BOK

引言 作为细胞进行有氧呼吸和能量生产的主要场所，线粒体（mitochondria）是一种几乎存在于所有真核细胞中的细胞器，被称作细胞的“动力工厂”。近年来研究发现除了为细胞基本生命活动提供能量，线粒体还在细胞信号转导、代谢产物合成、基因转录调控和细胞凋亡等过程中扮演重要角色【1,2】。以上线粒体功能的研究主要在单细胞真核生物（例如酵母）或体外培养细胞系中完成，对于其在高等生物体内细胞增殖、分化和命运决定过程中的功能性研究还十分有限。此外，在多细胞构成的组织与器官水平下，线粒体损伤导致的细胞胁迫对于不同类型细胞生命活动的影响是否具有偏好性仍是一个有待解决的问题。 2024年8月23日，加州大学圣地亚哥分校孙欣实验室在Cell Stem Cell杂志在线发表了题为“Context-dependent roles of mitochondrial LONP1 in orchestrating the balance between airway progenitor versus progeny cells”的研究论文。该研究揭示了线粒体在呼吸道上皮组织发育、稳态维持以及损伤修复中的功能，并且发现线粒体在同一组织中以细胞特异性的方式调控细胞增殖分化、凋亡或者长距离迁移。 在静止状态下，成人每分钟呼吸的空气体积有大约12升，而在运动时每分钟会消耗多达100升的空气。作为体内与吸入空气初次接触的部位和运输气体的唯一通道，呼吸道上覆盖着一层上皮组织，主要由三种不同类型的细胞构成：棒状细胞（club cell）分泌富含水解蛋白酶的粘液，负责湿润和净化吸入的空气；纤毛细胞（ciliated cell）通过纤毛韵律摆动不断将气道中的灰尘和病菌混合黏液排送到咽喉，进而通过咳出或者咽下食道来排出体外；基底细胞（basal cell）是位于呼吸道基底膜上的干细胞，可以不断自我更新和分化为上述两种细胞，及时修复受损的呼吸道。近期研究发现在肺部受到严重病毒侵染后（例如流感或新冠病毒），基底细胞会被激活并迁移到远离呼吸道的肺间质受损区域，在那里进行异位分化和组织修复【3-5】。除此之外，呼吸道上皮组织还包括一些数量较少的肺神经内分泌细胞（PNEC）、杯状细胞（goblet cell）、簇细胞（tuft cell）、离子转运细胞（ionocytes）和小丘基底细胞（hillock cell）。从胎儿出生时的第一口呼吸开始，多细胞精密分工的呼吸道上皮组织就时时暴露在充满污染和病菌的空气中，导致呼吸道相关疾病（慢性阻塞性肺病，COPD）已经跃升为世界第三致死病因【6】。而线粒体异常经常发现于呼吸道疾病中【7】，暗示其在呼吸道上皮组织中具有重要功能。 为了系统研究线粒体在肺呼吸道上皮组织形态建成和稳态维持中的功能，本文研究人员在小鼠呼吸道上皮组织中特异性敲除了一个名为Lonp1的基因，此基因编码一个定位于线粒体基质中的蛋白酶，对维持线粒体正常功能至关重要【8】。在胚胎发育时期，研究人员发现线粒体受损的呼吸道上皮组织无法分化出棒状细胞和纤毛细胞，而基底细胞表现出增生和异常分化；在呼吸道细胞已经完全分化的成体小鼠中，线粒体受损后导致上皮组织在短时间内重塑，棒状和纤毛细胞数量显著减少，基底细胞不仅在气管上皮组织中增生，而且在肺部支气管上皮组织（正常状态下小鼠肺部不存在基底细胞）中出现成片状的异位增生。与此同时，杯状细胞（goblet cell）大量的在支气管近端分化。上述在线粒体受损肺部的细胞组成变化与COPD病人肺部病理特征惊人相似。进一步，研究人员通过在COPD病人肺组织中分析单细胞测序数据以及免疫荧光染色证实Lonp1的蛋白表达水平，而非RNA转录本水平，在病变的呼吸道上皮细胞中显著减少，表明Lonp1的转录后调控亦或是COPD的致病机制之一。 为了研究线粒体调控呼吸道上皮组织的细胞特异性，研究人员分别在棒状、纤毛和基底细胞中敲除Lonp1，并在萘诱导气道上皮急性损伤修复模型中研究细胞增殖与分化。研究人员意外地发现线粒体受损特异性导致纤毛细胞凋亡，而对于棒状细胞和基底细胞的存活、增殖与分化并没有显著影响。进一步实验证实在呼吸道上皮组织中纤毛细胞的持续凋亡会直接导致与COPD呼吸道病理相似的细胞表型。通过普通转录组和单细胞转录组测序分析，研究人员发现缺失Lonp1引起的线粒体受损选择性地在纤毛细胞中激活下游整合应激反应（integrated stress response, ISR）通路。体内药物靶点抑制和遗传互补实验证实是ISR通路的激活导致了纤毛细胞凋亡，以及由此产生的一系列细胞重塑反应。 为了探索线粒体在基底细胞迁移中的功能，研究人员使用甲型流感病毒（Influenza A virus）侵染Lonp1敲除和对照小鼠。实验结果表明Lonp1敲除后的基底细胞驻留在呼吸道上皮组织，不能迁移到远端肺部受损的部位进行修复。进一步实验证实ISR通路在这些驻留的基底细胞中被激活，并且导致细胞周期阻滞。遗传互补实验证实ISR通路的激活是导致这些基底细胞驻留的直接原因。综上所述，该项研究发现在呼吸道上皮组织中由LONP1介导的线粒体稳态通过抑制ISR通路促进：1）胚胎发育中原始干细胞的增殖与分化；2）成体稳态下纤毛细胞的存活；3）肺损伤修复中基底细胞的迁移。 上述研究的发现伴随着一个有趣的问题：细胞对于线粒体损伤反应的特异性是如何决定的？通过在成体稳态和病毒侵染下呼吸道上皮组织单细胞测序分析，研究人员发现促细胞凋亡因子Bok特异性地在纤毛细胞和病毒激活的基底细胞中表达。在Lonp1突变体中进一步敲除Bok可以有效的抑制ISR通路在纤毛细胞和驻留基底细胞中的激活，并在一定程度上回补了Lonp1单独敲除的细胞表型。已经发表的工作表明BOK蛋白高度富集在线粒体-内质网膜偶联处【9】。因此，细胞特异性表达的BOK起到桥梁的作用，对线粒体损伤信号的传导不可或缺。 模式图（Credit: Cell Stem Cell） 参考文献 1. Monzel, A.S., Enriquez, J.A., and Picard, M. (2023). Multifaceted mitochondria: moving mitochondrial science beyond function and dysfunction. Nat Metab 5, 546-562. 10.1038/s42255-023-00783-1. 2. McBride, H.M., Neuspiel, M., and Wasiak, S. (2006). Mitochondria: More than just a powerhouse. Current Biology 16, R551-R560. 10.1016/j.cub.2006.06.054. 3. Ray, S., Chiba, N., Yao, C., Guan, X., McConnell, A.M., Brockway, B., Que, L., McQualter, J.L., and Stripp, B.R. (2016). Rare SOX2(+) Airway Progenitor Cells Generate KRT5(+) Cells that Repopulate Damaged Alveolar Parenchyma following Influenza Virus Infection. Stem Cell Reports 7, 817-825. 10.1016/j.stemcr.2016.09.010. 4. Vaughan, A.E., Brumwell, A.N., Xi, Y., Gotts, J.E., Brownfield, D.G., Treutlein, B., Tan, K., Tan, V., Liu, F.C., Looney, M.R., et al. (2015). Lineage-negative progenitors mobilize to regenerate lung epithelium after major injury. Nature 517, 621-625. 10.1038/nature14112. 5. Kumar, P.A., Hu, Y., Yamamoto, Y., Hoe, N.B., Wei, T.S., Mu, D., Sun, Y., Joo, L.S., Dagher, R., Zielonka, E.M., et al. (2011). Distal airway stem cells yield alveoli in vitro and during lung regeneration following H1N1 influenza infection. Cell 147, 525-538. 10.1016/j.cell.2011.10.001. 6. Chen, S., Kuhn, M., Prettner, K., Yu, F., Yang, T., Barnighausen, T., Bloom, D.E., and Wang, C. (2023). The global economic burden of chronic obstructive pulmonary disease for 204 countries and territories in 2020-50: a health-augmented macroeconomic modelling study. Lancet Glob Health 11, e1183-e1193. 10.1016/S2214-109X(23)00217-6. 7. Aghapour, M., Remels, A.H.V., Pouwels, S.D., Bruder, D., Hiemstra, P.S., Cloonan, S.M., and Heijink, I.H. (2020). Mitochondria: at the crossroads of regulating lung epithelial cell function in chronic obstructive pulmonary disease. Am J Physiol-Lung C 318, L149-L164. 10.1152/ajplung.00329.2019. 8. Gibellini, L., De Gaetano, A., Mandrioli, M., Van Tongeren, E., Bortolotti, C.A., Cossarizza, A., and Pinti, M. (2020). The biology of Lonp1: More than a mitochondrial protease. Int Rev Cel Mol Bio 354, 1-61. 10.1016/bs.ircmb.2020.02.005. 9. Carpio, M.A., Means, R.E., Brill, A.L., Sainz, A., Ehrlich, B.E., and Katz, S.G. (2021). BOK controls apoptosis by Ca(2+) transfer through ER-mitochondrial contact sites. Cell Rep 34, 108827. 10.1016/j.celrep.2021.108827. https://doi-org.libproxy1.nus.edu.sg/10.1016/j.stem.2024.08.001 责编|探索君 排版|探索君 文章来源|“BioArt” End 往期精选 围观 一文读透细胞死亡(Cell Death) | 24年Cell重磅综述（长文收藏版） 热文 Cell | 是什么决定了细胞的大小？ 热文 Nature | 2024年值得关注的七项技术 热文 Nature | 自身免疫性疾病能被治愈吗？科学家们终于看到了希望 热文 CRISPR技术进化史 | 24年Cell综述

