GLI3

引言Sonic Hedgehog（SHH）信号转导及其效应转录因子GLI1的异常激活在SHH依赖性髓母细胞瘤(MBSHH)和基底细胞癌(BCC)的发生中至关重要。2024年2月2日，浙江大学王继荣、吴希美及浙大城市学院曾玲晖共同通讯在Nature Communications (IF 16.6)发表题为“Phosphorylation of human glioma-associated oncogene 1 on Ser937 regulates Sonic Hedgehog signaling in medulloblastoma”的研究论文，该研究发现SHH以Smoothened依赖性方式使p38α（MAPK14）失活，相反，p38α直接在Ser937/Ser941上磷酸化GLI1(人/小鼠)，从而诱导GLI1的蛋白酶体降解，并否定SHH信号的转录。Gli1S941E系列功能丧失敲入显著降低平滑M2转基因诱导的自发性MBSHH的发生率和严重程度，而Gli1S941A功能获得性敲入表型Gli1转基因在皮肤中引起BCC样增殖。相应地，磷酸化Ser937-GLI1（GLI1的一种不稳定形式）与MBSHH患儿的总生存率呈正相关。总之，这些发现表明SHH诱导的p38α失活和随后的GLI1 去磷酸化和稳定在控制SHH信号传导方面的作用，并可能为未来干预MBSHH和BCC提供途径。Hedgehog (HH)信号通路对胚胎发育和肿瘤发生至关重要。哺乳动物HH配体由Sonic Hedgehog（SHH）、Indian Hedgehog（IHH）和Desert Hedgehog（DHH）组成。通过将HH配体与patched受体(PTCH)结合，可以解除对HH通路的辅助受体smoothened (SMO)的抑制，进而允许胶质瘤相关癌基因(GLI)家族转录因子GLI1、GLI2和GLI3诱导靶基因的转录。GLI2 和 GLI3 转录因子以蛋白酶体依赖性方式加工以产生转录激活因子或阻遏因子，而GLI1不仅是转录因子，也是HH信号通路的靶蛋白，通常被认为是转录激活因子，不需要蛋白酶体依赖的加工。融合抑制因子(SUFU)是一种细胞质蛋白，与所有三种GLI蛋白相互作用，并作为GLI转录因子的抑制因子。髓母细胞瘤（MB）是儿童最常见的小脑恶性肿瘤之一，约占所有儿童脑肿瘤的20%。MB有四个分子亚型，包括WNT组、SHH组、3组和4组，其中MBSHH是最常见的形式。基底细胞癌（BCC）是最常见的皮肤癌形式，也是所有癌症中最常见的形式。HH相关的基因改变常发生于MBSHH(87%)和BCC (85%), Ptch1和Sufu的功能缺失突变以及Smo和Gli2的功能获得性突变通常见于MBSHH和BCC，所有这些突变均导致GLI1水平上调。因此，GLI1被认为是这两种癌症发病率和严重程度的关键效应因素。在单倍不足的Ptch1+/-小鼠中，消融Gli1显著减少了MBSHH的自发形成。主要由于SHH信号通路的重要性，SMO抑制剂vismodegib和sonidegib已被批准用于治疗BCC，并正在进行MBSHH药物治疗的临床试验。尽管vismodegib对携带Ptch1或Smo突变的MBSHH有效力和疗效，但对于产生代偿机制并将SHH信号恢复至受体后水平的MBSHH无效，而且对Sufu或Gli基因改变的MBSHH几乎无影响。因此，在受体后水平，特别是在GLI1水平，识别出能够阻断信号传导的方法和分子，可能是这些疾病治疗干预的更好选择。SHH信号的激活使p38失活以诱导Gli1蛋白（Credit: Nature Communications）该研究证明了SHH通过使p38α失活来使hGLI1在Ser937上去磷酸化(mGli1在Ser941上)，从而稳定GLI1来诱导SHH信号的转录输出。因此，Gli1S941E的功能丧失性突变降低了SMO诱导的组成型活性MBSHH的发生率和严重程度，而Gli1S941A的功能获得性突变表型复制了Gli1转基因，导致皮肤BCC样增殖。重要的是，p-Ser937-GLI1水平与MBSHH患者的总生存期呈正相关。p38α介导的GLI1 Ser937/Ser941位点的磷酸化与MBSHH和BCC的发病和严重程度密切相关，因此干预GLI1的这一关键磷酸化位点可能为这些疾病的药物治疗提供新的途径。原文链接https://doi-org.libproxy1.nus.edu.sg/10.1038/s41467-024-45315-x责编|探索君排版|探索君文章来源|“iNature”End往期精选围观一文读透细胞死亡(Cell Death) | 24年Cell重磅综述（长文收藏版）热文Science最新发布：全世界最前沿的125个科学问题热文Nature | 2024年值得关注的七项技术热文Nature | 自身免疫性疾病能被治愈吗？科学家们终于看到了希望热文Nature | 癌症与神经系统的致命舞蹈

