）为配体，将金属离子、配体及核酸混合均匀后，通过一锅法成功将 siRNA 负载于金属 - 酚类 MOF 结构（TFSB）中 [45]。2.2.2 两步法  两步法是指先合成 MOF，再将 siRNA 装载其中，通常包括表面修饰和表面装载两种方式。表面修饰是指将药物直接修饰在颗粒表面从而实现负载 [46]，而表面装载是指利用 MOF 的表面孔道装载药物。MIL、UiO 家族具有高孔隙率和可控的表面官能团，其大孔隙用于负载化疗药物，而表面的金属离子有利于通过配位键作用结合 siRNA。该负载方法简单快速，将游离 siRNA 与 MOF 在水溶液中简单混合，便可得到负载 siRNA 的颗粒 [31]。此外，ZIF 家族还可通过 siRNA 与配体的预先孵育，然后逐渐加入含Zn2+ 溶液，以实现两步法制备负载 siRNA 的 ZIF 纳米颗粒 [47]。然而，基于表面金属配位键作用的两步装载方式使 siRNA 暴露在颗粒表面，在生理条件下存在着被核酸酶降解和被有机溶剂破坏的潜在风险。2.2.3 生物矿化法  传统载药方式较难合成具有特定尺寸、形貌，以及均匀分散的 MOF-siRNA 复合颗粒，一般需要在有机溶剂中反应或者对 MOF 材料进行表面功能化，增加了合成的复杂度，同时具有潜在的安全隐患 [43]。生物矿化 [47] 是生物分子与无机离子相互作用，产生硬质生物材料的过程。基于这一自然生物矿化过程的机制，多功能的纳米载体已被开发并尝试用于各种疾病的治疗。生物矿化法合成的材料具有以下优势。1）生物相容性。在仿生矿化过程中，纳米材料通过模拟活体条件进行合成，从而避免了被人体免疫系统排斥。2）生理稳定性。仿生矿化技术的合成环境与生理环境非常相似，从而确保了生物矿化纳米颗粒的生理稳定性。3）生物降解性。生物矿化纳米材料的主要成分源自机体内存在的物质，在人体中易于代谢，并可被吸收与再利用。4）高效负载生物大分子。由于生物矿物与生物分子之间广泛的相互作用，矿化材料可以促进核酸负载至纳米粒中 [48-49]。 近年来，基于生物矿化机制开发的多功能纳米递送核酸平台被广泛应用。牛血清白蛋白（BSA）结构含有大量的侧链氨基酸，具有羧基、羟基以及巯基基团，容易与 MOF 中的金属离子发生螯合，从而形成包裹蛋白质的纳米颗粒 [50]。BSA 的生物矿化法合成简便、快速、成本低廉且易被肾脏代谢，在核酸药物负载、递送等方面具有潜力。例如，将siRNA 原位封装于 pH 响应性的 ZIF-8 后，进一步用 BSA 生物矿化方法合成的二氧化锰涂层进行修饰 [51]，从而提高颗粒的负载率和主动靶向性，同时实现疾病治疗和磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）。虽然这种合成方法与两步法相比，可以更好地保护 siRNA 不被核酸酶降解，但其生物矿化的机制暂不清楚，如金属离子与生物分子的构象变化、结合位点等；此外，该方法制备的治疗系统在肿瘤微环境内的主动靶向效果仍有待提高。3角鲨烯作为疫苗佐剂的应用3.1 抗肿瘤治疗3.1.1 通过沉默癌基因实现精准抗癌  癌症易感基因如 PLK1、Survivin、SNHG15 等，在非小细胞肺癌、胃癌、黑色素瘤、乳腺癌、甲状腺癌等多种癌症中均过表达，但在正常分化成熟组织中低表达 [52]。通过 RNAi 疗法来精准靶向并沉默癌症易感基因，有望在癌症治疗领域带来突破性进展。研究人员通过 ZIF-8 纳米颗粒装载 PLK1 siRNA，同时采用同型癌细胞膜包裹颗粒，进行异位荷瘤小鼠模型尾静脉给药。该递送系统被肿瘤细胞摄取后，在溶酶体酸性条件下发生解离，释放出 2-甲基咪唑，通过质子海绵效应破坏溶酶体膜，实现了 siRNA 逃逸，从而下调肿瘤中过表达的 PLK1 癌基因，抑制肿瘤生长。该仿生 MOF-siRNA 递送系统具有制备工艺简单、负载和靶向效率高等特点，为核酸递送提供了新平台 [53]。基于 ZIF-8 高效的核酸装载能力，有研究通过一锅法将 Survivin siRNA 装载到 ZIF-8 内部，同时表面覆盖血小板膜。体内实验结果显示，与未治疗组相比，递送系统组具有主动靶向性，在肿瘤治疗方面展现了卓越的效果 [29]。因此，MOF 作为一种高效的核酸递送载体，可靶向沉默癌症易感基因，实现精准治疗。同时，MOF 表面易包被细胞膜等内源性物质，赋予载体靶向性，可帮助其逃避免疫系统清除、延长体内循环时间并提高基因沉默效果。3.1.2 降低化疗耐药性  由多种化疗药物引发的多药耐药性（multiple drug resistance，MDR），导致细胞内药物外排增加，药物水平降低，造成癌症复发和预后不良，死亡率增加 [54]。因此，亟需克服化疗耐药的新策略。顺铂是癌症治疗的广谱化疗药物之一，其引发耐药性的分子机制尚未被完全阐明，可能有以下几种机制：1）MDR 基因表达上调；2）肿瘤细胞转移和耐药信号通路异常激活；3）外排转运蛋白表达上调，导致癌细胞对顺铂摄取减少；4）癌基因突变等 [55]。 通过 RNAi 疗法可直接沉默 MDR 基因，解决顺铂的耐药问题。有研究通过 UiO 共递送顺铂和 MDR siRNA 至癌细胞中，沉默了 MDR 基因，从而克服癌细胞对顺铂的耐药性，增强了顺铂的疗效 [31]。此外，有研究发现肿瘤组织中 OUM1/PTPRZ1 信号通路异常，从而促进肿瘤细胞的增殖、迁移和耐药 [56]。因此，研究者利用 MOF 的酸响应释放特性和表面结构易功能化的特点，通过 Mn-MOF 递送可干扰 OUM1 和 PTPRZ1 的 siRNA，来抑制 OUM1/PTPRZ1 通路，从而抑制肿瘤细胞增殖和迁移，降低其对顺铂的耐药性，增强化疗效果 [57]。同时，在肿瘤微酸性条件下，MOF 结构被破坏，响应性释放锰离子，从而诱导类芬顿反应，产生大量活性氧，实现化学动力学治疗。3.1.3 多模式联合增强抗癌疗效  虽然 siRNA 可精准下调相关基因，但由于机体复杂的代偿平衡，siRNA 疗法在临床上的抑瘤效果仍未达到预期。