引言 细胞死亡在生物体的发育和稳态维持中起着关键作用。不同形式的细胞死亡，包括凋亡（Apoptosis）、坏死性凋亡（Necroptosis）、焦亡（Pyroptosis）和铁死亡（Ferroptosis），不仅在清除受损或过时的细胞中发挥作用，也在抑制病原体扩散中扮演重要角色。24年1月，Cell杂志刊文综述了各种细胞死亡路径的信号机制，探讨这些细胞死亡过程的异常激活或抑制如何导致疾病，并讨论了针对细胞死亡失衡状态的现有和潜在治疗方法。 细胞死亡可以是非溶解性的，且在免疫上相对沉默（凋亡），或者是溶解性的且促炎症的（坏死）。在多细胞生物中，基因程序化的细胞死亡被认为是维持稳态的重要支柱，但即使是单细胞生物也可以通过细胞死亡来抵御病原体或为适应营养匮乏而限制群落大小。非溶解性的细胞死亡程序最初是基于其形态学特征来定义的，这些特征包括细胞质空泡化、核浓缩和细胞膜起泡。其背后的分子机制在三个不同领域的多年研究之后才逐渐清晰。首先是认识到在遗传上易于操作的秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）中某些细胞可重复地经历凋亡。随后的遗传筛选识别出了细胞死亡的介导者（egl-1、ced-3和ced-4）和细胞死亡的抑制因子（ced-9），尽管当时它们还不能被赋予可识别的生化活性。关于ced-3功能的认识来自于对哺乳动物促炎症白细胞介素-1β（IL-1β）成熟的蛋白酶的鉴定。CED-3与这种现在被称为半胱天冬酶-1（caspase-1）的IL-1β转化酶之间的同源性促使人们认识到CED-3 是一种蛋白酶，并且秀丽隐杆线虫中的程序化细胞死亡是由蛋白水解驱动的。 ced-9基因在哺乳动物中有一个功能对应物，即B细胞淋巴瘤基因2（BCL-2），这是一种在人类滤泡性淋巴瘤中通过染色体易位激活的原癌基因。与许多其他原癌基因不同，BCL-2并不诱导增殖，而是抑制细胞死亡，并且能够在线虫中功能性地替代ced-9。在这些关键发现之后，进一步鉴定出了额外的哺乳动物半胱天冬酶(Caspase，半胱氨酸依赖的天冬氨酸定向蛋白酶）。此外，BCL-2被发现是控制Caspase激活的一个更大家族的成员，这个家族被称为内源性凋亡途径的裁决者。在外源性凋亡途径的形式中，出现了更多的复杂性，以及病原体对死亡途径成分的征用。对受感染细胞的研究显示，某些形式的坏死（即细胞破裂并释放促炎症内容物）也是基因程序化的。这些细胞死亡途径被称为焦亡（pyoptosis）和坏死性凋亡（necroptosis）。拥有多种死亡方式是对抗寻求保持其复制生态位的病原体的有效寄宿策略。 在成年人中估计每天有惊人的10^11个细胞经历程序化细胞死亡，这相当于我们一年内整个体重的细胞。通过细胞增殖，身体维持现状，同时排除老化、功能失调、受感染或突变的细胞。因此，扰乱细胞增殖与细胞死亡之间的稳态平衡将导致机体功能失调。过少的细胞死亡会导致过度增殖疾病，如癌症，而过多的细胞死亡则导致退行性疾病，如神经退行性疾病。在这里，本文主要基于当前对各种细胞死亡途径的主流观点，由于研究众多，有的令人困惑，甚至矛盾。为了避免遗漏某些进展，我们主要选择那些通过生物化学和遗传学相结合的方法经过考验的观点和证据，相对更能经受住时间的考验。内源性凋亡——从线虫到哺乳动物在秀丽隐杆线虫（C. elegans）中，许多内源性凋亡信号传导在哺乳动物中也有保留，但哺乳动物的细胞死亡途径更为复杂（见图1）。相似之处包括使用支架蛋白来协调半胱天冬酶（caspase）的激活。在C. elegans中，CED-4担当此功能，用于激活半胱天冬酶CED-3，而在哺乳动物中，凋亡肽酶激活因子1（Apoptotic peptidase activating factor 1，APAF-1）介导caspase-9的聚合。这一过程在BCL-2同源区3（BH3）-仅蛋白（BH3-only proteins）（如C. elegans中的EGL-1；哺乳动物中的细胞凋亡相关BCL-2拮抗剂（BAD），BH3相互作用域死亡拮抗剂（BID），BCL-2相互作用杀手（BIK），BCL-2相互作用的细胞死亡介质（BIM），BCL-2修饰因子（BMF），harakiri（HRK），NOXA（也称为12-肉豆蔻酸-13-醋酸诱导蛋白1）、以及p53上调的凋亡调节剂（PUMA））与BCL-2蛋白家族的促存活成员（C. elegans中的CED-9；哺乳动物中的BCL-2、BCL-XL、髓细胞白血病基因1（MCL-1）、BCL-W以及胎儿肝中表达的BCL-2相关基因（BFL-1；在小鼠中称为A1））结合，从而抑制它们。这些BH3-仅蛋白（BH3-only proteins）的表达在发育信号或应激刺激（例如，营养剥夺、DNA损伤和内质网（ER）应激）的作用下增加，通过多种转录和翻译后机制实现。 图1 - 哺乳动物内源性凋亡信号传导途径与秀丽隐杆线虫和果蝇的凋亡信号传导对比（Credit: Cell） 在C. elegans中，CED-9通过阻止CED-4激活caspase CED-3来维持细胞存活。相比之下，哺乳动物中促存活的BCL-2家族蛋白通过限制它们的促凋亡成员，即BCL-2相关X蛋白（BAX）和BCL-2拮抗剂/杀手1（BAK），来防止caspase的激活。未受抑制的BAX和/或BAK聚合，并导致线粒体外膜渗透（Mitochondrial outer membrane permeabilization，MOMP），从而释放促进凋亡的线粒体因子进入细胞质。线粒体释放的细胞色素c与adaptor APAF-1相互作用，促进凋亡体复合体的组装，有助于起始caspase，即caspase-9的二聚化和激活。线粒体释放的DIABLO（也称为线粒体衍生的第二凋亡激活因子[SMAC]）或HtrA丝氨酸蛋白酶2（HTRA2）阻止X连锁的凋亡蛋白抑制剂（XIAP）对caspase的抑制。虽然C. elegans没有类似BAK或BAX的蛋白，但其他线虫却有。因此，C. elegans可能是进化中的一个特例，因为它通过与CED-4的结合，以更直接的方式抑制caspase的激活，从而放弃了对凋亡的线粒体调控。或者，被BH3-only protein EGL-1结合的CED-9可能像BAX或BAK一样发挥功能。有证据表明CED-9与线粒体外膜相关，但EGL-1的亚细胞定位不太清楚。哺乳动物的caspase-9通过蛋白水解激活所谓的执行者caspase（caspase-3、-7和可能的-6），导致数百种细胞蛋白的切割。这些切割事件中的一些有助于拆解细胞，而其他则激活促进吞噬凋亡细胞及其膜包裹的碎片（称为凋亡体，apoptotic bodies）的过程。前者的一个例子是caspase-3或-7对caspase激活的脱氧核糖核酸酶抑制剂（ICAD，inhibitor of caspase-activated deoxyribonuclease）的切割，这释放了caspase激活的脱氧核糖核酸酶（CAD，caspase-activated deoxyribonuclease）以介导染色体DNA的核间切割。后者的一个例子是对XK相关蛋白8（XKR8，XK related 8）的蛋白水解激活，导致磷脂酰丝氨酸在细胞表面显示为“吃我”的信号，以吸引吞噬细胞。吞噬作用对凋亡的非炎症性质很重要。如果凋亡细胞未被“吞噬”，它们最终可能发展出膜损伤。细胞内损伤相关分子模式（DAMPs, damage-associated molecular patterns）的释放向邻近细胞发出“警报”，触发促炎症反应。DAMPs包括DNA、ATP和蛋白质，如高迁移率族蛋白盒1（HMGB1, high mobility group box 1）和IL-1α。调节凋亡细胞的吞噬作用的过程在进化过程中得到了保留，凸显了它们对正常发育和成年组织稳态的重要性。果蝇（Drosophila melanogaster）是另一种用于研究程序性细胞死亡（programmed cell death）的模式生物。在果蝇中，Debcl、Buffy和Sayonara属于BCL-2蛋白家族（BCL-2 protein family），但它们在程序性细胞死亡中的作用比其哺乳动物和秀丽隐杆线虫（C. elegans）的对应物有限。果蝇的半胱天冬酶（caspases）主要受到细胞凋亡抑制蛋白（IAPs, inhibitor of apoptosis proteins）的控制（见图1）。果蝇中程序性细胞死亡的触发是由IAP抑制剂Reaper、Hid和Grim的诱导表达引起的。哺乳动物的IAPs在抑制细胞死亡中也扮演重要角色，但XIAP是唯一直接针对caspase的哺乳动物IAP，它抑制caspase-3、-7和-9。 BCL-2蛋白家族 BCL-2家族的成员可以分为三个亚组：促凋亡的BH3-only protein、促生存蛋白和促凋亡效应蛋白。哺乳动物的促生存蛋白具有四个BH区域（BH regions）、一个C末端跨膜域（TM domain, transmembrane domain）和一个疏水表面凹槽，用于介导与BCL-2家族两个促凋亡亚组的BH3域的相互作用。效应蛋白BAX、BAK和与BCL-2相关的卵巢杀手蛋白（BCL-2-related ovarian killer，BOK）的结构与促生存蛋白非常相似。它们也具有四个BH区域（由一个保守序列基序定义的BH4域）、一个TM域和一个BH3结合表面凹槽。相比之下，许多BH3-only protein在未与促生存家族成员结合时是未结构化的（unstructured）。 促凋亡效应蛋白BAX、BAK和BOK 大多数健康细胞都表达可检测量的BAX和BAK，尽管有些细胞表达其中之一的量要多得多。缺乏BAX的小鼠表现出雄性不育和轻微的脾肿大，而缺乏BAK的小鼠基本正常。然而，BAX和BAK的联合缺失通常产生严重的颅面异常，这在出生时是致命的。这种表型在缺乏BOK的小鼠中会加剧。与BAX和BAK不同的是，BOK似乎不受促生存BCL-2蛋白的抑制。BOK的丰度和活性反而受到位于内质网（ER）的泛素连接酶gp78的抑制，gp78将BOK定位为蛋白酶体降解。来自Bax−/− Bak−/−或Bax−/− Bak−/− Bok−/−小鼠的细胞对所有测试的内源性凋亡刺激都极度抵抗，这表明BAX和BAK在凋亡中具有很大的重叠功能，作为必需的凋亡效应蛋白，而BOK的作用是辅助的。尽管它们具有广泛的功能重叠，BAX和BAK之间还是有显著差异。尽管两者都与线粒体外膜上的促生存BCL-2蛋白相互作用，但健康细胞中的大多数BAX是细胞质的，其跨膜结构域嵌入其疏水凹槽内。BAX激活时跨膜域是如何被置换的目前还不太清楚。BAX和BAK的另一个区别是，BCL-2被认为主要抑制BAX，而MCL-1抑制BAK，但BCL-XL可以有效地抑制这两种蛋白。有趣的是，电压依赖性阴离子通道2（VDAC2, voltage-dependent anion channel 2）允许BAX定位到外线粒体膜上杀死细胞，但相反，它可以抑制BAK的激活。尽管经过多年的深入研究，BAX或BAK形成的介导线粒体外膜通透性改变（MOMP）的孔的结构仍然是个谜。BH3-only proteinsBIM、PUMA和被蛋白水解裂解的BID（称为截短的BID或tBID）与所有促生存BCL-2蛋白高亲和力结合，因此是强有力的凋亡启动因子。其他的BH3-only protein则以更选择性的方式结合。NOXA仅与MCL-1和A1/BFL-1结合，而BAD、BIK和HRK主要与BCL-XL结合，程度较小的与BCL-2和BCL-W结合。因此，这些BH3-only protein往往是较弱的杀手，因为它们只抑制保护细胞的部分促生存BCL-2蛋白。特定的BH3-only protein，尤其是BIM、PUMA和tBID，也可能通过与BAX和BAK直接相互作用来触发凋亡。然而，对缺乏所有BH3-only蛋白的细胞系的分析表明，这些相互作用对启动凋亡并非必需。当保护细胞的促生存BCL-2蛋白通过遗传手段移除或用小分子BH3模拟物抑制时，细胞仍然经历BAX或BAK介导的凋亡。这些发现总体上与一种模型一致，即BAX和BAK需要被促生存BCL-2蛋白抑制以维持细胞活性。当促生存BCL-2蛋白被BH3-only protein或蛋白酶体降解（下文描述）中和时，凋亡就会启动。启动凋亡的BH3-only protein取决于应激刺激和细胞类型。BIM在免疫耐受中起主要作用，通过清除自反应性B细胞和T细胞。它还通过移除免疫反应后不再需要的B细胞和T细胞，帮助免疫细胞的稳态。BIM和PUMA促进由生长因子剥夺、钙通量失调、糖皮质激素或内质网（ER）应激引发的凋亡。转录因子和肿瘤抑制因子p53（在小鼠中也称为转化相关蛋白53 [TRP53] (transformation related protein 53)，在人类中称为肿瘤蛋白p53 [TP53] (tumor protein p53)）通过诱导Puma和Noxa的表达促进凋亡。BID通过caspase-8在外源性凋亡途径（下文描述）或通过细胞毒性T细胞或自然杀伤细胞释放的颗粒酶B (granzyme B)裂解而激活，后者通过穿孔素孔进入细胞。针对基因定位的小鼠的分析表明，BMF、BAD、BIK和HRK在启动凋亡中的作用不太突出。Pro-survival BCL-2 proteins所有促生存BCL-2蛋白（pro-survival BCL-2 proteins）都定位于线粒体外膜的外侧，但BCL-2也存在于内质网和核膜上。BCL-XL的相当部分是细胞质的。BCL-2、BCL-XL和BCL-W相对稳定，需要数小时才能转换，而MCL-1和A1/BFL-1是不稳定的蛋白，它们的半衰期以分钟而非小时计算，因为它们被泛素化并定向蛋白酶体降解。因此，当RNA或蛋白质合成停止时，MCL-1和A1/BFL-1的水平会急剧下降，依赖它们的细胞将死亡。许多病毒也产生促生存BCL-2同源物或结构类似物，强调内源性凋亡在消除病毒感染细胞中的重要作用。在小鼠中的遗传研究确定了不同促生存BCL-2蛋白的关键功能。A1的丧失只引起选择性造血细胞亚群的轻微缺陷。缺乏BCL-W的小鼠也基本正常，除了雄性不育。小鼠中缺乏BCL-2会导致过度的BIM驱动的凋亡，减少成熟B细胞和T淋巴细胞的数量，并导致过早白发以及致命的多囊肾病。BCL-XL缺乏在小鼠发育的胚胎第13天是致命的，因为这妨碍了血小板以及某些神经和红细胞群体的存活。MCL-1的缺失影响最为显著，对于早期植入胚胎和广泛的细胞类型的存活至关重要，包括造血细胞群、心肌细胞和肠上皮细胞。在某些细胞类型中，必须消除两种促生存BCL-2蛋白才能观察到严重缺陷。例如，BCL-XL或MCL-1可以维持肝细胞和某些神经细胞群的存活。促生存BCL-2蛋白和BH3-only protein的水平被精细平衡，因为基因剂量减半可能会产生戏剧性后果。例如，Mcl-1+/− Bcl-x+/−小鼠在出生后不久即死亡，表现出严重的颅面异常，但Mcl-1+/− Bcl-x+/− Bim+/−小鼠则健康。由缺陷的内源性凋亡引起的疾病 如上所述，强制表达BCL-2抑制内源性凋亡，可能导致人类滤泡性淋巴瘤。在小鼠中，淋巴细胞转基因过度表达BCL-2会引起类似于系统性红斑狼疮（SLE, systemic lupus erythematosus）的致命自身免疫疾病和低发病率的淋巴瘤。