ZBP1

【导读】 过度的DNA损伤，会触发各种类型的程序性细胞死亡（PCD），但DNA损伤诱导细胞死亡的调节机制尚不完全清楚。在这项研究中，团队报道了PANoptosis，一种协调的PCD通路，包括细胞焦亡、细胞凋亡和坏死性凋亡，被DNA损伤激活。 2024年10月27日，同济大学医学院蔡振宇团队在期刊《Cell Death & Disease》上发表了题为“Sensing of endogenous retroviruses-derived RNA by ZBP1 triggers PANoptosis in DNA damage and contributes to toxic side effects of chemotherapy”的研究论文。研究结果表明，ZBP1介导的PANoptosis被DNA损伤激活，并导致基于DNA损伤的化疗的毒副作用。 ZBP1可能是一个有前途的治疗靶点， 可以减轻化疗相关的副作用。 https://www-nature-com.libproxy1.nus.edu.sg/articles/s41419-024-07175-7 关于DNA损伤 01 触发DNA损伤诱导的细胞死亡，被认为是癌症治疗（如化疗或放疗）中的重要机制 。然而，DNA损伤诱导的细胞死亡的许多方面，尚不完全清楚。 PANoptosis是一种协调的细胞死亡通路，整合了焦亡、细胞凋亡和坏死性凋亡的关键成分。ZBP1介导的PANoptisis，已被证明在感染性和炎症性疾病中起关键作用，例如，病毒和真菌感染以及感染性炎症。 ZBP1是一种胞质核酸传感器，在细胞死亡和炎症的调节中起着至关重要的作用，特别是在病毒感染和免疫应答的情况下。在无菌条件下，ZBP1已被证明可以识别ERV来源的dsRNA，以诱导坏死性凋亡和炎症。 在这项研究中，团队发现ZBP1介导的PANoptosis，被DNA损伤化合物激活。从机制上讲，ERV被DNA损伤重新激活，并作为ZBP1的配体触发PANoptosis。ZBP1介导的PANoptosis有助于化疗药物的毒性作用。这些数据表明， ZBP1可能是减轻化疗引起的副作用的潜在治疗靶点。 ZBP1介导的PANoptisis，导致小鼠化疗诱导的毒性 02 包括ETO、CDDP和5-FU在内的DNA损伤剂是癌症治疗中最有效的化疗药物之一，然而，这些有效化疗药物的临床效用，受到其毒性不良反应的剂量限制。团队发现ETO严重破坏了小肠中的隐窝和绒毛，导致WT小鼠肺中严重的血管损伤、中性粒细胞浸润和IL-6表达增加，而这些影响在ZBP1中显著减弱。与ZBP1相比，WT小鼠的ETO处理，使脾脏重量和脾脏淋巴细胞的数量显著降低。腹膜注射CDDP，还导致WT小鼠小肠隐窝丢失，肺血管损伤和中性粒细胞浸润增加，脾脏淋巴细胞数量减少，所有这些影响在ZBP1中均得到缓解。此外，与载体对照治疗相比，ETO或CDDP治疗在小鼠小肠中PLA的红色荧光信号显著增加，这表明化疗诱导的dsRNA可以在体内被ZBP1识别。这些数据表明， ZBP1驱动的PANoptosis会导致化疗诱导的小鼠毒性和炎症。 ZBP1介导的PANoptis，导致小鼠化疗诱导的毒性。 结直肠癌（CRC）患者非癌组织中的ZBP1，可感应化疗诱导的dsRNA 03 ZBP1的表达在肿瘤组织中下调。ZBP1表达在所有患者的癌细胞系中都不存在。与匹配的非癌性结肠组织相比，ZBP1在肿瘤中的表达显著降低或不存在，而Casp-6、RIPK3和MLKL的表达，在正常组织和肿瘤组织中通常相当。这些数据表明，肿瘤可能通过下调ZBP1表达，来逃避ZBP1介导的细胞死亡，并且，ZBP1驱动的PANoptisis很可能在非癌组织中被化疗激活。 一些dsRNA阳性细胞是CD45阳性，表明dsRNA是由免疫前哨细胞中的化疗诱导的。在这些化疗正常的结肠组织中，通过PLA检测到dsRNA和ZBP1之间的关联，表明化疗中的ZBP1可以感应dsRNA。团队在化疗的正常结肠组织中检测到红色荧光PLA信号，但是，在没有化疗的正常结肠组织中不存在PLA信号。这些数据表明， ZBP1可以感应化疗诱导的dsRNA，并触发CRC患者非癌组织中的PANoptosis。 ZBP1在CRC患者的非癌组织中，感应化疗诱导的dsRNA。 总结 04 1. PANoptosis与DNA损伤诱导的细胞死亡之间的关系尚未被研究，本研究发现ZBP1衍生的PANoptosis可被DNA损伤激活。 2. ZBP1通过其Zα结构域结合病毒来源的Z-RNA，触发PANoptosome复合物的组装，该复合物包含RIPK、NLRP3、ASC、Casp-6和Casp-8等关键组分。 3. ZBP1的Zα结构域能够结合左旋Z构象的核酸，对于触发炎性细胞死亡至关重要。研究提出dsRNA由DNA损伤诱导，并通过ZBP1的Zα结构域结合，对PANoptosis至关重要。 4. ZBP1介导的PANoptosis会导致化疗诱导的毒性和炎症，化疗药物如ETO、CDDP和5-FU的最佳使用受到剂量限制性副作用的限制。 5. ZBP1在肿瘤组织中的表达较低或不存在，表明ZBP1衍生的PANoptosis可能在非癌组织中被化疗激活。 