为提高 siRNA 疗法的有效性，通常需要采用联合治疗方法。与单一治疗相比，联合治疗不仅可提高抗癌疗效，还可以一定程度地规避多药耐药现象，并抑制肿瘤的转移和复发 [58]。然而，多种治疗策略的联合会增加递送系统设计的复杂性、引发不良反应或面临其他未知的困难。因此，将多种治疗策略进行有机整合，兼具临床应用意义和挑战性。研究人员通过一锅法研制了一种可负载热休克蛋白 siRNA 的新型多功能锆-铁卟啉 MOF 诊疗平台（siRNA/Zr-FeP-MOF）。该平台具有光敏剂卟啉的结构，在近红外激光照射下，光敏剂卟啉催化内源性过氧化氢和氧气生成大量活性氧，从而破坏溶酶体膜，实现溶酶体逃逸；同时，siRNA 抑制热休克蛋白的表达，增强体系的光热治疗效果。该平台基于光敏剂的光动力治疗与基因治疗、光热治疗的协同作用，可显著抑制体内肿瘤生长 [39]。同时，其还具备一种三模态肿瘤成像能力，包括光学成像、计算机断层扫描成像和光声成像，可实现精准肿瘤诊断（见图 3）。3.2 治疗炎症相关疾病 退行性骨关节炎（degenerative osteoarthritis，OA）是一种高发病率疾病，也是临床上最为常见的关节炎类型，可导致关节功能障碍和慢性残疾 [59]。然而，单一治疗药物疗效差、生物利用度低，且靶向性是目前尚未解决的问题。其中，乏氧与炎症紧密相关 [60]，OA 病变组织中的 HIF-2α 过表达导致软骨发生退化，病灶难以完全根除。研究人员设计了一种 pH 响应性 MOF，共递送抗炎药物姜黄素（CCM）和 HIF-2α siRNA，在 OA 酸性微环境中颗粒结构发生裂解，释放 CCM 和 HIF-2α siRNA，从而下调促炎细胞因子水平，沉默 HIF-2α 以缓解软骨退化，协同抑制炎症反应 [30]。 类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种自身免疫性疾病，其发病机制是自身抗原与抗体结合形成免疫复合物，沉积于关节部位，诱导炎症并募集促炎 M1 型巨噬细胞，加剧炎症反应。目前，治疗 RA 的药物包括非甾体抗炎药、糖皮质激素、抗氧化剂TA，以及抗风湿药（传统化学药物或细胞因子）[61]。然而，抗风湿药难以靶向递送至关节炎病灶处，疗效较差且具有潜在的全身毒性。TA 作为一种抗氧化剂，可对 RA 起到缓解作用，有研究首次将其作为 MOF 的配体，使颗粒自身具有抗氧化活性 [45]。同时，该 MOF 装载的 siRNA 下调肿瘤坏死因子（TNF）-α，使巨噬细胞表型发生转化，从根源抑制病情。在胶原诱导的关节炎小鼠模型中，该治疗方法展现出良好的抗 RA 效果，且具备较高的生物相容性。4结语与展望基因治疗作为一种生物医学手段，在癌症、病毒感染和免疫疾病等领域具有广阔的应用前景，其中 RNAi 疗法由于其对特定基因的精准下调而备受关注。尽管现已开发出多种 siRNA 递送载体，但脱靶效应、免疫原性，以及核酸装载效率低等问题，严重限制了这些载体的临床应用。与其他非病毒载体相比，MOF 具备高孔隙率、高比表面积，以及可控的结构骨架和可生物降解等特性，为解决上述问题提供了新的材料。本文总结了 MOF-siRNA 递送系统的构建策略和研究进展，为提升 siRNA 疗法的有效性和安全性提供了新的方法和思路。由于 MOF材料在生物医药领域的应用刚刚起步，可供选择的性能优良的配体种类还比较匮乏，材料本身可能造成的免疫原性、长期毒性和体内代谢等方面的研究还不够充分，MOF-siRNA 递送系统临床转化的实现还需要较长的时间和过程。因此，进一步探索基于生物活性物质（如氨基酸、小分子药物）构建的MOF，寻求提高药效和生物安全性的方法，深入探讨 MOF 材料作为药物载体的可行性和潜力，对推动 MOF-siRNA 药物的临床转化具有重要意义。参考文献：[1]  Zhang J, Chen B, Gan C, et al. 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“ 点击蓝字 关注我们 顾景凯 吉林大学唐敖庆卓越教授、药物代谢研究中心主任，超分子结构与材料国家重点实验室教授，国家药品注册审评专家咨询委员会专家。中国药理学会药物代谢专业委员会副主委、分析药理专业委员会副主委；中国医药生物技术协会药物分析技术分会副主委；《药学学报》副主编；Drug Metab Dispos，Acta Pharm Sin B，Asian J Pharm Sci，J Pharm Anal等期刊编委。长期从事纳米药物、高分子药物、多糖药物、蛋白肽类药物体内时空命运分析和基于药代动力学的前体药物设计与开发。先后主持11项国家自然科学基金面上项目、重点项目和国家重大新药创制专项子课题，在 Adv Drug Deliv Rev，Anal Chem，Acta Pharm Sin B，Adv Mater，Biomacromolecules，Clin Pharmacokinet等期刊发表SCI论文200余篇，获授权发明专利15项，作为主要发明人之一的1类新药于2022年上市。 纳米药物递送系统体内命运分析新方法与新技术研究进展 PPS  王心怡1, 2#，付淑军3#，孟祥骏1，吴伟4*，顾景凯2** （1. 天津大学医学部药物科学与技术学院，天津300072；2. 吉林大学超分子结构与材料国家重点实验室超分子化学生物学研究中心 生命科学学院药物代谢研究中心，吉林 长春130012；3. 国家药品监督管理局药品审评中心，北京100022；4. 复旦大学药学院， 上海201203） [摘要] 纳米药物递送系统（NDDSs）能够改善药物的药代动力学行为，将活性药物成分靶向递送至病灶，并控制药物释放。近年来， 随着纳米技术的快速发展，NDDSs在医药领域展现出巨大潜力，已成为该领域的研究热点。