这些发现突显了内源性凋亡在维护免疫耐受以及肿瘤生成中的重要性。值得注意的是，当造血细胞还有MYC的非调节表达时，BCL-2是一个更强大的致癌基因，MYC是一个推动异常细胞分裂的转录因子。过量的BCL-2使恶性和非转化细胞对广泛的抗癌药物产生抵抗，无论这些药物是以p53依赖还是非p53依赖的方式杀死细胞。特别是BIM和PUMA这样的BH3-only protein未能中和过量的BCL-2，这阻止了内源性凋亡。因此，为癌症治疗开发了模仿BH3-only protein功能的小分子BH3类似物。特定于BCL-2的BH3类似物Venetoclax（也称为ABT-199）目前已被许多监管机构批准用于治疗慢性淋巴细胞白血病（CLL, chronic lymphocytic leukemia）和急性髓性白血病（AML, acute myeloid leukemia），这些恶性病变主要依赖BCL-2而非其他促生存BCL-2蛋白来生存。针对MCL-1和BCL-XL的BH3类似物也已被开发，但它们在正常健康细胞中的靶向毒性构成了一个挑战。针对BCL-XL的治疗可能会导致血小板减少症，而心肌细胞、肠上皮细胞和血液细胞亚群是一些可能不耐受MCL-1抑制剂的细胞类型。将BH3类似物选择性地送达癌细胞的抗体偶联物的使用可能是限制正常健康细胞毒性的策略。在某些情况下，抑制内源性凋亡可以预防而非促进肿瘤发展。例如，在小鼠中，低剂量γ-射线诱导的胸腺淋巴瘤可被Puma缺陷所预防。解释是，成熟白细胞应激诱导的凋亡触发了大量的造血祖细胞的动员和增殖，从而产生了肿瘤原性病变（oncogenic lesion）。MCL-1缺陷导致的增强凋亡促进了小鼠肠道的肿瘤生成。因此，了解BH3类似物药物诱导的正常细胞凋亡是否可能为次发性治疗相关癌症埋下伏笔，就显得很重要了。过度的内源性凋亡与急性和慢性退行性疾病有关，包括缺血再灌注损伤和神经退行性疾病。至今为止，针对caspase的治疗策略并未取得成功，抑制剂在临床试验中展现出有限的疗效以及毒性。重要的是，抑制内源性凋亡途径中的caspase并不能阻止线粒体外膜通透性改变（MOMP）后的线粒体功能障碍和细胞死亡。目前正在努力寻找抑制BAX或BAK的抑制剂，但考虑到可能的靶向毒性，是否存在治疗窗口尚不清楚。外源性凋亡和坏死性凋亡外源性凋亡和坏死性凋亡途径主要由细胞表面的死亡受体结合的细胞外配体触发。通过caspase-8传递凋亡信号，而当caspase-8被抑制时，可能发生坏死性凋亡，这是一种溶解性的细胞死亡形式。坏死性凋亡可能作为一种抗病毒防御机制而进化，因为某些病毒，包括巨细胞病毒、单纯疱疹病毒、牛痘病毒和腺病毒，编码caspase-8的抑制剂以防止凋亡。与此观点一致的是，缺乏坏死性凋亡的小鼠比野生型（WT）小鼠更易感染牛痘病毒或缺乏坏死性凋亡抑制剂病毒诱导的RIPK3降解（vIRD, viral inducer of RIPK3 degradation）的变异牛痘病毒。与内源性凋亡途径中的caspase-9一样，caspase-8通过裂解并因此激活caspase-3和-7来执行凋亡程序。配体和死亡受体(death receptor)配对包括FAS配体（FASL）与FAS、肿瘤坏死因子（TNF）或淋巴毒素-α与肿瘤坏死因子受体1（TNFR1）、TNF样细胞因子1A（TL1A）与死亡受体3（DR3）以及与TRAILR1或TRAILR2（小鼠只有一个TRAILR）相关的诱导凋亡配体（TRAIL）。尽管它们的名字，死亡受体并不专门传递细胞死亡信号。许多细胞对TNFR1的激活不是通过死亡而是通过激活核因子κB（NF-κB）和丝裂原激活蛋白激酶（MAPK）信号通路，促进促炎症和促生存基因的表达。TNFR1信号机制的扰动可能会促使细胞死亡的诱导，并在下文中进行讨论。死亡受体之外，外源性凋亡或坏死程序（necroptosis）的机制也可以通过 Toll 样受体 3（Toll-like receptor 3, TLR3）、TLR4 或 Z-DNA 结合蛋白 1（Z-DNA binding protein 1, ZBP1）被激活。TLR3 通过内体（endosomal compartment）中的双链 RNA 被激活，而 TLR4 感应细菌的外细胞脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）并随后转移到内体。ZBP1 是内部的 Z-形核酸传感器，这种核酸具有左旋的双链螺旋结构，由一些病毒和内源性逆转录元件产生。TLR3 或 TLR4 信号的典型输出是促炎和促存活的基因表达，但如 TNFR1 信号传导所见，某些细胞缺陷可能会使信号传导倾向于细胞死亡。因此，当细胞暴露于某些死亡配体或病原体相关分子模式（PAMPs, pathogen-associated molecular patterns）时，如果立即受到威胁，反映在关键信号组件的损害上，它们可以将其反应从促炎和促存活基因表达升级为外源性凋亡或坏死程序。 TNFR1 TNFR1在许多细胞类型上表达，并在病原体防御中发挥重要作用，但持续激活该受体可能助长慢性炎症。事实上，TNF抑制剂，它们阻断TNF-TNFR1和 TNF-TNFR2信号，广泛用于治疗自发炎性疾病，如炎症性肠病、类风湿性关节炎和强直性脊柱炎。与所有死亡受体一样，TNFR1有一个细胞质同型蛋白互作基序(cytoplasmic homotypic protein interaction motif)，称为死亡结构域（death domain, DD）。在配体诱导的TNFR1寡聚化后，DD通过招募与死亡结构域相关的TNFRSF1A适配蛋白（TNFRSF1A associated via death domain, TRADD）和受体相互作用蛋白激酶1（receptor interacting protein kinase 1, RIPK1）启动所谓的复合体I的组装（图 2A）。TRADD 绑定到 TNF 受体相关因子2（TNF receptor associated factor 2, TRAF2），这是 cIAP1 和 cIAP2 泛素连接酶的适配蛋白。cIAP1 和 cIAP2 通过向 RIPK1 和复合体 I 的其他组件添加K63连接的多聚泛素链，帮助对接线性泛素链装配复合体（linear ubiquitin chain assembly complex, LUBAC）和TGF-β激活的激酶1（TGF-beta activated kinase 1, TAK1）。LUBAC然后向TNFR1、TRADD 和 RIPK1添加M1连接的多聚泛素链，这增强了招募典型IκB激酶（IKK）复合体的能力。复合体I中TAK1和IKK 的激活，参与了NF-κB和MAPK 信号通路，驱动促炎基因（例如Ccl2, Ccl3, Ccl5, Csf2, Cxcl1, Cxcl2, Il1b, Il6, Nos2 和 Tnf）和促存活基因（例如Bclx和Cflar，编码细胞FLICE抑制蛋白[cFLIP]的基因）的表达。 图 2-外源性凋亡信号通路（Credit: Cell） 线性泛素链装配复合体（LUBAC，linear ubiquitin chain assembly complex）也是 TANK 结合激酶 1（TBK1）和 IKKε 进入复合体 I 的必要条件。这些激酶通过磷酸化 RIPK1，从而抑制其诱导死亡的激酶活性。TNFR1 信号激活的其他激酶，包括 IKK 和 MK2（也称为 MAPK 激活的蛋白激酶 2），通过在 RIPK1 的不同位点磷酸化促进细胞存活。RIPK1 的 K63 连接泛素化也似乎抑制了其激酶活性。阻断 RIPK1 上的这些翻译后修饰会使 TNFR1 信号向细胞死亡倾斜。TNFR1 下游 RIPK1 的激活如何促进细胞死亡仍在阐明中。RIPK1 的激酶活性对于 TNF 诱导的 NF-κB 或 MAPK 信号是非必需的，RIPK1 的主要底物似乎是其自身。RIPK1 在死亡结构域介导的激酶二聚化后的自磷酸化使 RIPK1 获得进入次级细胞质诱导死亡的复合体 II 的资格。RIPK1 从复合体 I 到复合体 II 的转变由圆柱状纤维瘤症（cylindromatosis, CYLD）增强，这是一种去泛素化酶，可以移除 M1 或 K63 连接的多聚泛素。CYLD 通过其适配蛋白: 精子生成相关蛋白 2（SPATA2）被招募到复合体 I，后者又与 LUBAC 结合。CYLD 是否能够接触其底物似乎还受到泛素结合蛋白 A20（也称为 TNF alpha 诱导的蛋白 3）和 A20 结合并抑制 NF-κB（ABIN-1）的进一步控制。这些蛋白都被招募进入复合体 I，并可能通过 CYLD 抑制多聚泛素链的切割。据此模型，缺乏 ABIN-1 和 A20 的小鼠肠上皮细胞比其 WT 对应物更易于 TNF 诱导的细胞死亡。使用环己酰胺抑制蛋白质翻译也可以增强 TNF 诱导的细胞死亡敏感性，但在这种情况下，RIPK1 的激酶活性是非必需的。TRADD 可以独立于 RIPK1 成核复合体 II。无论是 TRADD 还是 RIPK1 形成复合体 II 的骨架，两种蛋白都可以与通过死亡结构域相关的 FAS（FADD）结合，这是 caspase-8 的适配蛋白。FADD 中的死亡效应结构域（DED）然后与 caspase-8 酶原体中的两个 DED 之一相互作用。caspase-8 中的串联 DED 支持由 caspase-8 及其催化不活跃的同源物 cFLIP 组成的螺旋状 DED 丝状体的组装。caspase-8 的近邻诱导的同源二聚体，或者 caspase-8 与长型 cFLIP（cFLIPL）的异源二聚体，自我蛋白水解处理产生完全活跃的 caspase-8。caspase-8 的催化亚基之间的切割允许构象变化，稳定活性位点，但在 caspase-8/cFLIPL 异源二聚体中这一点不那么关键。异源二聚体介导的 caspase-8 同源二聚体的切割可能促进 caspase-8 的激活，至少在最初阶段如此。caspase-8 与 cFLIPL 的比例很重要，因为丰富的 cFLIPL 可以通过限制 DED 寡聚体中合并的 caspase-8 的总量来抑制 caspase-8 的激活。较短的 cFLIP 异构体（例如人类 cFLIPS 和病毒 FLIP 蛋白）通过扰乱定向 caspase-8 二聚体的螺旋状 DED 丝状体来抑制 caspase-8 的激活。环己酰胺似乎通过减少高度不稳定的 cFLIPL 量来促进 TNF 诱导的凋亡。cFLIPL 丰度的严格调控可能是为了促进快速杀死蛋白质翻译受损的病毒感染细胞而进化的。一些病毒获得了自己的 cFLIPS 版本，作为阻断外源性凋亡的手段。其他病原体，包括肠致病性大肠杆菌（EPEC），也获得了其他阻止死亡受体信号传导的手段。例如，EPEC 毒力因子 NleB1 是一种乙酰葡萄糖胺转移酶，可以修改并禁用 DD，包括 TNFR1、TRADD、RIPK1 和 FADD 中的那些。许多未感染的原代细胞对 TNF 的反应是低水平的 caspase-8 激活，不会触发凋亡。现有证据表明，在这种情况下，caspase-8 切割复合体 II 中的 RIPK1 支架，从而在有足够活跃的 caspase-8 有效切割和激活 caspase-3 和 -7 之前破坏复合体 II。与此模型一致的是，消除 RIPK1 中 caspase-8 切割位点的杂合突变增强了 TNF 诱导的 caspase-8 激活和凋亡。XIAP，作为 caspase-3、-7 和 -9 的抑制剂，可能增加了一层保护，防止凋亡的诱导。报道的其他限制复合体 II 的机制包括通过自噬相关蛋白 9A (ATG9A) 将复合体靶向溶酶体，以及通过聚 ADP 核糖聚合酶 tankyrase-1 的多聚 ADP 核糖化和随后的泛素化而导致的复合体的蛋白酶体降解。健康细胞中TNFR1对caspase-8的“挠痒”并非徒劳，因为它为当病原体抑制caspase-8时稳定化诱导死亡的复合体II（Complex II）奠定了基础。如果在复合体II中，活跃的RIPK1未被caspase-8切割，则它可以激活激酶RIPK3，释放caspase独立的混合谱系激酶结构域样（Mixed Lineage Kinase Domain-Like, MLKL）介导的坏死性死亡（necroptosis，如下所述）。因此，通过疱疹病毒B13R、牛痘病毒CrmA或小分子泛caspase抑制剂对caspase-8的抑制，会使某些细胞对TNF诱导的细胞死亡更加敏感。RIPK1和RIPK3通过它们的RIP同型互作基序（RIP Homotypic Interaction Motifs, RHIMs）相互作用。RHIM驱动的RIPK3寡聚化激活其激酶活性，导致伪激酶MLKL的磷酸化。MLKL随后形成寡聚体并转移到膜上，引发细胞裂解。坏死性死亡作为一种抗病毒防御机制的重要性，通过发现阻止RIPK3激活MLKL的病毒MLKL样假体（decoys）而凸显出来。已经鉴定出通过干扰RHIM依赖的RIPK3激活或针对RIPK3进行蛋白酶体降解来阻断坏死性死亡的病毒和细菌蛋白。虽然人类RIPK3的功能丧失突变与单纯疱疹脑炎（herpes simplex encephalitis）有关，但目前尚不清楚该疾病是否源于病毒感染细胞坏死性死亡受损，因为RIPK3还有坏死性死亡独立的功能。与RIPK3坏死性死亡独立作用一致，极少数MLKL缺陷病例未表现出对传染性病原体的增加敏感性。在小鼠中，肠上皮细胞或角质细胞中过量的TNFR1驱动细胞死亡是炎症的强劲驱动因素。