6. 研究结果表明，抑制ZBP1衍生的PANoptosis可能是一种潜在的治疗方法，可以减轻化疗引起的副作用并改善癌症患者的生活质量。 参考资料： 1. Goldstein M, Kastan MB. The DNA damage response: implications for tumor responses to radiation and chemotherapy. Annu Rev Med. 2015;66:129–43. 2. Cheung-Ong K, Giaever G, Nislow C. DNA-damaging agents in cancer chemotherapy: serendipity and chemical biology. Chem Biol. 2013;20:648–59. 【关于投稿】 转化医学网（360zhyx.com）是转化医学核心门户，旨在推动基础研究、临床诊疗和产业的发展，核心内容涵盖组学、检验、免疫、肿瘤、心血管、糖尿病等。如您有最新的研究内容发表，欢迎联系我们进行免费报道（公众号菜单栏-在线客服联系），我们的理念：内容创造价值，转化铸就未来！ 转化医学网（360zhyx.com）发布的文章旨在介绍前沿医学研究进展，不能作为治疗方案使用；如需获得健康指导，请至正规医院就诊。 热门推荐活动 点击免费报名 🕓 上海｜11月15日-16日 ▶ 2024第一届中国类器官转化医学大会 🕓 上海｜11月21日-24日 ▶ 第七届上海国际肿瘤内科学论坛 🕓 全国｜2024年12月-2025年03月 ▶ 中国转化医学产业大会 🕓 上海｜2025年02月28日-03月01日 ▶ 第四届长三角单细胞组学技术应用论坛暨空间组学前沿论坛 点击对应文字 查看详情

引言 免疫检查点阻断（immune checkpoint therapy）疗法是一类通过阻断抑制T细胞活性的信号通路来提高抗肿瘤免疫反应的治疗方法【1】。其中最典型的靶点是CTLA-4和PD-1/PD-L1。该疗法对不同类型的癌症显示出明显疗效，彻底改变了肿瘤治疗的策略。美国免疫学家詹姆斯·艾利森 (James P Alison) 和日本免疫学家本庶佑 (Tasuku Honjo) 因在该领域的突出贡献共同荣获2018年诺贝尔生理学或医学奖。根据肿瘤中淋巴细胞的浸润程度，可将其分为“热肿瘤” 和“冷肿瘤”。热肿瘤中淋巴细胞浸润丰富因而对免疫疗法反应良好。冷肿瘤中缺乏免疫细胞浸润因而对免疫疗法具有抵抗性，是肿瘤免疫治疗面临的一大挑战【2】。 美国 MD Anderson Cancer Center陈曦教授实验室长期致力于内质网应激反应和蛋白质稳态和应激在免疫微环境和肿瘤耐药性中的功能，机制以及临床转化研究【3-9】。 2024年10月16日， 陈曦实验室（徐龙勇，彭方略和罗琴为本文共同第一作者）在Cell杂志在线发表了题为IRE1α silences dsRNA to prevent taxane–induced pyroptosis in triple-negative breast cancer的文章，首次报道了内质网应激反应介导三阴性乳腺癌免疫逃逸的分子机制。实验室前期的研究鉴定了针对IRE1α核糖核酸酶的特异抑制剂ORIN1001【6】，该抑制剂在一期临床试验中肿瘤患者耐受良好【10】。在这项研究中徐龙勇领导的团队发现内质网应激感受器IRE1α抑制紫衫类（taxane）化疗药引起的双链RNA（dsRNA）。靶向IRE1α同时组合taxane化疗药导致p53-/- 肿瘤细胞中dsRNA聚积并被dsRNA受体ZBP1蛋白识别后引起NLRP3-GSDMD介导的细胞热死亡-焦亡，从而导致肿瘤中大量淋巴细胞浸润和激活。这项研究表明该ORIN1001联合紫衫类化疗药可以把对免疫治疗抵抗的三阴性乳腺癌冷肿瘤转化成反应良好的热肿瘤。 据国家癌症中心统计乳腺癌近年来发病率逐年上涨，在女性恶性肿瘤中新发病率最高【11】。而其中的三阴性乳腺癌 （triple-negative breast cancer）恶性程度最高，预后最差。由于化疗药除了引起细胞凋亡等免疫沉默的冷死亡外还具有引起免疫性的热死亡的潜力，因此被用来增强肿瘤中的淋巴细胞浸润和免疫疗法的效果（化疗-免疫治疗联合）。然而决定化疗药引起热死亡的机制并不清楚，许多冷肿瘤的患者对化疗-免疫联合疗法仍然具有抵抗性【12,13】。为此该团队以三阴性乳腺癌患者肿瘤样品为模型，通过免疫染色发现紫衫类化疗药只在部分患者的肿瘤中引起淋巴细胞浸润。进一步的研究发现这部分患者的肿瘤细胞中IRE1α蛋白核糖核酸酶活性较低，其活性与肿瘤中化疗药引起的淋巴细胞浸润程度负相关。这些结果提示IRE1α可能调节紫衫类化疗药的免疫刺激作用。团队以多种基因改造小鼠三阴性乳腺癌为模型来检测这种假设。通过使用ORIN1001小分子抑制剂，在肿瘤细胞中特异敲低IRE1α或者构建不被ORIN1001结合的IRE1α突变体等遗传操作结合质谱流式（CyTOF）和单细胞测序等技术表明IRE1α抑制紫衫类化疗药的免疫刺激作用。