对NDDSs的体内命运进行精准分析，是揭示其复杂体内过程，实现纳米药物安全、有效递送的关键之一。NDDSs在体内包含负载型药物、游离型药物、纳米载体和载体材料等多种形态成分，在复杂的生命体系中全面精准分析这些成分的动态变化具有极高的技术挑战。受分析方法与分析技术的制约，目前对于NDDSs的体内命运研究仍存在许多挑战，极大阻碍了NDDSs的快速发展与临床转化。综述对NDDSs中游离型药物、负载型药物、纳米载体和纳米材料的分析新方法、新技术及其在纳米药代动力学中的应用进行介绍，并对该领域未来研究方向提出展望，以期为NDDSs的体内命运相关研究提供参考。 1995 年，美国食品和药品管理局（food and drug administration，FDA）批准了首个抗癌纳米药物Doxil [1]。在过去的30年里，纳米药物递送系统 （nanocarrier drug delivery systems，NDDSs）发展迅速，迄今已有几十万篇相关论文发表[2]。然而， 尽管论文数量庞大， NDDSs的实际临床转化却十分有限。截至2023年末，仅有90多个纳米药物上市[2]。与普通制剂相比，这些纳米药物在临床依从性方面有了极大提高，但大多数在临床疗效方面并未取得显著的改善[1, 3]。 与普通药物制剂不同，NDDSs在体内始终存在 “载药粒子-游离型药物-解聚载体材料”多种形态的动态变化过程，该过程与其体内药代动力学行为、 药效作用和毒性反应密切相关。其中，载药粒子是药物的运输工具和储库，靶部位/靶点（如肿瘤组织） 中的游离药物是药效的物质基础，而其他组织中的游离药物、载药粒子、解聚载体材料等则可能导致 毒性/不良反应。因此，充分了解NDDSs各形态组分的体内药代动力学信息，对其安全性和有效性评价以及制剂处方的设计与优化具有重要意义[4-5]。以往由于缺少前瞻性的理论指导，尤其是缺少有效的分析策略与技术手段，在复杂的生命系统中对 NDDSs 游离药物、载药粒子、解聚载体材料的药代动力学过程进行精准分析，无疑存在巨大的挑战， 已成为制约 NDDSs 临床转化成功率的最主要瓶颈之一[6]。 针对上述问题，本文聚焦NDDSs在体内存在的不同形态成分，对近年来用于追踪NDDSs体内时空命运的先进分析策略与分析技术进行综述，以期为NDDSs的药代/毒代动力学、安全性与有效性评价以及NDDSs的处方设计与工艺优化研究提供比较全面的技术支持，进而提高NDDSs的临床转化成功率。 1 游离型、负载型药物和纳米载体分离分析技术 传统的药物分析技术只关注NDDSs中药物的总浓度，无法阐明药物是负载于载药粒子还是已经从载体中释放出来[7]。由于NDDSs改变了药物的分布，其所负载药物的吸收、分布、代谢、排泄行为相比普通制剂往往会发生显著变化[7]。因此，为了能够更准确地评估纳米药物的有效性与安全性， 区分游离型药物和负载型药物是极为重要的。在复杂的生命系统中，纳米药物的递送过程面临多种挑战，为确保所设计的纳米载体的优良性能，监测纳米载体的体内转运过程也是十分必要的[8]。下文将对NDDSs游离型药物、负载型药物和纳米载体的分离与分析技术进行介绍。 1.1 固相萃取技术 固相萃取（solid phase extraction，SPE）技术基于液-固相色谱理论，通过选择性吸附和选择性洗脱的方式对样品中不同组分进行分离。脂质体是由脂质双层构成的球形囊泡。作为首个成功应用于临床的纳米载体[9-12]，脂质体以独特的两亲性结构，即亲水核心和被脂质层包围的疏水空间，为封装不同极性的药物提供了可能[9, 13]。Wang等[14] 开发了一种SPE结合液相色谱-串联质谱（liquid chromatography tandem mass spectrometry，LC-MS/ MS）检测聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG） 化长循环阿霉素（doxorubicin，DOX）脂质体的负载型DOX和游离型DOX的分析方法。该方法利用PEG化长循环DOX脂质体在反相固相萃取小柱上保留能力差，而游离型DOX在反相固相萃取小柱上保留能力强的原理，能够从组织样本中分离出 PEG 化DOX脂质体（负载型DOX）；然后利用 LC-MS/MS 分别检测负载型DOX浓度和DOX总浓度，并通过二者差值计算出游离型DOX的浓度。该研究比较了荷瘤小鼠正常组织和肿瘤组织中PEG 化脂质体内DOX的释放与摄取曲线，结果表明脂质体能有效地将DOX释放到肿瘤中，与直接给药 DOX溶液相比，脂质体使肿瘤对DOX的吸收量增加了1.8倍；脂质体还降低了DOX在心脏的分布量， 从而减少了DOX的心脏毒性。 1.2 荧光成像技术  近年来，荧光成像技术凭借其高灵敏度、操作简便等特性使其在药物递送系统中得到广泛应用[15]， 常被用于标记NDDSs并对其进行可视化示踪[16]。下文将对常用于NDDSs游离型药物、负载型药物和纳米载体的荧光成像技术进行介绍。 1.2.1 聚集诱导发光技术 聚集诱导发光（aggregation- induced emission，AIE）是指某些分子在分散状态下几乎不发光，但当它们聚集在一起时，发光效率显著提高[17]。聚合物胶束是两亲性聚合物分子在水相介质中达到或超过临界胶束浓度（critical micelle concentration，CMC）后自发形成的一种有序结构。两亲性聚合物分子亲脂性尾部因其疏水作用而聚集于胶束内部，亲水性的头部则因具有极性而向外部延伸[18-19]。聚合物胶束的疏水核心能够通过疏水相互作用有效地负载疏水性药物，其亲水外壳与周围的水分子相互作用，保护胶束不被网状内皮系统识别[20]，进而对胶束内部的疏水基团起到保护作用。Sun等[21] 通过将氧化还原敏感的二硫键和 AIE 荧光团Tripp连接于甲氧基聚乙二醇（methoxy polyethylene glycol，mPEG），制备了mPEG-ss-Tripp 聚合物胶束，并以DOX作为药物模型，成功构建出能够同时实现癌症治疗与细胞内成像的智能给药系统。