例如，在LUBAC功能受损的Sharpincpdm突变小鼠中，慢性增生性皮肤炎可通过消除TNFR1、CYLD、FADD、caspase-8或RIPK1的激酶活性而被阻止。由于肠上皮细胞中IKK亚单位NEMO的丧失引起的结肠炎也可通过丢失TNFR1、FADD或RIPK1的激酶活性而被阻止。因此，即使在没有促炎症NF-κB信号的情况下，TNFR1诱导的细胞死亡也能驱动炎症。过度的凋亡可能会破坏皮肤或肠道这些屏障，并允许微生物的涌入，进而驱动炎症。在人类中，TNFR1诱导的细胞死亡被认为是由TBK1或OTULIN缺陷引起的自身炎症综合征的重要驱动因素。OTU去泛素化酶具有线性连接特异性（OTULIN, OTU deubiquitinase with linear linkage specificity）通过从泛素连接酶去除M1连结的多聚泛素来保持LUBAC活性。缺乏TBK1或OTULIN的患者细胞在培养中表现出对TNF诱导死亡的高度敏感性，值得注意的是，这些患者接受TNF抑制治疗可以缓解疾病。与人类不同，小鼠中Tbk1或Otulin失活突变会导致胚胎死亡。Tbk1缺陷导致胎儿肝脏中由TNFR1和RIPK1激酶活性驱动的细胞死亡，而Otulin失活（或丢失核心LUBAC基因Hoil1或Hoip）引起的胚胎致死部分依赖于TNFR1和活跃的RIPK1。缺乏NEMO的人类中的一些炎症病变对TNF阻断有反应，鉴于IKK缺陷增强了TNFR1刺激的细胞死亡，它们也可能反映了异常的TNF诱导细胞死亡。编码A20的TNFAIP3的半数不足可以引起自身炎症和自身免疫症，有些患者对TNF阻断有反应。虽然A20缺陷增加了对TNF诱导细胞死亡的敏感性，但完全缺乏A20的小鼠会发展出独立于TNF或TNFR1信号的严重早发炎症。后一观察表明，TNF诱导的细胞死亡只是A20负向调控的几个促炎过程之一。表达低活性A20且具有失活的锌指7（Zinc Finger 7, ZnF7）泛素结合结构域的小鼠会发展出TNF驱动的关节炎，而在A20中同时突变ZnF4和ZnF7会引发与A20缺陷相关的更严重表型。在完全缺乏A20或A20 ZnF4/ZnF7突变小鼠中消除依赖caspase-8的细胞死亡和依赖MLKL的坏死性死亡的影响尚未报道。因此，尚不清楚死亡受体或TRIF依赖的TLRs引发的异常细胞死亡是否是其致死性的主要驱动因素。TNFR1(肿瘤坏死因子受体1)刺激细胞死亡在没有通路负调控因子基因突变失活的情况下，其在人类炎症性疾病中的作用尚不明确。尽管如下所述，RIPK1 (受体相互作用蛋白激酶1)抑制剂的临床试验可能提供一些见解，但是抑制RIPK1的激酶活性也可能阻止FAS、TRAILR1、TRAILR2、TLR3和TLR4触发的某些形式的细胞死亡。接受RIPK1抑制剂GSK2982772治疗的类风湿关节炎和结肠炎患者在临床试验中未显示出益处（ClinicalTrials.gov 研究: NCT02858492和NCT02903966），但其他RIPK1抑制剂正在皮肤红斑狼疮（ClinicalTrials.gov 研究: NCT04781816）和肌萎缩侧索硬化症（ClinicalTrials.gov 研究: NCT05237284）的临床试验中。DR3DR3的表达范围不如TNFR1广泛，主要发现于淋巴细胞上，但它似乎与TNFR1以相似方式发出信号。TL1A (肿瘤坏死因子样配体1A) 与DR3的结合主要刺激促炎细胞因子和趋化因子的产生，但如cIAP缺乏这类扰动会促进细胞质中诱导信号复合体的组装。TL1A抑制剂已被证明对炎症性肠病患者有益，这表明TL1A像TNF一样，是慢性炎症的重要驱动因子。FAS和TRAIL受体FAS、TRAILR1和TRAILR2这些死亡受体也通过两个连续的复合体发出信号，但顺序与TNFR1和DR3相反。与受体相关的复合体触发细胞死亡，而第二个细胞质复合体称为FADDosome（FADD相关复合体），在未能死亡的细胞中可以刺激NF-κB和MAPK信号通路。FAS或TRAIL受体的DD（死亡结构域）直接与FADD结合以激活caspase-8。尽管caspase-8可以直接切割并激活caspase-3和-7，但FAS在“第二型”细胞（例如小鼠肝细胞）中诱导的凋亡需要caspase-8介导的促凋亡BH3仅限蛋白BID的蛋白水解激活，产生tBID。需要激活内在途径以克服XIAP介导的caspase-3和-7的抑制。FAS和TRAIL受体像TNFR1一样，在caspase-8被抑制时可以信号触发坏死性凋亡，这种细胞死亡依赖于RIPK1的激酶活性。RIPK1被FADD招募至受体复合体，随后与RIPK3结合促进坏死性凋亡。FADDosome的组装需要FADD和caspase-8，但不需要caspase-8的催化活性。FADDosome似乎包含了TNFR1复合体I的许多组分，包括TRADD、cIAP1/2、RIPK1、TRAF2、IKK、TAK1和A20。对于抵抗TRAIL诱导细胞死亡的肿瘤细胞，FADDosome调控的基因表达已被提出可调节抗肿瘤免疫细胞反应。FASL和TNF是细胞毒性T细胞用来杀死其靶细胞的武器，除了穿孔素和颗粒酶。过度的TNFR1驱动细胞死亡和过度的FAS或TRAILR触发的细胞死亡都可能导致组织损伤和炎症。FASL还通过杀死不再需要的淋巴细胞来维持淋巴稳态。FASL或FAS功能受损的小鼠和人类会发展成自身免疫性淋巴增生综合征（ALPS），一种通常稀有的、非传统B和T细胞异常累积的疾病。FADD或caspase-8酶活性的缺失（阻止所有外源性凋亡）对小鼠和人类的影响不同。无法激活caspase-8的小鼠会因未受控的TNFR1-、RIPK1-、RIPK3-和MLKL依赖的坏死性凋亡而在胚胎期死亡。相比之下，缺乏FADD或caspase-8的人类可能表现出ALPS、反复感染和早发性炎症性肠病。是否坏死性凋亡驱动了人类疾病尚不清楚。受损的caspase-8切割RIPK1必须促进炎症，因为杂合性RIPK1突变破坏了caspase-8切割位点，导致周期性发热综合征。NEDD4结合蛋白1（N4BP1）的切割和失活可能导致FADD或caspase-8缺陷患者的先天免疫受损。在人和小鼠的骨髓细胞中，N4BP1通过仅通过髓样分化基因88（MyD88）适配器信号的TLRs抑制细胞因子和趋化因子的产生。N4BP1是一种泛素结合内核糖核酸酶，但它如何精确地限制细胞因子和趋化因子反应还需进一步研究。TLR3、TLR4和ZBP1TLR3和TLR4都利用含RHIM（RIP同源相互作用基序）的适配蛋白Toll/IL-1受体域含有诱导干扰素-β的适配蛋白（TRIF）来与RIPK1和RIPK3结合（图3A）。反过来，RIPK1可能招募TRADD-TRAF2-cIAP1/2和FADD-caspase-8，最终导致NF-κB和MAPK激活以及caspase-8依赖的N4BP1切割。已显示阻断LUBAC或同时阻断cIAP1和cIAP2可使TLR3信号转向强烈的caspase-8激活和细胞死亡。如果caspase-8被抑制，那么TLR3和TLR4都可以刺激坏死性凋亡。抑制RIPK1可阻止巨噬细胞中TLR3或TLR4诱导的坏死性凋亡，这表明RIPK1的激酶活性通常是TRIF依赖性坏死性凋亡所必需的。然而，小鼠的遗传研究表明，即使在RIPK1缺失的情况下，TRIF或ZBP1也可以激活坏死性凋亡。实际上，小鼠RIPK1似乎利用其RHIM来抑制TRIF或ZBP1诱导的坏死性凋亡，因为RIPK1 RHIM突变小鼠中的炎症和围产期死亡可以通过失去MLKL或同时失去TRIF和ZBP1来预防。与RIPK1阻止TRIF从事细胞死亡机械相一致，缺乏RIPK1的原代人成纤维细胞对LPS或TLR3激动剂poly(I:C)诱导的细胞死亡更为敏感。总体而言，这些数据表明RIPK1的激活可能缓解其RHIM依赖性但又不甚明了的TRIF或ZBP1信号抑制。 图3-TLR3和ZBP1的细胞死亡信号（Credit: Cell） RIPK1支架也抑制caspase-8驱动的细胞死亡，因为Ripk1缺失的小鼠在围产期死亡，除非消除caspase-8和MLKL依赖的死亡程序。相比之下，RIPK1的激酶活性对小鼠的存活来说是可有可无的。RIPK1似乎至少部分限制凋亡，是通过阻止TRADD-FADD-caspase-8信号复合体的组装。考虑到RIPK1和TRADD似乎并行作用并且绑定相同的DD蛋白，RIPK1的缺失可能允许更多TRADD进入信号复合体，同时伴随着NF-κB和MAPK信号受损和cFLIPL表达减少。RIPK1缺失的原代人成纤维细胞也增强了TNF诱导的细胞死亡。尽管RIPK1的缺失在小鼠中是致命的，但缺乏RIPK1的人类主要表现为免疫细胞功能障碍，导致淋巴细胞减少、感染、关节炎和早发性炎症性肠病。小鼠与人类对RIPK1的更广泛需求可能反映了物种特异性差异，例如RIPK1的表达模式或其他通路组分的差异。ZBP1具有两个Zα结构域用于识别Z型核酸和一个RHIM与RIPK3结合。ZBP1-RIPK3相互作用可以通过MLKL触发坏死性凋亡或通过RIPK1、FADD和caspase-8触发凋亡（图3B）。RIPK1的激酶活性对这种细胞死亡来说是非必需的。制造Z-RNA的病毒包括巨细胞病毒、流感A病毒、单纯疱疹病毒1和牛痘病毒。巨细胞病毒通过产生caspase-8和RHIM-RHIM相互作用的抑制剂来逃避细胞死亡，而牛痘病毒则产生caspase抑制剂和一个Zα结构域蛋白，用以屏蔽病毒Z-RNA免受ZBP1的检测。内源性逆转录病毒元件产生的Z型核酸在过度的ZBP1依赖性细胞死亡导致皮肤或肠道炎症的小鼠模型中被暗示。有趣的是，ZBP1信号的输出不仅限于细胞死亡。ZBP1还可以独立于RIPK3、RIPK1 RHIM或细胞死亡，促进干扰素刺激基因（ISGs）的表达。解开这一信号通路将是重要的，因为ZBP1对由Adar1突变导致的ISG驱动病理有所贡献。人类ADAR1突变引起的重症特征是ISG表达增加，包括艾卡蒂-古蒂耶症候群（Aicardi-Goutieres syndrome）。特异性腺苷脱氨酶RNA（ADAR1）具有Zα结构域，似乎绑定并编辑会否则激活ZBP1的Z-RNAs。鉴于ZBP1诱导的坏死性凋亡和ISG表达的促炎性质，其他人提出利用ZBP1激动剂来增强癌症免疫疗法。焦亡(Pyroptosis) 焦亡是指由细胞质膜上的gasdermin孔洞引起的细胞死亡。焦亡作为一种独特的细胞死亡程序，起源于对感染沙门氏菌的巨噬细胞的研究。这种感染巨噬细胞的死亡依赖于caspase-1，这是一种蛋白酶，可以蛋白水解成熟IL-18和内源性发热原IL-1β。后续研究揭示，在人类中，caspase-1、-4和-5，以及在小鼠中，caspase-1和-11，都可以通过切割gasdermin D（GSDMD）引起焦亡。GSDMD的N端切割片段通过寡聚化并在膜上形成孔洞，促进细胞裂解。GSDMD在细胞膜上的孔洞会破坏离子梯度，并导致水分的大量涌入，最终引发依赖于ninjurin 1（NINJ1）的细胞质膜破裂（PMR）以及大量促炎DAMPs的释放。然而，包括IL-1β在内的小型DAMPs可以通过GSDMD孔洞离开细胞。在某些情况下，细胞膜修复机制可能限制GSDMD孔洞的形成。GSDMD孔洞是否能在不触发焦亡的情况下释放IL-1β仍未解决。炎症小体(Inflammasomes)Caspase-1在细胞质复合体中形成活性二聚体，这些复合体被称为炎症小体（图4）。炎症小体的组装由感应特定DAMPs或PAMPs的蛋白质触发，然后形成寡聚骨架。一些“感应器”蛋白质直接与DAMPs或PAMPs结合，而其他蛋白质则检测DAMPs或PAMPs在细胞内引起的扰动。前者包括absent in melanoma 2（AIM2），它与病毒或细菌的双链DNA结合，以及NLR家族凋亡抑制蛋白（NAIPs），它们与细菌的鞭毛、针和内杆蛋白结合。NLR家族含有pyrin结构域的1（NLRP1）和caspase激活和招募结构域8（CARD8）能够感知某些感染，因为它们各自具有一个抑制结构域，可以被细菌或病毒酶修饰并靶向蛋白酶体降解。这种抑制结构域的去除促进了炎症小体的组装。 图4-炎症小体诱导的GSDMD依赖性焦亡（Credit: Cell） 识别PAMPs或DAMPs的炎症小体感应器包括PYRIN和NLRP3。PYRIN能够感知修改和失活Rho GTP酶的细菌毒素，PYRIN的去磷酸化和微管聚合在炎症小体组装中发挥作用。NLRP3对多种刺激物作出反应，包括细菌毒素nigericin、胞外ATP和与痛风相关的尿酸晶体。细胞内钾离子流出被认为是驱动NEK7依赖性NLRP3寡聚化的统一事件，但这一过程的机制细节仍然不清楚。NLRP3在无菌炎症的背景下激活促使了小分子NLRP3抑制剂的开发。NLRP3抑制剂的临床试验集中在自身炎症性疾病上，包括骨关节炎、神经炎症以及COVID-19。PYRIN、NLRP1和NLRP3-NIMA相关激酶7（NEK7）炎症小体都包含了caspase-1适配蛋白含有CARD的凋亡相关斑点状蛋白（ASC），它有一个CARD与caspase-1中的CARD结合。NAIP和CARD8炎症小体不需要ASC，因为NAIP相互作用蛋白NLR家族含有CARD的4（NLRC4）中的CARD或CARD8本身可以与caspase-1结合。caspase-4或-5（啮齿动物caspase-11的人类对应物）中的CARD直接与细菌LPS的细胞质寡聚体结合。这种结合不需要表面表达的LPS受体TLR4。这些非典型炎症小体复合物产生活性的caspase二聚体，触发GSDMD依赖性焦亡。焦亡细胞还释放成熟的IL-1β，因为GSDMD切割引起的扰动激活NLRP3炎症小体和caspase-1。