这些数据揭示了多模式单细胞基因组和类器官技术在了解人脑发育的基因调控程序方面的非凡潜力。该研究为如何利用人体模型系统和单细胞技术重建人类发育生物学提供了一个框架。 众所周知，每种动物都有自己的大脑，但人脑是独一无二的，它赋予了人类思考、说话、感知和一系列行为，控制着个体一生中所想和所做的一切。人脑被认为是生命科学中最复杂的器官。因此，到目前为止，依然有太多的长期未解之谜。 在过去的研究中，科学家们通过研究动物大脑已经取得了一些进展；但遗憾的是，这些发现并不能直接转化到人类中。因为人脑具有区别于其他物种的独特特征。此外，最近的细胞图谱对小鼠和人类发育中的脑细胞组成进行了高分辨率描述, 但由于难以在生命最早阶段获得脑组织, 以及缺乏系统操纵基因功能的方法, 研究控制人脑发育的机制始终是一项重大的挑战。 2022年10月5日，瑞士苏黎世联邦理工学院的 Barbara Treutlein 博士、何志嵩博士和罗氏制药的 J. Gray Camp 博士领导的研究团队在 Nature 上发表了题为：Inferring and perturbing cell fate regulomes in human brain organoids 的研究论文。 该研究建立了人类大脑类器官发育的多组学图谱，首次证明转录因子 GLI3 参与了人类前脑模式的形成。该研究为如何利用人体模型系统和单细胞技术重建人类发育生物学提供了框架。 近年来，利用人类干细胞在受控培养环境中生成复杂的大脑类器官（Brain Organoids）为理解人脑发育的机制开辟了新的途径。大脑或非导向性神经类器官可以从胚胎干细胞或诱导多能干细胞发育成三维神经上皮细胞，这些细胞可以自我模式化、区域化，并最终形成不同脑区的神经元。 目前，大脑类器官已被成功用于模拟小头症、自闭症等其他神经发育障碍。然而，在正常和干扰条件下协调人脑早期发育的基因调控网络仍是未知的。 在这项新研究中，该团队生成了人脑类器官发育过程中的单细胞转录组和单细胞可获得的染色质分析数据。该数据集来自3个人类 iPS 细胞系和1个胚胎干细胞系的11个时间点，涵盖了2个月的发育过程，包括胚状体形成、神经外胚层诱导、神经上皮化、神经祖细胞模式和神经发生。研究人员利用这些数据建立了一个大脑类器官发育的多组学图谱，揭示了发育层次和命运决定的关键阶段，以及类器官内每个细胞的分子指纹。 然而，类器官中的每个细胞都有超过20000个基因，而且每个类器官又由数千个细胞组成。因此，产生一个巨大的矩阵。 为了分析所有这些海量多维数据并预测基因调控机制，研究人员开发了一个框架程序Pando，它结合了多组学数据和转录因子结合位点的预测，以推断描述类器官发育的整个基因调控网络。 使用 CRISPR-Cas9 基因编辑技术，研究人员在每个细胞中选择性地关闭某个基因，整个类器官中共有24个基因被同时关闭。这使他们观察到特定基因在大脑发育中所扮演的角色。 研究人员表示，这种方法可以用于筛选与疾病有关的基因，以及观察该基因对器官内不同细胞发育的影响。 为了验证他们的理论，研究人员关注了转录因子 GLI3 。GLI3 是小鼠皮层发育调节因子，该基因突变可导致小鼠中枢神经系统畸形。过去，GLI3 在人类神经发育中的作用还未被探索，但已知该基因突变会导致 Greig头多并指综合征和 Pallister Hall 合征等疾病。 为了确认 GLI3 在人类环境中参与细胞命运的建立，以及检查潜在的发育机制，研究人员通过 CRISPR-Cas9 基因编辑建立了 GLI3 敲除 iPS 细胞系和一个对照的野生型细胞系，并生成了两个独立的大脑类器官，从而验证了 GLI3 在人类背侧端脑细胞命运中的关键作用，并进一步确定了 GLI3 在内侧神经节隆起（MGE）和外侧/尾部神经节隆起（LGE/CGE）神经元中的贡献。