当细胞内谷胱甘肽（glutathione，GSH）还原 mPEG-ss-Tripp 中的二硫键时，聚合物胶束迅速释放药物来抑制肿瘤转移，同时通过监测Tripp的AIE 信号变化来研究胶束的细胞内释药行为。 聚合物纳米粒利用其独特的结构通过吸附或共轭作用使其于聚合物基质或载体表面携带药物[22]， 从而实现对药物的递送。Wang等[23]制备了一种负载姜黄素（curcumin，Cur）的聚乳酸-羟基乙酸 [poly(lactic-co-glycolic) acid，PLGA] 纳米粒（Cur@ PLGA-NPs）。Cur 是一种具有AIE性质的药物， 在与PLGA纳米粒结合后，利用其荧光特性监测载药纳米粒在细胞内的分布。该纳米粒与CT26细胞孵育后，由于Cur的AIE特性，载药Cur纳米粒在细胞中表现出红色荧光，且其荧光强度呈现出浓度依赖性，这表明Cur纳米粒被成功内化到CT26 细胞中。 Wang 等[24] 报道了蛋白冠对阳离子脂质体与细胞相互作用的影响。该研究将具有AIE效应的TR4 作为细胞膜探针，引入阳离子脂质体（TR4脂质体）。当TR4以单体形式存在时不发出荧光，而一旦其插入脂质体中就会发射出较强的荧光。通过成像定位技术，该研究分别对含蛋白冠和不含蛋白冠的脂质体组的观察结果显示，蛋白冠的形成对阳离子脂质 体的转运行为产生了显著的影响，即当脂质体表面形成蛋白冠后，其与细胞的相互作用方式从能量非依赖性的膜融合转变为能量依赖性的内吞作用。 Xu 等[20] 设计并成功合成了一种具有AIE特性的壳聚糖，该壳聚糖通过引入疏水性片段、基于二苯甲酮结构的AIE荧光团、肿瘤靶向配体和酸敏键， 实现了对肿瘤的靶向作用及在酸性条件下的药物释放。该壳聚糖的两亲性使其能够自组装形成包封含紫杉醇的胶束。这种“可视化”胶束系统不仅能够在肿瘤中有效聚集并特异性释放药物，而且能实时监测药物行为。在MCF-7细胞实验中，孵育2 h 即可在细胞质中观察到来自该胶束系统的黄色荧 光，这一现象表明胶束已成功被肿瘤细胞内化。随着孵育时间的延长，荧光强度逐渐增强，进一步说明了肿瘤细胞对胶束的内吞量在不断增加。类似地， Kulkarni 等[25] 将基于四苯乙烯（tetraphenylethylene， TPE）的AIE 荧光团掺入聚乙二醇-聚己内酯 [poly(ethylene glycol)-block-poly(ε-caprolactone)， PEG-b-PCL] 中，该嵌段共聚物可通过自组装形成包 封有DOX和Cur的胶束，可以同时实现肿瘤给药与纳米载体的生物成像示踪。 AIE 效应最显著的优势是在聚集状态下荧光信号的增强，这大大提高了检测的灵敏度。由于AIE 探针在溶液中几乎不发光，其可有效减少背景信号， 提高信噪比。虽然AIE探针在聚集时发光强，但这也可能导致空间分辨率的不足。在AIE探针高度聚集的区域，过强的荧光信号可能掩盖细微的结构信息，特别是在亚细胞结构的研究中。在某些生物环境下，非特异性吸附可能使AIE探针重新聚集，导致产生错误的荧光信号，影响实验结果的准确性。另外，负载的AIE探针在体内从纳米载体上释放行为未必与药物完全一致，这也会影响负载型药物分析结果的准确性。 1.2.2 聚集发光淬灭技术 聚集发光淬灭（aggregation- caused quenching，ACQ）荧光探针具有强疏水性[26]， 在有机溶剂中具有良好的荧光发射性质。随着环境含水量的增加，ACQ荧光探针的荧光发射强度会经历一个显著的变化过程。当含水量达到某一特定值时，ACQ荧光探针的荧光发射强度会迅速下降，而当其处于绝对水环境时，由于分子间的聚集作用， 其荧光发射会完全淬灭[27]。ACQ荧光探针在检测纳米载体完整性方面具有重要的应用价值，当纳米载体保持完整时，其内部的ACQ探针由于处于有机环境而发出强烈的荧光；当纳米载体发生解聚或分解时，ACQ探针由于暴露于水环境中而发生荧光强度降低，甚至完全淬灭。 复旦大学吴伟教授课题组开发了一种利用近红外荧光染料的ACQ特性来监测完整纳米载体体内命运的新策略。该技术已被成功应用于研究多种纳米载体的体内命运[28-33]。He等[34]采用该策略标记和追踪口服聚合物胶束的体内命运发现，大鼠口服聚合物胶束后，其在胃肠道中至少保留4 h，血液和肝脏中出现的荧光直接证明完整聚合物胶束的口服吸收，且约1% ~ 2%的完整胶束通过淋巴途径被吸收。Wu等[35] 也将ACQ探针封装到聚合物胶束中来跟踪胶束的体内命运。 纳米乳是一种由水、油和适当的表面活性剂自组装形成的纳米体系[10]。Jiang等[36]利用ACQ 荧光探针的特性，对石杉碱甲纳米乳（huperzine A-nanoemulsion，HupA-NE）及乳铁蛋白修饰的石杉碱甲纳米乳（lactoferrin-huperzine A-nanoemulsion， Lf-HupA-NE）在大鼠体内的转运进行了示踪。活体成像结果显示，HupA-NE和Lf-HupA-NE经鼻腔给药后，均可通过神经和血液循环转运到脑中。 可溶性微针是近年来研究较多的一类微针，其主要由水溶性高分子材料制备而成，药物分布在针尖的基质中，当微针刺入皮肤后，针尖通过吸收组织液逐渐溶解，并释放出封装的药物[35]。Fu等[26] 将ACQ探针负载于固体脂质纳米粒，进一步将二者一并封装到可溶性微针中，随后追踪固体脂质纳米粒在大鼠不同皮肤部位的透皮扩散情况。活体成像显示，随着时间推移，大鼠不同皮肤部位的荧光强度均逐渐降低，表明负载于纳米载体的ACQ探针因暴露于生物基质而发生荧光猝灭。 Naghibi 等 [37] 将四苯乙烯溴代异丁酸酯 （tetraphenylethene-bromoisobutyrate，TPE-BIB）与 PEG 和肼（hydrazine，Hyd）结合，合成出一种新型刷状聚合物TPE-PEGA-Hyd，其中肼为DOX的结合位点。