ORIN1001组合taxane化疗不但显著增加冷肿瘤中的淋巴细胞浸润从而使其变成热肿瘤，而且明显提高浸润的CD8+ T细胞活性。虽然活化的T细胞会上调PD1并通过分泌IFN上调肿瘤微环境中的PD-L1这种负反馈来调节自己的活性，但是加入针对PD-1的阻断抗体可以打破这种负反馈从而发挥免疫治疗的作用来消除肿瘤。 在研究其中的机制的过程中，徐龙勇等发现白细胞介素1α（IL-1α）特异的在ORIN1001组合taxane化疗的肿瘤负荷小鼠血清中升高。以往的研究表明IL-1α在炎症小体（inflammasome）激活的情况下被分泌到细胞外【14】。通过电镜，免疫染色等方法结合小分子抑制剂和遗传操作，实验室确认了NLRP3炎症小体介导的GSDMD切割导致细胞焦亡，IL-1α分泌和肿瘤中淋巴细胞浸润。在众多激活NLRP3炎症小体的分子中ORIN1001组合taxane特异的在p53-/- 肿瘤细胞中引起dsRNA累积。有意思的是这些dsRNA并不是经典的转座子元件，而是来自编码基因并呈现非经典的左手螺旋 （Z-type dsRNA， Z-RNA）。ZRNA很少被ADAR修饰【15】，被细胞中的ZBP1蛋白识别后可以激活NLRP3炎症小体【16】。ORIN1001组合taxane引起的dsRNA可以引起ZBP1依赖的NLRP3炎症小体激活和细胞焦亡。序列分析和体外试验表明许多dsRNA是IRE1α核糖核酸酶的底物，IRE1α切割这些dsRNA后导致它们的降解。实验室还进一步探讨了ORIN1001组合taxane化疗只在肿瘤细胞中引起dsRNA累积的机制并发现肿瘤细胞中p53的缺失是关键因素。以上这些发现可以在三阴性乳腺癌患者肿瘤样品和病人来源肿瘤异种移植（Patient-derived tumor xenograft, PDX）模型中验证。这些研究详细阐明了肿瘤细胞如何利用IRE1α和p53来避免taxane化疗引起的危险信号和热死亡并进而逃避免疫系统攻击。 图一：IRE1α抑制化疗药引起的热死亡和免疫刺激（Credit: Cell） 综上所述，这项研究系统性的揭示了化疗药引起肿瘤细胞热死亡的可能方式以及肿瘤细胞通过内质网应激反应和p53抑制这种热死亡的具体机制，并为针对冷肿瘤的化疗-免疫治疗提供了新的策略 （图1）。通过ORIN1001靶向抑制IRE1α可以在p53 缺失的三阴性乳腺癌中有效增强taxane化疗药引起的dsRNA和热死亡，并引起淋巴细胞浸润和显著提高患者对免疫治疗的发应。 参考文献 1. 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摘要：先天免疫系统是抵御流感病毒的第一道防线，流感病毒会导致严重的呼吸道炎症，每年在全球造成超过65万人死亡。信使RNA（mRNA）疫苗是传统疫苗方法的有希望的替代品，因为它们具有安全剂量、低成本制造、快速开发能力和高效率。在这篇综述中，我们提供了我们对使用模式识别受体检测和响应mRNA疫苗的先天免疫反应的当前理解。我们还提供了mRNA疫苗的概述，并讨论了推进这一有前途的治疗方法的未来方向和挑战。 关键词：mRNA、疫苗、流感病毒、先天免疫、炎症体、细胞因子、炎症 1.引言 先天免疫系统是宿主对病原体的第一反应线，也是针对病毒疫苗（包括减毒或灭活病毒）的第一道防线，用于预防传染病。接种疫苗后，先天免疫系统识别并清除接种细胞，同时协调适应性免疫反应，以抗原特异性反应的形式，从而维持对病毒感染的长期保护。为了快速检测和防御各种病毒，免疫细胞已经进化出获得多种模式识别受体（PRRs），如Toll样受体（TLRs）、视黄酸诱导基因I（RIG-I）样受体（RLRs）和核苷酸结合寡聚化结构域（NOD）样受体家族蛋白（NLRs）。通过这些受体，先天免疫系统以严格调节的方式激活，同时保留适应性免疫反应，但不会引发过度的先天免疫反应，这些反应可能导致组织损伤和全身性炎症，对宿主有害。在本篇综述中，我们讨论了先天免疫识别、炎症体的激活以及对流感病毒感染及其mRNA疫苗的细胞因子分泌反应。我们还强调了mRNA疫苗作为预防和控制流感病毒疾病的有前途的工具。 2.迄今为止流感疫苗的简要历史 流感病毒是人类最严重的呼吸道传染病原之一。季节性流感病毒流行估计每年在全球导致29万至65万人死亡。流感病毒是包膜的、负义单链RNA（ssRNA）病毒，具有分节段的基因组。例如，流感A病毒（IAV）包含八个RNA片段，编码RNA聚合酶亚基[聚合酶酸性蛋白（PA）、聚合酶基础蛋白1（PB1）、聚合酶基础蛋白2（PB2）]、病毒糖蛋白[血凝素（HA），促进病毒进入；神经氨酸酶（NA），促进病毒释放]、病毒核蛋白（NP）、基质蛋白（M1）、膜蛋白（M2）和非结构蛋白1（NS1）（图1A）。IAV通过内质网摄取和释放感染细胞，病毒核糖核蛋白（vRNPs）进入细胞核进行mRNA转录和复制，通过正义互补核糖核蛋白（cRNP）中间体。病毒mRNA然后在细胞质中转化为病毒蛋白，这些蛋白被组装成新的病毒颗粒并从细胞中释放出来（图1B）。 图1 | 流感A病毒结构和复制。(A) 流感A病毒（IAV）基因组由八个分节段的单链负义RNA（vRNA）组成。