Sebaceous of Jadassohn Nevus

这篇文章于2025年发表在Stem Cell Reviews and Reports，全面评估了临床级MSC可扩展生产的自动化制造工艺和平台。摘要：     间充质干细胞/基质细胞（MSC）具有卓越的再生和免疫调节特性，因此在再生医学方面具有巨大的潜力。然而，它们的治疗应用需要在严格的监管标准和良好生产规范（GMP）指南下进行大规模生产，这带来了重大挑战。本综述全面评估了临床级MSC可扩展生产的自动化制造工艺和平台。分析了各种大型培养容器，包括多层培养瓶和生物反应器，它们在MSC扩增中的功效。此外，还回顾和比较了自动化MSCs生产平台，如Quantum®细胞扩增系统、CliniMACSProdigy®、NANT001/XL、CellQualia™、Cocoon®平台和Xuri™细胞扩增系统W25。我们还强调了优化培养基的重要性，特别强调从胎牛血清转向人源化或无血清替代品，以满足GMP标准。此外，还讨论了替代冷冻保存方法和控速冷冻系统的进展，这些方法为MSC保存提供了有希望的改进。总之，推进自动化制造工艺和平台对于实现基于MSC的再生医学的全部潜力和满足对基于细胞的疗法日益增长的需求至关重要。强调涉及行业、学术界和监管机构的合作举措，以加速基于MSC的疗法向临床实践的转化。1.背景介绍     间充质干细胞/基质细胞（MSC）是一种存在于各种组织中的多能成体干细胞，包括骨髓、脂肪组织和脐带。它们具有显着的自我更新和分化能力，使它们能够产生各种细胞类型，如成骨细胞、软骨细胞或脂肪细胞。此外，MSC分泌多种生物活性分子，包括生长因子、细胞因子和细胞外囊泡，有助于组织修复和再生。这些旁分泌因子发挥抗炎、抗凋亡和促血管生成作用，促进各种损伤和疾病的组织愈合。此外，使MSC对治疗应用具有吸引力的关键特征之一是其免疫调节特性。MSC已被证明可以通过抑制各种免疫细胞（包括T细胞、B细胞、巨噬细胞和树突状细胞）的增殖和功能来抑制免疫反应。这种免疫调节作用使MSC成为治疗各种自身免疫性疾病、移植物抗宿主病（GVHD）和炎症综合征的有希望的候选者。因此，MSC为再生医学、组织工程和自身免疫性疾病的治疗提供了一条有前途的途径，因此在解决未满足的医疗需求方面具有巨大潜力。     由于MSC的生产被视为ATMP（先进疗法药品），因此其应用由特定的监管框架控制。MSC生产需要符合当前良好生产规范（GMP）标准的大规模细胞扩增系统。GMP指南是由政府监管机构制定的严格法规，例如美国的食品药品监督管理局（FDA）或欧洲药品管理局（EMA），旨在确保药品（包括基于MSC的产品）的质量、安全性和有效性。考虑到基于MSC的疗法涉及事后无法过滤或灭菌的活细胞的给药，MSC生产的首要GMP先决条件是具有受控无菌和多级无菌保护解决方案的环境。洁净室设施、无菌防护服、层流罩和封闭培养系统共同参与其中，以限制空气中的颗粒数量并避免最终产品受到污染。最后但并非最不重要的一点是，训练有素、组织有序、了解制造过程的员工对于不伤害患者也很重要。      基于MSC的疗法的生产过程包括供体和MSC来源选择、细胞分离和扩增、质量控制以及扩增细胞的进一步移植等步骤。将MSC用于治疗目的的关键挑战之一是能够在保持其特性和功能特性的同时大量扩增它们。一般来说，天然组织和收集的生物材料中MSCs的初始频率非常低——据报道，骨髓中每104-105个单核细胞或脂肪抽吸物中每102-103个细胞中MSC少于或大约1个。传统的MSC体外扩增至临床相关产量（数百万至数亿个细胞）通常非常耗时、劳动密集型，并且需要大量的培养箱空间。因此，它不仅效率低下，而且还可能损害扩增的MSC的质量。重要的是，以前的研究报道了MSC在晚期传代中的增殖和分化能力下降。      MSC制造过程的另一个组成部分是最终产品的质量控制。这包括细胞活力、表型标志物、分化潜能和无微生物污染的检测，以评估制造细胞产品的纯度、特性、效力和安全性。根据国际细胞治疗学会（ISCT）的规定，MSC必须满足以下方面：（I）塑性粘附性，（II）CD105、CD73和CD90等分化簇（CD）分子表达阳性，缺乏CD45、CD34、CD14、CD11b、CD79α和人类白细胞抗原（HLA）-DR的表达，（III）在体外分化为脂肪细胞、软骨细胞和成骨细胞[9].然而，为了确保MSC的安全性和功能性，应进行免疫调节活性和基因组稳定性的额外测试。2.MSC生产平台     大规模生产临床级MSC的生物工艺策略是一个复杂的过程，对封闭和无菌环境有很高的要求。因此，MSC加工必须在符合GMP的专用设施中进行，以最大限度地降低物理屏障和空气过滤污染的风险。为了响应该领域的客户需求，一些制造商正在开发和引入用于自动和密闭细胞培养的新技术，例如量子®细胞扩增系统（TerumoBCT）、CliniMACSProdigy®（MiltenyiBiotec）、NANT001/NANTXL系统（VivaBioCell）、CellQualia™（Sinfonia技术）、Cocoon®平台（Lonza）或Xuri™细胞扩增系统W25（Cytiva）（图1）.生物反应器的利用在扩大基于细胞的疗法的可及性方面具有巨大潜力，特别是对于缺乏现场GMP合规实验室的中心。这些生物反应器为细胞培养和扩增提供了受控的环境，确保了细胞生产过程的一致性、可重复性和质量。通过使用生物反应器，没有GMP设施的中心仍然可以生产临床级细胞，从而将基于细胞的治疗范围扩大到更多患者。图1：大规模生产临床级间充质干细胞/基质细胞（MSC）的生物加工策略的复杂概述。MSC扩增平台（Quantum®细胞扩增系统、CliniMACSProdigy®、NANT001/XL、CellQualia™、Cocoon®平台和Xuri™细胞扩增系统W25）需要以下输入：样品或分离的细胞、培养基、洗涤试剂（磷酸盐缓冲盐水）、解离试剂（胰蛋白酶、TrypLE）和可选添加剂。细胞收获、质量控制（最终产品的纯度、特性、效力和安全性）、冷冻保存和产品配方等下游工艺也是临床级MSC生产的重要组成部分。     Terumo-BCT开发的量子®细胞扩增系统代表了一种利用中空纤维生物反应器的自动和闭式细胞培养的替代策略。此外，该设备以适合细胞培养过程的速率提供连续的培养基更换。生物反应器本身的面积为21,000cm2，相当于120个T-175培养瓶。值得注意的是，在细胞接种前，该生物反应器的中空纤维必须涂有粘合基材，如纤连蛋白、波形蛋白或冷沉淀物（通常来自多个供体的血液）。迄今为止，已有多达25项实验研究测试了Quantum®细胞扩增系统用于成人MSC扩增，使其成为贴壁细胞使用最广泛的生物反应器系统。此外，在比较脂肪组织来源的MSC（AT-MSC）的产量和群体倍增时，Quantum®优于基于培养瓶的手动培养，因此适用于大规模生产。此外，用人血小板裂解物（hPL）取代胎牛血清（FBS）作为生长补充剂，可显著增强AT-MSC在Quantum®内的扩增，同时保持其质量。例如，以20×106的密度加载到Quantum®中，来自骨髓的解冻MSC（BM-MSC）（在第2代）（在第2代）扩增7天，产量为100–276×106。此外，几项研究表明，能够在体外抑制T淋巴细胞活化的量子®扩增BM-MSC可以保持免疫调节功能。此外，Quantum®系统可以直接连接到任何气体及其组合，从而提供常氧或低氧微环境。Hanley等人观察到，与Quantum®和缺氧扩增的BM-MSC相比，培养瓶和常氧培养的BM-MSC的生产率较低。另一方面，加强对乳酸和葡萄糖水平的监测，再加上Quantum®生物反应器内新鲜培养基的持续供应，很可能促进了卓越的存活率和整体生长。通常，与基于培养瓶的增殖相比，Quantum®减少了所需的传代次数（减少到一半）和开放作（从54400个步骤减少到133个步骤）。此外，他们的研究还声称量子®扩增BM-MSCs在缺血性卒中大鼠模型中的治疗效果。另一项研究揭示了源自脐带组织（UC-MSC）的Quantum®制造的MSC和移植到诱导膝关节关节表面缺损小鼠身上的BM-MSC的愈合能力。采用Quantum®生物反应器系统的临床试验探索了GVHD、2型糖尿病、帕金森病、高级别神经胶质瘤、缺血性心脏病、中风和急性呼吸窘迫综合征等疾病的治疗方法。利用各种MSC类型，包括BM-MSC、AT-MSC或神经MSC，这些试验证明了使用Quantum®系统在不同剂量和给药途径下产生的细胞的安全性、耐受性和有效性。  来自MiltenyiBiotec的CliniMACSProdigy®设备利用ACC（贴壁细胞培养）工艺和适当的管路组（TS730），可实现自动MSC分离（通过骨髓样本的密度梯度离心）、接种、培养、培养基更换、繁殖和收获。Godthardt等人展示了该系统的大规模和临床级效率以及特定MSC-BrewGMP培养基的使用。此外，他们声称原代组织分离的BM-MSC以及AT-MSC或UC-MSC的单细胞悬液可以由CliniMACSProdigy®处理。此外，据报道，使用1层CellSTACK®的10天程序能够产生100多个集落，由29至5000万个MSC（第零代–P0）组成，这些集落是从马电针动员的外周血样本中分离出来的。分离的MSC具有特征性的成纤维细胞样形态和MSC表型特征。重要的是，与手动方案相比，Prodigy系统在P0收获的MSC数量显著更高，并且通过随后的手动传代提高了纯度，P3中CD73、CD90和CD105的阳性率达到95%。在制造商研究中，人骨髓单核细胞最初接种在1层CellSTACK®腔室中。然后在CliniMACSProdigy®系统内使用MSC-BrewGMP培养基洗涤、培养和扩增这些细胞，并将其扩增成三个5层CellSTACK®腔室。为了进行比较，使用T175培养瓶进行手动扩增过程。扩增14天后，CliniMACSProdigy®系统产生3.8×10⁸个BM-MSC（第2代），而手动过程在同一传代下产生4.5×10⁸个细胞，表明自动和手动方法之间的细胞数量相似。然而，平台复杂性和高耗材价格使CliniMACSProdigy®成为昂贵的制造选择，尤其是对于小规模MSC增殖。     NANT001或XL系统提供了另一个平台，在XL系统的情况下，包含一个CellSTACK®（636cm2）或两个互连的细胞培养容器（T-175和3180cm2的5层培养瓶）。与CliniMACSProdigy®不同，该系统不需要外部培养箱。另一方面，它的产能较低，但足以满足中小批量的自体生产。此外，它还允许对过程控制信息（例如温度、pH值、汇合度和细胞分离）进行智能和远程监控。NANTCartridge是一个封闭系统，由四个通过无菌连接器易于连接的部分组成[23]。Fitzgerald等人测试了NANT001系统在符合GMP的要求下生产来自健康供体的自体AT-MSC的效率。手动和自动过程同时进行，将加工后的基质血管组分（SVF）的细胞以4,000个细胞/cm2的密度放入一个636cm2的CellSTACK®培养室中。总体积为150mL的培养基由补充有5%hPL和1U/mL肝素的最低必需培养基（α-MEM）的α改良型组成。用150mL磷酸盐缓冲盐水洗涤培养样品，然后在第1天、第3天和50%汇合时更换培养基。在达到90%汇合度24小时后，用50mL重组TrypLE溶液收获扩增的细胞。来自三次验证运行的数据显示，分别持续6-8天和7-9天的手动和自动过程的细胞产量（平均2.7×107）和活力（>90%）相当。此外，两种扩增的AT-MSC都具有MSC表型特征以及与脂肪细胞和骨细胞相似的分化能力。      CellQualia™代表了另一个由Sinfonia技术设计的智能细胞处理系统。该系统使用两个细胞培养单元以及从1层到5层（CellSTACK）®和36层（HYPERStack®）腔室的自动传代，实现MSC的紧密和自动化生产。分析技术的内置过程通过对自动采集的样品进行在线（温度、CO2、形态、pH、葡萄糖和乳酸）和离线分析，确保高水平的质量控制。通过监测乳酸水平随时间的变化，可以间接评估细胞生长和增殖动力学。一旦乳酸水平达到表明最佳细胞密度的某个阈值，系统就会表明需要自动传代。此外，犬尿氨酸的积累和低水平2-氨基己二酸的维持表明细胞在整个过程中保持未分化状态。Hosoya等人证实了CellQualia™连续繁殖的MSC的塑料粘附和表型特征，这些MSC对MSC特异性标志物CD105、CD73和CD90呈阳性。然而，该研究缺乏对MSCs阴性标志物及其分化能力的评估。从2×10开始，该公司表示，在培养2次传代和6天后，MSC产量相当于1×108个细胞。     Lonza推出的Cocoon®平台旨在满足自体（患者规模）细胞疗法的生产要求。该系统使用封闭的一次性盒，为培养锚依赖性或独立细胞提供平面或体积空间。在包埋盒内，热障将温暖和寒冷区域分开，确保细胞培养（37°C）和试剂储存（4°C）的最佳条件。此外，该盒还配备了pH和溶解氧传感器，可在制造过程中实时记录数据。该平台是可定制的，易于使用，并且需要最少的作员干预，但是，目前其广泛的实施尚不清楚。     由Cytiva开发的Xuri™细胞扩增系统W25代表了细胞治疗生物工艺的飞跃。该系统采用单向WAVE™摇摆技术和各种培养体积（从300mL到25L），适用于小规模研究或大规模临床生产。