该聚合物不仅具有PEG的优良特性，还因TPE-BIB 的引入而具备了AIE性能，为药物递送和体内示踪提供了有力的工具。TPE-BIB是能够发出蓝色荧光的AIE荧光团，其荧光强度在聚集状态下显著增强，而DOX在作为药物模型的同时，还具有ACQ特性，其红色荧光在聚集状态下较弱（见 图1）。TPE-PEGA-Hyd-DOX 在肿瘤细胞的低pH 环境中由于肼的裂解而释放DOX。因此，通过该体系410 nm（蓝色）和600 nm（红色）的荧光比率， 可以实现对药物在体内的实时监测。 ACQ是示踪负载型药物和载体粒子的重要技术手段。在许多生物检测中，ACQ效应可减少背景信号，有助于提高检测信噪比。然而，基于ACQ的生物成像不适用于亲水性纳米载体，因为ACQ探针很难被包裹到亲水性基质中，且水分子会迅速吸收到亲水性基质中，导致探针聚集和荧光猝灭。由于ACQ效应依赖于荧光分子的聚集程度，这使得精确的定量分析变得较为复杂。此外，同AIE探针 一样，负载的ACQ探针在体内从纳米载体上释放 行为未必与药物完全一致，这可能会导致对负载型药物的分析不准确。 1.2.3 荧光共振能量转移技术 荧光共振能量转移 （fluorescence resonance energy transfer，FRET）是 2 个荧光团（一个作为供体，另一个作为受体）之间的能量转移过程，当供体的发射光谱与受体的激发光谱在很大程度上重叠，且2种荧光探针之间的距离非常接近时，二者之间就会发生能量转移，处于激发态的供体以非激发方式将能量传递给旁边的受体，使得供体发射的荧光强度衰减，受体荧光分子的荧光强度增加[38]。FRET技术为监测NDDSs的药物释放和载体完整性提供了一种强大的工具 [39]。在实验设计中，将供体和受体分别标记在纳米材料和药物分子上，当药物从纳米材料中释放时，受体与供体之间的距离发生变化，进而引起FRET信号的改变。因此，通过分析FRET信号的变化，不仅 可以用来监测药物的释放，还能够用于指征有机纳米载体的完整性[17, 40]。在选择FRET染料时，通常倾向选择具有近红外范围发射光谱的染料，这是因为近红外光能够更好地穿透细胞和组织，从而避免来自这些生物结构自发荧光的干扰[40]。 Zhong 等[41] 合成了含有TPE的pH响应型纳米复合体，且以DOX作为药物模型。通过监测DOX 与TPE之间的FRET信号变化，在肿瘤细胞内追踪由pH变化触发的DOX动态释放过程。Laskar 等[42] 将 2 种疏水性荧光抗癌药物Cur和喜树碱 （camptothecin，Cpt）分别通过酯键和氧化还原响应型二硫键与PEG连接，成功合成出两亲性的PEG 化前药Cpt-S-S-PEG-Cur。由于前药聚合物能够在水中形成稳定的纳米组装以及Cpt（FRET供体）的发射光谱与Cur（FRET受体）吸收光谱之间的重叠， 供受体之间能够产生FRET信号。在与肿瘤相关的氧化还原环境（存在一定量的GSH）中，这些稳定的纳米组装显示出Cpt的优先释放，导致FRET消失。因此，这种基于GSH响应型FRET的递药系统能够实现以非侵入方式来监测载体中的药物释放。Zhou 等[43] 报道了一种含供体荧光团DAN-聚丙硫醚（polypropylene sulfide，PPS）-mPEG 与受体荧光团DAB-PPS-mPEG的新型氧化响应型聚合物胶束。当活性氧存在时，该胶束中的PPS嵌段发生氧化并分解，导致供体荧光团淬灭，从而触发FRET 过程的改变，这种设计使得药物释放与荧光信号变化直接相关。该研究以尼罗红为模型药物，探究了胶束荧光变化与胶束降解及药物释放之间的关系。 纳米晶在改善水溶性差的药物口服生物利用度方面展现出巨大潜力，然而，关于纳米晶如何提高口服生物利用度的具体机制，目前仍存在一定争议，这主要是由于在研究中无法同时追踪溶解的药物和纳米晶颗粒所导致。目前对此存在2种不同的观点：一是通过纳米晶减小粒径从而改善溶解度；二是通过纳米晶的内吞作用改善口服吸收[44]。Zhang 等[17] 以香豆素6为药物模型制备纳米晶，通过ACQ信号来检测游离的香豆素6，同时将2-((5 (4-( 二苯基氨基)苯基)噻吩-2-基)亚甲基)丙二腈 [2-((5-(4-(dip-tolylamino)phenyl)thiophen-2-yl) methylene)malononitrile，MeTTMN] 掺入香豆素6 构建FRET对，并通过监测FRET信号跟踪纳米晶体颗粒。研究结果表明，该纳米晶体主要通过快速溶解改善药物的口服吸收，成功阐明了纳米晶如何提高药物的口服吸收。 Tengjisi等[38]通过合成2种类型的FRET纳米粒， 成功构建了能够同时监测药物释放与二氧化硅纳米粒降解的系统。该研究中疏水性FRET对（DiO和 DiI）被共同封装在纳米粒核心（FRET@Si NP）， 用作药物替代物以模拟药物包封和药物释放。当 DiO 和DiI 足够接近时，可以观察到来自DiI的 FRET信号。然而，一旦2种染料因药物释放而分离， DiI 信号消失，DiO信号则会出现（见图 2A）。同时，另一组FRET对（Cy3和Cy5）被用于二氧化硅纳米粒的外表面标记（Si@FRET NP），用于监测二氧化硅的降解。当二氧化硅壳完整时，可观察到来自Cy5的FRET信号；随着二氧化硅的降解， Cy3 信号开始增加，而Cy5信号降低（见图 2B）。通过使用这2个FRET纳米系统，药物释放和二氧化硅纳米粒的降解可以被分别监测。 FRET 信号的产生依赖于供体发射光谱与受体吸收光谱的重叠及两者适当的空间配置，这保证了检测的特异性。FRET技术提供了强大的定性分析能力，但其在定量分析方面仍面临着诸多挑战。例如， FRET 效率的计算需要考虑多种因素，包括供体和受体的光谱重叠、荧光寿命、荧光量子产率等，这些均需要复杂的数学模型和校正方法。因此，FRET 技术尚难以实现全面的药代动力学分析。