每个节段都被核蛋白（NP）包裹，并通过RNA聚合酶介导，形成病毒核糖核蛋白（vRNP）复合体（PB1、PB2、PA和NP），这是转录和复制的基本单位。(B) 感染的vRNP被运输到细胞核中，在那里发生病毒转录和复制，随后产生后代vRNP。后代vRNP被运输到细胞质后，病毒开始组装。HA，血凝素；M1，基质蛋白；M2，膜蛋白；NA，神经氨酸酶；NS1，非结构蛋白1；PA，聚合酶酸性蛋白；PB1，聚合酶基础蛋白1；PB2，聚合酶基础蛋白2。 季节性流感病毒有四种不同类型：A型、B型、C型和D型。A型和B型流感病毒目前在人群中共同循环，并引起季节性流行：IAV的H1N1和H3N2亚型，以及流感B病毒（IBV）的两个不同谱系（山形谱系和维多利亚谱系）。通过世界卫生组织全球流感监测网络的协调，每年设计季节性流感病毒疫苗，配方包含两种IAV株和两种IBV株；然而，季节性流感病毒疫苗的有效性在每个流感季节都有很大差异。在季节性流感疫苗注射后，先天免疫细胞，包括存在于肌肉中的巨噬细胞和树突状细胞（DCs），会引起趋化因子释放的增加，这导致更多免疫细胞从血液中招募到疫苗接种部位。分化的DCs作为抗原呈递细胞，迁移到淋巴结，导致T细胞和B细胞的激活，以产生抗体（图2）。然而，疫苗诱导的免疫反应狭窄且特定于株，需要不断更新（几乎每年），由于点突变的高频率，这最终是一个复杂、昂贵且耗时的过程。此外，包括禽类和猪类在内的各种流感病毒株已经获得了在人类中高效生长的能力，跨越物种障碍从动物宿主传播，并在人群中传播，对人类构成严重威胁。除了季节性流行，流感大流行每隔几十年发生一次，由猪源H1N1 IAVs引起，这些病毒以前从未循环过，并且可以迅速在人类中传播。1918年的H1N1流感大流行在全球造成约4000万人死亡。自那时以来，流感大流行由1957年的H2N2、1968年的H3N2和2009年的H1N1pdm09引起。考虑到季节性流感病毒疫苗诱导的株特异性免疫可能无法对大流行性流感病毒提供强大的保护，因此需要开发新型流感疫苗，以诱导不专注于相应疫苗株的广泛免疫。 图2 | 宿主对mRNA疫苗的免疫反应。自复制RNA（saRNA）疫苗可以以类病毒RNA颗粒、体外转录RNA和质粒DNA的形式传递。树突状细胞（DCs）在肌肉中识别saRNA并分化。分化的DCs作为抗原呈递细胞，迁移到淋巴结，导致T细胞和B细胞激活以产生抗体。 在1980年代之前，已经建立了灭活疫苗和减毒活疫苗来保护人类免受致病微生物的侵害。灭活疫苗是通过化学或热处理制造的，而减毒活疫苗通常在动物或细胞系中开发。使用杀死的整个生物体疫苗或减毒活疫苗在减少包括麻疹、腮腺炎、风疹和脊髓灰质炎在内的病毒感染以及根除天花感染方面取得了巨大成功。尽管取得了成功，但传统疫苗策略仍然存在主要问题。流感病毒等传染性病原体能够逃避适应性免疫反应，而且通常很难开发减毒或杀死的整个生物体疫苗。在目前的流感病毒疫苗的情况下，主要挑战是其在老年人（65岁及以上）中的低效性，他们比儿童和成年人更容易感染流感病毒。灭活流感病毒疫苗的其他缺点通常归因于流感病毒表面抗原的突变。关于流感病毒减毒活疫苗的其他担忧包括可能引起全身性炎症和死亡，可能是由于回突变、获得补偿性突变或与循环传播的野生型株重组。 通常，流感病毒通过鼻腔或口腔腔感染宿主，首先与呼吸道上皮细胞接触，类似于通过鼻腔内给药的减毒活流感疫苗。感染呼吸道上皮细胞后，病毒或鼻腔内流感疫苗可以诱导全身和粘膜免疫反应。先天免疫细胞的防御机制，特别是DCs，是流感病毒的强大屏障。在不同的粘膜表面存在特定的免疫系统来抵抗流感病毒的入侵。存在于感染细胞内的病毒RNA被各种模式识别受体（PRRs）识别为非自身，导致促炎细胞因子、趋化因子和I型干扰素（IFNs）的释放。巨噬细胞、肺泡细胞、DCs和浆细胞样DCs产生I型IFNs，进而刺激邻近细胞中IFN刺激基因（ISGs）的表达，诱导抗病毒状态。 与流感病毒感染或鼻内流感疫苗不同，基于mRNA的疫苗包含编码病毒蛋白和免疫调节蛋白作为佐剂的mRNA，这些佐剂增强了免疫刺激性特性。当mRNA进入宿主细胞时，内质网（例如，TLR3、TLR7和TLR8）和细胞质先天免疫传感器（例如，RIG-I、PKR、NOD2、OAS和MDA5）识别mRNA，包括单链RNA（ssRNA）和双链RNA（dsRNA）。随后，免疫细胞被激活并产生I型IFN和多种炎症细胞因子。然而，疫苗中的单链mRNA通过体外转录过程适当纯化，以消除与先天免疫传感器的相互作用，这些相互作用会诱导过度分泌I型IFN及其细胞功能障碍。此外，佐剂刺激先天免疫反应，并在不引起可能引发严重副作用的全身性炎症的情况下，推动抗原特异性T细胞反应。此外，注射部位（例如，皮下、肌肉内、皮内和静脉内）和mRNA疫苗递送配方（例如脂质纳米颗粒）影响免疫反应的效力。例如，脂质纳米颗粒载体系统进一步保护mRNA免受核酸酶的侵害，并通过肌肉内注射靶向淋巴管并促进淋巴结中的蛋白质翻译。与鼻内mRNA介导的先天免疫反应相比，肌肉内mRNA主要被非免疫细胞摄取，包括局部肌细胞。一旦进入淋巴结，脂质纳米颗粒最终被DCs吞噬，从而产生并呈递抗原给T细胞以促进适应性免疫反应。