WAVE™技术提供的轻柔摇动运动增强了营养物质的分布和气体交换，这是维持最佳细胞生长和活力的关键因素。专为免疫治疗中不依赖贴壁的细胞（嵌合抗原受体T细胞）的可扩展扩增而设计，但也可以参与微载体上的MSC生产。Silva等人在小体积接种到2L细胞袋的CultiSpher-S微载体上进行了UC-MSC的扩增，并在最初的24小时内保持静止。之后，在600mL培养基中的摇摆培养物中扩增UC-MSC。总体而言，该系统产生的膨胀系数范围为12.3至24.8。重要的是，摇摆培养中采用的动态条件不会对扩增细胞的质量产生负面影响，这通过各种质量控制措施（包括活力、表型保留和分化潜力）得到验证。有趣的是，另一项研究发现，在摇摆生物反应器中自发产生的MSCs聚集体表现出增加的干性、迁移特性和血管生成因子表达，从而提供了更高的治疗潜力。总体而言，Xuri™细胞扩增系统W25是一种多功能且高效的MSC扩增工具，为研究和临床应用提供了可靠的解决方案。3.细胞培养容器的放大    多层培养瓶是大规模MSC生产的重要组成部分，与传统使用的T-25、T-75和T-175培养瓶相比，其表面积更大（表1），从而减少了MSC的广泛传代培养。通常，放大涉及使用更大的生物反应器来提高生产能力，需要进行大量优化以保持更大体积的细胞质量。相比之下，横向扩展通过添加更多相同大小的生物反应器来扩大容量，确保各单元的条件一致，但需要更多的空间和资源。在放大和横向扩展之间进行选择取决于生产目标、预算和保持细胞一致性的能力等因素。如今，多层培养瓶是最有效的大规模策略之一，据报道其扩增率为100倍甚至更高。另一方面，随着细胞培养过程扩大到更大的容器尺寸，在整个生产过程中保持无菌和均一的培养环境变得越来越具有挑战性。表1.Corning和ThermoFisher不同多层培养瓶的生长面积   CellSTACK®多层培养瓶（Corning）和Nunc™CellFactory™系统（ThermoFisher）就是此类容器的示例，它们由堆叠在一起的多层细胞培养表面组成。它们都有5种尺寸，从1到40层不等，每层提供636厘米和632厘米的生长面积2。据报道，对于2室CellSTACK®，在5天的培养过程中，最终细胞产量为2.84×108（WJ-MSCs（沃顿氏果冻-MSCs）和4.69–5.65×107（BM-MSCs）。比较这两项独立研究，初始接种的细胞数量存在显着差异，范围为1000至4000个细胞/cm2，导致计算的扩增率存在195.28倍和9.22-11.10倍的巨大差异。同样，两位独立作者使用4室Nunc™CellFactory™在收获时获得了不同的细胞产量，对应于扩增的BM-MSC×7.8×108和2.5108。最后，在5腔CellSTACK®中培养牙髓来源的MSC（DP-MSC）11天，分别产生3.2×108个细胞在补充FBS和hPL的培养基中培养的108个细胞。总体而言，接种密度、培养基、某些添加剂和培养时间等细胞培养参数会影响给定系统的细胞产量。此外，康宁的CellBIND®表面处理通过增加聚苯乙烯细胞培养容器的亲水性来增强细胞粘附和生长，使其更有利于多种细胞类型。这种处理确保了一致、稳健的细胞培养条件，这对无血清或低血清培养基应用特别有益。  HYPERFlask®和HYPERStack®容器采用独特的细胞-介质环境气体交换技术，通过透气材料消除容器内的内部顶部空间。在补充有15%人AB血清的α-MEM中，以2×103个细胞/cm2的浓度接种10层HYPERFlask®（1720cm2）（共3.44×106个细胞）中，从人脐带基质（UCM-MSCs）衍生的扩增MSC能够在培养11天后产生4.5×107个细胞，相当于12.99的扩增率。HYPERStack®由Stackettes组成–一个单独的细胞培养室，由顶板和透气膜组成。每个Stackette拥有500cm2的生长面积，它们通过两个（液体和空气）歧管互连，形成一个模块，每个Stackette之间有一个露天气管空间。因此，HYPERStack®的12层和36层模块（相当于6000和18000cm2）具有与传统的2层和10层堆叠培养容器相同的体积占地面积。从而最大限度地减少培养空间，同时满足培养细胞的代谢需求。Sherman等人进行的初步数据显示，以3×103个细胞/cm2的密度接种BM-MSCs扩增5天后，可以®产生8.7亿个细胞的平均收获产量（扩增比为16.11）。      康宁®CellCube®系统为贴壁细胞培养提供了一个新颖、稳定且可扩展的平台。其模块化设计由平行的10、25或100个聚苯乙烯板组成，可在紧凑的占地面积中提供8500至85000cm2的大生长表面积。在CellCube®系统内，在每个培养板的两侧接种和培养细胞，使培养空间加倍。接种过程需要优化贴壁时间和系统的多次垂直旋转，以均匀接种细胞。此外，内置蠕动泵和一次性生物反应器可确保高效的连续流体再循环，以实现最佳的气体和营养物质输送。CellCube®系统的这种基于灌注的设计创造了一个与体内条件非常相似的环境，从而提高了细胞生产率。提供的信息概述了HEK293T和Vero细胞培养物在100层CellCube®模块中的成功扩增，展示了对培养条件的严格控制以及使用代谢物分析来确定收获时间。HEK293T和Vero细胞培养物均能有效扩增，分别×10个10个细胞的产量达到1.4和1.1。4.优化MSC生产：利用符合GMP要求的血清和无血清培养基     工艺验证是药物开发中的关键步骤，在此期间，必须仔细评估可能危及产品安全性的培养基、添加剂和材料的使用。例如，使用动物源性添加剂存在病原体传播的风险，需要进行彻底的风险分析并考虑替代添加剂。选择合适的培养基对于MSC的扩增和质量是必不可少的，尤其是在临床目的的大规模生产中。FBS作为富含生长因子和营养物质的天然补充剂，在许多实验室应用中用于细胞体外扩增，有着悠久的历史。然而，使用FBS培养旨在进一步用于治疗应用的MSC会带来重大风险，这主要是由于牛病毒、朊病毒和人畜共患病原体的潜在污染，这些物质可能会引发人类的免疫反应。在GMP级MSC生产中，利用经验证的FBS彻底检查免疫调节剂的存在，对于维持质量标准至关重要。γ辐照处理被认为是防止FBS中病毒污染的最佳方法之一，它与GMP流程一致。然而，采用无异种成分（xeno）的培养基，如富含人源物质的含血清培养基或无血清和无异种成分的培养基（SXFM），是符合GMP要求的MSC生产的最佳选择。将人类成分而不是动物衍生物加入培养基中，可确保符合细胞扩增过程的GMP指南。目前，包括人血清、脐带血血清、富血小板血浆和hPL的人源化补充剂被用作FBS的替代品（表2）。尽管自体人血清是MSC扩增的最佳选择，但获得足以产生临床相关量MSC的血清将具有挑战性。然而，来自多个供体的混合同种异体人血清可能有助于克服这一限制并促进MSC的大规模生产。尽管如此，人源补充剂（例如自体人血清）还有下一个显着的缺点，即从一个批次到另一个批次观察到的显着差异。尽管这些变化可以通过每批生产大型供体库来减轻，但它们同时也增加了可能因人类病毒而引起的感染风险。因此，这些障碍可能对大规模临床试验中MSCs的充分扩增和相关治疗效果构成重大挑战。     为了在不使用任何动物产品的情况下获得安全的人类产品，研究人员使用psoralen或核黄素灭活的hPL作为FBS的替代品，验证了在GMP条件下生产MSC。这种方法保留了MSC的多能和免疫调节能力。Mareschi等人使用hPL而不是FBS从5个骨髓样本中分离MSC。他们研究了一种新的hPL生产方法，该方法涉及用Ca-Gluconate处理血小板池以形成凝胶凝块，然后机械挤压以释放生长因子。将通过冻融循环和添加肝素获得的标准hPL（hPL-E）与新的hPL（hPL-S）没有血小板或纤维蛋白原，但含有相似数量的蛋白质和生长因子。hPL-S需要更少的生产步骤来符合GMP条件，保持干细胞标志物，并显示出显着差异，例如HLA-DR表达较低，使其成为MSC生产的有效替代方案。目前，有几种市售的病毒灭活GMPhPL以及最终的商业产品，如人血小板裂解物（生命科学生产）、血小板裂解物MultiPLi（Macopharma）和PLUS™GMP级（CompassBiomedicalInc）。此外，与hPL相关的污染风险得到有效管理。例如，自2018年以来，法国的所有血小板浓缩物都经过补骨脂素处理，以降低微生物污染的风险。另一种消除潜在病原体的方法是在使用hPL之前对其进行伽马射线照射[57]。然而，与hPL产品生产相关的一个重大限制是必须确保血小板供体的充足供应。管理符合GMP的培养基的补充选择是使用合成的、化学成分明确的培养基，例如BDMosaic™间充质干细胞无血清（BDBiosciences）、MesenCult-XF™（StemCellTechnologies）、MSCNutriStem®XF（生物工业）、无血清成分确定的细胞培养物（TNCBioBV）等。上述培养基的成分仅由已知化合物组成，使其成为FBS的潜在可取替代品。尽管如此，它们特别适用于研究目的，因为它们需要不断开发和改进以维持关键的细胞功能，例如粘附、分化、免疫调节和其他基本过程。用于优化和可重复的MSC生产的下一组培养基是具有高质量成分的无血清、无异种成分配方，例如MSC-BrewGMP培养基（MiltenyiBiotec）和StemProMSCSFMXenoFree™（Invitrogen）等。然而，化学成分明确的培养基的一个关键限制是由于缺乏附着因子，MSC增殖缓慢或有限，以及细胞对底物的粘附不足。因此，使用某些培养基需要在塑料表面预涂特定物质，以确保最佳的细胞附着和生长。另一方面，补充人血浆衍生物的StemProMSCSFM™（LifeTechnologies）等培养基对于无包被的MSC培养来说并不是最佳。MSC-BrewGMP培养基（MiltenyiBiotec）是市场上唯一一种符合GMP要求的SXFM，因为它是袋装的，用于封闭系统培养，不需要表面涂层。最常用的分子，如纤连蛋白、层粘连蛋白和肽，用于表面改性，通过引入正表面电荷来促进细胞生长，从而增强粘附力。表2：用于 GMP 级 MSC 生产的培养基     比较补充动物或人血清的不同培养基类型与无血清培养基（SFM）的效果，可得出对MSC特性的显著结果。Dreher等人证明，与在10%FBS中培养的AT-MSC相比，在补充有10%人血清的培养基中培养的AT-MSC在应用后在非肥胖糖尿病免疫缺陷小鼠肺和肝脏中的存在减少。总之，在人血清存在下培养的AT-MSC在特异性粘附和细胞外基质相关分子的下调方面表现出有趣的变化。他们认为整合素α6（CD49f）表达的降低可能与对层粘连蛋白的粘附减少有关。尽管如此，减少间充质干细胞在肺部的滞留可能会降低肺栓塞的风险。细胞扩增培养基的选择在影响MSC的增殖动力学等特性方面起着关键作用。多项实验研究揭示了各种培养基类型对MSC特性和培养动力学的显着影响。Wuchter等人进行了一项比较分析，研究了三种符合GMP的培养基对MSC扩增的影响：补充有10%混合hPL的基础培养基（Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）-低葡萄糖）、StemPro®MSCSFMCTS（Invitrogen）（用于人离体组织和细胞培养加工应用）和补充有10%FBS的非XFMSCGM™（Lonza）（仅供研究应用）。最显着的差异出现在延长培养（50天）后BM-MSCs的大小和增殖动力学。StemPro®MSCSFMCTS显著促进了生长，与其他MSC相比，产生的MSC具有更小但高度均匀的形态。在hPL培养基中培养的BM-MSCs表现出明显的突起，但与在含有FCS的MSCGM™中培养的BM-MSC相比更小。然而，与在MSCGM™中培养相比，用hPL培养基培养的MSC观察到的生长增加略大。血小板裂解物对MSCs扩增的促进也与其他研究的结果一致。此外，Poloni等人证明，在含有10%混合同种异体人血清的Iscove改良Dulbecco培养基中培养的CD271阳性BM-MSC与在补充动物血清的培养基中培养的培养基相比，表现出相当的分化能力以及表面和基因标志物的表达。此外，未观察到核型改变。他们还证明，使用CD271选择的细胞和混合的同种异体人血清，仅30天内从5mLBM抽吸物中细胞产生显着增加到临床显着水平（10×10^8MSC）[66]。此外，SFM的使用也对MSC的特性产生了显着影响。例如，PRIME-XVSFM（IrvineScientific）已被证明可以增强人BM-MSC中的集落形成能力，提高成骨潜力，并增加群体倍增。因此，它是动物血清的优质替代品。尽管基于FBS的培养基和PRIME-XVSFM的渗透压相似（分别为0.31和0.29Osmol/kg），但SFM更接近人类生理条件，因此被认为对细胞有更好的影响。此外，Aussel等人证明，SXFM，特别是MSC-BrewGMP培养基（MiltenyiBiotec），显著影响MSC的克隆形成效率。具体来说，与传统的AT-MSC和BM-MSChPL培养基相比，SXFM条件下的菌落大小和密度增加。     值得注意的是，用于收获和分离用于临床应用的MSC的其他补充试剂也必须满足所有安全标准。目前，大多数临床研究使用猪来源的胰蛋白酶进行细胞分离制备。