此外， FRET 荧光染料的生物活性也可能会影响NDDSs的药代动力学特性。 1.2.4 碳量子点 碳量子点（carbon quantum dots， CQDs）是一种零维碳纳米材料，具有众多优于有机荧光团的特性[45]。首先，CQDs高度的光稳定性确保了其在各种环境下均能保持稳定的发光性能。其次，CQDs具有可调节发射特性，使其发射波长可根据需要进行调整，从而满足不同的应用场景。再者，CQDs较大的双光子激发截面使其在较低能量激发下也能实现高效发光，有利于降低高能激光对生物组织的损害。此外，CQDs还具有优异的细胞渗透性和生物相容性。Mazandarani等[46]合成了一种壳聚糖-适体-碳量子点（chitosan-aptamer-carbon quantum dot，CS-Apt-CQD）纳米水凝胶，通过乳化法将5-氟尿嘧啶-灵芝酸负载于水凝胶系统中，其中CQD发挥示踪水凝胶的作用。Rahiminezhad等[47] 开发出一种新颖的纳米复合材料，该材料结合了石墨烯量子点（graphene quantum dots，GQDs）和 PLGA，GQD凭借其独特的光致发光特性而被用作荧光探针，以实现对药物递送过程的精确追踪，进而优化索拉非尼的药物递送效果。 CQDs 具有非常稳定的荧光特性，使其在长时间或复杂环境下仍能保持较高的信号强度。目前CQDs的荧光发光波长多为蓝绿色（400 ~ 520 nm），多需要紫外光波激发，存在生物组织穿透深度低、易造成生物组织光损伤的缺点。 1.3 酶联免疫吸附测定技术 酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）是一种经典的生物分析技术，其基于抗原与抗体之间的特异性结合。当一种特定的抗原被加入到样品板的小孔中时，可与相应的抗体结合。这种结合可通过添加酶标记的二抗来检测，该酶可催化一种底物产生颜色、荧光或其他可检测的信号。邓雪等[48]利用ELISA技术，对尿酸酶和尿 酸酶脂质体在大鼠体内的药代动力学行为进行比较， 结果显示，尿酸酶脂质体组的大鼠体内尿酸酶活性更高，且半衰期更长。ELISA具有高灵敏度、高通量的优点，但使用该方法需要针对每种待测物开发特异性的抗体与检测条件，不仅操作繁琐，且成本高昂。此外，ELISA作为间接检测技术，其选择性、动态范围往往不尽如人意[49]。近年来，直接利用 ELISA 技术对NDDSs进行体内分析的研究相对较少，这可能是因为NDDSs的复杂性与多样性使得开发通用的ELISA检测方法变得困难。 1.4 抗聚乙二醇单链可变片段抗体技术 复旦大学占昌友教授课题组开发了一种利用抗 PEG 单链可变片段抗体（anti-PEG single chain variable fragment antibody，PEG-scFv）来分离PEG 化脂质体的技术[50]。scFv 是一类具有小相对分子质量和高抗原结合活性的抗体片段[51]，因其无Fc片段，在纳 米药物表面吸附后，scFv不会引起补体激活[52-53]。PEG-scFv 与 PEG 化脂质体表面的PEG结合后，能够引起PEG化脂质体的沉淀，通过低速离心，易于将沉淀的脂质体与上清液中的游离型药物分离，进而对二者进行后续的定量分析（见图3）。此外， 这项技术也被证明能够用于分离血浆中的PEG化聚合物胶束，从而实现了紫杉醇胶束的稳定性和体内命运的解析[54]。 PEG-scFv 专门针对PEG分子，具有很高的结合特异性，且这种结合不会导致药物载体中的药物泄漏，确保了该分离方法的准确性和效率。因许多纳米药物均使用PEG来增加溶解性、稳定性或减少免疫原性，该技术对于其他种类的PEG化纳米药物也具有很好的应用潜能。 1.5 稳定同位素示踪超滤技术 超滤是一种膜分离技术，主要用于大分子和小分子的分离。超滤法主要依赖于半透膜的微孔结构。当溶液在外界压力作用下流经超滤膜表面时，小于膜孔径的小分子透过膜，而大于膜孔径的物质被截留。对于纳米药物，在超滤过程中存在一个重要的问题，即血浆蛋白结合的药物成分对负载型药物定量准确性的影响[55]。Stern 团队开发了稳定同位素示踪超滤（stable isotope tracer ultrafiltration assay，SITUA）技术，通过将稳定同位素示踪剂加入到含有纳米药物的血浆样本中，对传统的超滤方法进行改进，从而能够更准确地评估血浆蛋白的结合情况[56]。SITUA假设同位素标记的药物与从纳米药物中释放的药物具有相同的蛋白结合行为。该具体过程为：首先将同位素标记的药物（D*）加入到含有纳米药物的血浆中，D*会迅速与血浆蛋白达到结合平衡；然后将血浆样本转移到超滤装置中并通过离心分离，分别检测血浆样本中D*的总浓度 [Total D*]、超滤液中 D* 的浓度[Ultrafiltrate D*]、血浆样本中非同位素标记药物（D）的总浓度[Total D]以及超滤液中D的浓度[Ultrafiltrate D]。通过图4中的公式（1）计算D*的蛋白结合率（%Bound D*）。由于D与D*具有相同的血浆蛋白结合行为，因此D的血浆蛋白结合率等于D*的血浆蛋白结合率。根据图 4中的公式（2）计算游离型药物的浓度[Unencapsulated D]。确定了%Bound D* 和[Unencapsulated D] 后，可以使用图4中的公式（3）计算蛋白结合型D的浓度 [Protein-bound D]，并使用图4 中的公式（4）计算负载型药物的浓度[Encapsulated D][55]。 SITUA 技术已被用来研究白蛋白结合型紫杉醇Abraxane® 及紫杉醇聚合物胶束制剂Genexol®PM 在大鼠中的药代动力学特征，并进行了生物等效性评价。该研究结果发现，尽管Abraxane®和 Genexol®PM 的总药物、游离型药物的浓度-时间曲线几乎相同，但2种制剂游离型药物的药代动力学参数具有显著的统计学差异，而总药物无此差异[57-58]。