TRRAP

引言 在真核细胞中，核小体是染色质的基本组成单元，其可以通过改变自身的定位、共价修饰组蛋白及置换组蛋白变体的方式来改变染色质的结构和调控基因表达。核小体的这些调控主要由染色质重塑复合物和组蛋白修饰复合物来执行。人源TIP60复合物（hTIP60）是一个具有 17 个亚基的超大型复合物（分子量约为1.7 MDa），它的独特之处在于同时拥有组蛋白变体置换和组蛋白乙酰化活性。根据酶活和分子组成上的相似性，hTIP60被认为是酵母中 SWR-C复合物（ySWR-C）和 NuA4复合物（yNuA4）的融合物。之前的研究表明，hTIP60在多种生物学过程中发挥重要作用，包括转录调控、DNA修复、细胞周期控制和胚胎发育等，同时hTIP60的突变被认为与多种癌症相关。 过往的研究报道了hTIP60 复合物的同源物如 ySWR-C、 yNuA4、hSRCAP-C等复合物的高分辨冷冻电镜结构，从结构生物学的角度阐明了这些复合物结合底物核小体并发挥活性的机制，另外也有一些研究通过晶体学、核磁共振波谱（NMR）等技术对 hTIP60 复合物的部分亚基如YL1、YEATS4、MRG15-MRGBP、EPC1-MBTD1等进行了结构分析，而hTIP60 复合物的完整结构信息一直处于空白状态，因此目前该复合物的组装及其结合核小体的模式仍然很不清楚。 2024年8月17日，复旦大学徐彦辉团队在Nature Communications杂志上在线发表了题为Structure of the human TIP60 complex的研究论文。该研究利用单颗粒冷冻电镜技术，结合交联质谱及体外生化功能分析阐明了hTIP60复合物精细的分子组装机制，并提出了该复合物作用于核小体的模型。 根据已有的关于hTIP60复合物的报道及其与yNuA4和ySWR-C复合物的同源性研究，由17个亚基组成的hTIP60复合物可被划分为5个模块，其分别为含有Snf2家族ATPase结构域的motor 模块、调节性的ARP模块、发挥乙酰化功能的HAT模块、含有多个组蛋白修饰阅读器的TINTIN（Trimer Independent of NuA4 for Transcription Interactions with Nucleosomes）模块、以及用于结合转录激活因子的TRRAP模块（图1）。 图1. 人源TIP60复合物的模块化组织和结构域示意图(Credit: Nature Communications) 徐彦辉课题组的这项工作报道了hTIP60复合物单体状态下的冷冻电镜结构，9.4 Å的整体冷冻电镜密度图表明该复合物主要由两大部分构成，这两部分被称为核心亚复合物（包括motor 模块及ARP模块）和 TRRAP模块，它们通过一段柔性区域连接（图1a），随后研究人员将这两部分的分辨率均细化至3.2 Å（图1b）。这些结构表明EP400亚基作为hTIP60复合物的骨架蛋白，整合了复合物的motor 模块、ARP（actin-related protein）模块和TRRAP 模块。在motor模块中，RUVBL1-RUVBL2六聚体是EP400亚基的ATPase结构域和YL1亚基组装的刚性核心。在ARP模块中，ACTL6A-ACTB异二聚体和一个额外的ACTL6A 亚基通过疏水作用与EP400 亚基的HSA螺旋进行接触；而亚基 DMAP1、EPC1和EP400之间的相互作用网络增强了ACTL6A-ACTB异二聚体和EP400-HSA之间的结合。在TRRAP模块中，EP400亚基的 SANT结构域及其C端区域与TRRAP亚基存在广泛的相互作用界面。总体来看，ARP模块与motor模块之间的连接非常稳定，而其与TRRAP模块之间的连接非常灵活，这是hTIP60复合物特有的结构特征。 除了上述已经确定的模块外，hTIP60 复合物的整体冷冻电镜密度图中TRRAP模块和核心亚复合物之间还存在了一些较弱的密度，这些密度可能属于hTIP60复合物其他的模块，包括HAT模块和TINTIN模块（图2a）。因此在hTIP60复合物中，其HAT模块、TINTIN模块和TRRAP模块都以灵活的方式连接到核心亚复合物中，这种结构上的可塑性可能有助于该复合物在细胞中识别复杂的染色质环境并找到合适的底物。 图2. 人源TIP60复合物单体的结构：(a). hTIP60 复合物在低轮廓水平（low contour level，左）和高轮廓水平（high contour level，右）的整体冷冻电镜密度图。(b). 