然而，为了优化该程序，使用TrypLE（Gibco，ThermoFisherScientific）或TrypZean（Sigma-Aldrich）等重组胰蛋白酶是有利的，因为它们对细胞的影响更温和，并且与猪来源的胰蛋白酶相比不存在异种蛋白。对于GMP条件下的酶组织消化，建议使用GMP级胶原酶而不是I型胶原酶，因为后者可能含有可能携带传染源的成分。出于这些目的，例如，源自溶组织梭菌的胶原酶NB6GMP级（NordmarkBiochemicals）是一种用于分离干细胞的高纯度组织解离酶。它包含具有酶活性的蛋白质，包括I类和II类胶原酶、中性蛋白酶和梭菌蛋白酶。0.4PZU/mL胶原酶NB6的最佳浓度和3h的消化时间表明，在第0代时，沃顿胶溶胶衍生的MSC产量更高。此外，其他类型的胶原酶也用于组织消化：CLSAFA（Worthington）和LiberaseMTF-SGMPGRADE（Roche）。另一方面，胰蛋白酶和胶原酶的另一种替代替代品是Accutase（Life Technologies），它是蛋白水解酶和胶原水解酶的混合物。然而，离心、过滤或微碎裂等机械作提供了避免与胶原酶使用相关的安全问题的替代方法。根据迄今为止收集的数据，来自骨髓、脂肪组织和脐带的MSC是临床试验中最常用的细胞来源。然而，AT-MSC在大规模生产中具有优势，因为与来自同一供体的BM-MSC相比，AT-MSC在长时间培养过程中具有增强的遗传和形态稳定性，并且增殖更快。此外，AT-MSCs在25次传代后表现出分化潜能降低，而BM-MSCs的免疫抑制作用仅在7次传代后观察到下降。5.临床条件下MSC的冷冻保存     细胞或组织在细胞疗法中的应用导致了治疗获得性或遗传性疾病的新型药物的诞生。这些是已知的ATMP，被定义为主要生物作用由细胞或组织执行的治疗产品。冻存保存仍然是延长细胞（包括MSC）保存时间的唯一技术。它有助于维持细胞功能特性，并允许细胞聚集以达到临床使用所需的数量。与成骨细胞和软骨细胞等特殊细胞的冷冻保存相比，MSC必须考虑更多因素。具体来说，评估MSC冷冻保存后的免疫调节和多系分化能力、细胞活力和表型至关重要。如果这些能力受损，MSC可能无法保持原有的免疫调节和再生特性。冷冻保护剂      冷冻保护剂是能够防止生物物体遭受冰冻损伤并确保其解冻后存活的试剂。冷冻保护剂在冷冻过程中的保护作用基于它们与细胞内外的水分子形成牢固键的能力，这比水分子本身之间的键更强。此外，它们还可以降低盐浓度，最大限度地降低破坏细胞蛋白质结构的风险。低温保护剂还与膜的结构部件粘合，保护它们免受冰晶的损坏（图2）。图2：细胞冻存机制作为基于细胞的疗法生产的关键步骤。在冷冻保存过程中导致细胞损伤的过程涉及特定的机制。为了防止这种伤害，必须在细胞悬液中添加适量的适当冷冻保护剂（CPA）并应用最佳冷却速率。      已经开发了各种技术来冷冻保存MSC，例如慢速冷冻和玻璃化。但是，这些方法有局限性。首先，即使使用冷冻保护剂（CPA），使用这些方法保存的MSC仍然存在冷冻损伤的风险。其次，二甲基亚砜（DMSO）等CPA可能会无意中诱导MSC分化为神经元样细胞。为了解决这些问题，需要优化CPA的使用或开发新的冻存方法。微/纳米技术的最新进展提供了有希望的改进，有可能提高冷冻保存的效率并克服当前方法的局限性。在高度疏水性的纳米粗糙表面上冷冻封装在纳升液滴中的细胞以及创建无毒的纳米级生物启发CPA等创新是该领域特别有前途的进展。     已建立的MSC冻存方案使用DMSO。残留的痕量DMSO，即使在洗涤步骤之后，也会对患者造成重大不良反应的风险。此外，DMSO与异常基因表达和MSC分化有关。因此，开发一种不含DMSO的MSC冻存方法是非常可取的。海藻糖、植物蛋白和防冻蛋白模拟物等物质已与降低浓度的DMSO相结合，以改善MSC冻存。这些组合成功地抑制了冰的再结晶，并保护了细胞膜，类似于天然防冻蛋白。目前有几种市售的冷冻保存选项用于MSC的冷冻保存。     CryoStor®CS2、CS5和CS10是市售的GMP级冻存培养基，设计用于优化细胞和组织在−80°C至−196°C的超低温环境中的保存。这些制剂在冷冻、储存和解冻过程中提供保护环境，增强细胞活力和功能，同时无需血清和高细胞毒性试剂。CryoStor专门处理细胞的分子生物学方面，减少冻存诱导的延迟性细胞死亡，从而提高解冻后活力，特别是对于MSC和肝细胞等敏感细胞类型。该产品线包括CryoStorCS2（2%DMSO）、CS5（5%DMSO）和CS10（10%DMSO）。冻存过程涉及关键步骤。最初，通过机械或酶解离制备细胞，然后离心以产生细胞沉淀。去除上清液，同时尽量减少培养基稀释。然后加入CryoStor冷培养基，使其浓度达到0.5-10×10^6个细胞/ml，在2-8°C下孵育约10分钟。以每分钟-1°C的受控速率将温度降低到-80°C，在此温度下保持15-20分钟，然后在-5°C左右开始冰成核，从而开始成核。或者，样品可以在−20°C下保存2小时，然后在−80°C下保存。冷冻后，它们可以在低于-130°C的液氮中储存，或在-80°C的温度下短期储存。解冻至关重要，应在37°C水浴中迅速解冻。解冻后，细胞-CryoStor混合物需要用培养基在20–37°C下稀释。解冻后活力应在24小时后使用活/死荧光测定或MTT等代谢测定进行评估，以仔细比较与非冷冻对照的准确性。      Ho等人提出了一项研究，其中犬AT-MSC被修饰为过表达治疗性转基因，用CryoStor10冷冻保存长达11个月。结果表明，冻存不会影响转基因表达、细胞活力或迁移能力。值得注意的是，解冻的MSC表现出与新鲜MSC相当的细胞毒性，可有效治疗患有癌症的犬患者，并导致超过20个月的无进展生存期，突出了冻存MSC在临床应用中的可行性。此外，将马MSC冷冻保存在CryoStor®CS10中，并评估其在小马体内的活力。Williams等人的研究涉及在模拟冷藏运输后和解冻后立即通过静脉注射这些MSC，并监测临床和血液学变化。结果显示没有不良反应或血液参数偏差。注射后CD4+和CD8+淋巴细胞群增加，表明可能存在免疫反应。CS10有效地维持了MSCs的活力。有必要进一步研究以探索与不同MSCs供体的免疫相互作用。      最近的一篇论文比较了两种冷冻保护剂：STEM-CELLBANKER™（CB）和10%DMSO，均在无异种成分培养基中，用于AT-MSC和BM-MSC。与非冻存MSC相比，两种冻存保护剂都保持了相似的细胞形态和表面标志物表达。然而，冷冻保存的AT-MSC与CB（90.4%）相比于DMSO（79.9%）具有更好的活力。虽然在CB和非冻存条件下，AT-MSC的群体倍增时间相当，但使用DMSO时略有增加。BM-MSC显示两种冷冻保护剂的倍增时间更长。重要的是，两种MSC类型在冷冻保存后都保留了其分化能力。总之，CB比DMSO更能保持AT-MSC的特性，这可能会影响细胞治疗应用。据制造商称，STEM-CELLBANKER®DMSOFREEGMP级是一种创新的冻存解决方案，旨在保存不含DMSO的各种细胞类型。其配方符合JPN、EU、US和PIC/S的GMP指南生产，不含血清、动物源性成分和DMSO，减轻了对研究至关重要的纯度的担忧。STEM-CELLBANKER®DMSOFree可显著提高细胞活力，同时保留细胞多能性和解冻后有效增殖等关键特性。该解决方案提供了卓越的批次间稳定性，确保了批次间性能的一致性。制造商还声称用户会喜欢它的便利性，因为它不需要准备;细胞可以直接在-80°C下冷冻，从而简化了冻存工作流程。它还在美国FDA药物主文件中注册，允许客户申请监管提交授权书。总体而言，该产品代表了那些寻求无DMSO解决方案的人在低温保存方面的重大进步。      人脐带（UC）是MSC的一个有前途的来源，尽管被归类为实体组织，但UC具有单个供体的多种用途等优势。然而，以前使用动物或同种异体血清的冻存方法导致冻融UC-MSC中的细胞增殖较低。Shimazu的研究团队使用无血清和无异种成分的冷冻保护剂STEM-CELLBANKER建立了一种最佳的冷冻保存技术。经过缓慢的冷冻过程和随后的解冻，保存的UC产生的MSC保持了与新鲜细胞相当的典型表型、免疫抑制能力和分化潜力，证明了临床活力。冻存方法和可用系统      冻存MSC有两种主要方法：慢速冷冻和快速冷冻/玻璃化。缓慢冷冻的速率为1°C/min，因其污染风险低且更易于加工而受到诊所和研究实验室的青睐，允许在一个含有低浓度CPA的小瓶中冷冻大量MSC。尽管存在冻伤风险，但优化CPA的使用对于防止冰晶形成至关重要。玻璃化反应涉及使用液氮将细胞悬液从水相快速转化为玻璃态，需要多摩尔CPA混合物和逐步引入，以尽量减少化学毒性。然而，它有渗透损伤的风险，并且由于需要人工作和高技能，不太适合大体积处理。     开发了一种新的低温保存方案，使用甜菜碱和电穿孔。甜菜碱是一种天然的渗透保护剂，稳定、无毒且高度亲水性，这使其能够竞争性地结合水分子并防止结冰。电穿孔被广泛接受用于将非渗透性分子输送到细胞中，在电刺激下在细胞膜上产生临时的疏水孔，允许分子通过。这种联合方法在各种MSC类型中表现出普遍适用性，并在各种MSC类型中保持较高的解冻后细胞活力，包括人源性UC-MSC、小鼠源性BM-MSC和转基因UC-MSC。     对于同种异体“现成”临床应用，需要大量的冷冻MSC。高细胞浓度的冻存可最大限度地减少DMSO输注量，从而降低输注相关毒性。使用CellSeal®冻存管，将1000万个/mL的细胞用5%DMSO冷冻至-80°C，并储存在液氮中。使用该系统冷冻的AT-MSC在解冻时显示出高功能活力。该系统可轻松进行床旁解冻和给药，残留DMSO极少，无需细胞洗涤。未来的研究将检查解冻后AT-MSC在体内的植入潜力。     在表3中，我们列出了用于MSC冻存的控速冷冻系统的市售选项。这些先进的冷冻系统在确保MSC在冷冻保存过程中的活力和功能方面发挥着至关重要的作用，允许受控的温度曲线，防止冰晶的形成并保持细胞完整性。该表提供了各种型号的详细信息，包括其规格、特点和典型应用，可帮助研究人员和从业人员在为其MSC冻存需求选择合适的设备时做出明智的决定。表3.用于MSC冻存的市售受控冷冻系统概述      关于MSCs悬液的冻存，必须专注于标准化细胞培养质量的评估。特别是，冷冻保存前后评估标准的一致性至关重要。通过比较冷冻前后的相似指标，我们可以准确确定冷冻保存对细胞培养的影响。此外，重要的是要认识到细胞培养物在冷冻保存后必须经过修复或驯化过程。几项研究表明，如果没有这个适应阶段，就无法完全恢复冷冻保存的干细胞的治疗潜力。     重要的是要认识到，各种复杂的基于细胞的产品可能有很大差异，这意味着单一的冻存方案可能并不适合所有产品。因此，为每个产品创建单独的协议会使标准化工作复杂化。因此，基于复杂生物医学细胞的产品的冷冻保存是一个具有挑战性和争议性的问题。然而，研究表明，这个概念是可以实现的，值得进行更深入的调查。阻碍冻存标准化的另一个方面是实验室之间技术设备的显著差异。通常，每个实验室都会根据其特定的技术能力和可用试剂来建立其冻存方案。因此，需要一种综合方法来标准化冷冻保存过程。尽管如此，编制通用指南以增强冷冻保存过程，最大限度地减少对细胞的压力应该是可行的。作者希望这篇综述有助于组织和选择冷冻保存MSCs、含MSCs的组织和相关生物医学细胞产品的方法。6.结论     当前用于生产临床级MSC的大规模扩增平台的一个局限性是不同系统和方法之间的细胞产量和质量的差异。虽然已经开发了各种生物反应器和培养容器来满足放大生产的需求，但在培养条件、细胞处理技术和质量控制措施方面仍然缺乏标准化。这种可变性会导致最终产品不一致，从而影响其治疗效果和安全性。此外，与其中一些平台相关的复杂性和成本可能会限制其广泛采用，尤其是在资源受限的环境中或小规模的生产需求中。     展望未来，应将工作重点放在标准化方案和优化大规模扩增平台上，以确保临床级MSC生产的可重复性、一致性和成本效益。这可能涉及开发更加用户友好的模块化系统，以便无缝集成到现有的制造过程中，以及实施先进的监测和控制技术，以确保对培养条件的精确调节。此外，需要继续研究新型培养基底物、培养基配方和生长因子，这些物质可以增强细胞增殖、维持干性并促进治疗效力。MSC的冷冻保存对于在临床应用中保持其活力和治疗潜力也至关重要。虽然DMSO通常用作冷冻保护剂，但它存在毒性和不必要的分化等风险，这促使开发了替代冷冻保存方法和试剂以及市售的GMP级冷冻保存培养基。此外，受控速率冷冻系统的进步提高了MSC解冻后的活力。涉及工业界、学术界和监管机构的合作倡议对于加速基于MSC的疗法从实验室到临床的转化至关重要。最终，应对这些挑战和提高大规模生产能力对于实现基于MSC的再生医学的全部潜力和满足对基于细胞的疗法日益增长的需求至关重要。识别微信二维码，添加抗体圈小编，符合条件者即可加入抗体圈微信群！请注明：姓名+研究方向！本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