GSDMD依赖性焦亡在病原体防御和炎症性疾病中的作用小鼠的遗传研究表明，GSDMD依赖性焦亡是限制沙门氏菌等细胞内病原体生长的重要机制。其他细胞内细菌通过使用抑制焦亡的毒力因子来保护其复制生态位。志贺氏菌有两个效应器武器来阻止焦亡，caspase-4和-11的抑制剂OspC3和泛素连接酶IpaH7.8。后者通过将人类GSDMD和GSDMB（下文将描述）靶向蛋白酶体降解来抑制焦亡。焦亡的促炎性质有助于抗击病原体，因为包括中性粒细胞在内的免疫细胞被招募到感染部位。但是，由于通路失调导致的过度焦亡会引起疾病。人类NLRP1、NLRP3、NLRC4和MEFV（编码PYRIN）的生殖系激活突变破坏了正常的炎症小体调节，并引起一系列自身炎症性疾病。这些疾病的患者通常对IL-1β阻断反应良好，异常的IL-1β产生可能反映了焦亡的增强。与这一观点一致的是，Gsdmd的缺失阻止了表达疾病相关PYRIN或NLRP3突变体的基因敲入小鼠中炎症性病变和活性IL-1β水平的升高。值得注意的是，在体外培养细胞中，Gsdmd缺失延缓而不是阻止了经典炎症小体激活后的细胞死亡和IL-1β释放。细胞死亡仍然发生，因为caspase-1还可以通过蛋白水解激活caspase-3和-7来触发较慢的凋亡过程。因此，体内的细胞死亡类型很重要。可以推测，在Mefv或Nlrp3基因敲入突变小鼠中，Gsdmd缺陷细胞通过凋亡死亡可能有益，因为在继发膜损伤释放由caspase-1产生的促炎、成熟形式的IL-1β之前，它们被吞噬细胞清除。Gsdmd缺失还改善了小鼠败血症模型中的疾病。caspase-1、IL-1β和IL-18对小鼠LPS诱导的败血性休克是可有可无的，而caspase-11依赖性焦亡在内皮细胞中似乎驱动血管泄漏和低血压。通过内皮GSDMD孔洞的Ca2+流入可能促进微血管中致命的凝血和血块形成。总体来看，这些研究表明GSDMD抑制剂在暴发性炎症环境中可能提供治疗益处。有趣的是，最近的研究报告称，外源性添加的拮抗性GSDMD纳米体能够抑制体外细胞中的GSDMD依赖性焦亡。据称，GSDMD纳米体通过最初的GSDMD孔洞进入细胞，然后抑制进一步孔洞的形成。最初的GSDMD孔洞被认为是短暂的，并且通过膜修复机制从质膜中移除。这些发现表明GSDMD是可药用的，但这些纳米体是否能在体内抑制GSDMD尚不清楚。由于纳米体只能结合人类GSDMD，因此无法在临床前小鼠模型中评估其疗效。除了半caspase-1、-4、-5和-11，还有其他蛋白酶也能切割并激活GSDMD（Gasdermin D）。由caspase-8切割GSDMD引起的细胞焦亡在应对耶尔森菌感染的宿主反应中扮演了重要角色。中性粒细胞弹力酶也被证实能够切割并激活GSDMD。相比之下，据报道caspase-3通过在N端形成孔的域内切割来使GSDMD失活。更广泛的气道上皮细胞死亡蛋白家族人类有六种气道上皮细胞死亡蛋白家族成员（GSDMA, GSDMB, GSDMC, GSDMD, GSDME, 和 GSDMF），而小鼠缺少Gsdmb，但有三种Gsdma基因（Gsdma1, Gsdma2, 和 Gsdma3），四种Gsdmc基因（Gsdmc1, Gsdmc2, Gsdmc3, 和 Gsdmc4），以及Gsdmd, Gsdme, 和 Gsdmf。除了GSDMF，每种气道上皮细胞死亡蛋白都有一个在N端的保守形成孔的域，被C端控制着。不同的蛋白酶切割不同的气道上皮细胞死亡蛋白以释放形成孔的域，这些域随后可以与细胞膜、细胞器膜或细菌的外膜结合。缺乏Gsdma1（或Gsdma1-3）、Gsdmc1-4、或Gsdme的小鼠比野生型对照组对某些细菌或蠕虫感染更易感，这表明许多气道上皮细胞死亡蛋白有助于宿主对病原体的防御。在培养细胞中，caspase-3对GSDME的蛋白水解激活被报告可以引起细胞焦亡或凋亡后的次级膜损伤。后者的生理意义不太确定，因为在体内吞噬细胞通常会迅速清除凋亡细胞。无论如何，GSDME已被证实在小鼠中介导化疗药物引起的组织损伤或感染肠道病毒71型。由细胞毒性淋巴细胞释放的Granzyme B可以切割并激活caspase-3来切割GSDME，但它也可以直接在靶向肿瘤细胞中切割GSDME。在各种肿瘤细胞中，GSDME的表观遗传沉默或突变失活暗示了GSDME在抑制肿瘤中的作用。因此，进行实验以查看Gsdme缺陷是否增强小鼠自发性肿瘤模型中的肿瘤发生将是有启发性的。已有报告称，嵌合抗原受体T细胞引起的GSDME驱动的肿瘤细胞裂解在小鼠中触发细胞因子释放综合征。GSDMA主要在上皮细胞中表达。它似乎直接作为病原体传感器，通过链球菌致热外毒素B（SpeB）的蛋白水解切割后诱导细胞焦亡。GSDMB可以被细胞毒性淋巴细胞释放的Granzyme A切割并激活，Granzyme A是另一种效应蛋白酶。值得注意的是，已在不同细胞类型中描述了多种GSDMB剪接变体，其中一些编码无功能的GSDMB蛋白，这些蛋白不能诱导细胞焦亡。哪些亚型最具生理相关性尚不清楚，这使得解释将GSDMB的单核苷酸多态性与哮喘、克罗恩病和溃疡性结肠炎相关联的全基因组关联研究变得复杂。较少研究的GSDMC可能通过从杯状细胞和潘氏细胞释放IL-33在小鼠中介导抗蠕虫防御。 NINJ1依赖的质膜修复（PMR） 由NINJ1介导的PMR负责焦亡细胞的破裂，NINJ1是一种表达在细胞表面的跨膜（TM）蛋白。消除NINJ1并不会阻止细胞死亡，但会阻碍大型细胞内分子（如乳酸脱氢酶（LDH），PMR的标准标记物，和HMGB1）的释放。在培养中诱导焦亡的Ninj1缺陷细胞因其持续膨胀的形态而显著。认为从死亡细胞中排出的大型DAMPs（损伤相关分子模式）可“警告”免疫细胞，因为缺乏Ninj1的小鼠比野生型对照组更易感染肠杆菌属鼠伤寒杆菌或伪结核耶尔森菌。在活细胞中，NINJ1似乎是单体或二聚体，但在焦亡细胞中则是寡聚体。纯化的NINJ1形成的纤维在一个表面上是疏水的，而另一个表面上是亲水的，这表明NINJ1通过封顶膜边缘245或形成类似纳米盘的环，从而撕裂膜的部分。目前尚不清楚什么触发了垂死细胞中NINJ1的寡聚化。一种可能性是NINJ1感知到随着细胞膨胀而发生的膜张力或脂质排列的变化。在培养中，NINJ1也介导凋亡细胞的次级PMR。凋亡细胞最终会膨胀，因为ATP水平下降和Na+/K+ ATPase泵功能失常。caspase-3对GSDME的切割和GSDME孔的形成可能会通过渗透压加速膨胀。有趣的是，NINJ1对经历坏死或铁死亡的细胞的PMR是可有可无的。NINJ1依赖的DAMP释放是否加剧炎症和疾病严重程度，是一个活跃的研究领域。细胞死亡的灵活途径有越来越多的证据表明哺乳动物细胞在编程性细胞死亡途径中的灵活使用。例如，巨噬细胞中的炎症小体可以激活caspase-1或-8，焦亡通常因为其更快的动力学而占优势。在小鼠中的遗传实验揭示了当通常占主导地位的死亡途径受阻时，细胞死亡的意外途径。例如，在小鼠中表达蛋白水解失活的caspase-8会激发致命的坏死，但如果消除MLKL以防止坏死，那么ASC和caspase-1信号传导则有助于致死性。在另一个例子中，FADD缺陷的小鼠肠上皮细胞的回肠炎是由坏死或GSDMD依赖的焦亡驱动的。最后，坏死可以触发细胞内NLRP3炎症小体的激活，导致caspase-1的激活和活化IL-1β的释放。假设NLRP3在垂死细胞内检测到某种形式的细胞扰动。尽管NLRP3和caspase-1不是这些细胞死亡所必需的，但它们仍然通过允许垂死细胞释放成熟的IL-1β，从而为死亡的炎症性质做出贡献。 铁死亡铁死亡指的是细胞积累致命水平的依赖铁的磷脂过氧化物，从而导致非凋亡性死亡。经历铁死亡的细胞会破裂，但磷脂过氧化物如何破坏质膜的完整性尚不清楚。合成易氧化膜脂的代谢酶（例如，长链酰基辅酶A合成酶家族成员4 [ASCL4] 和溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶3 [LPCAT3]）和氧化膜脂的铁依赖酶（例如，花生四烯酸脂氧酶）赋予细胞对铁死亡的易感性（图5）。常用的铁死亡诱导剂包括小分子erastin和RSL3，它们通过干扰限制膜脂过氧化物的机制发挥作用。RSL3抑制谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4），这是一种利用谷胱甘肽将脂质过氧化物还原为无毒的脂质醇的脂质过氧化物酶。Erastin通过抑制进口半胱氨酸和使半胱氨酸可用于谷胱甘肽合成的xc−系统来耗尽细胞内谷胱甘肽。抑制其他自由基清除代谢物的产生，包括辅酶Q10（CoQ10）和四氢生物蝶呤（BH4），也可以使细胞对铁死亡更加敏感。增加游离铁的丰度是使细胞准备好铁死亡的另一种方式。 图5-细胞组分决定对铁死亡的敏感性（Credit: Cell） 铁死亡已被暗示与许多疾病有关，但在基因层面上测试其在临床前疾病模型中的因果关系很困难，因为铁死亡的媒介物在正常细胞代谢中也扮演着关键角色。检测铁死亡是另一个挑战，因为没有一个独特的标记物能够区分这种细胞死亡形式。必须观察到脂质过氧化，并评估一系列标记物以排除其他形式的细胞应激。尽管如此，一个活跃的研究领域是探索是否可以通过诱导铁死亡选择性地消除癌细胞。例如，一些肿瘤细胞可能比正常细胞更依赖半胱氨酸的摄入。结论和未来方向细胞死亡对于多细胞生物的存活和适应性是必需的，但必须严格调节以防止疾病。对细胞死亡信号机制的全面理解揭示了在疾病中抵制异常细胞死亡的机会。就内在凋亡途径而言，成功的故事是BCL-2抑制剂Venetoclax的开发，用于治疗某些血液系统恶性疾病。基于在临床前炎症性疾病模型中遗传消除这些途径的益处，抑制促炎细胞死亡程序的抑制剂的识别是一项较新的努力。焦亡的效应器，如NLRP3和GSDMD，以及作为外源性凋亡和坏死途径的介质的RIPK1，是感兴趣的靶点。这些努力的关键是知道不同细胞死亡途径在人类疾病中何时何地被激活。各种形式的细胞死亡的分子标记已被定义，例如，坏死途径的磷酸化RIPK3或磷酸化MLKL，以及炎症小体诱导的焦亡的切割GSDMD，但它们在组织中的存在可能是短暂的，因为噬菌细胞会迅速清除死亡细胞。因此，即使在遗传学告诉我们途径处于活跃状态的临床前模型中，检测途径激活标记也可能具有挑战性。 真正重要的是，阻断一个死亡途径是否会在临床上带来好处。如果焦亡是驱动败血症中失控炎症的引擎，那么针对GSDMD等焦亡的特异性抑制剂应该是有效的。这样的治疗的前景值得进一步调查。类似地，BCL-2抑制剂在临床上的巨大成功激励了开发针对常在固态恶性肿瘤中过度表达的MCL-1和BCL-XL的抑制剂。将这些抑制剂靶向癌细胞将至关重要，以避免对正常健康细胞的靶向毒性，但正在取得进展。例如，与针对肿瘤抗原CD276的特异性抗体结合的BCL-XL抑制剂似乎在保留抗肿瘤活性的同时引起的血小板减少症较少。希望过去50年在细胞死亡研究中取得的进展将继续转化为有意义的救命疗法。 感谢您能耐心读完 原文链接 https://doi-org.libproxy1.nus.edu.sg/10.1016/j.cell.2023.11.044 责编|探索君 排版|探索君 End 往期精选 围观 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摘要:生物类似单克隆抗体（mAbs）需求的不断增长促使稳定高产细胞系的开发，同时减少筛选所需的时间。现有平台已被证明是低效的，导致最终mAb产品在产量、生长特性和质量特征上的不一致性。选择适当的表达宿主、设计有效的基因表达系统、开发简化的细胞系生成方法、优化培养条件以及确定放大和纯化策略，都是哺乳动物细胞中重组蛋白特别是单克隆抗体生产的关键步骤。因此，一个积极的研究领域致力于表达和优化重组蛋白生产。本综述探讨了旨在加速细胞系开发以实现治疗蛋白合成的效率和一致性的最近突破和方法，特别是单克隆抗体。主要目标是弥合日益增长的需求与持续、高质量的mAb生产之间的差距，从而惠及医疗保健和制药行业。 引言 随着靶向生物制剂的引入，特别是单克隆抗体（mAbs），严重和慢性疾病的治疗发生了根本性变化。这些药物显著改变了包括癌症（使用单克隆抗体）、自身免疫疾病、糖尿病（使用人类胰岛素）和贫血（使用如红细胞生成素等替代品）等疾病的治疗方式。抗体，特别是单克隆抗体及其衍生物，包括抗体-药物偶联物、Fc融合蛋白和抗体片段，在诊断和治疗应用方面的广泛范围众所周知。像pembrolizumab（Keytruda）和nivolumab（Opdivo）这样的抗体在癌症免疫治疗领域引起了极大关注。自1992年第一个治疗性单克隆抗体muromonab-CD3获批以来，美国共批准了119个治疗性单克隆抗体，包括两个诊断性单克隆抗体。值得注意的是，这些批准中有很大一部分与癌症无关，证明了抗体作为治疗各种疾病的显著疗效。 抗体批准用于非癌症疾病，如治疗HIV感染（Ibalizumab）和预防偏头痛（erenumab、galcanezumab、fremanezumab），展示了进一步的多样化。此外，美国FDA已批准四种单克隆抗体用于治疗HIV感染、预防呼吸道合胞病毒和吸入性炭疽。一个很好的例子是Adalimumab（Humira），这是2018年世界上销售额最高的药物，作为生物疾病修饰剂皮下给药。它在治疗类风湿性关节炎和其他由TNFα介导的持续性、危及生命的疾病中发挥着关键作用。 图1 细胞系开发的流程：展示了开发基因工程细胞系/克隆群体以生产重组单克隆抗体(mAbs)所涉及的步骤的示意图。 如图1所示，细胞系开发（CLD）是涉及工程细胞系以主要生产重组治疗蛋白的整个产品开发的基本步骤。这涉及使用表达载体，包括调控元件，如启动子、增强子、选择标记基因，以及密码子优化的目标基因（GOI）。GOI的表达受到这些调控元件以及位于基因上游的信号序列的强烈影响。