人源TIP60复合物单体状态下的冷冻电镜重构密度图及三维模型。(Credit: Nature Communications) 此外，该研究还报道了与核小体结合的hTIP60复合物的较低分辩率的冷冻电镜结构，该结构显示核小体结合在hTIP60复合物的核心亚复合物和TRRAP模块之间（图3），值得注意的是，在对hTIP60-核小体复合物的冷冻电镜数据进行仔细的分析后，研究人员并未观察到hTIP60的核心亚复合物像其他重塑复合物那样（即催化亚基的ATPase结构域抓住核小体的DNA以进行染色质重塑）结合核小体的构象。 图3. 核小体结合状态下的人源TIP60复合物的冷冻电镜重构密度图及模型(Credit: Nature Communications) 综上所述，该研究揭示了hTIP60 复合物的 motor 模块、ARP 模块和 TRRAP 模块高分辨的结构信息，阐明了该复合物的分子组装机制及各模块之间的相互作用模式；并首次报道了和核小体结合的hTIP60复合物的冷冻电镜重构密度图，从结构生物学的角度对该复合物如何与核小体作用提供了见解，为继续探索hTip60复合物作用于染色质并调控基因表达的机制提供了线索。 参考文献 https://www-nature-com.libproxy1.nus.edu.sg/articles/s41467-024-51259-z 责编|探索君 排版|探索君 文章来源|“BioArt” End 往期精选 围观 一文读透细胞死亡(Cell Death) | 24年Cell重磅综述（长文收藏版） 热文 Cell | 是什么决定了细胞的大小？ 热文 Nature | 2024年值得关注的七项技术 热文 Nature | 自身免疫性疾病能被治愈吗？科学家们终于看到了希望 热文 CRISPR技术进化史 | 24年Cell综述

p53是一种重要的抑癌基因，也是人类癌症中最常见的突变基因。突变型p53除了失去其抑癌功能外，通常还具有固有的、新的致癌功能，被称为“功能获得”。越来越多的证据表明，突变p53与晚期恶性肿瘤和不良预后密切相关，这使其成为开发新的癌症治疗方法的靶点。本文就肿瘤中突变p53的类型和突变p53基因谱系以及靶向突变p53用于肿瘤治疗的新策略做一个简要介绍。肿瘤中的突变型p53蛋白p53位于人17号染色体短臂(17p13.1)，由11个外显子、10个内含子和393个氨基酸残基组成。p53蛋白是一种转录因子，通常分为三个功能区：氨基末端结构域、DNA结合域和羧基末端结构域。野生型p53(wt p53)通过调控多个靶基因的转录，在许多重要的生物学过程中发挥关键作用。然而，突变的p53不仅失去了wt p53的肿瘤抑制功能，而且还获得了促进恶性肿瘤进展的新功能。p53的主要突变类型包括错义突变、截断突变、框架内突变和剪接突变。错义突变导致单一氨基酸替换，在肿瘤发生过程中显示出功能增强的活性，例如促进肿瘤细胞侵袭和迁移的p53 R175H和R273H突变。截短突变会导致蛋白质截断，这也可以促进肿瘤的发展。例如，p53外显子6截断突变体R196*和R213*促进肿瘤细胞的增殖和转移。框架内突变由核苷酸的缺失或插入引起。剪接突变是由发生在剪接部位的突变引起的。因此，不同的p53突变类型是由不同的机制引起的，并有助于肿瘤的恶性发展(图1)。图1. p53的主要突变类型大约80%的p53突变是错义突变。它主要位于编码DNA结合域的第5-8外显子，最常见的突变位点出现在R175、G245、R248、R249、R273和R282。使用COSMIC数据库表明，大多数替代突变是G到A的转变，其次是C到T的转变(图2)。错义突变通常分为两类。一类是DNA接触性突变，发生在与DNA接触的氨基酸中，导致p53无法与DNA结合，如p53 R273H和R248Q突变体。另一类是构象突变，发生在维持结构的氨基酸中，导致蛋白质未折叠，如p53 R175H、Y220C和R249S突变体。有趣的是，并不是所有的突变都是等同的。例如，接触突变体对p63或p73的亲和力低于构象突变体。氨基末端反式激活区域的突变导致p53的截短形式，它可以激活凋亡靶基因。然而，大多数突变发生在wtp53 DNA结合区，并导致功能失活。同一残基的不同单一氨基酸取代也有不同的影响。p53 R175C突变同时诱导细胞周期停滞和细胞凋亡，p53 R175P突变只诱导细胞周期停滞，而p53 R175D突变同时失去这两种功能。此外，p53突变会增加结构的不稳定性，并将包裹在p53疏水核心中的黏附序列暴露在蛋白质表面，从而推动p53聚集体的形成。