流感仍然是全球严重的健康问题，每年导致大量发病率和死亡率。疫苗接种对于减轻其影响至关重要，但需要快速有效的生产策略来处理时间和供应问题。该领域传统上依赖于基于鸡胚的生产，现已见证了向基于细胞培养的方法的范式转变，该方法提供了更高的灵活性、可放大性和工艺安全性。本综述简要概述了可用的细胞基质和技术进步。我们总结了实现工艺强化的关键步骤 - 从滚瓶生产到基于载体的动态培养，从批次模式的悬浮培养到使用各种细胞截留装置的高细胞密度灌流。此外，我们比较了一次性系统和传统系统，并讨论了包括缺陷性干扰颗粒在内的挑战。总之，我们描述了当前基于细胞培养的流感病毒生产的最新技术，以可持续地满足疫苗需求，保证及时供应，并应对季节性流行病和全球大流行的挑战。 流感等呼吸道疾病仍然是全球严重的健康和经济负担。多种流感疫苗接种方式，包括灭活 (IIV)、减毒活 (LAIV) 和重组 (RV) 疫苗均已获许可，并构成全球流感预防战略的基石。此外，基于核酸的平台技术正在开发中。通常，流感疫苗被设计为一种/两种甲型和乙型流感病毒 (IAV、IBV) 毒株的三价或四价组合物，符合国际卫生组织的年度建议。传统上，生产基于将目标毒株注射到受精鸡蛋中而使其复制的过程。这种方法虽然被广泛使用（约占全球 IIV 生产能力的 84.5%），但其耗时长，容易受到鸡蛋供应短缺的影响，并且废物处理也存在困难。相比之下，基于细胞的生产提供了更快的时间线、更好的抗原匹配和效力、更好的可放大性，并且不依赖于鸡蛋的供应，因此，人们对基于细胞培养的方法的转变兴趣日益浓厚，这是因为需要更高效、更灵活的生产平台来满足全球需求并应对短缺。 基于细胞培养的流感疫苗的早期开发可以追溯到 20 世纪中叶，当时有越来越多的连续细胞系可用，并且已经实施了一些用于生产动物疫苗的创新。但直到 21 世纪，生物工艺技术的重大进步才使其广泛用于人类疫苗。静态细胞培养最初用于小规模生产，为生物反应器设计、培养基配方和工艺优化的后续创新奠定了基础。静态培养的固有局限性，包括低细胞密度批次工艺以及有效规模放大的障碍，促使人们探索动态培养系统，以提高生产力和可放大性。细胞系适应悬浮生长、设计细胞系的建立以及培养基配方的改进方面的同步进步最终产生了高产生产系统，并允许进一步优化工艺和强化措施，以提高生产力、可放大性和工艺稳健性。图1以 MDCK 细胞为例，概述了 IAV 细胞培养工艺中的技术进步及其应用。通过实施高细胞密度 (HCD) 培养策略，可以克服传统批次工艺的局限性。特别是，补料分批和灌流策略的实施带来了一些工程挑战，这些挑战近年来已得到有效解决。 图 1. 使用 MDCK 细胞进行细胞培养的流感病毒生产工艺的技术进步。传统的基于鸡蛋的工艺自 20 世纪 40 年代开始出现（红色箭头）。从 1958 年 Madin 和 Darby 从一只健康可卡犬的肾脏中首次分离出 MDCK 细胞开始，基于细胞培养的生产方式多种多样。培养基开发的进步以及 MDCK 细胞对悬浮生长的适应为建立更高效、更强化的工艺提供了可能性。对于依赖悬浮细胞系的灌流工艺，生物反应器系统与细胞截留装置相连，该装置可以是基于膜的，也可以是倾斜沉降器（重力）或声学过滤器。自千禧年以来，基于 MDCK 细胞的工艺已获准用于生产人类流感疫苗（蓝色箭头）。BR：生物反应器；CSTR：连续搅拌罐反应器。 下面，我们将介绍可能鼓励进一步工艺开发的关键步骤和创新，从而建立流感病毒生产的上游工艺，提高工艺效率、疫苗效力并降低生产成本。我们将介绍合适宿主细胞系的识别和选择、使用静态培养的早期生产方式、向悬浮培养的过渡以及涉及贴壁和悬浮细胞系的工艺强化选项。我们探讨技术进步的基本原理以及每种方法面临的挑战。此外，我们还将讨论一次性 (SU) 相对于传统不锈钢 (SS) 技术的适用性。通过了解开发和生产的新模式，我们可以发现进一步优化和创新的机会，以满足不断增长的疫苗需求并提高全球可及性。 本综述的重点将放在基于哺乳动物和禽类细胞培养的流感病毒生产上；植物和昆虫细胞不予考虑。当然，重要的是要认识到优化上游工艺只是疫苗生产的一个方面。疫苗生产过程中的下游工艺、混合和制剂阶段同样至关重要。虽然整个过程的重要性已经得到认可，但本文不会进一步讨论这些方面。 基于细胞培养的流感病毒生产 开发基于细胞培养的流感病毒生产工艺的关键是选择合适的宿主细胞系，该细胞系可以支持有效的病毒复制并满足监管要求。细胞系通常配有推荐的生长培养基，支持贴壁或悬浮细胞生长，但可以基于此进行调整和优化。成分是关键，可确保营养物质和必需因素的平衡，从而实现快速细胞生长（倍增时间少于 30 小时）以及高病毒复制。传统上，细胞在含血清培养基 (SCM) 中培养，因为它提供所有必需的生长因子和营养素。然而，血清容易引起批次间差异，如今需要无动物成分的工艺，以最大限度地降低外来因子污染的风险。因此，包括无血清培养基 (SFM) 或化学成分确定培养基 (CDM) 在内的现代培养基更受青睐，因为它们能提供更安全、更一致的性能。然而，要在这些培养基中实现相当的细胞生长和病毒产量，需要仔细优化配方并补充生长因子。由于培养基有 40 多种不同的成分，设计培养基成为一门艺术。因此，即使没有针对预期工艺进行完全优化，也会使用和组合现有的“现成”培养基。根据细胞的成分和代谢，这可能导致不良的次级副产物（如氨和乳酸）积累到对细胞生长和病毒生产产生不利影响的浓度。此外，细胞系、培养模式和系统决定了各种工艺参数的最佳设计空间，这些参数应在整个过程中得到严格控制。我们小组之前总结了关于选择适当的工艺参数和基于细胞培养的病毒生产的强化策略的一般考虑因素。对于流感病毒，温度通常保持在 32°C 至 37°C 之间，pH 值保持在 7.2 至 7.6 之间，溶氧浓度保持在 30% 以上。感染时，通常会将种子病毒与蛋白酶（如胰蛋白酶）一起添加，以增强病毒进入细胞的能力。必须仔细调整蛋白酶的浓度和活性，以确保病毒复制达到最佳状态，而不会引起过度蛋白质消化，导致贴壁细胞培养中的细胞脱落甚至细胞死亡。同样重要的是种子病毒的制备，要考虑到对特定细胞系的潜在适应性，并确保感染性颗粒与非感染性颗粒的比例较高。虽然众所周知，病毒在鸡胚中繁殖会导致抗原编码基因发生突变，从而对疫苗有效性产生不利影响，但在使用 MDCK 细胞的序列分析研究中未观察到细胞特异性适应性突变。这里，在 MDCK 细胞中传代的种子病毒代表了在人类中分离的病毒。通常，种子病毒的传代次数限制为五次。虽然细胞特异性适应需要 2-3 个步骤，但仍有扩大规模的空间。尽管如此，我们清楚地看到，在大规模生产过程中，需要通过测序和抗原表征持续监测种子病毒的遗传稳定性。CGE-LIF（激光诱导荧光检测毛细管凝胶电泳）是一种非常有效和可靠的工具，可用于监测从种子病毒到最终收获甚至下游纯化的聚糖组成。 流感病毒的最佳收获时间通常是感染后 36 至 72 小时，此时病毒滴度达到峰值。然而，这可能因所用的细胞系、工艺参数和病毒株而异。特别是对于流感病毒生产，种子病毒输入不仅对复制速度起着关键作用，而且对缺陷干扰颗粒 (DIP) 的出现也起着关键作用。因此，感染复数 (MOI) 通常在 10 到 10^−5之间，需要根据研究目的仔细考虑。 下面，我们将概述目前基于细胞培养的流感病毒生产的最新技术，首先关注细胞系的选择，然后详细阐述工艺策略选项，最后讨论（一次性）培养系统的选择。 用于生产流感病毒的贴壁细胞和悬浮细胞 目前，尚无普遍适用的基于细胞培养的病毒生产解决方案或平台工艺。这种限制主要源于病毒能够有效感染的宿主物种数量有限，这一特性称为宿主范围。此外，不同宿主细胞系的病毒产量可能有很大差异，并且由于对疫苗安全性（即致瘤性和外来因子）的要求很高，细胞系可能不符合疫苗生产的条件。因此，历史上已建立但往往表现不佳的细胞系仍被广泛使用，需要对疫苗生产监管机构批准的宿主细胞进行系统的细胞系筛选，以选择理想的候选细胞。鉴定是一项劳动密集型的挑战，需要克服多个障碍，包括培养基选择、培养模式和工艺条件。此外，由于知识产权和许可问题，潜在细胞系的商业用途甚至学术用途往往受到限制，这也可能限制筛选选项。除了病毒产量和工艺生产率外，还应考虑疫苗产品的抗原匹配和免疫原性，因为多项研究可能表明生产系统（鸡蛋或特定细胞系）的依赖性存在明显差异。最佳宿主细胞系的选择标准此前已有阐述，并且，适合生产流感疫苗的候选宿主细胞已经在之前的文章中接受了彻底的回顾。到目前为止，已经对使用多种来源的传统或设计细胞系（例如 MDCK、Vero、HEK293、AGE1.CR、PER.C6、EB66、CAP、DuckCelt-T17 或 PBG.PK2.1 细胞）来生产流感病毒进行了评估。尽管这些候选宿主细胞系具有多种优势，但只有有限数量的细胞系经过鉴定并用于生产基于细胞培养的流感疫苗，包括用于 IIV 和 LAIV 的 MDCK 和 Vero 细胞以及用于 RV 的 Sf9 衍生细胞。行业专有数据和这种选择性使用背后的决策过程并未向公众披露，这也限制了我们对为什么最终选择某些细胞系进行疫苗生产的理解。从学术角度来看，我们可以假设存在一些障碍，包括监管部门的批准、既定的生产方案、首次上市决策和成本效益。 表 1. 已获批的、基于动物细胞培养的流感疫苗概况。 通过直接比较，Genzel 等人阐明了贴壁性 MDCK 或 Vero 细胞是否是最适合生产流感疫苗的细胞基质的问题。尽管在优化的小规模条件下（滚瓶、T 瓶），上清液中两种病毒滴度相似，但 MDCK 细胞在使用微载体的生物反应器（波浪生物反应器和搅拌罐生物反应器 (STR)）中表现更佳。随着先进的培养基开发和细胞系工程的发展，现在有各种悬浮 MDCK 细胞，为生物工艺操作和可放大性提供了巨大优势。相比之下，Vero悬浮细胞的开发则是一项更具挑战性的任务，多个研究小组为此已经投入了30多年的时间。迄今为止，报道的最大细胞密度高达 8×10^6 cells/mL；然而，这仅在摇瓶培养 13 天并更换三次完全培养基时才能达到；否则，在批次培养中仅可达到约 2×10^6 cells，在 3 L 生物反应器灌流培养中可达到 6.8×10^6cells。此外，超过 40 小时的倍增时间和频繁形成聚集体仍然是重大问题，从而限制了高效或强化工艺的选择。因此，MDCK 细胞在工业生产中占主导地位。 表 2. 用于 IAV 生产的 MDCK 细胞系概况。 MDCK 细胞在流感病毒生产中的作用 早在1958年，SH Madin和NB Darby就从健康可卡犬的肾脏中分离出MDCK细胞，几年后将其保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)。MDCK 细胞系非常适合作为极化细胞的模型，因此成为细胞生理学和病毒学研究中研究最广泛、特征最明确的上皮细胞系之一。全球领先的研究机构已使用贴壁 MDCK 细胞分离和复制人类流感病毒，主要用于流行病学研究和诊断目的。除此之外，MDCK 细胞也在基于细胞培养的流感疫苗生产中占据主导地位，因为它们对所有流感亚型均有效，并能产生高滴度的各种毒株。因此，自上个世纪末以来，人们一直在努力利用 MDCK 细胞代替鸡蛋来生产人类流感疫苗，并进行了广泛的安全性分析，以排除对致瘤性和致癌性的担忧。 此外，学术界和工业界都在努力提高细胞特异性病毒产量 (CSVY) 和总体生产力。这些努力包括使细胞驯化悬浮生长而不是贴壁在微载体或培养瓶表面，这可以通过用人类siat7e基因转染贴壁的MDCK细胞或遵循先进的培养基开发来实现。此外，还采用了提高细胞密度的策略、实时监测病毒感染动态，以便及时收获病毒、开发多尺度模型以改进过程理解、或通过基因操作获得主要表达人类流感受体的细胞系。最后，选择高产细胞克隆对于提高上游生产过程中的生产效率具有巨大潜力。这似乎尤为重要，因为 MDCK 细胞表现出巨大的细胞间异质性，包括形态、电生理和生化特性、碳水化合物表达、以及最重要的病毒生产能力。这里，单细胞水平的研究可以阐明子代病毒产量和细胞内病毒 RNA 水平高达约 1,000 倍的差异。揭示这种异质性背后的主要驱动因素的工作尚未得出简单的答案。然而，最近的转录组分析表明，抑制宿主细胞功能以转移细胞资源与维持足够的病毒复制活动之间的平衡是一个相关因素。得益于多个学术和工业研究小组的不懈努力，目前已获得了几种具有不同特性的 MDCK 细胞系，其中大多数细胞系源自保藏在 ATCC 的 CCL-34 细胞系。 涉及贴壁细胞系的工艺 如今，在许多生物工艺环境中，悬浮细胞比贴壁依赖型细胞更受青睐，因为它们能够支持高细胞密度生长、规模放大、灵活性、成本效益和过程控制选项。然而，悬浮细胞并不总是可用的，对于某些细胞系来说，调整或改造它们，以支持悬浮生长仍然是一项挑战。由于涉及此类贴壁依赖型细胞的工艺总是受到可用表面积的限制，过去人们进行了大量工作来优化生产，以实现最高效率。这可以通过 T 瓶、滚瓶、细胞工厂或固定床反应器内的表面积或使用的微载体数量来确定。其中一些静态细胞培养系统不仅表面积有限，而且缺乏过程控制选项。虽然可以在滚瓶等中实现适当的培养基混合和气体扩散，但无法控制 pH 值和 pO2 等关键参数。然而，在极少的操作人员干预下，病毒生产很容易产生高滴度。在之前的研究中，滚瓶中贴壁的 MDCK 细胞产生了 1.0 × 10^9 PFU/ml 的 A/PR/8/34 (H1N1)。尝试在培养基中使用丙酮酸代替谷氨酰胺来缓解氨的积累，从而优化这种静态生产过程，但并未显著提高产量。相比之下，载体技术的实施已经可以帮助缓解表面限制，并在占用空间较小的情况下获得更多的过程控制。