铁死亡新突破！浙江大学研究团队：肝癌耐药问题的新解决方案

2024-09-03

索拉非尼在晚期肝细胞癌（HCC）治疗中被广泛应用。然而，其有效性受到耐药性发展的限制。2023年8月29日，浙江大学与杭州医学院的研究人员在《Journal of Experimental & Clinical Cancer Research》期刊上发表了一篇题为“CCT3/ACTN4/TFRC轴通过抑制铁内吞作用保护肝细胞癌细胞免受铁死亡”的研究论文。研究发现，含有热休克蛋白伴侣TCP1亚基3（CCT3）的蛋白质赖氨酸21（K21）泛素化与索拉非尼耐药性相关。对索拉非尼治疗的HCC患者转录组数据分析显示，与非响应者相比，响应者的CCT3表达较低。实验表明，抑制CCT3表达可以增强HCC细胞对索拉非尼的敏感性，并增强索拉非尼诱导的铁死亡。此外，研究发现CCT3与ACTN4相互作用，阻碍转铁蛋白受体蛋白1（TFRC）的循环，从而阻碍铁的内吞作用。机制上，CCT3通过K6连接的非降解性泛素化在K21上的去泛素化抑制铁死亡，该过程在索拉非尼治疗时发生。CCT3敲低可增强索拉非尼在裸鼠体内的抗肿瘤效果。

总体而言，研究人员发现了一种新型热休克蛋白伴侣蛋白的功能。靶向CCT3/ACTN4/TFRC轴提供了一种有前途的策略，可以增强铁死亡并克服索拉非尼耐药性在HCC中的作用。

肝癌在全球所有癌症类型中排名第六，是第三大癌症相关死亡原因。在原发性肝癌中，肝细胞癌（HCC）最常见。在HCC的早期阶段，手术干预仍然是主要治疗模式。然而，大约50%的晚期HCC病例需要索拉非尼和局部消融作为主要治疗策略。索拉非尼是一种口服多靶点酪氨酸激酶抑制剂，通过靶向血管内皮生长因子受体（VEGFR）、血小板衍生生长因子受体（PDGFR）、Raf家族激酶等，有效抑制肿瘤细胞增殖和血管生成。因此，HCC患者的生存率有所改善。尽管索拉非尼对治疗HCC有效，但它对患者总生存期的影响有限，仅延长了三个月。耐药的出现给索拉非尼治疗HCC患者的有效性带来了重大挑战。深入了解肝癌中索拉非尼耐药的分子机制，有助于改善疾病预后，并有助于识别能够绕过化疗耐药的治疗靶点。

表观遗传学、转运过程、肿瘤微环境和调控性细胞死亡已被确定为索拉非尼耐药的潜在触发因素和贡献者。在治疗耐药机制领域，越来越多的关注集中在铁死亡上，其在形态学、生化和遗传学方面的特征与凋亡、自噬、坏死和其他形式的细胞死亡不同。在铁死亡过程中，铁和脂质过氧化显著积累。主要调节机制包括Xc系统、谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）活性和活性氧（ROS）产生。与其他酪氨酸激酶抑制剂不同，索拉非尼能够在多种癌细胞系中诱导铁死亡。研究表明，铁死亡与索拉非尼在HCC中的耐药性有关。然而，需要进一步研究来阐明索拉非尼耐药性中铁死亡的分子机制。

为了探究CCT3如何促进HCC对索拉非尼的耐药，研究人员对97L和LM3细胞在索拉非尼治疗和CCT3表达抑制后的蛋白质表达进行了全面分析。研究结果显示，97L和LM3细胞在索拉非尼治疗和CCT3抑制后出现了显著的蛋白质表达变化。KEGG途径分析表明，抑制CCT3后，差异表达的蛋白质涉及谷胱甘肽代谢、自噬和内吞作用，这些过程与细胞内铁运输和铁死亡有关。研究人员通过GO分析也证实了CCT3敲低的有效性。研究人员使用KEGG进行的分析还揭示了索拉非尼响应中涉及铁死亡、活性氧和氧化磷酸化的情况。蛋白质组学研究的综合结果表明，抑制CCT3可增强索拉非尼的敏感性，这可能是通过诱导铁死亡实现的。

为了验证这一假设，研究人员使用了3-甲基腺嘌呤（3-MA）、Necrostatin-1（Nec-1）、Z-VAD-FMK、去铁胺（DFO）和Ferrostatin-1（Fer-1）分别抑制自噬、坏死、凋亡和铁死亡。研究结果表明，只有铁死亡抑制剂DFO和Fer-1减弱了CCT3对索拉非尼敏感性的影响，而其他细胞死亡途径的抑制剂则没有。通过使用FerroOrange，研究人员观察到，CCT3表达下调导致索拉非尼处理的97L和LM3细胞中二价铁离子的积累增加。此外，CCT3敲低还促进了这些细胞中的脂质过氧化。研究结果表明，CCT3水平降低导致细胞内谷胱甘肽水平降低。透射电子显微镜的实验结果显示，CCT3表达减少导致97L和LM3细胞线粒体体积减小、膜密度增加。拯救实验揭示，CCT3过表达减轻了索拉非尼处理后97L和LM3细胞中铁离子积累的影响。总之，CCT3在HCC细胞中起着索拉非尼诱导的铁死亡抑制剂的作用。

研究人员通过小鼠实验进一步研究了CCT3在体内对索拉非尼疗效的影响。结果表明，CCT3持续敲低与索拉非尼联合使用导致肿瘤体积和质量显著下降。CCT3敲低组肿瘤组织中的4-HNE染色强度在索拉非尼治疗后超过对照组，表明肿瘤内氧化应激加剧。基于这些结果，CCT3敲低后，索拉非尼的铁死亡诱导和肿瘤抑制作用得到增强。

总之，本研究通过蛋白质翻译后修饰组学和CRISPR/Cas9敲除文库筛选的方法，鉴定出CCT3为与索拉非尼耐药相关的重要基因。研究发现CCT3通过与ACTN4的相互作用阻碍TFRC的循环，这一调节机制受K6连接的K21位点泛素化调控。研究揭示了分子伴侣的新功能和铁死亡的负反馈机制，对HCC治疗和解决索拉非尼耐药问题具有重要临床意义。

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