这也再次证明了只关注总药物浓度的传统分析方法的局限性。 利用SITUA技术可以获得血浆样本中的负载型药物、蛋白结合药物和游离型药物的浓度信息。然而， SITUA 技术是基于稳定同位素标记药物和从纳米药物中释放的药物具有相同血浆蛋白结合行为的假设。实际上，血浆中释放药物的浓度范围较宽，不同浓度下药物的蛋白结合率可能会发生变化，从而导致潜在的准确性问题。因此，在使用此方法之前，需要检验不同浓度下药物的血浆蛋白结合率是否一致。此外，超滤装置的非特异性吸附问题也需要注意。 1.6 磁共振成像技术 磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI） 是一种无创成像技术，具有高分辨率与深组织穿透能力，能够精确捕捉到纳米载体在体内的动态变化[8]。 氧化铁纳米粒（iron oxide nanoparticle，IONP） 由于其独特的磁性和良好的生物相容性被广泛用作MRI造影剂[59]。Stater 等 [60] 将免疫佐剂单磷酰脂质A（monophosphoryl lipid A，MPLA）装载到纳米氧化铁粒菲立莫妥（ferumoxytol，FH）的碳水化合物外壳中，形成FH-MPLA复合物。随后， 将FH-MPLA通过静脉注射到小鼠体内。FH作为纳米载体，能够将药物有效地递送至肿瘤细胞， 同时也作为MRI造影剂，可通过无创成像技术实时监测纳米载体的体内分布。Zhou等[61]设计并合成了一种装载有金丝桃素的锰基树枝状聚合物纳米粒（manganese-based and hypericin-loaded polyester dendrimer nanoparticle，MHD），当 MHD 到达肿瘤部位时，MHD可被肿瘤细胞内化并降解释放出金丝桃素和锰离子。锰离子一方面具有优异的MRI成像性能，另一方面可通过将内源性H2O2转化为毒性 羟基自由基，从而强化金丝桃素的光动力治疗过程。MHD整体显示出良好的成像能力与治疗效果。 MRI 技术能够提供高分辨率的三维成像，这对于纳米载体在体内的行为和分布的研究至关重要。MRI 技术和相关纳米载体的研究涉及复杂的物理学、化学和生物学问题，需要跨学科的知识和技术， 涉及材料科学、生物医学工程、药学等多个领域。MRI 设备及维护成本高昂，对于初期纳米载体的研究和开发造成较高的经济压力。另外，不是所有的纳米材料均适合作为MRI造影剂，需要具有特定的磁学性质，这进一步限制了MRI的应用范围。 2 载体材料分析技术 纳米载体依赖载体材料来维持其结构，从而实现药物递送与控制释放的目的。载体材料不仅能够影响其所负载药物的药代动力学过程，导致药效和毒副作用的改变，也能通过影响机体免疫、代谢等过程，产生新的毒副作用。因此，阐释载体材料的体内命运对于评估NDDSs的安全性具有重要意义。纳米载体包括有机载体和无机载体。尽管无机载体 相关报道很多，但在生物相容性、生物降解性及载药性能等方面有机载体优于无机载体。目前，绝大多数已上市或处于临床阶段的纳米载体均基于有机载体。由于有机载体的组成材料具有生物降解性， 其降解产物较为复杂，且检测过程易受生物基质的干扰。有机载体材料多为高分子聚合物，通常具有多分散的性质，不同相对分子质量的同系物组成和比例千变万化，因此其体内定性、定量分析均具有很大的挑战。下文将对常用的纳米载体材料分析技术进行介绍。 2.1 液相色谱-串联质谱技术 近几十年来LC-MS/MS技术的发展令人瞩目， 不仅在小分子药物的定量分析中展现出高灵敏度， 还在大分子如蛋白质的定量生物分析中逐渐获得更多关注。LC-MS/MS技术具有优异的选择性、良好的准确度与精密度以及更宽的动态范围[62]，使得其在分析复杂生物基质中的待测物时具有更高的可靠性。 小分子纳米载体材料相对分子质量固定，采用基于多反应监测（multiple reaction monitoring， MRM）扫描模式的传统LC-MS/MS技术即可实现其在生物样品中的定量分析，这已是成熟技术体系。然而纳米载体材料多数为高分子聚合物，相对分子质量呈多分散性，在电喷雾质谱中离子化后会形成多电荷离子，进而产生大量的前体离子。上述生物 样品定量分析常用的MRM扫描模式，因其分辨率和扫描速度的局限，无法全面采集到聚合物的质谱信息，导致无法精准分析聚合物纳米材料。Zhou等[63] 开发了一种基于MSALL采集模式的LC-MS/MS技术。该技术采用信息独立采集方式，允许所有PEG前体 离子通过质谱第一个四极杆并进入碰撞池，在碰撞池通过施加适当的碰撞能量从而裂解产生PEG特异性碎片，利用PEG特异性碎片实现对具有多分散相对分子质量和众多前体离子的PEG的绝对定量分析 （见图5）。该项技术的主要优势包括能够全面分析聚合物，具有出色的特异性、高灵敏度和可重复性。基于该技术，Meng等[64]研究了两嵌段共聚物单甲氧基聚乙二醇-聚乳酸[monomethoxy poly(ethylene glycol)-block-poly(D，L-lactic acid)，PEG-PLA] 的大鼠体内命运，包括大鼠静脉注射后的药代动力学、 生物分布、代谢和排泄情况。该研究结果表明， PEG-PLA 原形主要分布在脾脏、肝脏和肾脏，主要通过尿液排泄，其中超过80%以代谢物PEG排出。Ren 等[65] 使用该技术研究了D-α-生育酚聚乙二醇 1000 琥珀酸酯（D-α-tocopheryl polyethylene glycol 1000 succinate，TPGS）及其代谢物PEG1000 在大鼠口服和静脉注射后的药代动力学、组织分布和排泄情况，还考察了TPGS与人肝微粒体中细胞色素 P450 的相互作用。 2.2 放射性同位素标记技术 使用放射性同位素标记技术，能够在体内对纳米材料和载体进行示踪，从而定量研究其生物分布与清除过程[66-67] ，进而评估纳米药物的治疗潜力。 