在批次模式下，MDCK 细胞的细胞密度已达到 3.2 × 10^6 cells/mL，微载体浓度为 2 g/L，在 SFM (A/PR/8/34 (H1N1)) 中产生的最大病毒滴度为 2.9 log10 (HAU/100 µL)。与搅拌罐生物反应器（2 g/L Cytodex 1, 2 L 规模）相比，波浪生物反应器的实施允许更高的细胞密度和更好的贴壁，然而，最大滴度仍在 3.3 log10 (HAU/100 µL) 范围内 (A/PR/8/34 (H1N1))。使用重复补料分批策略，12.5 g/L Cytodex 1 可实现11.2 x 10^6 cells/ml的高细胞密度，产生2.8 log10(HAU/100 µL)，在灌流中，在5.5 x 10^6 cells/ml (10.5 g/L Cytodex 1)的最高细胞密度下，总病毒滴度甚至可以达到 3.3 log10 (HAU/100 µL)。尽管微载体培养比静态培养具有多种优势，但剪切力、灭菌和清洁程序的需要可能会限制其使用。此外，并非所有细胞在 SFM 中培养时都表现出良好的附着力。或者，在填充床生物反应器中，细胞被固定在生物反应器内松散填充的基质上，这提供了较大的表面积、高氧传递率，并且可作为一次性使用。使用 30 ml小规模模型，Sun 等人报告细胞数量为 3.2 × 10^10 cells，感染 3 天后最大病毒滴度为 2.9 log10(HAU/100 μL) 和 7.8 × 10^7 TCID50/mL（MDCK 细胞，A/New Caledonia/20/99 (H1N1)）。此外，在使用贴壁细胞生产病毒时，使用中空纤维 (HF) 生物反应器可能是一种有前途的方法。这些系统由一个带有数百个毛细血管的组件组成，其中毛细血管外空间细胞生长并产生病毒，而营养物质和氧气则通过毛细血管内空间不断供应。这里，通过一个收获步骤可以达到最大总病毒滴度 3.53 log10 (HAU/100 μL)，这相当于细胞特异性病毒产量 (CSVY) 为 1,604–3,209 病毒子/细胞（毛细血管外空间中 1–2 × 10^9 cells/mL，A/PR/8/34 (H1N1)）。使用多个收获步骤和调整条件，甚至可以达到更高的 CSVY，即 4,055–8,110 病毒子/细胞。近期发展的成果，如一次性固定床生物反应器系统（scale-X、Univercells 或 iCELLis、Pall），可以克服前面描述的静态培养的几个局限性。这些系统提供 2 至 600 平方米的生长表面，提供可放大的工艺和自动化过程控制（pH、DO、液体流速），同时充当预过滤器，截留细胞碎片和杂质。例如，Berrie 等人报道，与培养瓶和细胞工厂相比，在 scale-X 生物反应器中使用 Vero 细胞生产水泡性口炎病毒，10 平方米单位可容纳多达 1 × 10^10cells，滴度提高了 2 至 4 个数量级。但目前还没有关于流感的数据。 表 3. 不同细胞系中生产甲型流感病毒的关键特征。 涉及悬浮细胞系的工艺 悬浮细胞作为病毒生产宿主的可用性为工艺开发和规模放大提供了许多新的可能性。为了满足对可持续和高成本效益工艺日益增长的需求，人们开始转向开发强化和一体化的生产方法。因此，现在出现了用于高通量筛选和工艺优化的缩小模型以及用于大规模生产的、占地面积小的准连续生产系统。悬浮细胞系的产生可以通过适应适当的培养基或通过基因工程来实现。现代培养基甚至允许 MDCK 细胞悬浮生长到高细胞密度。然而，并非每种培养基都能直接支持单细胞生长，细胞会形成簇或聚集体。下面，我们总结了流感病毒生产的工艺优化和强化策略，展示了这些方法的潜力。 简单直接：批次培养 对于批次病毒生产，将有限量的培养基添加到生物反应器中，并使细胞生长至所需的细胞密度。感染种子病毒后，病毒开始复制，当滴度达到最大值时，通过收获步骤结束生产周期。清洁和灭菌后，生物反应器即可准备进行下一批操作。大多数工业疫苗生产过程仍以批次模式运行，因为设置和维护相对简单，并且独立批次的生产有助于降低安全性和批次放行风险。不幸的是，此类行业工艺的数据尚未全面向公众开放。然而，作为示例，在实验室规模上有涉及悬浮 HEK-293 或 MDCK 培养的流感疫苗生产潜在工艺的学术描述。Bissinger 等人展示了强化 IAV 生产工艺的良好性能，其中 MDCK 悬浮细胞在 CDM 中培养。使用快速生长的 MDCK 细胞，在 1 L STR 中感染流感 A/PR/8/34 H1N1 病毒，浓度高达 9.5 × 10^6的极高滴度。上游生产能力估计为 600 剂/升。假设下游工艺过程中的总回收率为 50%，则 4-5 天内每升生物反应器收获物可获得约 300 剂单价疫苗（15 µg/剂）。相比之下，使用滚瓶只能获得约 10.4 剂/升的单价疫苗，而三价或四价疫苗剂量则需要大约 3-4 个鸡蛋，具体取决于生产商和毒株。 强化工艺的第一步：补料分批培养 虽然批次生产工艺易于设置和维护，但在疫情期间，由于产量和速度的需求增加，批次生产工艺可能会受到限制。因此，更有效地利用生物反应器容量并因此进行强化生产变得至关重要。 采用补料分批方法，包括初始生长阶段，然后逐步添加新鲜培养基，可以稀释累积的氨和乳酸（病毒生产和细胞生长抑制代谢物）并补充消耗的营养物质，从而提高细胞密度并提高病毒产量和单位细胞病毒生产力。在补料分批模式下，HEK293SF 细胞中 A/PR/8/34 (H1N1) 的生产导致时-空产量 (STY) 提高了 2.7 倍。然而，在一项涉及 PBG.PK2.1 细胞的研究中，采用补料分批策略无法胜过批次工艺的结果。无论稀释步骤如何，以补料分批模式操作仍然会导致代谢副产物（如乳酸和氨）积累到抑制水平，尤其是在使用浓缩补料时，从而阻碍病毒的生产。 工艺强化的下一个阶段：灌流培养 真正连续的工艺对裂解性病毒生产提出了挑战。因此，灌流策略的实施已成为流感病毒生产的一项根本性进步，通过提高细胞密度、病毒产量和总体效率来强化工艺。为了实现高细胞密度和高生产率，必须为细胞提供最佳的代谢环境。这可以通过不断供应新鲜培养基、同时去除等量的废培养基来实现。这种置换不仅为细胞生长提供营养，还可以部分去除不良代谢副产物（例如乳酸和氨）或蛋白酶抑制剂、细胞产生的二氧化碳以及为控制 pH 而添加的碱中的碳酸氢盐。 与真正的连续培养相比，将细胞截留在培养系统内是一项关键的技术，通常通过膜、沉淀或离心来实现。Chotteau 和 Göbel 等人的文献对可用技术进行了全面概述。过程控制可以通过手动干预或自动化实现。对于后者，使用电容等技术实时监测细胞生长和病毒生产的关键阶段对于实现培养条件的精确控制和优化（例如动态补料策略或收获时间点）非常有用。 半灌流培养是评估细胞能否小规模生长至高细胞密度的最简单方法。在这种方法中，细胞在摇瓶中生长，通过离心定期更换一定量的培养基，通常以细胞特异性灌流速率为指导。通过这种培养模式，Bissinger 等人在 CDM 中将MDCK 细胞密度达到高达 60 × 10^6，然而，当细胞以 40 × 10^6 的密度感染 A/PR8/34 (H1N1) 时，滴度达到最高，导致病毒总滴度为 4.2 log10 (HAU/100 µL)，这相当于累积滴度接近 4.5 log10 (HAU/100 µL)，感染滴度接近 1010TCID50/ml。对于生物反应器操作，通过离线离心保持细胞无菌性和连续性是一项挑战，需要大量投资，尤其是在大规模生产中。对于使用生物反应器进行放大，工业上通常考虑使用基于膜的细胞截留系统，例如旋转滤器、切向流过滤 (TFF) 或交替式切向流过滤 (ATF)。在这里，ATF 和 TFF 模式是更优选的，因为与细胞培养液流向过滤器表面的正交流相比，切向流可防止膜污染。有各种使用 ATF 或 TFF 系统在悬浮MDCK、AGE1.CR、CAP 和 PBG.PK2.1培养中生产流感病毒的报告，这些报告强调了与批次生产相比病毒产量的提高。 图 2. 可用于在贴壁细胞或悬浮细胞中生产流感疫苗的培养系统比较。STR：搅拌罐生物反应器；OSB：轨道振荡生物反应器（一次性使用）；波浪生物反应器（一次性使用）；摇瓶半灌流；ATF：交替式切向流过滤；TFF：切向流过滤；TFDF：切向流深层过滤；AS：声学沉降器；IS：倾斜沉降器；HFBR：中空纤维生物反应器；半连续：两级半连续摇瓶培养系统；CSTR：两级连续搅拌罐生物反应器培养系统。 Gränicher 等人使用 PBG.PK2.1 细胞，在 ATF 培养中达到了高达 50 × 10^6 cells/mL 的细胞密度和 3.93 log 10 (HAU/100 µL) 的最大 HA 滴度；然而，CSVY 低于通过优化的批次或补料分批培养获得的 CSVY。相比之下，当 MDCK 细胞密度最高为 45 × 10^6 cells/mL 时，Wu 等人能够获得 4.42 log10 (HAU/100 µL) 的极高滴度，这对应于 ATF 模式 (A/PR8/34 (H1N1)) 下的累积滴度为 4.5 log10 (HAU/100 mL) 和 1.8 × 10^10 TCID50/mL。通过这种培养可以确定非常高的产量：CSVY 为 11,690 病毒子/细胞；STY 为 8.0 × 10^13 病毒子/升/天；单位体积生产率：1.02 × 10^13 个病毒体/升/天。 对于 CSVY 低得多的禽细胞系 (AGE1.CR.pIX)，Vazquez-Ramirez 等人提出了一种采用 ATF 系统的混合补料分批/灌流策略。使用这种组合策略，滴度达到 3.3 log10(HAU/100 μL)，与对照灌流培养相比增加了 5 倍，与传统批次工艺相比增加了 7 倍。尽管培养基消耗量增加，但混合策略实现了与批次工艺相似的单位体积生产率（5.4 × 10^11 vs. 6.5 × 10^11病毒子/升/天）。总之，这证明了整合不同培养策略、以实现最佳病毒产量和工艺效率的潜力。 然而，由于病毒具有裂解性、大尺寸（痘苗病毒可达 360 nm）和独特的表面特性，传统的基于膜的细胞截留在病毒生产中面临挑战。病毒感染后的细胞凋亡和细胞裂解缩短了工艺时间，但随着细胞碎片、蛋白质和宿主细胞 DNA 的积累，杂质水平增加，导致常见的缺点，包括膜堵塞以及生物反应器内不希望的病毒积累。尽管流感病毒颗粒的直径只有 80 到 120 nm，但几项研究发现，当使用截留分子量为 50 kDa、0.2 µm 和 0.5 µm 的 ATF 膜时，会出现病毒截留和膜堵塞。 最近，基于膜的新技术已经面世，可以实现连续病毒收获，由于在生物反应器内的停留时间较短，可以提高 CSVY 和产品质量。例如，Hein 等人建立了一个自动灌流工艺，使用 ATF 模式下孔径约为 10 µm 的管状膜 (VHU) 连续生产和收获 IAV DIP。DIP 的生产始于细胞密度 20 × 10^6 cells/ml。虽然细胞有效地截留在生物反应器中，但产生的病毒颗粒100% 穿过膜，没有观察到污垢。在使用常规 HF 膜（孔径 0.2 µm）的对照工艺中，大多数 IAV DIP 都截留在生产容器中。切向流深层过滤 (TFDF) 技术 (Repligen) 也可能是一种选择。在这里，在 TFF 模式下使用孔径为 2–5 µM 的膜可以有效截留细胞，而同时进行深层过滤则可以通过过滤器收获病毒颗粒。使用 TFDF 补料分批/灌流装置在 HEK293SF 细胞中生产 IAV，Silva 等人最近展示了病毒生产和通过膜的有效收获，而不会遇到病毒截留、膜堵塞或剪切应力增加的问题。我们在实验室中使用该技术在 MDCK 细胞中生产 IAV 也获得了有希望的结果；但是，数据尚未公布。TFDF 组件可放大且可从中试规模到 2,000 L 规模进行商业化，并且可以推动疫苗工艺开发走向集成式连续下游工艺。 克服膜污染和病毒截留问题的另一种选择是依靠重力或声波的细胞截留装置，这两种装置都已用于流感病毒的生产。声学沉降器和倾斜沉降器均可连续收集病毒，优先截留活细胞，并且与基于膜的系统相比，施加的剪切应力较低，这一点尤其关键，因为受感染的细胞往往对剪切更敏感。 Petiot 等人使用声学沉降器，在密度高达 18 × 10^6 cells/mL 的 HEK293 细胞中获得了令人满意的结果。与批次工艺相比，灌流模式的滴度几乎高出一个数量级。随后，Granicher 等人将声学沉降器在密度为 25 至 50 × 10^6 cells/mL的 AGE1.CR.pIX 细胞培养中的性能与 ATF 培养进行了比较。由于能够连续收获病毒，CSVY 至少增加了 1.5 倍，单位体积生产率最高提高了 3 倍。这些结果再次凸显了连续收获病毒对于流感生产过程的重要性，并展示了声学沉降器应用的潜力。然而，该设备主要建立在实验室规模上，在商业生产中不太常见。同样，Coronel 和 Gränicher 等人使用倾斜沉降器连续收获病毒获得的 CSVY 为 3474 病毒体/细胞，与 ATF 对照培养相比增加了 4.7 倍，单位体积病毒生产率也提高了 2.2 倍。然而，该装置的局限性在于灌流速率能力、缺乏工业规模的现成解决方案、高停留时间和温度梯度。总之，所有讨论的结果都强调了流感病毒生产的灌流策略的复杂进步，因为它们为细胞生长和病毒生产阶段提供了明显改善的代谢环境。