突变的p53还可以与p63和p73共同聚集，阻止p63和p73进入细胞核执行转录调控功能。图2. COSMIC数据库显示的常见错义突变肿瘤中突变型p53的基因谱证据表明，不同肿瘤的p53突变谱不同。癌症基因组学数据库显示，来自10,000名癌症患者的肿瘤组织样本中，p53突变的频率为42%。但不同类型肿瘤的突变频率不同，小细胞肺癌突变频率为89%，结直肠癌突变频率为72%。而在甲状腺癌、宫颈癌和骨癌等恶性肿瘤中，p53突变的频率较低(图3)。在肺癌和肝癌中，G：C到T：A的错位是最常见的替换。在结直肠癌、脑肿瘤和白血病中，突变大多发生在CpG二核苷酸热点。在食道癌中，A：T碱基对突变更为常见。此外，同一器官中不同肿瘤亚型的Tp53突变谱也不同。图3. 不同肿瘤中p53基因的突变频率突变p53的调控机制突变p53蛋白在肿瘤中的积聚突变型p53在肿瘤细胞中高度表达，这是其获得功能活性所必需的。然而，突变p53在肿瘤中积聚的确切机制还不完全清楚。翻译后修饰是许多细胞信号事件的中心，也在调控p53中发挥重要作用。wt p53作为一种DNA序列特异性转录调节因子，在感应到各种压力信号时被激活，翻译后修饰可以调节其激活。与wtp53类似，转录后修饰，如磷酸化、乙酰化和泛素化，也可以调节突变p53的水平。研究报道，突变的p53可以通过Ser15、Thr81和Ser392位的磷酸化修饰。DNA-PK使Ser15/Ser37上的突变p53磷酸化有利于突变p53的稳定，并增强其在卵巢癌中的功能获得活性。此外，突变的p53可以通过乙酰化进行修饰。TRRAP是几个组蛋白乙酰转移酶复合体的组成部分，过度表达TRRAP会增加突变p53的水平，而沉默TRRAP会减少淋巴瘤和结肠癌中突变p53的积累。除了磷酸化和乙酰化外，泛素化也参与了对突变p53的调控。在正常情况下，wt p53在MDM2的负反馈调节下保持在低水平，其靶向p53蛋白酶体介导的降解。但是，突变的p53不能有效地激活MDM2，导致MDM2的负调控作用丧失。突变p53发挥功能获得作用不同的p53突变体利用不同的机制来发挥功能获得(图4)。首先，突变p53与转录因子(TF)结合，以执行其功能。wt p53识别并与DNA反应元件(RE)结合，然后招募TF、组蛋白乙酰转移酶(HAT)、与乙酰化组蛋白结合的染色质重塑复合体，以及与启动子结合形成预起始复合体的RNA聚合酶II。然而，突变的p53不能与p53 DNA RE结合，它通过不同的机制发挥其功能获得活性来促进肿瘤的发生。例如，突变的p53与不同的转录因子和辅因子结合，如NF-Y、p73、NRF2、ETS-1，并调节其靶基因的转录。作为对DNA损伤的反应，突变的p53与NF-Y目标启动子结合，并招募p300来乙酰化组蛋白，导致细胞周期基因的过度表达，并促进恶性肿瘤的发展。在某些情况下，突变的p53可以结合到DNA的某些特定结构上，并调节转录，如基质附着区。此外，突变的p53可以与其他蛋白质相互作用，从而改变或抑制它们的功能。在结直肠癌和胰腺癌中，突变的p53通过Notch1信号通路拮抗p63/p73介导的肿瘤抑制。 图4. 突变P53的转录模型及其在肿瘤中的作用肿瘤治疗策略恢复突变p53 wt活性重新激活突变p53 的wt活性是减缓肿瘤进展的有效策略(图5)。许多研究发现，小分子化合物和多肽药物可以诱导突变p53的空间构象和折叠模式的改变，如CP-31398、RITA、PEITC、NSC319726、Chetomin、ReACp53和PCAPS。另外APR-246、COT1-2、PC14586和Arsenic Trioxide (ATO)目前正在进行临床试验。APR-246又称Prima-1MET，其体内活性形式为亚甲基喹诺酮。它通过共价结合突变p53的DNA结合域，恢复野生型构象和抗肿瘤转录活性。APR-246在食管腺癌、急性髓系白血病和三阴性乳腺癌中具有显著的抗肿瘤活性。COTI-2可以重新激活突变的p53并恢复DNA结合特性，从而抑制细胞生长并诱导细胞凋亡。PC14586是p53 Y220C突变的再激活剂，目前正在进行临床试验。ATO可以靶向结构突变的p53并恢复转录活性。因此，这些研究表明，将突变的p53恢复到wt构象是一种很有前途的抗肿瘤策略。图5. 携带突变p53的肿瘤细胞的治疗策略突变型p53的降解突变型p53可以形成稳定的聚集体，在细胞中积累，并在癌症进展中发挥重要作用。因此，促进突变p53的降解也可能表现出抗肿瘤作用。