Anane-Adjei 等 [68] 制备了一种经89Zr 标记的超支化聚N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺[hyperbranched N-(2-hydroxypropyl)methacry-lamide,HPMA]聚合物， 并将其静脉注射到小鼠体内，随后利用正电子发射断层扫描-计算机断层扫描（positron mmission tomography-computedtomography，PET-CT）成像技术来监测聚合物在小鼠体内的实时生物分布。Imlimthan 等[69] 开发了一种177Lu 标记的载有维罗非尼的纤维素纳米晶（cellulose nanocrystal，CNC）颗粒，并通过单光子发射计算机断层成像术（single-photon emission computed tomography，SPECT）对 177Lu-CNC 在肺转移性黑色素瘤小鼠的体内命运进行了示踪。该研究结果显示，随着孵育时间的延长，177Lu-CNC在 肿瘤细胞内的放射性增高，而在48 h后放射性降低。  放射性同位素示踪剂为医学领域提供了强大的监测工具。然而，放射性同位素示踪剂也存在一些不可忽视的缺点，主要集中在成本、安全性以及同位素标记脱落对结果准确性的影响等。 2.3 同步辐射X射线技术 同步辐射X射线技术，凭借其高灵敏度和空间分辨率来研究纳米材料的电子配置、配位几何或氧化状态的能力，已被用于分析纳米材料的体内行为[70]。Yao 等[71] 研究了[Gd@C82(OH)22]n 在巨噬细胞中的分布情况，发现[Gd@C82(OH)22]n主要分布在溶酶体 中。该技术还可以提供高分辨率的三维亚细胞定位， 观察纳米材料在完整细胞中的位置。此外，该技术可根据[Gd@C82(OH)22]n 的密度和分布情况指征纳米材料在3种不同类型的溶酶体中的细胞内转运情况。同样，具有足够样品穿透力的纳米尺度三维成像在研究细胞内纳米材料的分布方面起重要作用，其能够将细胞内纳米材料的积累情况可视化，提供了进 一步研究其生物转化行为的新方向。 3 结语与展望 过去几十年NDDSs的研发投入巨大，但仅有数十个产品上市，这在很大程度上可能归因于对 NDDSs 的体内命运缺乏最基本的认知。NDDSs在复杂生命体系中不仅存在多种形态成分，且多种形态成分之间始终处于动态平衡之中，给其体内命运研究带来极大的技术挑战。本文对近年来用于追踪 NDDSs 体内命运的分析技术进行了综述，希望能够为NDDSs的体内命运研究提供技术参考。 尽管NDDSs体内命运的分析技术已取得一定进展，但仍面临诸多挑战，如检测的分辨率、灵敏度和特异性等方面仍有待提高。此外，目前对NDDSs 体内命运的研究仍主要依赖单一技术或方法，缺乏多种技术综合应用以对其进行系统性研究。质谱具备同时检测药物、载体材料及其代谢物的能力，且具有高灵敏度和高特异性的优势。通过将质谱技术与操作简便、条件温和、分离高效的新型分离技术结合，有可能在同时定量纳米药物的游离型药物、 负载型药物、纳米载体和纳米材料方面进一步取得进展。多种成像技术如同步辐射光源、MRI、荧光成像的结合，有望实现优势互补，从而精准、实时、 动态地观察纳米药物在体内的分布和代谢过程，并从不同角度揭示纳米药物的生物分布和作用机制， 最终获得更全面、更准确的纳米药物体内命运信息。 随着纳米药物体内命运研究的不断深入，研究纳米药物与不同类型细胞（如肿瘤细胞、免疫细胞、 内皮细胞等）之间的相互作用，分析纳米药物在细胞内的分布和运动轨迹，探讨纳米药物与生物大分子之间的相互作用，深化对纳米药物与体内系统相互作用的理解。为实现这些目标，需要克服更多技术挑战， 探索和发展更为高效、灵敏和精准的分析新技术，从而更加全面、深入地揭示NDDSs的体内命运，更高效地推动纳米药物的设计与优化，最终实现纳米药物在临床应用中的疗效最大化与毒副作用最小化。 参考文献： [1] Zingg R, Fischer M. 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DOI: 10.1107/S2052252517017912. 美编排版：何裕爽 感谢您阅读《药学进展》微信平台原创好文，也欢迎各位读者转载、引用。本文选自《药学进展》2024年第10期。 《药学进展》杂志由中国药科大学和中国药学会共同主办、国家教育部主管，中国科技核心期刊（中国科技论文统计源期刊）。刊物以反映药学科研领域的新方法、新成果、新进展、新趋势为宗旨，以综述、评述、行业发展报告为特色，以药学学科进展、技术进展、新药研发各环节技术信息为重点，是一本专注于医药科技前沿与产业动态的专业媒体。 《药学进展》注重内容策划、加强组稿约稿、深度挖掘、分析药学信息资源、在药学学科进展、科研思路方法、靶点机制探讨、新药研发报告、临床用药分析、国际医药前沿等方面初具特色；特别是医药信息内容以科学前沿与国家战略需求相合，更加突出前瞻性、权威性、时效性、新颖性、系统性、实战性。根据最新统计数据，刊物篇均下载率连续三年蝉联我国医药期刊榜首，复合影响因子1.216，具有较高的影响力。 《药学进展》编委会由国家重大专项化学药总师陈凯先院士担任主编，编委由新药研发技术链政府监管部门、高校科研院所、制药企业、临床医院、CRO、金融资本及知识产权相关机构近两百位极具影响力的专家组成。 联系《药学进展》↓↓↓ 编辑部官网：pps.cpu.edu.cn； 邮箱：yxjz@163.com； 电话：025-83271227。 欢迎投稿、订阅！ 往期推荐 “兴药为民·2023生物医药创新融合发展大会”盛大启幕！院士专家齐聚杭城，绘就生物医药前沿赛道新蓝图“兴药强刊”青年学者论坛暨《药学进展》第二届青年编委会议成功召开“兴药为民·2023生物医药创新融合发展大会”路演专场圆满收官！校企合作新旅程已启航 我知道你在看哟