目前有多种高效的细胞截留方案可供选择，每种方案都有不同的优点和缺点，影响因素包括剪切应力、可放大性和易实施性。然而，选择生物反应器系统并将其与合适的细胞截留装置相结合是设计高效、稳健的灌流工艺的关键考虑因素，因为如果该装置允许连续收集病毒，病毒产量将大大提高。 强化病毒生产的挑战：连续培养 近年来，人们越来越关注在各种生物制药应用中采用连续生产方法而非批次模式。这种稳定状态下的操作可以延长生产阶段，同时可能提高生产率和效率。对于重组蛋白或非裂解性病毒的生产，可以通过恒化工艺实现，其中进料和产品收获的流速均保持均匀，确保工作体积和营养供应恒定。相反，许多病毒，如流感病毒，是裂解性的，需要在一系列不同的容器中分离细胞生长和病毒繁殖，以避免细胞凋亡和细胞裂解的影响。在最简单的情况下，这种级联可以在两级连续搅拌罐反应器 (CSTR) 系统中实现。从专用于细胞生长的初级 STR，细胞被连续转移到专门用于感染和病毒繁殖的二级 STR。 Frensing 等人最初尝试在 CSTR 系统中的 AGE1.CR 细胞中连续生产 IAV，但未能达到预期的效果。相反，生产导致病毒滴度出现周期性波动，与批次培养相比，单位体积生产率明显降低。这种波动被称为“冯·马格努斯效应”，可以归因于 DIP 的出现。DIP 本身不具有复制性，但会与传染性流感病毒颗粒竞争并干扰其复制，这严重限制了 IAV 或其它 DIP 生产病毒的连续生产工艺的可用性。然而，随着管式推流生物反应器系统的开发，Tapia 等人可以绕过这些限制，并在 AGE1.CR.pIX 和 MDCK 细胞中展示出 IAV 的稳定滴度生产。该系统由一个用于细胞生长的 CSTR 构成，该 CSTR 与一个用于病毒繁殖的 105 米长的管状推流生物反应器相连。这样就无需考虑滴度波动，与典型的批次培养相比，STY 大约提高了 2 倍。 然而，DIP 并不总是被视为 IAV 生产中的不受欢迎的副产品，因为它们也显示出作为预防和治疗抗病毒药物的潜力。为了进一步探索 DIP 的演变，采用数学建模来描述在二级 STR 中不同停留时间的两次 CSTR 培养的实验结果。此外，Pelz 等人最近使用了一种简化的半连续装置来模拟小规模的连续病毒繁殖。他们没有使用级联 STR，而是使用两个不同的摇瓶进行悬浮 MDCK 细胞繁殖和 IAV 生产。在 21 天的培养期内，由于 DIP 和感染性颗粒之间的竞争性动态相互作用，再次观察到病毒滴度出现强烈的周期性波动。随后，采用下一代测序加深对 DIP 形成的了解并确定有希望的抗病毒治疗候选药物。此外，这些研究还证明了 DIP 在流感种子病毒生产中的重要性。 尽管与批次工艺相比，连续生产可以大幅减少占地面积和生产成本，但进一步的限制包括对技术人员的高资质要求以及由于设置的复杂性和工艺时间的延长而导致的污染风险增加。因此，连续流感生产不一定能胜过提供巨大灵活性和控制力的批次工艺的优势。 流感病毒生产中的一次性技术 一次性（SU）技术的应用在生物制药行业逐渐流行起来，而 COVID-19 疫情甚至加速了生物工艺中对 SU 设备的需求稳步增长。根据最近的一项调查，在临床上游工艺中使用 SU 设备的操作从 2014 年的 38.6% 增加到 2022 年的 62.9%。如今，SU 选项已在商业上可用于多种生物反应器操作，然而，决定是否应使用 SU 或 SS 技术进行疫苗生产需要仔细权衡其优势和挑战。由于周转时间短，SU 系统具有极大的灵活性、快速可放大性和更高的生产率，使其特别适合响应多样化的市场需求并有效调整生产活动。此外，由于资本投资、工程和运营成本较低，此类系统很容易在欠发达地区建立，因此是扩大全球生产能力的关键因素。然而，疫情表明，当需求增加时，SU 设备的供应和灭菌尤其受到限制。相比之下，以耐用性、安全性和适合长期生产而闻名的 SS 反应器更适合可预测的大规模生产。SU 与 SS 的可持续性和可析出物问题仍然存在争议。同样，一些 SU 设备是由新公司提供的，这些公司并不总是在市场上。然而，特别是疫苗生产工艺需要维持多年的生产，需要提供后备方案。因此，需要保证 SU 设备的质量和可用性，以允许长期供应和生产相应的疫苗。工艺中的任何变化都需要证明产品质量足够。最后，在临床和商业生产过程中扩大和调整 SS 系统所面临的挑战可能会限制灵活性和对不断变化的市场需求的响应能力。 对于流感病毒的生产，迄今为止已经评估了几种一次性系统，包括HF、填充床、轨道摇动、振荡和搅拌生物反应器系统。例如，文献中已经回顾了更多用于生物制药生产中的 SU 生物反应器系统及其相关挑战。SU 系统的设计在传质和混合原理、规模和应用领域（研发或生产）方面差异很大。近年来，SU 微型反应器系统（如 Sartorius 的 ambr 系统（15 mL wv）或 Merck 的 Erbi Breez（2 mL wv，灌流））在早期开发中越来越受欢迎。在我们的实验室中，使用 ambr15 系统在微型反应器规模上筛选多种克隆 MDCK 细胞系、以生产流感病毒时，取得了令人鼓舞的结果。在受控条件下并行运行多达 48 个 SU 罐并进行自动采样，可以快速生成有关多个工艺变化的数据。 在灌流模式下将 SU 系统应用于生产工艺又增加了一层优势。例如，Coronel 等人研究了在与基于膜的细胞截留装置耦合的 SU 轨道振荡生物反应器中生产 IAV。在比较分析中，采用 ATF 或 TFF 系统的灌流策略可以明显胜过对照批次工艺。由于袋子设计简单，无需耦合器或搅拌器，因此系统设置非常容易，适用于对剪切敏感的细胞，即使在高细胞密度下也可以满足 AGE1.CR.pIX 细胞的氧气需求。此外，该系统适合规模放大，因为市面上有 1.5 L 至 2,500 L 的工作体积（Kühner）。许多其它供应商也提供高达 6,000 L 的 SU 系统（例如 ABEC）。 综合起来，SU 系统可以提供灵活、完全可放大、即插即用的生物反应器操作，尤其是高效的灌流工艺，与一次性设备的体积范围完美契合。它们已经普遍用于重组蛋白的生产；我们在基于细胞培养的疫苗生产领域看到了类似的潜力。 展望和总结 在过去的二十年中，许多技术进步已经建立并强化了基于细胞培养的流感疫苗生产工艺。从传统的基于鸡胚的生产向细胞培养方法的转变似乎越来越不可避免，尤其是随着准连续工艺的选择，旨在提高效率和降低成本。然而，仍然存在的挑战包括优化细胞系和培养基、以获得更高的病毒产量、实施先进的在线监测工具以及使下游工艺适应新的模式。实现在小空间内具有高病毒生产率的稳健且可放大的灌流策略对于满足不断增长的疫苗需求可能至关重要。然而，在疫苗生产中，批次和连续模式之间的选择取决于几个因素，包括生产规模、成本效益、过程控制、产品质量和监管考虑。在某些情况下，具有高性能细胞系的稳健批次工艺仍然可以胜过灌流工艺，并且具有更简单的设置和更少的工程和操作任务要求。此外，该行业正在积极探索在开发和生产两个领域整合一次性技术。同样，技术进步与强化工艺相结合可以实现高效的上游工艺，并逐步使用较小的设备完成，这有利于实施一次性技术，同时提高灵活性并降低污染风险。随着基于细胞培养的流感疫苗生产的进步，解决这些挑战对于充分发挥这种方法的潜力并最终取代基于鸡胚的生产至关重要。这包括改进工艺强化策略、建立平台工艺、确保产品一致性以及优化整个生物工艺工作流程，以满足大规模疫苗生产和对新出现的流感病毒株的快速反应的需求。 识别微信二维码，可添加药时空小编 请注明：姓名+研究方向！

摘要:流感仍然是一个严重的全球健康问题，每年造成重大的发病率和死亡率。疫苗接种对于减轻其影响至关重要，但需要快速高效的制造策略来应对时间和供应问题。传统上依赖于基于鸡蛋的生产，该领域已经见证了向基于细胞培养的方法转变，这提供了增强的灵活性、可扩展性和流程安全性。本综述提供了可用细胞基质和技术进步的简洁概述。我们总结了向流程强化的关键步骤——从滚筒瓶生产到载体上的动态培养，从批量模式的悬浮培养到使用各种细胞保持装置的高细胞密度灌注。此外，我们比较了一次性使用和传统系统，并解决了包括干扰粒子缺陷在内的挑战。总的来说，我们描述了当前基于细胞培养的流感病毒生产的最先进技术，以可持续地满足疫苗需求，保证及时供应，并应对季节性流行病和全球大流行的挑战。 1.引言 呼吸道疾病，如流感，仍然是一个严重的全球健康和经济负担。流感疫苗包括灭活疫苗（IIV）、减毒活疫苗（LAIV）和重组疫苗（RV）等几种接种方式，这些疫苗获得了许可，构成了全球流感预防策略的基石。此外，基于核酸的平台技术正在开发中。通常，流感疫苗设计为三价或四价组合，包含一种/两种流感A型和B型病毒（IAV, IBV）株，根据国际卫生组织每年的推荐。生产传统上基于将目标株注入受精鸡蛋的过程，让它们复制。这种方法虽然广泛使用（约占全球IIV生产能力的84.5%），但耗时且易受鸡蛋供应短缺的影响，且难以处理废物。相比之下，基于细胞的生产提供了更快的时间线、改善的抗原匹配和效力、更好的可扩展性，并且不依赖于鸡蛋的可用性。因此，人们越来越感兴趣转向基于细胞培养的方法，这是由于需要更高效和灵活的制造平台来满足全球需求并应对短缺。 基于细胞培养的流感疫苗的早期开发可以追溯到20世纪中叶，当时越来越多的连续细胞系变得可用，一些创新已经实施用于动物疫苗的生产。但直到21世纪，生物加工技术的重大进步才使得它们广泛用于人类疫苗使用。最初用于小规模生产的静态细胞培养，为后续在生物反应器设计、培养基配方和流程优化方面的创新提供了基础。静态培养的固有限制，包括低细胞密度批处理和高效放大的障碍，促使探索动态培养系统以提高生产力和可扩展性。同时在适应细胞系悬浮生长、建立设计细胞系和改进培养基配方方面的进展，最终实现了高产生产系统，并允许进一步的流程优化和强化措施以提高生产力、可扩展性和流程稳健性。图1展示了使用MDCK细胞为例的技术进步及其在IAV基于细胞培养的过程中的应用的概述。通过实施高细胞密度（HCD）培养策略，可以克服传统批处理过程的限制。特别是，近年来已经有效地解决了实施进料批处理和灌注策略的几个工程挑战。 在接下来的部分，我们将描述可能鼓励进一步流程开发的关键步骤和创新，建立具有改进的流程效率、疫苗效力和降低生产成本的流感病毒生产的上游流程。我们涵盖了适合的宿主细胞系的识别和选择、使用静态培养的早期制造方式、过渡到悬浮培养，以及涉及粘附和悬浮细胞系的流程强化选项。我们探讨了技术进步的基本原理，以及每种方法相关的挑战。此外，我们讨论了一次性使用（SU）与常规不锈钢（SS）技术的适用性。通过理解正在开发和制造中的新方式，我们可以识别进一步优化和创新的机会，以满足日益增长的疫苗需求并增加全球可及性。 本综述的重点将是哺乳动物和禽类细胞培养基流感病毒生产；不考虑植物和昆虫细胞。当然，重要的是要承认优化的上游处理只是疫苗制造的一个方面。疫苗生产过程中的下游处理、混合和配方阶段同样至关重要。虽然认识到整个过程的重要性，但这方面的内容在本文中将不再进一步讨论。 图1. 使用MDCK细胞的基于细胞培养的流感病毒生产过程的技术进步。自20世纪40年代以来，传统的基于鸡蛋的过程就已经可用（红色箭头）。从1958年Madin和Darby从一只健康的可卡犬肾脏中分离出MDCK细胞开始，就建立了各种基于细胞培养的生产方法。培养基开发的进步和MDCK细胞适应悬浮生长的改进，为建立更高效和更密集的过程打开了可能性。对于依赖悬浮细胞系的灌注过程，生物反应器系统与细胞保留装置相连，该装置可以是基于膜的，或者是倾斜沉降器（重力）或声学过滤器。自千禧年之交以来，基于MDCK细胞的过程已获得许可，用于生产人类流感疫苗（蓝色箭头）。BR：生物反应器；CSTR：连续搅拌罐反应器。 2.基于细胞培养的流感病毒生产 开发基于细胞培养的流感病毒生产过程的关键是选择合适的宿主细胞系，它可以有效支持病毒复制并满足监管要求。细胞系通常带有推荐的生长培养基，支持粘附或悬浮细胞生长，但可以从那里进行调整和优化。组成是关键，确保营养和基本因素的平衡，允许快速的细胞生长，倍增时间少于30小时，以及高病毒复制。传统上，细胞在含有血清的培养基（SCM）中培养，因为它提供了所有必要的生长因子和营养物质。然而，血清容易引入批间变异，现在更倾向于使用无动物成分的过程，以最小化外来因子污染的风险。因此，现代选择包括无血清（SFM）或化学定义培养基（CDM），因为它们提供了更安全和一致的性能。然而，在这些培养基中实现可比较的细胞生长和病毒产量需要仔细优化配方和补充生长因子。培养基设计本身是一门艺术，为特定细胞系和目标病毒开发培养基大多超出了范围。因此，通常使用现成的培养基并结合使用，即使它们没有完全为预期的过程优化。根据组成和细胞的代谢，这可能导致不希望的次级副产品，如氨和乳酸，积累到对细胞生长和病毒生产产生不利影响的浓度。此外，细胞系、培养模式和系统决定了各种流程参数的最佳设计空间，这些参数应该在整个过程中严格控制。我们小组之前总结了适用于基于细胞培养的病毒生产的流程参数和强化策略的一般考虑。对于流感，温度通常保持在32°C和37°C之间，pH值在7.2和7.6之间，溶解氧浓度超过30%。在感染时，通常与蛋白酶（如胰蛋白酶）一起添加种子病毒，以增强病毒进入细胞。必须仔细调整蛋白酶的浓度和活性，以确保最佳病毒复制，而不会导致过度的蛋白质消化，导致粘附细胞培养中的细胞脱落甚至细胞死亡。