与这些一样，所使用的宿主细胞也是CLD的另一个关键方面。各种哺乳动物细胞系被用作大规模治疗蛋白生产的宿主。这些包括像NS0、SP2/0、中国仓鼠卵巢（CHO）细胞系和像HEK-293这样的人类细胞系。CHO细胞系是生产生物类似药的黄金标准表达系统，因为这些细胞能够精确地进行mAbs的糖基化，并已确立了其监管接受度的记录。与此一起，CHO细胞的增长可以在悬浮培养中规模化，使用化学定义的培养基。因此，在上游过程开发方面取得了相当大的进步，以提高mAb产量并获取对蛋白质功能和稳定性必要的适当PTMs。CLD过程中的第一步是构建含有GOI的表达载体，然后将这个表达载体转染到宿主细胞系中。所使用的转染方法可以从多种选项中选择，如阳离子聚合物、电穿孔或核穿孔。总的来说，CLD是一个复杂的过程，呈现出挑战，如需要保持mAbs的高产量，具有与创新mAb相当的质量和结构属性。细胞生物学、生物化学和生物工程的进步已经彻底改变了从哺乳动物细胞生产治疗蛋白的过程。现有的生物制剂利用商业上可用的平台为治疗蛋白生产生成专用细胞系。然而，当前平台在生长特性、不一致的产量和质量属性方面存在限制。因此，生物制药行业不断寻求开发更新、更有效的方法来克服这些挑战并提高治疗蛋白的生产能力。当我们在CHO细胞系生成的复杂网络中努力时，从效率到产量的路径以科学创造力、技术实力和监管合规性的动态互动为特点。 使用哺乳动物细胞生产mAbs涉及几个关键步骤，这些步骤对确保这些蛋白质的效率和一致性至关重要。这些包括设计有效的基因表达系统、选择合适的表达宿主、开发简化的细胞系生成方法和优化培养条件。这篇综述特别强调了在这些领域中的每一项进展，无论单独还是集体，如何有助于加速治疗蛋白生产的效率和一致性，特别是mAbs。此外，这篇综述提供了对CHO细胞系开发如何从更传统的方法演变为一系列复杂技术，以提高mAb产量和质量的更深入理解。此外，新方法对于优化表达载体、宿主细胞（基因组学到蛋白质组学和代谢组学）和细胞系开发过程至关重要。这些方法在实现大规模、高密度细胞培养、增强基因传递策略、优化下游恢复和分析方法以提高效力和经济效益方面发挥关键作用。本综述中讨论的进展的整合将实现简化的细胞系开发，从而将创新研究转化为治疗产品。研究人员可以探索新的方法来设计细胞系，整合合成生物学的原理，并创建具有改进适应性和生产力的平台，以生产商业上可行的治疗蛋白。 载体工程策略 载体工程领域对于精确调控和提升宿主细胞基因表达至关重要，它显著改变了细胞系的开发。在这个复杂的过程中，载体——在所需细胞中传递和表达感兴趣基因的工具——被战略性地修改和设计。如图2所示，载体元素的修改，如启动子、增强子和染色质修饰元件，可以增强目标基因的表达，并提高基因转移的效率以及对蛋白质分泌至关重要的信号序列。 载体工程的进步已经彻底改变了细胞系开发领域，使研究人员能够在不同系统中表达和研究基因，并促进了针对各种疾病的基因疗法的发展。在本文中，我们讨论了载体工程的最新进展及其在细胞系开发中的应用，特别强调了治疗蛋白的生产。 改变启动子和增强子元件是载体工程的基石之一。这些组分在决定基因如何翻译成RNA然后翻译成蛋白质方面起着至关重要的作用。选择正确的启动子是获得高水平和一致的转基因表达的关键步骤。启动子在合成和处理控制转录起始的信号中起着关键作用。使用了各种启动子，包括像磷酸甘油酸激酶1 (PGK)、人类延伸因子-1α (EF-1) 和人类泛素 C (UBC) 这样的真核异源启动子，以及像巨细胞病毒立即早期 (CMV-IE) 和 Simian Virus 40 (SV40) 这样的病毒异源启动子。人CMV主要即刻-早期增强子/启动子 hCMVp 因在促进转基因表达方面非常有效而经常被使用。SV40 增强子是第一个被发现的顺式作用元件，并且已被证明可以显著提高同源和异源启动子的转录速率 。在一项比较研究中，RSVp 在用于CHO细胞的基于质粒的短暂转基因表达时，显示出仅次于 hCMVp (100%) 的第二高表达率 (92%)。尽管病毒启动子通常用于重组蛋白的表达，但它们容易受到DNA甲基化引起的表观遗传沉默的影响，从而导致表达减少。 图2 载体工程方法：提高重组单克隆抗体(mAbs)表达的关键策略是开发高效率的表达载体，这些载体配备有强启动子、染色质修饰元件，并对信号序列和密码子进行优化。 由内源性启动子如中国仓鼠延伸因子-1 (CHEF-1) 启动子提供的替代病毒启动子是可取的。这些启动子是从通常存在于宿主细胞中的基因衍生的，从而降低了与病毒启动子相关的沉默和压力反应的风险。合成生物学的概念也导致了合成启动子的出现，它们提供了创新和适应性强的转录调控。例如，超级核心启动子 SCP1 结合了几个来源的组分，大大提升了转录速率。 使用对 cumate 敏感的操纵子序列（来自 Pseudomonas putida 的 cymene 操纵子）的 cumate 基因开关是最新开发的哺乳动物诱导系统之一，其工作原理类似于 Tet-On/Tet-Off 系统。在无血清的 CHO 细胞中，基于腺病毒或慢病毒载体的 cumate 基因开关已被研究用于过渡性基因表达。根据产品的不同，LV/CHO 系统产生了短暂转基因表达，具有 6-74 的 ON/OFF 诱导比率（单克隆抗体为 6 倍，抗凝剂、红细胞生成素为 74 倍），这在需要迅速生产相对较小数量的蛋白质时具有优势。cumate 基因开关技术可以修改用于补料批次培养 。CHOBRI/rcTA，最近描述的一种 cumate 诱导稳定 CHO 细胞系，允许可重复合成高达 350 mg/L 的重组抗体和 940 mg/L 的重组 Fc 蛋白 。Poulain 等人也进行了类似的研究，它表明 cumate 基因开关是稳定克隆形成的良好平台，并鼓励在 CHO 细胞中更广泛地使用诱导系统进行大规模生物生产 。诱导系统的关键好处是细胞培养生长和生产阶段的有效独立性。没有受到重组蛋白生产带来的代谢压力的细胞生长和分裂得更快，从而实现了更高的细胞密度。尽管诱导启动子在生物制剂生产中具有广泛的应用范围，但在使用影响细胞健康和生产力的有毒诱导剂方面存在限制。 染色质修饰元件改善转基因转录 与启动子和增强子等元件一样，目标基因（GOI）的表达取决于在宿主染色体上的整合位点。随机整合可能导致不可预测的结果，影响GOI的表达以及内源基因功能。为了克服这种位置效应，已在哺乳动物表达系统中描述了多种染色质修饰元件（CMEs），这些元件可以提高异源产物的产量。这些可以分为1.那些积极将染色质改变为开放的转录状态的（普遍作用的染色质开放元件[UCOEs]和位点控制区域[LCRs]）2.那些防止异染色质标记扩散到染色质形成的区域的边界（绝缘子、稳定抗抑制因子[STAR]元件、支架或基质附着区域[S/MARs]）。 图3 普遍作用的染色质开放元件（UCOE）：染色质修饰元件，如UCOE，保护目标基因（GOI）免受表观遗传沉默的影响，从而保持基因处于开放状态以进行转录。(i) 整合到基因组异染色质区域的进入性GOI通过DNA中胞嘧啶的甲基化等共价修饰被沉默。这导致基因沉默和生产力随时间的丧失。(ii) 在基因盒上游加入UCOE会产生抵抗沉默的开放染色质区域。这维持了GOI的整合独立状态，因此延长了生产力的维持时间。 普遍作用的染色质开放元件（UCOEs）是保持染色质开放的序列，从而实现一致的高水平的转基因表达，如图3 所示。这些UCOEs具有无甲基化CpG岛，被发散转录的启动子所环绕，类似于管家基因的调控方式。UCOEs的上游整合被发现可以提高表达水平并抵抗基因沉默。Nematpour等人评估并得出结论，UCOEs的使用与重链结合大大增强了mAb表达的水平和稳定性，从而产生了更高产量的更稳定的细胞系。Doan等人通过使用结合UCOE和DHFR的载体构建，提高了CHO-DG44细胞中抗TNFα mAbs的表达。这些研究清楚地强调了UCOEs在增强转基因表达中的作用，从而被证明是商业生产mAbs的良好选择。 另一组CMEs包括S/MARs，它们是富含AT的实体，使DNA附着和高阶环的创建成为可能。它们对结合核基质或支架具有高亲和力，体外。在计算机上的研究表明，核小体定位基序和众多转录因子的结合位点的存在与MARs提高转基因产量的能力有关。当S/MAR插入到启动子之前控制GOI时，通过在整合位点生成独特的染色体域来保护转基因免受表观遗传沉默的影响。人类血红蛋白、干扰素和鸡溶菌酶50区域的MAR已被描述，并成功用于提高稳定转染的CHO细胞中的转基因产量。与UCOEs相比，MAR活性似乎较少见。尽管由于其巨大的大小和作用方式理解不足，管理MARs可能是不可预测的，但更多的研究无疑将带来更好的理解。 其他染色质修饰元件的使用，如绝缘子和稳定抗抑制因子（STARs），并没有显著增加转基因表达。尽管早期报告表明这些元件相当有效和有前景，但该系统从未在工业中完全实施。虽然这些元件中的一些在早期研究中显示出希望，但它们的全部潜力仍在探索中。这些元件的效果因几个参数而异，如整合位点、宿主细胞系以及GoI的特征。 有几种技术用于优化基因表达以合成治疗蛋白。虽然经常使用强天然病毒启动子来实现高水平的表达，但合成启动子库准确调节转录强度。病毒和哺乳动物异源启动子都容易受到转录抑制的影响，这解释了为什么内源性CHO启动子如CHEF-1α是有利的替代品。诱导系统，如Tet-On或cumate基因开关，可以将生长和生产阶段分开。此外，保证表达稳定性至关重要，通过在表观遗传水平上工作的元件如MARs和UCOEs实现，以维持整个培养过程中的转录许可染色质状态。染色质修饰元件在未来可能会以更高级的方式使用。 密码子优化和信号序列的使用 密码子优化描述了通过利用同义突变来提升GOI蛋白表达的方法。由于不同细胞中转运RNA的丰度不同，以及它对mRNA稳定性和转录本产生的二级结构的影响，密码子优化对于基因表达至关重要。使用DNA洗牌的实证方法，早期对CHO细胞中绿色荧光蛋白(GFP)的基因表达进行密码子优化尝试，使产量提高了42倍。随着对哺乳动物细胞理解的加深，现在有更合理的密码子优化方法，并且使用所谓的密码子适应指数来评价一个基因对表达优化得有多好。关于CHO细胞的最新蛋白质组学研究涉及了对密码子使用的全面评估。发现脯氨酸、苏氨酸、天冬氨酸和半胱氨酸更倾向于特定的密码子。在CHO和人类细胞中使用基于密码子使用的优化，观察到mAb表达的提高在1.5到四倍之间。一些研究声称密码子优化主要增加了mRNA水平。 人类IgG抗体由两个相同的重链(HCs)和两个相同的轻链(LCs)组成。为了将HC和LC蛋白复合物运输到内质网进行正确的折叠、组装和翻译后修饰，HC和LC需要正确的信号肽。与使用天然IgG LC信号肽相比，使用人血清白蛋白产生的信号肽使稳定mAb产生的CHO细胞小池的平均比生产率翻了一番多，超过40 pg/cell/day。通过密码子优化和选择合适的信号肽，在CHO细胞中展示了pertuzumab产量的两倍增加。 总之，载体工程是一个多方面且不断扩展的领域，它推动了细胞系的创造。研究人员可以通过系统地调整载体元素，在宿主细胞中获得最佳的基因表达和蛋白生产。这在研究、生物技术以及医学中有广泛的应用，允许合成治疗蛋白、研究基因功能和发展新的基因治疗。随着学科的发展，载体工程将在未来分子生物学和生物技术领域中发挥越来越重要的作用。 宿主细胞工程 CHO细胞是生物制药行业中生产生物类似药和其他治疗蛋白的首选，因为它们具有哺乳动物的特性，有助于正确的蛋白质折叠和糖基化，以及在悬浮培养中的有效可扩展性。然而，使用中国仓鼠卵巢(CHO)细胞生产生物制药面临着由于治疗蛋白需求不断增长所带来的重大挑战。为了满足这些需求，研究人员转向了细胞工程的创新策略。这些策略通常涉及操纵CHO细胞内特定基因的活性以实现期望的结果，如增强蛋白表达和提高细胞活性。这是通过技术如某些基因的过表达、CRISPR-Cas介导的敲除（涉及沉默特定基因）或敲降（涉及减少特定基因产物的表达）来实现的。 开发了CHO细胞变体，在多个关键方面优于其亲本细胞系。这些包括提高的生长速率、增加对凋亡（程序性细胞死亡）的抵抗力、改善的代谢活性、在蛋白合成方面的增强生产力，以及定制具有特定糖基化模式的重组蛋白的能力。此外，最近的进步导致了悬浮细胞系的创建，这些细胞系更易于管理，并且可以更有效地扩大规模用于大规模生产。本节重点介绍通过基因组修饰实现改善重组蛋白生产的宿主细胞工程的发展。 工程细胞死亡 细胞死亡触发代谢物的积累和压力中断，导致细胞培养和生物过程产量的不平衡。此外，细胞死亡引入蛋白酶，导致产品不稳定和酶阻碍期望的产品合成。培养基中营养物质的不足促使细胞缺乏，诱导宿主细胞的自噬。操纵控制凋亡和自噬的基因提供了一种延长培养可持续性的方法，详细见表1、2和3。通过哺乳动物细胞工程提高细胞活性，目标是凋亡和自噬基因，如图4所示。通过增加特定的B细胞家族(BCF)蛋白如BCL-2和BCL-XL的表达，增加细胞活性，抑制凋亡触发。BCL-2相关基因也抵消了各种细胞线中的生理压力，提高了单克隆抗体(mAb)的产量和细胞寿命。 SIRT6是一种应对压力的蛋白质，它调节DNA修复和基因组完整性，对细胞存活和寿命起着关键作用。Hashemi等人通过稳定过表达SIRT6对CHO-K1细胞进行了工程改造，评估了其对凋亡相关基因和单克隆抗体（mAb）生产的影响。值得注意的是，经过SIRT6工程改造的细胞显示出增加的BCL-2 mRNA水平，并且与亲本CHO-K1细胞相比，caspase-3和Bax mRNA表达减少。这与更高的细胞活性和减少的凋亡进展相吻合。此外，在SIRT6工程克隆中的短暂和稳定表达期间，IgG1 mAb效价显著提高了1.7倍和2.8倍。 