mRNA疫苗诱导细胞内产生抗原蛋白以及先天免疫反应的能力必须促使CD8+和CD4+ T细胞分化为效应和记忆亚群，以保护免受感染。 体外转录的mRNA在哺乳动物中的有效使用首次报告于1990年，将报告基因mRNA注射到小鼠体内诱导了目标蛋白的产生。随后的研究表明，在下丘脑中施用编码血管加压素的mRNA可以在大鼠中诱导生理反应。然而，这些早期的有希望的结果并没有导致对mRNA疫苗开发的显著投资，因为人们担心mRNA的不稳定性、严重的先天免疫反应和体内递送无效。然而，在过去的十年中，重大的技术革新和研究投资使mRNA成为一种有前途的疫苗工具。与亚单位、灭活和减毒活病毒相比，mRNA疫苗的使用具有多种优势。由于mRNA是一种非传染性和非整合性平台，因此没有感染或插入突变的潜在风险。此外，mRNA通过正常的细胞过程降解，各种修饰和递送方法可以调节其在体内的半衰期。将mRNA配方成载体分子有助于在细胞质中快速摄取和表达，在那里它是稳定的并且高度可翻译的。此外，由于体外转录反应的高产量，mRNA疫苗具有快速、廉价且可堆叠的制造潜力。此外，已经使用非人灵长类动物模型进行了几项优雅的流感mRNA疫苗研究。在猴子中免疫修饰的非复制型mRNA编码流感H10包裹在脂质纳米颗粒中后，针对血凝素的抗体保护水平显著增加，与人类季节性流感疫苗接种后的观察结果类似。使用一种新的成像技术（正电子发射断层扫描-计算机断层扫描，PET-CT），标记有探针的mRNA疫苗被运送以评估猴子中的生物分布，提供了疫苗接种后先天和适应性免疫反应机制的见解，这些反应在接种部位和引流淋巴结转化为保护性免疫。 3.先天免疫对流感病毒的反应 IAV被包括TLRs、RLRs和NLRs在内的PRRs识别为外来物质，导致程序性细胞死亡、I型IFN的分泌和促炎细胞因子的分泌，从而引发过度炎症。 3.1.与流感病毒识别相关的TLR和RLR TLR和RLR介导的流感病毒信号诱导I型IFN的释放，并刺激感染细胞和附近细胞表达ISGs以诱导抗病毒状态。此外，TLR和RLR信号还诱导促炎细胞因子的释放，如白细胞介素（IL）-6和IL-8。TLR3在内质网中感应dsRNA。尽管感染流感病毒的细胞不产生dsRNA，但Tlr3−/−小鼠在致命流感病毒感染后比野生型小鼠寿命更长，这表明TLR3在病毒感染后识别了未知的RNA结构。此外，Tlr3−/−小鼠在流感病毒感染后产生正常的抗体，以及CD4+和CD8+ T细胞反应，表明TLR3对于产生T细胞免疫是可有可无的。在浆细胞样DCs中，TLR7识别流感病毒的ssRNA基因组。TLR7通过适配器髓系分化初级反应88（MYD88）信号传导，导致激活包括核因子-κB（NF-κB）和干扰素调节因子7（IRF7）在内的转录因子，从而诱导产生I型IFN和促炎细胞因子。RIG-I是一种细胞质PRR，通常识别5'ppp双链RNA（dsRNA）。RIG-I还感应流感病毒复制后产生的5'ppp病毒ssRNA。在检测到流感病毒RNA后，RIG-I的解旋酶结构域与ATP相互作用，这有助于卡斯帕酶募集结构域（CARD）发生构象变化，与信号适配器线粒体抗病毒信号蛋白（MAVS）相互作用，以产生I型IFN。 3.2.炎症体介导的对流感病毒的反应 NLRs在抗病毒免疫反应、炎症反应和细胞因子诱导中发挥重要作用。促炎信号诱导免疫细胞（如巨噬细胞和中性粒细胞）的招募，以消除病原体和病原体衍生分子。IL-1β和IL-18是关键的促炎细胞因子，对抵御IAV感染很重要。IL-1β和IL-18的分泌需要分别通过炎症体介导的pro-IL-1β和pro-IL-18的蛋白水解成熟。炎症体是由caspase-1、ASC和PRRs（如NOD样受体家族蛋白3（NLRP3））组成的多蛋白复合体。在病毒配体感应后，PRRs诱导自聚合并结合到炎症体适配蛋白ASC，ASC由N末端pyrin结构域（PYD）和C末端CARD组成。ASC通过PYD结构域的同型相互作用寡聚化，然后通过CARD与caspase-1结合以形成炎症体，最终诱导炎症性细胞死亡。 在巨噬细胞中，流感病毒诱导的NLRP3炎症体激活需要Z-DNA结合蛋白1（ZBP1）形成ZBP1-NLRP3炎症体。当复制时，IAV产生Z-RNAs，这是RNA双螺旋的转化版本，被ZBP1感应并与受体相互作用的丝氨酸/苏氨酸激酶3（RIPK3）和caspase-8结合以激活ZBP1-NLRP3炎症体。最近，研究表明caspase-6促进RHIM依赖性RIPK3与ZBP1的结合，促进ZBP1介导的NLRP3炎症体激活。在呼吸道上皮细胞中，MxA充当炎症体传感器，识别流感病毒蛋白NP并以NLRP3独立的方式诱导IL-1β和IL-18的释放。 NLRP3和MxA炎症体激活已被证明是对抗流感病毒的重要先天免疫防御。在流感病毒株A/Puerto Rico/8/34（PR8）感染后，发现NLRP3对白细胞迁移到肺部和保护宿主免受感染很重要。在人类MxA转基因小鼠的流感病毒感染期间，呼吸道上皮中MxA炎症体的快速激活显示出抑制病毒从细支气管传播到远端肺泡区域。这些研究表明，最佳的炎症体激活对宿主有益；然而，异常激活可能导致有害结果。 4.