同样重要的是准备种子病毒，考虑到可能适应特定细胞系，并确保感染性与非感染性颗粒的高比例。虽然众所周知，在胚蛋中病毒传播可能导致抗原编码基因的突变，从而对疫苗效力产生不利影响，但在使用MDCK细胞的序列分析研究中没有观察到细胞特异性适应性突变。在这里，通过MDCK细胞传代的种子病毒代表了在人类中分离的病毒。通常，种子病毒的传代次数限制在五次。虽然细胞特异性适应需要2-3个步骤，但仍有放大的空间。然而，我们清楚地看到需要通过测序和抗原性特征化，在大规模生产过程中持续监测种子病毒的遗传稳定性。一个非常有效和可靠的工具，用于监测从种子病毒到最终收获甚至下游纯化的糖组成是CGE-LIF（毛细管凝胶电泳与激光诱导荧光检测）。 流感病毒的最佳收获时间通常在感染后36至72小时，这时病毒滴度达到高峰。然而，这可能因细胞系、流程参数和使用的病毒株而异。特别是对于流感病毒生产，种子病毒输入不仅对复制速度至关重要，也对缺陷干扰粒子（DIPs）的出现至关重要。因此，感染的多重性（MOI），通常在10到10-5之间，需要根据研究目的仔细考虑。 以下，我们概述了基于细胞培养的流感病毒生产的当前最先进技术，首先关注细胞系的选择，然后详细讨论流程策略选项，最后讨论（一次性使用的）培养系统的选择。 2.1.用于流感病毒生产的粘附和悬浮细胞 目前，基于细胞培养的病毒生产没有普遍适用的解决方案或平台流程。这种限制主要源于病毒能够有效感染的宿主物种数量有限，这一属性被称为宿主范围。此外，不同宿主细胞系的病毒产量可能差异巨大，细胞系可能因疫苗安全性的高要求（例如肿瘤原性和外来因子）而不符合疫苗生产资格。因此，历史上建立的、但往往表现不佳的细胞系被广泛使用，需要系统地筛选监管当局批准用于疫苗生产的宿主细胞，以选择理想的候选细胞。识别是一个劳动密集型的挑战，涉及导航包括培养基选择、培养模式和流程条件在内的几个障碍。此外，潜在细胞系的商业甚至学术使用通常由于知识产权和许可问题而受到限制，这也可能限制筛选选项。 除了病毒产量和流程生产力，考虑因素还应包括疫苗产品的抗原匹配和免疫原性，因为几项研究表明，根据生产系统（鸡蛋或特定细胞系）的不同，存在明显差异。选择最佳宿主细胞系的标准之前已经概述，适合流感生产的候选细胞已经在接受过彻底审查的综述中进行了检查。已经评估了几种传统或设计细胞系用于流感病毒生产，包括MDCK、Vero、HEK293、AGE1.CR、PER.C6、EB66、CAP、DuckCelt-T17或PBG.PK2.1细胞。尽管这些候选宿主细胞系有多种好处，但只有少数已经合格并用于基于细胞培养的流感疫苗的生产，包括用于IIV和LAIV的MDCK和Vero细胞，以及用于RV的Sf9衍生细胞。事实上，行业的专有数据和这种选择性使用背后的决策过程没有向公众披露，这也限制了我们对为什么某些细胞系最终被选为疫苗生产的理解。从学术角度来看，我们可以假设包括监管批准、既定生产协议、市场首推决策和成本效益在内的障碍。 在一项头对头比较中，Genzel等人阐明了粘附MDCK或Vero细胞是否是流感疫苗生产最合适的细胞基质的问题。尽管在优化的小规模条件下（滚筒瓶、T型瓶），两者在上清中可以获得类似的病毒滴度，但在微载体上的生物反应器中，MDCK细胞表现更优。随着先进培养基开发和细胞系工程，现在有多种悬浮MDCK细胞可用，为生物过程操作和可扩展性提供了巨大优势。相比之下，Vero悬浮细胞的开发是一个更具挑战性的任务，已经吸引了多个研究小组超过三十年。在这里，迄今为止报告的最大细胞浓度高达8×106细胞/毫升；然而，这只是在13天的摇瓶培养中通过三次完全更换培养基才达到的；否则在批处理中达到约2×106细胞/毫升，在3升生物反应器灌注培养中达到6.8×106细胞/毫升。此外，倍增时间超过40小时和频繁形成聚集体仍然是重大问题，从而限制了有效或强化流程的选项。因此，MDCK细胞主要占据工业制造。 2.2.MDCK细胞在流感病毒生产中的作用 早在1958年，MDCK细胞就被SH Madin和NB Darby从一只健康的可卡犬的肾脏中分离出来，几年后存放在美国典型培养物收藏所（ATCC）。由于非常适合作为极化细胞的模型，MDCK细胞系成为最广泛研究和良好特征化的上皮细胞系之一，用于细胞生理学和病毒学调查。全球领先的研究机构已经使用粘附MDCK细胞进行人类流感病毒的分离和复制，主要用于流行病学研究和诊断目的。除此之外，MDCK细胞也主导了基于细胞培养的流感疫苗制造，因为它们对所有流感亚型都易感，并能产生各种高滴度的病毒株。因此，自上个世纪末以来，一直在努力利用MDCK细胞进行人类流感疫苗制造，而不是使用鸡蛋，这导致了广泛的安全性分析，以消除关于肿瘤原性和致癌性的担忧。 此外，学术和工业努力已经做出，以提高细胞特异性病毒产量（CSVY）和整体生产力。这些努力包括适应悬浮生长而不是将细胞粘附到微载体或瓶表面，这可以通过转染粘附MDCK细胞与人类siat7e基因或遵循先进的培养基开发来实现。此外，应用了提高细胞浓度、实时监测病毒感染动态以及时收获病毒、开发多尺度模型以改善流程理解或获得主要表达人类流感受体的细胞系的遗传操作等策略。最后，选择高产细胞克隆对于提高上游制造过程中的生产力具有重要潜力。这似乎特别相关，因为MDCK细胞显示出广泛的细胞间异质性，在形态、电生理和生化特性、碳水化合物表示以及最重要的病毒生产能力方面存在显著差异。 在单细胞水平上的研究可以揭示后代病毒产量和细胞内病毒RNA水平之间高达大约1000倍的差异。尽管如此，揭示这种异质性背后主要驱动因素的努力尚未得出一个简单的答案。然而，最近的转录组分析表明，抑制宿主细胞功能以转移细胞资源和维持足够活动以进行病毒复制之间的平衡是一个相关因素。由于多个学术和工业研究小组的这些密集努力，几种具有不同特性的MDCK细胞系变得可用，其中大多数细胞系源自存放在ATCC的CCL-34谱系。 2.3.涉及粘附细胞系的流程 如今，在许多生物处理环境中，悬浮细胞因能够支持高细胞密度生长、易于放大、灵活性、成本效益和流程控制选项而受到青睐，而不是依赖锚定的细胞。然而，悬浮细胞并不总是可用的，对于一些细胞系来说，适应或工程化它们以支持悬浮生长仍然是一个挑战。由于涉及这种依赖锚定的细胞的流程总是受到可用表面积的限制，过去已经做出了大量努力来优化生产以实现最大效率。这可以通过T型瓶、滚筒瓶、细胞工厂的表面积，或者在固定床反应器中或使用的微载体数量来确定。其中一些静态细胞培养系统不仅在表面积上有限，而且缺乏流程控制选项。尽管在滚筒瓶中可以实现适当的培养基混合和气体扩散，但并未对诸如pH和pO2等关键参数进行控制。然而，病毒生产可以轻松实现高滴度，并且只需要最少的操作者交互。在之前的研究中，涉及滚筒瓶中粘附MDCK细胞的流程产生了1.0×109 PFU/ml的A/PR/8/34 (H1N1)。尝试通过使用培养基中的丙酮酸代替谷氨酰胺来绕过氨积累以优化这种静态生产过程，并未导致显著更高的产量。相比之下，实施载体技术已经可以帮助缓解表面积限制并获得更多流程控制，同时拥有更小的占地面积。在批处理模式下，使用2 g/L的微载体浓度，MDCK细胞可以达到3.2×106细胞/mL的细胞密度，产生了最大病毒滴度为2.9 log10(HAU/100 µL)。实施波纹生物反应器允许更高的细胞密度和更好的附着，相比之下搅拌罐生物反应器（2 g/L Cytodex 1, 2 L规模），然而最大滴度仍然在3.3 log10(HAU/100 µL)范围内。使用重复进料批处理策略，可以实现11.2×106细胞/mL的高细胞密度，12.5 g/L Cytodex 1，产生了2.8 log10(HAU/100 µL)。在灌注中，甚至可以达到更高的总病毒滴度3.3 log10(HAU/100 µL)，在最大细胞浓度为5.5×106细胞/mL（10.5 g/L Cytodex 1）时。尽管微载体培养显示出多个优于静态培养的优势，剪切力、需要灭菌和清洁程序可能限制其使用。此外，并非所有细胞在SFM中培养时都表现出良好的附着。或者，在固定床生物反应器中，细胞被固定在生物反应器内的松散包装基质上，这提供了大表面积、高氧气转移和作为一次性选项的可用性。使用30 mL小规模模型，Sun等人报告了3.2×1010细胞的数量，提供了最大病毒滴度为2.9 log10(HAU/100 μL)和7.8×107 TCID50/mL，在感染后3天（MDCK细胞，A/New Caledonia/20/99 (H1N1)）。此外，实施中空纤维（HF）生物反应器可能是使用粘附细胞进行病毒生产时的一个有前景的方法。这些系统由一个装有数百个毛细管的盒组成，其中细胞在毛细管外的空间生长并产生病毒，而营养物质和氧气通过毛细管内的空间不断供应。在这里，可以实现最大总病毒滴度3.53 log10(HAU/100 μL)，单次收获步骤，这对应于1,604–3,209病毒/细胞的细胞特异性病毒产量（CSVY）（毛细管外空间1–2×109细胞/mL，A/PR/8/34 (H1N1)）。使用多次收获步骤和调整的条件，甚至可以达到更高的CSVY 4,055–8,110病毒/细胞。最近的发展，如一次性固定床生物反应器系统（scale-X, Univercells或iCELLis, Pall），允许克服先前描述的静态培养的几个限制。这些系统提供从2到600平方米的生长表面，提供可扩展的流程与自动化流程控制（pH, DO, 液体流速），同时作为预过滤器保留细胞碎片和杂质。例如，Berrie等人报告了10平方米单元的多达1×1010细胞，并且使用scale-X生物反应器与烧瓶和细胞工厂相比，使用Vero细胞生产的水泡性口炎病毒产量提高了两到四个数量级，然而，目前尚无流感数据。 2.4.涉及悬浮细胞系的流程 悬浮细胞作为病毒生产的宿主的可用性为流程开发和放大提供了许多新的可能性。为了满足对可持续和成本效益流程的日益增长的需求，已经出现了向开发强化和集成生产方法的转变。因此，现在有高通量筛选和流程优化的缩放模型以及具有小占地面积的准连续生产系统可用于大规模制造。产生悬浮细胞系可以通过适应适当的培养基或通过遗传工程来实现。现代培养基甚至允许MDCK细胞悬浮生长到高细胞浓度。然而，并非每种培养基都直接支持单细胞生长，细胞形成簇或聚集体。以下，我们总结了这种流感病毒生产的流程优化和强化策略，展示了这些方法的潜力。 2.5.简单直接：批处理培养 在批处理模式下进行病毒生产时，向生物反应器中添加有限数量的培养基，并将细胞生长到所需的细胞浓度。随后用种子病毒感染，启动病毒复制，当滴度达到最大时，通过收获步骤结束生产周期。清洁和消毒后，生物反应器可以为下一批操作做准备。大多数工业疫苗生产过程仍然以批处理模式运行，因为设置和维护相对容易，独立批次的生产有助于减轻安全性和批次放行的风险。不幸的是，这些行业流程的数据并不完全公开。然而，有学术描述在实验室规模上涉及悬浮HEK-293或MDCK培养的流感疫苗生产的潜在流程。在这里，Bissinger等人展示了一个集成的IAV生产流程的良好性能，其中MDCK悬浮细胞在化学定义培养基中培养。使用快速生长的MDCK细胞在1 L STR中感染流感A/PR/8/34 H1N1病毒，可以达到高达3.6 log10(HAU/100 µl)的滴度，细胞浓度高达9.5×106细胞/mL。上游生产能力估计为600剂/L。假设下游处理中总回收率为50%，大约每升生物反应器收获液可获得300剂单价疫苗（每剂15 µg）。相比之下，使用滚筒瓶只能获得大约10.4剂/L的单价疫苗，而根据制造商和株，需要3-4个鸡蛋来获得三价或四价疫苗剂。 2.6.迈向流程强化的第一步：进料批处理培养 虽然批处理过程易于设置和维护，但在大流行期间，当增加产量和速度的需求增加时，它们可能会受到限制。那时，更有效地利用生物反应器容量，从而进行强化变得至关重要。 采用进料批处理方法，包括初始生长阶段，然后逐步添加新鲜培养基，可以稀释积累的氨和乳酸（抑制病毒生产和细胞生长的代谢物），并补充消耗的营养物质，从而提高细胞浓度，并导致更高的病毒产量和特定病毒生产力。在进料批处理模式下，HEK293SF细胞中A/PR/8/34 (H1N1)的生产导致空间时间产量（STY）提高了2.7倍。然而，在涉及PBG.PK2.1细胞的研究中，采用进料批处理策略无法与批处理过程的结果竞争。然而，无论是否进行稀释步骤，进料批处理模式的操作仍然可能导致代谢副产品如乳酸和氨的积累达到抑制水平，特别是当使用浓缩饲料时，从而阻碍病毒生产。 2.7.流程强化的下一阶段：灌注培养 真正的连续流程对溶瘤病毒生产提出了挑战。因此，灌注策略的实施已成为流感病毒生产中的一项基本进步，通过提高细胞浓度、病毒产量和整体效率来强化流程。要实现高细胞密度（HCD）和高生产力，必须为细胞提供最佳代谢环境。这可以通过不断供应新鲜培养基，同时移除等量的耗尽培养基来实现。这种交换不仅为细胞生长提供营养物质，还允许部分移除不利的代谢副产品（例如乳酸和氨）或蛋白酶抑制剂、细胞产生的二氧化碳和用于pH控制添加的碱基中的碳酸氢盐。 与真正的连续培养不同，在培养系统中保留细胞是一个关键的技术方面，通常通过膜、沉降或离心来实现。Chotteau等人和Göbel等人的文献提供了现有技术的全面概述。 流程控制可以通过手动干预或自动化实现。