众所周知，应用siRNA沉默促凋亡蛋白FADD、Alg-2和REQUIEM可以增强CHO细胞培养密度和生产力。MacDonald等人最近的一项研究利用CRISPR‐Cas9技术对BCL‐2家族的关键效应蛋白Bak1、Bax和Bok进行组合敲除（KOs）。研究发现Bak1和Bax表现出协同的抗凋亡特性，而Bok的缺失影响最小。Bak1和Bax的缺失有助于延缓和减轻细胞死亡进展，揭示了它们在CHO细胞培养性能中的重要性。Rahimi等人的研究也显示了类似的结果，其中破坏Bax导致工程克隆中的细胞活性延长和增殖率增加。操纵细胞中Bax蛋白表达的减少导致增强了对压力诱导的凋亡耐受性，对凋亡诱导剂oleuropein的抗性，并显著提高了重组蛋白生产水平。 自噬是细胞在压力下恢复平衡的重要过程，它影响蛋白质表达动态。敲除ULK1，自噬启动的关键参与者，导致在稳定Cripto-Fc生产细胞中蛋白质表达增强了三倍。这些发现强调了自噬、蛋白质表达和细胞稳态之间复杂的相互作用，突出了有针对性的干预优化细胞机械以提高蛋白质生产的潜力。 这些研究表明，调节凋亡和自噬途径至关重要，因为导致细胞死亡的因素、代谢失衡和产品不稳定之间存在复杂的相互作用。此外，自噬、蛋白质表达动力学和细胞稳态之间的联系为靶向治疗提供了基础，为优化细胞过程以实现更高的mAb生产具有巨大的潜力。 宿主细胞代谢途径工程 宿主细胞的代谢活动会产生各种废物，这些废物可能阻碍细胞生长并影响产品产量。增加的葡萄糖和谷氨酰胺摄取率会导致乳酸和氨的积累，妨碍细胞增殖和产品生产。研究表明，控制培养基中的葡萄糖和谷氨酰胺水平可以防止这些有害代谢物的积累。CHO细胞培养中抑制性废物产物的显著部分来自氨基酸的分解。在Mulukutla等人的一项研究中，工程化CHO细胞在补料批次培养中被设计为减少特定氨基酸代谢产物的产生。这是通过针对与苯丙氨酸-酪氨酸和支链氨基酸相关的途径来实现的。在苯丙氨酸-酪氨酸途径中过表达表达不足的基因减少了抑制性副产品。在支链氨基酸分解途径中，敲除BCAT1基因消除了有问题的代谢产物产生，从而在补料批次培养中改善了细胞生长和生产力。 策略性地工程化宿主细胞内的代谢途径已成为减少不良废物代谢物产生和积累的有效方法。相关基因精心策划了这些效应，详细列在表1、2和3中，概述了它们修改的有效性。 乳酸脱氢酶（LDH）在将丙酮酸转化为乳酸的过程中至关重要，这一过程由NADH/NAD+辅酶对驱动。LDH已被确定为目标，使用如功能丧失突变等技术在宿主细胞中进行操纵。CHO细胞中LDHA基因的单等位基因敲除诱导了一种代谢状态，减少了乳酸产生并增加了重组蛋白生产，如图5 所示。Ley等人利用CRISPR-Cas9基因组编辑修改了九个不同氨基酸分解途径中的基因。这导致了通过扰动单个氨基酸分解基因而显著减少特定的乳酸和铵分泌。这些变化与增加的生长速率和整体活性细胞密度相吻合。观察到铵（高达26%）和乳酸产生（高达22%）的显著减少，强调了针对性基因中断，特别是Hpd和Gad2，在抗体生产场景中微调细胞性能的潜力。 优化工作还针对负责葡萄糖和谷氨酰胺摄取的转运蛋白。Wlaschin等人通过RNA干扰（RNAi）下调膜结合葡萄糖转运蛋白GLUT5，减少了葡萄糖消耗并减轻了乳酸和氨的积累。增强宿主细胞代谢所必需的蛋白质与提高培养活性和更高产品产量相关联，如表1中详细讨论的。 此外，研究人员还探索了除三羧酸（TCA）循环之外的替代代谢途径。例如，生产组织型纤溶酶原激活剂（tPA）的CHO细胞通过修改半乳糖代谢中的关键步骤来限制乳酸合成。这涉及增强半乳糖激酶（Galk1）的表达，这改善了生物量和产品合成。CHO-Galk1细胞表现出增强的葡萄糖和半乳糖生长期中的糖酵解通量，使它们能够以半乳糖作为主要碳源生存。虽然乳酸产生减少，但代谢调整被注意到，强调了需要进一步改进以优化半乳糖代谢和营养利用。在另一项研究中，Tang等人证明，删除负责将磷酸烯醇丙酮酸（PEP）转化为丙酮酸的丙酮酸激酶肌肉（PKM）基因，减少了中国仓鼠卵巢（CHO）细胞中的乳酸分泌。敲除丙酮酸激酶肌肉同工型1和2（PKM-KO）和同工型1（PKM1-KO）导致改变的葡萄糖消耗，氨基酸代谢，减少乳酸分泌，并与野生型细胞相比，IgG效价更高。 宿主细胞代谢的操纵已成为CHO CLD中的一种强大策略。通过调节特定基因表达，已在CHO细胞的开发中取得了显著进步。这些修改有望增强细胞活性并提高免疫球蛋白Ig效价，同时减少细胞死亡率。一个核心重点是减少培养环境中乳酸和氨的产生。此外，还探索了从TCA循环偏离的替代代谢途径的转变，以优化细胞的代谢框架。这些累积策略强调了代谢工程在定制CHO细胞以实现提高性能和放大Ig生产中的有效性。 工程化细胞周期 改造哺乳动物细胞系的生长和分裂方式，特别是对于生产单克隆抗体（mAbs）至关重要的细胞系，提供了增加细胞密度和产量的途径。经过工程改造的细胞系表现出高生长速率，这反过来又导致营养稀缺、有毒代谢产物的积累和氧气耗尽。这在批量培养中普遍存在，导致细胞密度迅速下降。为了解决这些问题，采用策略性干预来平衡生长和产品形成。这些策略中的关键蛋白是细胞周期抑制因子，如p21CIP1和p27KIP1，它们在DNA损伤后阻止细胞分裂中发挥关键作用。另一种蛋白，干扰素调节因子-1（IRF-1），可以作为靶点来减缓细胞生长并增加IgG抗体的产生。 表1 利用基因过表达对CHO细胞工程进行目标基因和途径的列表 表2 使用基因敲除对CHO细胞工程进行目标基因和途径的列表 表3 使用基因敲减对CHO细胞工程进行目标基因和途径的列表 重点是增强调节细胞增殖和活性的基因。表1提供了这些基因及其影响的列表。在细胞周期中共同表达检查点蛋白，如细胞周期依赖性激酶样3和细胞色素c氧化酶亚基15，显著增加了最大活性细胞密度。当在CHO细胞中过表达c-myc基因时，也观察到了类似的改善，导致细胞密度显著增加了70%。 图4 防止凋亡工程的策略：通过遗传修饰来防止凋亡/自噬，目标是敲除/抑制促凋亡基因或过表达抗凋亡基因。(i) 将GOI转染到宿主细胞中，形成具有特定生长和生产力特性的生产细胞系。(ii) 当使用遗传工程宿主细胞进行生产时，这种生长和生产力特性会得到增强。这些经过遗传操作的宿主细胞系利用CRISPR/Cas9和siRNA等工具来防止或延迟凋亡，从而在生产期间的更长时间内保持细胞健康。 将细胞生长与生物治疗药物生产解耦已成为生物制药领域越来越受欢迎的策略，特别是对于难以表达的产品。典型的方法包括在没有同时产生重组蛋白的情况下培养细胞至高密度（称为生长阶段）。随后，触发重组蛋白的表达，并停止细胞增殖（生产阶段）。这通常通过结合诱导型基因表达系统和控制增殖的策略来实现。生长和生产阶段的分离优化了细胞资源的分配，提高了生长特性和难以生产蛋白的产量。 然而，目前控制哺乳动物细胞增殖的方法依赖于温度变化和化学试剂。这些方法与许多非增殖途径相互作用，导致对产品质量和培养活性产生不同的影响。相比之下，合成生物学提供了一种替代方法，策略性地针对增殖途径以阻止细胞生长。令人惊讶的是，这些合成生物学技术尚未得到广泛利用。针对细胞增殖控制的靶向代表了在G1阶段特别阻止细胞增殖的潜在解决方案，G1阶段的特点是细胞更大，核糖体蛋白S6水平更高，同时保持产品质量。细胞周期的有序进展依赖于各种细胞周期调节因子的受控激活、降解和合成。 合成生物学在将生长和生产分离到哺乳动物细胞中的潜力已经在“按设计纯度”的细胞系中部分实现。启动咖啡因诱导的哺乳动物蛋白激酶R有效地停止了非产品蛋白的翻译，另外还有病毒IRES序列作为额外的保障，确保重组蛋白生产的保护。尽管取得了这些进展，但由于从IRES序列的翻译无法获得完整的核糖体机械装置，因此可实现的效价受到限制。 工程化糖基化 在哺乳动物细胞中生产治疗性抗体涉及一个复杂的过程，其中包括各种修饰，其中之一就是糖基化。糖基化模式在决定单克隆抗体（mAbs）在人体内的行为和效力方面至关重要。这些模式影响诸如抗体在血液中的持久性、引发免疫反应的潜力以及有效执行其预期功能的关键因素。异常的糖基化模式可能导致免疫反应和mAb效力下降，这使得在生物制药生产中必须解决这个问题。 研究人员正在积极探索策略，以微调治疗性抗体中的糖基化模式。一种方法涉及操纵特定基因以诱导更类似于人类的糖基化模式。这些针对性的基因操纵，如表1所强调的，有潜力生产出糖基化模式与人类等同的mAbs，从而提高它们在给患者施用时的兼容性和效力。 图5 宿主细胞乳酸代谢的调控。在哺乳动物细胞中，减少补料批次过程中乳酸的形成是使用的一种有效的代谢工程技巧。(i) 利用乳酸脱氢酶(LDH)从丙酮酸生成乳酸，导致培养基酸化以及增加的氧化应激，从而导致细胞死亡。(ii) 降低LDH基因的表达减少了乳酸水平和活性氧(ROS)的生成，维持了细胞在补料批次培养中更长时间的活性。 另一种策略侧重于控制N-糖基化途径，以增强重组抗体上的糖链结构。通过协调这一途径，研究人员已经实现了抗体糖基化模式的显著改善，这可以有助于更好的治疗效果。相反，另一种途径涉及抑制宿主细胞内的特定糖基化途径。这种操纵允许生产具有定制糖基化模式的mAbs，解决了不适当糖基化的问题，并增强了这些抗体的治疗潜力。例如，MGNT和MGAT1等目标基因敲除已经证明这种方法在中国仓鼠卵巢（CHO）细胞中的可行性。用于生产具有定制糖基化模式的单克隆抗体的基因已在表2和3中列出，以及所使用的干预方式，基因敲除或敲降。 在最近的研究中，像CRISPR-Cas介导的基因干预这样的新型基因工程技术已经成为改变mAbs糖基化模式的强大工具。Shen等人利用CRISPR‐Cas13d技术精确控制与CHO细胞中的糖基化、代谢、凋亡和其他关键细胞过程相关的基因表达。这项技术大幅减少了IgG岩藻糖化，并有效抑制了90%以上的FUT8基因表达。在Yang、Wang等人的另一项研究中，利用CRISPR-Cas9介导创建了FUT8基因敲除的CHO细胞系。这种基因敲除不仅影响了核心蛋白岩藻糖化，而且对各种糖基化机制产生了更广泛的影响，导致蛋白质糖基化谱的相对丰度发生变化。 此外，研究人员还探索了调节糖基化途径以优化抗体糖型谱。在Prabhu等人的一项研究中，通过策略性地敲除与糖基化途径相关的基因，修改了重组IgG的糖型谱。这种方法抑制了UDP-Gal和GDP岩藻糖的生产，这些是糖基化中的关键分子。有趣的是，工程化细胞系依赖于一个挽救途径，通过操纵细胞外半乳糖和岩藻糖水平来调节糖基化水平。这种创新方法允许生产具有特定糖基化谱的糖工程蛋白，以增强生物活性和靶向治疗应用。 此外，探索mAbs上特定的唾液酸残基，如N-糖基神经氨酸（NGNA），已经揭示了过表达特定基因的潜在好处。Fischer等人进行了一项涉及CMAH基因的研究，该基因与NGNA唾液化有关。通过修改CMAH基因位点，他们成功增加了NGNA唾液化水平。这种改变经过精心执行，涉及创建一个催化失活的CMAH蛋白版本，导致工程细胞表面糖蛋白上的NGNA唾液化增强。这一突破表明设计具有改变唾液化模式的抗体，可能增强其治疗属性。 这些在宿主细胞工程方面的进展加速了生物制药行业朝着更高效和可靠的制造工艺发展。研究人员通过理解和改变复杂的生物途径，提高了细胞存活率和蛋白表达。他们还发现了操纵糖基化模式的独特方法，这是治疗干预有效性中的关键因素。现代方法如CRISPR-Cas介导的基因编辑可以使改变更加精确和针对性。这些进展不仅解决了产品稳定性和可扩展性的问题，而且还为定制特定产品特性以满足各种治疗需求打开了大门。宿主细胞工程定位于成为决定生物制药发展方向的关键因素，因为该领域持续扩大。 选择和扩增 在用适当的表达质粒转染后，生产宿主细胞系会受到选择压力，以产生具有基因组整合表达载体的稳定细胞库。已经开发了几种技术来选择特定的染色体基因以及这些基因的扩增。通过与非选择性目标基因一起共转染可以用于基因扩增的基因，这种基因扩增可以比仅通过传统基因转移单独产生任何特定基因产物产生更高的产量。 DHFR基础平台 使用DHFR表达载体与DHFR缺陷的CHO细胞结合是基因转移和扩增最受欢迎的方法。由于CHO细胞非常适合生产蛋白质，它们已被用来创建几种具有高商业价值的蛋白质。二氢叶酸还原酶（DHFR）和谷氨酰胺合成酶（GS）选择/扩增平台通常被用于稳定和均匀的mAb生产。在接受细胞转染表达载体后，编码所需蛋白和DHFR的DHFR阳性转化子被分离出来。然后选择转化细胞群体，以抵抗DHFR抑制剂甲氨蝶呤（MTX）的增长水平。使用这种方法可以分离出具有提高的DHFR蛋白水平和扩增的DHFR基因拷贝的MTX抗性细胞。由于DHFR和目标基因在物理上接近，它们会共同扩增。这种促进蛋白质过表达的技术非常有效，至今仍是最流行的共转移和共扩增方法。 然而，扩增产生的多重串联载体重复可能不稳定，这使得它费力、耗时，并随着时间降低产量。减少DHFR选择标记的表达是提高基因拷贝数以改善转基因转录的另一种策略。只有具有最高转录活性位置的细胞才能在筛选中存活。在Naddaf等人的研究中，使用phiC31整合酶技术将DHFR选择标记用于创建一个高表达质粒，可以用于在CHO-DG44细胞中表达Blinatumomab的研究，并预期其使用。在Min等人的平行研究中，甲氨蝶呤介导的基因扩增与位点特异性整合相结合，开发了高产rCHO细胞系。这种混合细胞系开发方法有潜力提高在生物制药制造中常用的CHO细胞的蛋白质生产效率和产量。 GS基础平台 谷氨酸合酶（GS）选择方法也在CHO细胞中广泛使用。谷氨酸合酶催化谷氨酸向谷氨酰胺的转化，由GS基因编码。由于谷氨酰胺是一种必需的氨基酸，细胞在没有GS表达的情况下无法在无谷氨酰胺的培养基中生长。然而，CHO细胞通常在无谷氨酰胺的培养基中表达GS。因此，为了能够使用GS作为可选择性标记，必须在细胞培养基中加入竞争性抑制剂MSX。