适应性免疫对流感病毒 先天和适应性免疫反应显著保护宿主免受流感病毒侵害，并对产生强烈的抗体反应很重要。流感病毒感染后，先天免疫系统对于识别和清除接种细胞至关重要，同时也通过抗原特异性抗体反应协调适应性免疫，并提供长期保护。 在识别病毒抗原和与认知CD4+ T细胞相互作用后，幼稚B细胞被激活。一些激活的B细胞迅速分化为短寿命的浆细胞。尽管其他激活的B细胞迁移到二级淋巴组织的滤泡并经历生发中心反应，但浆细胞在人类中产生第一波病毒特异性抗体。如果浆细胞来自记忆B细胞，那么在感染后约7天，浆细胞的数量在外围达到峰值。然而，少数激活的B细胞只会分化为长寿命的浆细胞，它们迁移并居住在骨髓中产生抗体，提供长期血清抗体水平，并与抵御病原体感染和疾病的防御相关。另一部分主要激活的B细胞分化为记忆B细胞，它们不释放抗体并留在外围进行免疫监视，但它们是长寿命的，可以在感染期间重新激活成为浆细胞，以产生新的抗体和进一步的记忆B细胞。总体而言，适应性免疫衍生的抗体反应对流感病毒感染相对广泛且持久；然而，由于高突变率和抗原灵活性，流感病毒有时会偏离适应性免疫反应。需要进一步研究自然病毒感染如何诱导长期免疫反应，以开发下一代流感病毒疫苗。 5.传统的季节性流感病毒疫苗 季节性流感病毒疫苗是使用基于鸡蛋、细胞和蛋白质的技术生产的，整个过程通常需要6~8个月。针对IAVs和IBVs的流感疫苗在1940年代发明，这些全病毒灭活疫苗是在胚蛋中产生的，由甲醛和苯汞硝酸盐灭活的粗提纯全病毒组成。2012年，含有基于细胞的病毒的疫苗作为生产灭活和减毒活疫苗的替代方法出现。三价灭活和减毒活流感疫苗的有效性分别约为成人和儿童的65%和83%。通常使用的减毒活流感病毒疫苗通常是冷适应和温度敏感的，在上呼吸道而不是下呼吸道有效复制。总体而言，这些研究表明季节性流感病毒疫苗对流感病毒感染提供了良好的保护。 然而，也有关于这些疫苗的负面报告。成人75%的疫苗效力在老年人中突然下降，老年人更容易感染流感病毒。此外，疫苗和循环株之间的不匹配有时也会发生，通常与较低的疫苗效率有关。根据美国病毒学监测和美国流感疫苗效力（Flu VE）网络数据，2019-2020年流感季节所有年龄组对IAV或IBV的估计疫苗效力（VE）降至29%（2010-2018年平均VE为44.1%），由于抗原漂移的IAV（H3N2）的传播，这引发了对疫苗株选择的担忧（https://www-cdc-gov.libproxy1.nus.edu.sg/flu/vaccines-work/past-seasons-estimates.html）。此外，保护的持续时间有时很短。为了在老年人中诱导更强、更持久的免疫反应，已经测试了高剂量疫苗或包括MF59和AS03在内的先进佐剂疫苗。高剂量疫苗的剂量是三价灭活疫苗的4倍，可以比标准剂量疫苗诱导更多的抗体。MF59佐剂季节性疫苗已在25多个国家获得许可并针对老年人群市场。AS03佐剂流感病毒疫苗也在考虑用于老年人群。 6.传统大流行流感病毒疫苗 IAV通常在一种动物种群内传播，但有时它们可以跨越并导致另一种物种生病。在后一种情况下，与在人类中循环的季节性IAV相比，表现出更显著的遗传变化。如果新型IAV具有传染性并在人类中容易传播，则被认为是流感病毒大流行。由于大多数人口对新型流感病毒株没有或只有有限的自然免疫力，因此已经使用多种生产平台开发了大流行IAV疫苗候选物。带有佐剂的灭活分裂流感病毒疫苗平台进展最远，其他平台，包括核酸（DNA和mRNA）、载体、重组蛋白（VLP；类病毒颗粒）、活病毒仍在开发中。H5N1禽流感病毒疫苗是第一个获得美国FDA批准用于人类人口的疫苗，因为对高致病性H5N1病毒可能引起流感大流行的潜力提出了关注。 流感大流行管理面临的挑战之一是在全球疫苗生产能力在爆发后的几个月内。在针对H5N1株的疫苗的情况下，使用反向遗传学生成了种子株，以去除HA的多基本裂解位点，并将背景更改为高生长PR8 H1N1株，后者表现出相对较少的致病性。这些修改有助于生产更安全的疫苗株，并大量生产，因为高致病性IAV经常杀死胚蛋，导致产量低。已经对H5N1和H7N9疫苗在人类中进行了测试，需要高抗原剂量或使用佐剂以诱导可靠的血凝抑制滴度。一项H7N9疫苗的临床试验尽管使用了佐剂，但产生了大约60%的效力，这表明为了实现足够的疫苗效力，需要佐剂和多次接种。 7.针对流感病毒的信使RNA疫苗策略 mRNA疫苗通过实验方法进行了广泛表征，这些方法改善了mRNA的稳定性和传递以及蛋白质生产。这些方法涉及开发纳米颗粒运输技术，这些技术可以稳定mRNA，增强细胞摄取，并在mRNA进入细胞时提高生物可用性。mRNA疫苗的一个明显优势是它不需要进入细胞核来促进抗原表达。 7.1.针对流感病毒的自复制mRNA疫苗 自复制RNA（saRNA）疫苗可以以质粒DNA、类病毒RNA颗粒和体外转录RNA的形式携带（图3）。基于DNA质粒的saRNA疫苗结合了更稳定的DNA核酸产品和更高水平的抗原表达的优势。saRNA疫苗在临床前模型中引起了强烈的免疫反应。saRNA疫苗源自阿尔法病毒的基因组骨架，其中编码病毒RNA复制机制的基因是完整的。 图3 | 通过自复制RNA疫苗获得抗原表达。