一些药物，如gambogic acid、capsaicin、MCB-613和NSC59984可以降解突变的p53。肿瘤免疫治疗越来越多的证据表明，p53可以调节先天和获得性免疫反应。wt p53是TLR 8介导的免疫反应的重要组成部分。wt 53还通过诱导TAP1参与MHC-I抗原提呈通路的激活。然而，p53基因突变会影响T细胞的募集和活性，导致免疫逃避并促进癌症进展。在肺癌中，突变的p53抑制了STING-TBK1-IRF3复合体的形成，导致天然免疫信号通路的失活。另外，突变的p53被发现具有免疫原性，并可以作为新的抗原来触发免疫反应。例如，在肺腺癌中，突变p53促进了PD-L1的表达和CD8+T细胞的渗透，并增强了肿瘤的免疫原性。因此，携带突变p53的患者可能对PD-1阻断免疫疗法更敏感。此外，P1C1TM是一种工程化的T细胞受体样抗体，它区分表达HLA-A24+的突变p53和wt p53，并在携带突变p53的细胞中介导抗体依赖的细胞毒性。P1C1TM与PNU-159682的联合可特异性抑制肿瘤的生长。H2-scDb是一种双特异性抗体，能特异性识别携带p53 R175H突变的癌细胞，并在体内外有效激活T细胞杀伤肿瘤细胞。除了抗体，肿瘤疫苗在免疫治疗中也发挥着至关重要的作用。INGN-225是一种p53修饰腺病毒介导的树突状细胞疫苗。在小细胞肺癌的II期临床试验中，INGN-225被证明能诱导显著的免疫反应并提高化疗的疗效。因此，了解突变p53在免疫调节中的作用将有助于开发更有效的抗肿瘤免疫疗法。其他疗法许多研究发现，干扰蛋白质相互作用、协同致死治疗、基因治疗和基因组编辑也可以用作靶向突变p53的治疗策略。突变p53通过与多种蛋白质相互作用发挥功能。因此，干扰蛋白质相互作用也可以是一种策略。RETRA是一种小分子化合物，可以从突变的p53-p73复合体中释放p73，从而抑制肿瘤的发展。在正常情况下，当DNA损伤时，细胞会依赖wt p53诱导的G1期阻滞进行修复。有趣的是，当p53发生突变时，癌细胞将依靠G2-M检查点来修复受损的DNA。因此，在具有p53突变的人类癌症中，AZD1775和UCN-01通常被用作合成致死剂。AZD1775是一种有效的、选择性的WEE1抑制剂，已进入II期临床试验。研究表明，它提高了卡铂治疗携带突变p53的卵巢癌的疗效。UCN-01是一种选择性蛋白激酶C抑制剂。它增强了丝裂霉素对携带突变p53的人表皮细胞癌和胰腺癌的毒性，UCN-01和inotuzumab ozogamicin的联合应用显著增加了细胞死亡。通过腺病毒将wtp53基因导入癌细胞是挽救肿瘤中p53活性的直接策略。Gendicine是第一个被批准用于治疗各种类型癌症的基因治疗产品，包括头颈癌、肺癌、乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌、肝癌和胰腺癌。Gendicine联合化疗和放射治疗通常比单独使用标准疗法产生更高的有效率。重要的是，p53的突变状态不会显著影响接受Gendicine治疗的患者的结果和长期存活率。Onyx-015是一种E1B区缺失的腺病毒，可以在wtp53缺陷的癌细胞中复制并产生细胞溶解。与携带wtp53的小鼠相比，Onyx-015治疗显著提高了携带突变p53的小鼠的存活率。小编小结肿瘤中存在极高概率的p53突变。从大量的实验数据中，已经发现突变的p53在促进癌症恶性表型中起着关键作用。因此，它被认为是治疗多种癌症的有吸引力的靶点。然而，仍然存在许多悬而未决的问题。首先，p53在50%以上的肿瘤中发生突变，那么影响p53突变类型和突变谱的因素有哪些？其次，翻译后修饰在突变p53的积累中起着重要作用。翻译后修饰是如何调节突变的p53发挥作用的，其具体的调控机制是什么？第三，目前的研究主要集中在p53的突变热点上。目前还不确定具有不同残基和不同功能结构域的p53突变是否发挥相同的功能获得，以及它发挥功能获得的机制是什么？第四，突变的p53通常被认为是“无法下药”的。近年来，尽管有研究报道已开发出多种靶向突变p53的小分子化合物或多肽药物，但进入临床试验的药物寥寥无几，尚未有靶向突变p53的药物被批准上市用于肿瘤治疗。显然，未来对突变p53仍有更多的研究要做。参考文献1.Mutant p53 in cancer: from molecular mechanism to therapeutic modulation.2.Should mutant TP53 be targeted for cancer therapy?