对于后者，实时监测细胞生长和病毒生产的关键阶段，例如使用电容法，对于实现精确控制和优化培养条件（例如动态进料制度或收获时间点）非常有用。 半灌注培养提供了在小规模评估细胞是否可以在HCD下生长的最简单方法。在这里，细胞在摇瓶中生长，通过离心定期交换一定量的培养基，通常由细胞特定的灌注率指导。通过这种培养方式，Bissinger等人在化学定义培养基中达到了高达60×106细胞/mL的MDCK细胞浓度。然而，当细胞在40×106细胞/mL时感染A/PR8/34 (H1N1)，达到了最高滴度，总病毒滴度为4.2 log10(HAU/100 µL)，对应于近4.5 log10 (HAU/100 µL)的累积滴度和近1010 TCID50/mL的传染性滴度。对于生物反应器操作，通过离线离心保持细胞无菌性和连续性面临挑战，并且需要大量投资，特别是在大规模时。 对于使用生物反应器的放大，通常在工业中考虑使用基于膜的系统进行细胞保留，如旋转过滤器、切向流过滤（TFF）或交替切向流过滤（ATF）。在这里，ATF和TFF模式更受青睐，因为与细胞肉汤对过滤面的正交流相比，切向流可以防止膜污染。有多种报告使用ATF或TFF系统在悬浮MDCK、AGE1.CR、CAP和PBG.PK2.1中生产流感病毒，强调与批处理生产相比病毒生产的改善。 使用PBG.PK2.1细胞，Gränicher等人在ATF培养中达到了高达50×106细胞/mL的细胞浓度和最大HA滴度3.93 log10(HAU/100 µL)；然而，CSVY低于优化批处理或进料批处理培养获得的值。相比之下，在最大MDCK细胞浓度45×106细胞/mL时，Wu等人展示了非常高的滴度4.42 log10(HAU/100 µL)，对应于4.5 log10 (HAU/100 mL)的累积滴度和1.8×1010 TCID50/mL的传染性滴度（A/PR8/34 (H1N1)）。在这种培养中，可以确定非常高的产量：CSVY为11,690病毒/细胞；STY为8.0×1013病毒/L/d；体积生产力为1.02×1013病毒/L/d。对于CSVY低得多的禽细胞系（AGE1.CR.pIX），Vazquez-Ramirez等人（2019年）提出了一种混合进料批处理/灌注策略，使用ATF系统。通过这种组合策略，达到了3.3 log10(HAU/100 μL)的滴度，与仅参考灌注培养相比增加了5倍，与传统批处理过程相比增加了7倍。尽管培养基消耗增加，但混合策略实现了与传统批处理过程相似的体积生产力（5.4×1011 vs. 6.5×1011病毒/L/d）。总之，这证明了整合不同培养策略以实现最佳病毒产量和流程效率的潜力。 然而，由于溶瘤性质、大尺寸（痘病毒高达360 nm）和病毒的独特表面特性，传统的基于膜的细胞保留在病毒生产中面临挑战。病毒感染后的细胞凋亡和溶解缩短了流程时间，但增加了杂质水平，因为细胞碎片、蛋白质和宿主细胞DNA积累，导致常见的缺点，包括膜堵塞和生物反应器内不希望的病毒积累。尽管流感病毒颗粒直径仅在80至120 nm之间，但几项研究在使用50 kDa、0.2 µm和0.5 µm截止的ATF膜时观察到病毒保留和膜堵塞。 最近，出现了允许连续病毒收获的基于膜的技术，这可能通过缩短生物反应器内的停留时间来提高CSVY和产品质量。例如，Hein等人建立了一个自动化灌注过程，使用约10 µm孔径的管状膜（VHU）在ATF模式下连续生产和收获IAV DIPs。DIP生产在大约20×106细胞/mL的细胞浓度下启动。虽然细胞有效地保留在生物反应器中，但100%的产生的病毒颗粒通过了膜，并且没有观察到污染。在控制过程中，使用常规HF膜（孔径0.2 µm），大多数IAV DIPs保留在生产容器中。切向流深度过滤（TFDF）技术（Repligen）可能也是一个选项。在这里，使用2-5 µM孔径的膜在TFF模式下有效保留细胞，同时深度过滤允许通过过滤器收获病毒颗粒。Silva等人最近使用TFDF进料批处理/灌注设置在HEK293SF细胞中生产IAV，展示了病毒生产和通过膜的有效收获，而没有面临病毒保留、膜堵塞或增加剪切力的问题。我们实验室也使用这项技术在MDCK细胞中获得了有希望的IAV生产结果；然而，数据尚未发表。TFDF模块是可扩展的，并且从试点到2,000 L规模商业化，可能会推动疫苗流程开发朝着集成的连续下游处理发展。 克服膜污染和病毒保留问题的另一种选择是依靠重力或声波的细胞保留装置，这两种方法都已应用于流感病毒生产。声波和倾斜沉降器都允许连续病毒收获，优先保留活细胞，并且与基于膜的系统相比，施加的剪切力较低，这一点尤其关键，因为感染的细胞对剪切更为敏感。 使用声波沉降器，Petiot等人在浓度高达18×106细胞/mL的HEK293细胞中获得了有希望的结果。与批处理过程相比，灌注模式的滴度几乎高出一个数量级。随后，Granicher等人（2020年）比较了在浓度介于25至50×106细胞/mL的AGE1.CR.pIX细胞培养中声波沉降器的性能与ATF培养。由于能够连续收获病毒，至少实现了1.5倍的CSVY增加和高达3倍的体积生产力提升。这些结果再次强调了连续病毒收获对流感生产流程的重要性，并展示了声波沉降器应用的潜力。然而，这些设备主要在实验室规模上建立，在商业制造中较少见。类似地，Coronel和Gränicher等人使用倾斜沉降器在高达50×106 AGE1.CR.pIX细胞/mL的培养中达到了高细胞密度。连续收获病毒导致CSVY为3474病毒/细胞，与ATF对照培养相比增加了4.7倍，体积病毒生产力也提高了2.2倍。然而，该设备的局限性在于灌注率容量、缺乏现成的工业规模解决方案、高停留时间和温度梯度。总的来说，所有讨论的发现都强调了流感病毒生产中灌注策略的复杂进步，因为它们为细胞生长和病毒生产阶段提供了明显改善的代谢环境。 2.8.强化病毒生产的挑战：连续培养 近年来，对于各种生物制药应用，人们越来越感兴趣地使用连续制造方法替代批处理模式。在稳态下进行这样的操作可以允许延长生产阶段，同时可能导致提高生产力和效率。对于重组蛋白或非溶瘤病毒的生产，这可以通过化学计量器过程实现，其中维持进料和产品收获的均匀流速，确保一致的工作体积和营养供应。相反，许多病毒如流感是溶瘤的，需要在不同的容器中分离细胞生长和病毒传播，以避免凋亡和细胞溶解的影响。这种级联可以在最简单的情况下通过两级连续搅拌罐反应器（CSTR）系统实现。从专门用于细胞生长的初级STR，细胞被连续转移到仅用于感染和病毒传播的次级STR。 Frensing等人最初尝试在CSTR系统中连续在AGE1.CR细胞中生产IAV，未能达到预期的效益。相反，生产导致病毒滴度出现周期性振荡，与批培养相比显著降低了体积生产力。这种波动被描述为“von Magnus效应”，可以归因于DIPs的出现。DIPs本身不复制，但与感染性流感病毒颗粒的复制竞争和干扰，这可能严重限制连续流程用于IAV或其他产生DIPs病毒的生产。然而，随着管状Plug-flow生物反应器系统的发展，Tapia等人能够规避这些限制，并在AGE1.CR.pIX和MDCK细胞中展示稳定滴度的IAV生产。该系统由一个用于细胞生长的CSTR和一个用于病毒传播的105米长的管状Plug-flow生物反应器组成。通过这种方式，省略了滴度振荡，并实现了与传统批培养相比约2倍的STY。 然而，DIPs并不总是被视为IAV生产中不想要的副产品，因为它们也显示出作为预防性和治疗性抗病毒的潜力。为了进一步探索DIPs的演变，应用数学建模来描述在次级STR中不同停留时间的两个CSTR培养的实验结果。此外，Pelz等人最近使用简化的半连续设置来模拟小规模的连续病毒传播。而不是级联STRs，使用两个不同的摇瓶用于悬浮MDCK细胞的扩增和IAV生产。在21天的培养期内，由于DIPs和感染性颗粒的竞争动态相互作用，再次观察到病毒滴度的强烈周期性振荡。随后，使用下一代测序来加深对DIP形成的理解，并确定有前途的抗病毒治疗候选物。此外，这些研究还展示了DIPs在流感病毒种子病毒生产中的重要性。 尽管连续生产可能承诺与批处理相比在占地面积和制造成本上大幅减少，但进一步的限制包括对技术人员的高资质要求，以及由于设置的复杂性和延长的过程时间而增加的污染风险。因此，连续流感生产并不一定能超过提供极大灵活性和控制的批处理过程的优势。 图2. 用于流感疫苗制造的可用培养系统比较，包括贴壁细胞或悬浮细胞。STR：搅拌罐生物反应器；OSB：轨道摇动生物反应器（一次性使用）；Wave生物反应器（一次性使用）；摇瓶半灌注；ATF：交替切向流过滤；TFF：切向流过滤；TFDF：切向流深层过滤；AS：声学沉降器；IS：倾斜沉降器；HFBR：中空纤维生物反应器；半连续：两阶段半连续摇瓶培养系统；CSTR：两阶段连续搅拌罐培养系统。 2.9.一次性技术在流感病毒生产中的应用 一次性使用（SU）技术的实施在生物制药行业中逐渐获得普及，COVID-19大流行情况甚至加速了生物加工中对SU设备需求的稳定增长。根据最近的一项调查，临床上游处理中使用SU设备的运营从2014年的38.6%增加到2022年的62.9%。如今，市场上有多种生物反应器操作的SU选项，然而，决定疫苗生产中使用SU还是不锈钢（SS）技术涉及仔细平衡优势和挑战。由于它们的低周转时间，SU系统提供了极大的灵活性、快速的可扩展性和增加的生产率，使它们特别适合应对多样化市场需求和有效调整生产活动。此外，这些系统是扩大全球生产能力的关键因素，因为它们可以由于较低的资本投资、工程和运营成本而在不太发达的地区轻松建立。然而，大流行表明，当需求增加时，SU设备的供应和灭菌尤其有限。相比之下，以耐用性、安全性和适用于长期生产而闻名的SS反应器，适合可预测的大规模生产。SU与SS的可持续性问题和可提取物仍然存在争议。同样，一些SU设备由新公司提供，而这些公司并不总是在市场中保持存在。然而，特别是疫苗制造过程需要维持多年的生产，并且需要提供备选方案。因此，需要保证SU设备的质量，以允许长期供应和生产相应的疫苗。流程中的任何变化都需要证明产品质量的充分性。最后，临床和商业制造中SS系统的放大和适应性挑战可能会限制灵活性和对市场变化需求的响应能力。 对于流感病毒生产，迄今为止已经评估了几种一次性系统，包括中空纤维（HF）、固定床、轨道摇动、振荡和搅拌生物反应器系统。SU生物反应器系统的设计在质量传递和混合原理、规模和应用领域（研发或制造）方面差异很大。近年来，SU微生物反应器系统，如Sartorius的ambr系统（15 mL wv）或Merck的Erbi Breez（2 mL wv, 灌注）在早期开发中越来越受欢迎。在我们的实验室中，使用ambr15系统在微反应器规模上筛选多个单克隆MDCK细胞系进行流感病毒生产时取得了有希望的结果。平行运行多达48个SU容器，并在控制条件下自动采样，可以快速生成多个流程变化的数据。 将SU系统用于灌注模式的生产流程增加了另一层优势。例如，Coronel等人研究了在与基于膜的细胞保留装置耦合的SU轨道摇动生物反应器中的IAV生产。在比较分析中，采用ATF或TFF系统的灌注策略可以明显优于参考批处理过程。由于简单的袋式设计，无需耦合或搅拌器，系统设置容易实现，适合剪切敏感细胞，即使在高细胞密度下，AGE1.CR.pIX细胞的氧气需求也能得到满足。此外，该系统适用于放大，因为商业上可用的工作体积在1.5 L到2,500 L之间（Kühner）。许多其他供应商也提供高达6,000 L的SU系统（例如ABEC）。 总的来说，SU系统可以提供灵活、完全可扩展的即插即用生物反应器操作，特别是高效的灌注流程与一次性设备的有限体积容量完美契合。它们已经普遍用于重组蛋白的制造；我们在基于细胞培养的疫苗生产领域看到了类似的潜力。 3.展望和结论 在过去二十年中，为了建立和加强基于细胞培养的流感疫苗制造流程，已经取得了许多技术进步。从传统的基于鸡蛋的生产向基于细胞培养的方法转变似乎越来越不可避免，特别是随着准连续流程的选择，旨在提高效率和降低成本。然而，剩余的挑战包括优化细胞系和培养基以获得更高的病毒产量、实施先进的在线监测工具以及适应新方式的下游处理。实现具有高病毒生产力的小占地面积的稳健和可扩展的灌注策略可能是满足日益增长的疫苗需求的关键。然而，疫苗生产中批处理和连续模式之间的选择取决于多个因素，包括生产规模、成本效益、流程控制、产品质量和监管考虑。在某些情况下，具有高性能细胞系的稳健批处理过程仍然可以胜过灌注过程，并且以更简单的设置和较少的工程和运营任务要求而更具说服力。此外，行业正在积极探索在研发和制造两个领域整合SU技术。在这里，技术进步和加强流程的结合可以导致有效的上游流程，这些流程可以逐步使用更小的设备完成，这有利于SU技术的实施，除了提高灵活性和降低污染风险。随着基于细胞培养的流感疫苗生产的进展，解决这些挑战对于实现这种方法的全部潜力至关重要，最终可能取代基于鸡蛋的生产。这包括完善流程强化策略、建立平台流程、确保产品一致性以及优化整个生物加工工作流程，以满足大规模疫苗生产的需求和对新出现的流感毒株的快速响应。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 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