展示了自复制RNA（saRNA）传递的三条途径。这些包括：1） 类病毒RNA颗粒通过受体介导的内吞作用将saRNA传递到细胞质；2） 直接将体外转录的复制子saRNA以生理盐水或合成配方的形式传递给细胞；3） 携带复制酶基因和转基因的质粒DNA进入细胞核，在那里转录生成复制子saRNA，然后运输到细胞质。三条saRNA疫苗途径最终产生信使RNA（mRNA），通过核糖体翻译产生疫苗抗原。 有几份报告使用了针对流感病毒的saRNA疫苗。用编码PR8 H1N1 IAV HA的10 mg saRNA疫苗免疫，在小鼠中产生了抗体反应，并在致命的同源病毒挑战中提供了保护。另一项研究表明，开发了saRNA疫苗，其中A/California/07/2009（H1N1）或A/Shanghai/2/2013（H7N9）IAV HA编码的saRNA被配制在脂质纳米颗粒中，小剂量在小鼠中两次肌肉注射后诱导了保护水平的血凝抑制滴度。与这一发现一致，另一组表明，肌肉注射0.1或0.2 mg PR8 H1N1 IAV NP、M1或联合NP+M1自复制RNA-脂质纳米颗粒疫苗在小鼠中引起了强烈的抗原特异性T细胞反应和对同源病毒感染的保护。IAV HA和NP复制子RNA与含壳聚糖的脂质纳米颗粒或聚乙烯亚胺（PEI）复合后，在小鼠皮下给药后引起了T细胞和B细胞免疫反应。最近的一项研究揭示了一种由化学修饰的阳离子树状分子复合成的脂质纳米颗粒组成的递送平台。使用这个平台，肌肉注射编码A/WSN/33（H1N1）IAV HA的RNA复制子成功地保护了小鼠免受致命同源病毒挑战。最近的一项研究显示了自复制mRNA和非复制mRNA免疫后在小鼠中免疫反应和保护效力的直接比较。动物在首次疫苗接种后八周内两次肌肉注射不同剂量的PR8 H1N1 IAV HA编码未配方自复制mRNA或未修改非复制mRNA，并进行了挑战。两个平台都引起了对同源流感病毒感染的保护。 7.2.非复制型流感病毒mRNA疫苗 非复制型mRNA疫苗可以通过结合各种修饰的核苷酸来制造，并且在开发直接可注射的非复制型mRNA疫苗方面投入了大量的努力。有几项针对流感病毒的非复制型mRNA疫苗的研究。在脂质体中复合的IAV NP编码mRNA的给药在小鼠中诱导了细胞毒性T细胞反应。用各种IAV HA、NP和NA编码的RNActive疫苗在小鼠、雪貂和猪中进行皮内免疫，单次免疫后产生了保护性免疫反应。使用PR8 H1N1 IAV HA编码未修改mRNA-脂质复合物的小鼠静脉内免疫显示单剂量给药后T细胞激活增加。总之，确定这些发现是否以及如何转化为临床试验和疫苗接种将是重要的。 7.3.先天免疫对mRNA疫苗的反应 先天免疫系统作为宿主对mRNA疫苗接种的第一反应线。在mRNA疫苗接种期间，mRNA可被各种PRRs识别，包括TLRs、RLRs和NLRs，以产生IFNs和促炎细胞因子。典型地，IFNs和促炎细胞因子对宿主大有裨益，触发IFN诱导基因的诱导和免疫细胞的浸润，以清除接种细胞。然而，失调的IFNs和促炎细胞因子会抑制mRNA疫苗的效力，导致有害的全身性超炎症和组织损伤。因此，体外转录mRNA的适当纯化对于最大化免疫原产生和避免不必要的先天免疫激活至关重要。 TLR3感应超过45个碱基对的dsRNA和来自ssRNA形成二级结构或来自病毒复制中间体的dsRNA。TLR7可以识别dsRNA和ssRNA，而TLR8只感应ssRNA。TLR7的激活可以刺激抗原呈递、细胞因子释放并诱导B细胞反应。特别是，RIG-I感应带有5'-三磷酸的ssRNA和dsRNA并刺激IFN产生。 mRNA疫苗通过RNA传感器产生的IFN产生依赖于体外转录mRNA的质量、传递载体和给药途径。体外转录mRNA被dsRNA污染的识别会导致快速的I型IFN诱导，这上调了蛋白激酶R（PKR）和2'-5'-联腺苷酸合成酶（OAS）的表达和激活。这导致翻译抑制和细胞mRNA、核糖体RNA和体外转录mRNA的降解（图4）。通过包括反向相快速蛋白液相色谱或高性能液相色谱在内的色谱方法，可以有效地从体外转录mRNA中去除污染的dsRNA。这些方法的纯化已被证明可以增加人类DCs中体外转录mRNA的抗原蛋白产生高达约1000倍。除了dsRNA污染物外，单链mRNA分子被识别为PAMP并被TLR7和TLR8检测，导致I型IFN产生和体外转录mRNA的抗原蛋白产生减少。 图4 | 失调的先天免疫阻止mRNA疫苗的效力 在mRNA疫苗接种时，进入的自复制RNA（saRNA）被Toll样受体（TLR）3、TLR7和视黄酸诱导基因I（RIG-I）识别，这促进了它们的下游信号传导和随之而来的产生I型干扰素（IFN）。体外转录mRNA被dsRNA污染的识别会导致快速的I型IFN产生，这会诱导蛋白激酶R（PKR）和2'-5'-联腺苷酸合成酶（OAS）的表达和激活。这将抑制翻译并诱导细胞mRNA、核糖体RNA和体外转录mRNA的降解。EIF2a，真核生物启动因子2a；IFNAR，干扰素α受体。 鉴于减少I型IFN信号传导对mRNA疫苗策略至关重要，几项研究揭示了减少I型IFN信号传导的修饰mRNA的开发。