通过加入MSX，只有那些在质粒载体中表达GS可选择性标记并因此产生更多GS的细胞才能在筛选条件下存活。细胞系的工程化以及转染和选择过程的优化一直是提高GS基因选择强度的主要领域。研究表明，使用锌指核酸酶（ZFN）技术敲除CHO细胞中的内源GS基因，可以产生对MSX选择更敏感的多个细胞系，并增加了重组mAb高产频率六倍，提高了细胞系开发和克隆筛选程序的有效性。在抑制内源GS基因表达的同时，通过提高细胞培养基中的谷氨酰胺含量，可以在使用相同浓度的MSX时有效增加选择强度。 这两种技术在转染后都需要多轮扩增，尽管它们使用不同的代谢途径（DHFR的核苷酸代谢和GS的谷氨酰胺代谢）。因此，使用有毒化学物质和专用培养基需要昂贵且耗时的开发。与GS平台相比，DHFR平台的扩增需要更长时间，因为需要使用类似物（MTX或MSX）进行多轮扩增，如图3所示。在爱丁堡大学，创建了一种名为OSCAR™的新表达系统。该系统依赖于部分失活的微小基因载体，编码酶，次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶（HPRT），这是通过典型的细胞挽救途径所需的嘌呤合成。当其中一个微小基因和GOI被转染到HPRT缺陷的哺乳动物细胞中时，细胞被培养在一种选择性的次黄嘌呤氨基蝶呤胸腺嘧啶（HAT）培养基中，阻止了新的嘌呤合成。因此，使用失活的HPRT酶的挽救途径对细胞存活至关重要。由于这种酶对细胞存活需要高浓度，OSCAR™系统在比传统的DHFR和GS系统更短的时间内，以单步选择了GOI并进行了扩增。与传统系统相比，OSCAR™创造了细胞，其稳定表达产量提高了七倍，由于没有特殊培养基和危险物质，材料成本降低了七倍，使其成为一种迅速的技术。尽管OSCAR™是一种新技术，但需要进一步研究以确定它是否可以应用于更广泛的细胞和培养基类型，以及其在生物反应器中的性能。 在通过DHFR或GS平台进行选择后的转染体产生群体经过筛选和扩增后，这个细胞池（通过DHFR或GS平台产生）被进行单细胞克隆，以产生单克隆群体（图6）。 高通量筛选和筛选系统 转染群体被视为一池细胞，因为它是由转染基因盒数量和位置显著不同的异质细胞混合而成的。这导致了具有不同遗传和表型特征的细胞群体，这些特征影响产品质量和稳定性。此外，生长速率和代谢特征的差异将显著影响产品特征。因此，有必要建立表型和遗传上相同的生产细胞系。同样，监管指南规定，生产细胞系必须是单克隆的，并起源于单个祖先细胞。因此，单细胞分离和克隆筛选系统是生物技术和生物制药行业中关键的工具，用于识别和选择高质量的细胞系。这些系统允许研究人员分离单个细胞，克隆它们，然后筛选它们以获取理想特征，如高生产力或蛋白质质量。 图6 DHFR/MTX 和 GS/MSX 选择和扩增系统：利用MTX（叶酸的类似物，是嘌呤和嘧啶从头合成所必需的）扩增含有相邻GOI的DHFR基因载体。MTX的浓度逐渐从10纳摩尔(nM)增加到1000 nM，并且需要多轮扩增，这需要更多的时间来建立细胞系（12-14周的DHFR扩增）。在GS-MSX系统中，MSX作为谷氨酸的类似物和谷氨酰胺（必需氨基酸）的前体，用于增强GOI的扩增。在这里，建立选定细胞池所需的时间相对较少，因为使用了25到50微摩尔(µM)的MTX浓度，并且不像DHFR-MTX扩增那样需要那么多轮的扩增。 限制稀释是最早和最广泛使用的单细胞分离方法之一。该方法涉及将细胞连续稀释，直到分离出单个细胞并将其培养成克隆群体。虽然限制稀释（LD）是一种低通量技术，但它是一种有价值且可靠的单细胞分离和克隆选择方法。然而，由于细胞倾向于聚集在一起，以及该技术的手动性质，建议进行两轮限制稀释以确保单克隆性。 荧光激活细胞分选（FACS）是另一种广泛使用的单细胞分离方法，它利用荧光标记和自动化细胞分选。FACS能够高通量地进行单细胞分离，并已用于各种应用，如干细胞和免疫细胞的分选。ClonePix系统是一种高通量单细胞分离和克隆筛选系统，它使用基于图像的技术。该系统可以挑选单个细胞并将它们分配到微孔板中，允许同时高效筛选和分析多个克隆。其他使用基于图像的技术来分离和筛选单细胞的高通量系统包括视频成像板系统（VIPS）、cellcelector和单细胞打印机。这些系统可以将单个细胞分配到多孔板中，允许高通量克隆筛选。Josephides等人报告了使用Cyto-Mine单细胞分析和单克隆性保证系统，该系统采用皮升滴技术筛选数百万滴液，允许以自动化方式分析单个细胞并分配单个细胞。这些高通量技术比传统方法更受青睐，提供了更高的单细胞选择精度和准确性，从而提高了克隆性和可重复性。此外，这些自动化解决方案提供文档记录，协助符合监管要求，确保结果的可追溯性，确保克隆开发的质量问题。 转染策略 在产品细胞系开发中，将所需的表达载体传递到宿主细胞的策略至关重要。这取决于宿主细胞系的类型、产品类型及其产量，以及重要的监管合规性。转染策略包括基于试剂的方法，如使用阳离子脂质、二乙氨基乙基（DEAE）-右旋糖酐、聚乙二醇化聚乙烯亚胺、磷酸钙和阳离子聚合物或其树状分子介导的传递、病毒介导的传递以及基于仪器的传递方法，如电穿孔和显微注射等。非病毒传递技术因已获得监管机构批准用于人类用药的蛋白质生产而受到欢迎。 初步的DNA传递技术，如磷酸钙沉淀和DEAE-右旋糖酐，非常经济，但常与较差的转染效率和高水平的细胞毒性相关。阳离子聚合物，如聚乙烯亚胺（PEI），是常用的、经济的、非细胞毒性的试剂，可以扩大到数百升，并实现几乎100%的转染效率。市场上可购买的试剂，如jetPEI®，已被生物制药行业用于大规模生产治疗性蛋白，使用HEK 293和CHO细胞平台。然而，PEI与一些生长介质的成分不兼容。 另一种被广泛接受的将外来DNA引入宿主细胞的方法是电穿孔或电场介导的通透性，这涉及将细胞暴露于短暂的电脉冲中，以在细胞膜上形成瞬时孔隙。在最佳电场强度、脉冲长度、缓冲液电导率、波形和脉冲数量下，这种方法提供了高转染效率、高细胞活性、易用性和适用于不同细胞类型，且不改变宿主细胞的生物结构或功能。据报道，微流体电穿孔方法，即细胞在通过电场室时进行电穿孔，允许使用设备如MaxCyte VLX®可扩展转染系统进行大规模转染。 核转染是传统电穿孔方法的重大进步，它允许通过电场和特定于细胞类型的溶液组合直接将DNA传输到细胞核。Amaxa开发了一种专利的商业电穿孔系统，称为Nucleofection™，目前由Lonza拥有。有几种专利的细胞特异性缓冲液旨在最大限度地提高转染效率，同时最小化细胞死亡。由于Nucleofection™技术能够转染各种难以转染的细胞，核转染技术在研究人员中变得相当流行。 工艺优化 使用哺乳动物细胞培养生产生物制剂的最优产量在很大程度上依赖于培养基和饲料的优化（如图7所示），因为这些过程在增强细胞生长和蛋白质生产中起着至关重要的作用。 图7 影响过程优化的因素：各种因素，如培养基和饲料优化、过程参数（pH、溶解氧、温度）优化、生物反应器设计以及纯化过程，都有助于开发高效的生产流程。 在饲料和培养基优化方面已经取得了一些进展，以提高生物制剂的产量。例如，使用动态喂养方式和计算机生物模拟（“数字孪生”）以及代谢途径的基因组规模通量分析来优化培养基组成是一些已经开发的先进技术。Saldanha等人使用偏最小二乘模型来识别增加mAb生产力的关键成分。推断得出，虽然TCA循环中间体和几种维生素的浓度在mAb生产处于高峰时对静止相有显著影响，但几种氨基酸、丙酮酸和吡哆醇的初始浓度影响了早期细胞生长。详细了解细胞如何响应各种培养基成分、喂养方法、气体交换和其他参数对于有效的培养基开发和优化过程是必要的。 培养基和饲料优化可以采用不同的技术进行，例如实验设计（DoE），这是一种用于设计和分析实验的统计方法。Mora等人为确定高效的喂养策略开发了一个DoE框架，这有助于减少操作人工时间并提高整体工作流程效率。这种方法可以显著减少培养基优化所需的时间和资源，同时提供了一个稳健且可重复的方法以实现最佳生产力。如今有许多类型的生物反应器可用，例如细胞培养袋、G-Rex罐、摇摆运动生物反应器、搅拌罐和搅拌槽生物反应器以及中空纤维生物反应器。这些生物反应器用于不同的目的，如用于可扩展和多功能的生物治疗药物生产过程[93]以及补料和批量细胞培养。此外，一直在开发GMP生物反应器，重点是封闭且完全自动化的护理点（POC）系统。生产生物制剂或细胞治疗需要自动化、可扩展、经济实惠且符合GMP的生物反应器。近年来，一次性生物反应器已成为生产生物制剂的首选。这些由一次性袋子代替培养容器组成。在这种情况下，生物反应器与塑料衬里相关联，该衬里被封闭在更耐用的结构中，并与细胞和培养基接触。一次性生物反应器由不锈钢体组成，内衬生物反应器袋、组件和其他用于生物生产、过程开发以及研究和开发的配件。这些袋子和组件在使用一次后被丢弃。过程参数优化是开发用于生产治疗产品的哺乳动物细胞系的一个重要步骤。这包括优化温度、pH值、溶解氧浓度和搅拌速率等参数，以确保生产高质量的治疗蛋白。在生物制剂制造中的过程参数优化方面已经取得了一些进展。例如，数字生物制造正在经历与数字制造相同的大部分进步。为确保生物制造过程处于控制之下，生物制剂的持续过程变量监测计划需要收集与关键过程参数（CPPs）和关键质量属性（CQAs）相关的例行数据，以及数据的预处理、分析和评估。像人工智能和机器学习这样的现代技术是改善生物过程和推进生物技术行业的有希望的工具。它们可以用来优化生物过程参数、监测和控制生物反应器，并预测产品产量和质量。机器学习算法可以分析大型数据集以识别变量之间的模式和关系，从而实现更准确的预测和控制策略。基于AI的控制系统可以实时调整过程，以优化生产力并最小化变异性。这种控制策略的例子包括开环控制、比例积分/比例积分微分（PI/PID）控制、级联控制、模型预测控制、基于神经网络和基于模糊逻辑的控制。除了过程控制外，这些策略也可以用来预测产品质量概况。最近，Athanasios等人开发了一个混合建模框架，使用通常生成的细胞外测量来预测抗体糖基化。该框架结合了由中央中国仓鼠卵巢细胞代谢的化学计量模型计算的核苷酸糖供体通量与人工神经网络，以准确计算抗体糖蛋白分布概况。该框架在三个独立的补料批次实验中进行了测试，并且演示了仅有0.27%的误差率。该平台在过程控制、细胞系选择和代谢工程中具有潜在应用。由于尖端生物制药，包括病毒样颗粒、外泌体、细胞和基因疗法，以及重组蛋白和肽，缺乏任何平台生产方法，因此迫切需要加强和加速产品开发程序。只要符合设计空间限制，这种方法就可以使制造过程的优化或修改。除了优化培养基和过程参数外，实时监测它们对于在制造期间更好的控制是必要的。近年来，随着更复杂的分析方法、网络物理系统和复杂的询问工具的可用性，生物制药开发过程的实时跟踪已大大进步。几十年来，许多传感器已可用于生物过程监测，而新的传感器，特别是光谱传感器，正在进入细胞培养生物过程。为了监测生物过程，已经探索了几种光谱技术，包括紫外-可见（UV-Vis）、近红外（NIR）、中红外（MIR）、介电光谱学、拉曼光谱学和荧光光谱学的效用。例如，Geetanjali等人为所有20种氨基酸、葡萄糖、乳酸和曲妥珠单抗浓度在CHO细胞培养中创建了基于傅里叶变换近红外光谱（FT-NIR）的测量方法。这些最新发展产生了许多独特的技术或策略，用于生物制造评估。 结论与展望 总之，近年来，由于载体工程、CHO宿主细胞工程、选择和扩增策略、转染策略、转录因子工程和培养基优化的不断发展，CHO细胞中单克隆抗体的生产取得了显著进步。载体工程使得能够创建更高效的载体，这些载体可以产生更高的蛋白产量并更精确地控制基因表达。此外，CHO宿主细胞工程已推进了具有更理想糖基化模式的抗体生产，从而带来更好的临床结果。使用诸如谷氨酰胺合成酶扩增和甲氨蝶呤选择等选择和扩增策略，已经筛选出稳定蛋白生产的高产细胞系。此外，转染策略也发展到提高基因转移效率和蛋白表达水平，如电穿孔和核转染的使用。转录因子工程已成为通过靶向转录调控途径提高蛋白表达水平的有希望的策略。而且，培养基优化在最大化细胞生长和蛋白生产方面发挥了关键作用，包括化学定义培养基的发展和营养物质及补充剂浓度的优化。总体而言，这些在载体工程、CHO宿主细胞工程、选择和扩增策略、转染策略、转录因子工程和培养基优化方面的进步，为大规模成功生产单克隆抗体做出了贡献，从而推动了几种重要生物制药的开发。在这些领域的进一步研究和创新将继续提高单克隆抗体生产的效率、安全性和效力，推动生物制药领域的发展。CHO细胞中单克隆抗体生产的成功取决于仔细优化和测试每个步骤，这需要分子生物学、细胞生物学和生物加工方面的专业知识。 展望未来，CHO细胞在单克隆抗体生产方面的细胞系开发前景非常光明。机器学习、人工智能和自动化等新技术的融合可能会在优化细胞系和加速生物制造过程中发挥更重要作用。一个潜在的未来方向是使用单细胞组学技术，如单细胞转录组学和蛋白质组学，以更好地了解细胞异质性，并识别有助于最佳细胞系性能的关键因素。这可能导致开发新的方法来选择表现最佳细胞和优化生物过程。另一个潜在的发展领域是使用合成生物学方法设计和工程化具有特定功能和属性的细胞，如增强的蛋白分泌、增加的细胞活性和改善的压力耐受性。这些进步可能导致开发完全新型的细胞系，这些细胞系能够以改进的属性和降低的成本生产生物制剂。 总体而言，CHO细胞在单克隆抗体生产方面的细胞系开发的持续进步对于满足对生物制药的日益增长的需求和改善患者结果至关重要。新技术和方法的整合将在实现这一目标和推动生物制造未来方面发挥关键作用。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 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