包括天然存在的化学修饰核苷，包括假尿苷和1-甲基假尿苷，防止TLR7、TLR8和其他先天免疫传感器的激活，从而减少I型IFN信号传导。另一项研究还表明，与未修饰的mRNA相比，核苷修饰的mRNA在体外和体内（特别是在小鼠中）在原代DCs中的翻译更好。总之，mRNA疫苗与先天免疫反应之间的平衡对于潜在的疫苗方法至关重要；这种平衡必须精细控制，以减少过度的先天免疫反应，同时在DCs中保持最大的免疫原产生。 注意，虽然依赖炎症体的IL-1β和IL-18的释放触发了DCs中进一步的产生，以诱导流感病毒特异性CD8+ T细胞启动，体外转录mRNA是否可以被炎症体传感器识别在很大程度上仍然未知。未来的研究需要全面检查驱动炎症体适应性免疫反应所需的因素。 7.4.基于mRNA的流感病毒疫苗开发 mRNA疫苗最近吸引了大量关注，涉及大规模的学术和工业投资，生物技术公司已成功筹集资金用于开发创新的RNA疫苗。Moderna Therapeutics（美国）的科学家开发了第一种直接可注射的针对H10N8和H7N9的流感RNA疫苗，证明了用可接受的耐受性概况诱导保护性免疫原性的可能性。对于第一种人类季节性流感病毒RNA疫苗试验，CureVac AG公司（德国）开发了一种序列工程化的mRNA-脂质纳米颗粒策略，该策略在不使用修饰核苷酸的情况下实现了非凡的体内蛋白质翻译水平。使用这种策略，最近的一项研究表明，单次肌肉注射10 mg A/Netherlands/602/2009（H1N1）HA编码mRNA-脂质纳米颗粒在非人灵长类动物中诱导了保护范围内的血凝抑制滴度（≥1:40）。此外，第二次剂量接种有效地增强了免疫反应，并在所有接种动物中使血凝抑制滴度≥1:160超过1年。CureVac AG科学家提供的证据表明，两次免疫接种mRNA-脂质纳米颗粒编码的HA来自A/Hong Kong/4801/2014（H3N2）比许可的MF59佐剂三价灭活IAV疫苗诱导更强的T细胞和B细胞免疫反应。 7.5.mRNA疫苗的局限性 通常不常观察到与mRNA疫苗相关的超敏反应。同样，严重的急性发作，假定为免疫球蛋白E（IgE）或免疫球蛋白G（IgG）介导的，以及补体介导的过敏性或严重的迟发性T细胞介导的全身反应被认为是非常罕见的。疫苗的活性抗原也可以发展超敏性。疫苗接种后的急性超敏反应包括自限性的局部副作用，系统反应可以从荨麻疹/血管性水肿到全系统多系统涉及的全身性过敏性反应。过敏性反应是一种罕见的危及生命的过敏反应，通常在接种后几分钟到几小时内发生。疫苗诱导的过敏性反应通常很少见。2019年冠状病毒病（COVID-19）大流行突显了通过脂质纳米颗粒中的mRNA疫苗进行强大疫苗生产的需求。出乎意料的是，由于公共疫苗引起的严重过敏反应较少，因此，围绕特应性个体的相当大的公众关注。以前的疫苗相关过敏性反应的免疫机制研究集中在明胶、乳胶和鸡蛋蛋白的存在上，最近更多地关注聚山梨酯80，这是一种广泛存在于许多疫苗中的表面活性剂。然而，上述所有辅料都没有包含在辉瑞-BioNTech COVID-19 mRNA疫苗中，而且在大规模2/3期临床试验中没有观察到过敏性反应病例；因此，这些事件是出乎意料的。因此，初次接触COVID-19疫苗时发生的过敏性反应是指预先存在的抗体介导的免疫（过敏）或与以前暴露无关的假过敏反应。已知过敏原引起的过敏性反应最好通过与肥大细胞和嗜碱细胞的结晶片段（Fc）ϵ受体交联的IgE的经典范式来理解，但包括抗体依赖性补体激活或IgG相关肥大细胞/粒细胞/血小板/嗜碱细胞介导的肥大细胞/粒细胞/血小板/嗜碱细胞激活通过Fcg受体的非经典途径已在动物模型和人类对药物的过敏反应中描述。不幸的是，关于疫苗潜在用途的信息用于测试以确认病理病因或预测反应风险仍然很少。在公共卫生危机期间，需要对经历过敏性疫苗反应的患者进行快速彻底的基于研究的评估，并在处于风险中的个体中进行前瞻性临床试验，以解决这些问题。 8.结论和未来研究方向 我们已经强调了IAV mRNA疫苗接种期间先天免疫系统的反应。最佳的先天免疫感应和炎症细胞因子释放对于T细胞和B细胞免疫反应至关重要。然而，过度的宿主先天免疫反应可能导致细胞因子风暴和/或组织损伤，抑制流感病毒mRNA疫苗的效力。因此，必须控制mRNA诱导的先天免疫，以减少过度炎症，同时保持抗体产生。 在过去的十年中，流感病毒mRNA疫苗领域取得了明显的突破，证明了在临床前和临床环境中的概念验证。然而，减少mRNA的先天免疫感应和将有希望的动物数据最大化转化为人类仍然是一个挑战。需要进一步的临床试验来检查长期安全性和免疫原性，以评估RNA疫苗对流感病毒疫苗领域的影响。 目前，COVID-19大流行继续在全球蔓延，迫切需要有效的疫苗来对抗它。FDA批准的mRNA疫苗在工作年龄成人中预防SARS-CoV-2感染方面非常有效，疫苗减轻了突破性感染者的病毒RNA负荷、发热症状风险和病程，尽管接种了疫苗。mRNA疫苗领域的未来是潜力无限的，相关公司和其他学术机构提供的临床数据和资源可能会显著地建立和加强基于mRNA的疫苗的基础研究。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。