GLI3 的缺失会影响类器官的进一步发育。 论文通讯作者 Barbara Treutlein 表示，这项研究首次证明了 GLI3 基因参与了人类前脑模式的形成，而这以前只在小鼠中发现过。这项研究可以让你使用来自多个单细胞的全基因组数据推测单个基因所发挥的作用；而且，这些在培养皿中的模型系统确实反映了 GLI3 在小鼠发育生物学中的作用。 在荧光显微镜下来自人干细胞的大脑类器官：GLI3 （紫色）标记前脑区域的神经元（绿色）前体细胞 该团队还发现了培养基是如何以自组织的方式形成组织的，其结构在形态学以及基因调控和模式形成的层面上都与人脑的结构相当。Barbara Treutlein 表示，像这样的类器官确实是研究人类发育生物学的一种极好的方法。 这些由人类细胞材料组成的类器官研究还有一个优点，就是它可以转化到人类身上，不仅可以用于研究基础发育生物学，还可以用于研究基因在疾病或发育性脑部疾病中的作用。例如，该团队正在通过这种类器官研究自闭症和脑室周围异位的遗传原因。此外，类器官还可以用于药物测试和培养可移植器官的组成部分。 总之，这些数据揭示了多模式单细胞基因组和类器官技术在了解人脑发育的基因调控程序方面的非凡潜力。该研究为如何利用人体模型系统和单细胞技术重建人类发育生物学提供了一个框架。

在一项新的研究中，Treutlein和她的同事们如今在不同的时间点和非常详细地研究了人类大脑类器官内的数千个细胞。他们成功地将这些数据表示为一种图谱，用于显示这种大脑类器官内每个细胞的分子指纹。 人类的大脑很可能是整个生物世界中最复杂的器官，长期以来一直是科学家们着迷的对象。然而，研究大脑，特别是调节和指导它的发育的基因和分子开关，并不是一件容易的事。 迄今为止，科学家们一直在使用动物模型（主要是小鼠）进行研究，但他们的发现不能直接适用于人类。小鼠的大脑结构与人类不同，缺乏人类大脑典型的皱褶表面。迄今为止，细胞培养物在这一领域的价值有限，因为细胞在培养皿上生长时往往会扩散到大片区域；这与大脑的自然三维结构不相符。 绘制分子指纹图谱 瑞士苏黎世联邦理工学院生物系统科学与工程系的Barbara Treutlein教授及其团队采取了一种新的方法来研究人类大脑的发育：他们正在培养和使用类器官---毫米大小的可以利用所谓的多能性干细胞培育出的三维组织。 只要这些多能性干细胞接受到正确的刺激，他们就能将它们编程成为身体中存在的任何一种细胞，包括神经元。当它们聚集成一个小的组织球，然后暴露在适当的刺激下，它们甚至可以自我组装，形成具有复杂组织结构的三维大脑类器官。 在一项新的研究中，Treutlein和她的同事们如今在不同的时间点和非常详细地研究了人类大脑类器官内的数千个细胞。他们的目标是用分子遗传学术语来描述这些细胞：换句话说，所有基因转录本（转录组）的总量作为基因表达的衡量标准，同时基因组可访问性作为调节活性的衡量标准。他们成功地将这些数据表示为一种图谱，用于显示这种大脑类器官内每个细胞的分子指纹。相关研究结果于2022年10月5日在线发表在Nature期刊上，论文标题为“Inferring and perturbing cell fate regulomes in human brain organoids”。 然而，这个过程产生了巨大的数据集：这种大脑类器官中的每个细胞有2万个基因，而每个大脑类器官又由成千上万个细胞组成。论文共同第一作者、Treutlein团队的博士生Jonas Fleck解释说，“这导致了一个巨大的矩阵，而我们能够解决它的唯一方法是借助合适的程序和机器学习。” 为了分析所有这些数据并预测基因调节机制，这些作者开发了他们自己的程序。Fleck说，“我们可以用它来为每个基因生成一个完整的相互作用网络，并预测当该基因失效时在真实的细胞中会发生什么。” 识别基因开关 这项新研究的目的是系统地确定那些对大脑器官不同区域的神经元发育有重大影响的基因开关。在CRISPR-Cas9系统的帮助下，这些作者有选择地关闭了每个细胞中的一个基因，在整个大脑类器官中同时关闭了大约二十多个基因。这使他们能够发现各自的基因在大脑类器官的发育中发挥了什么作用。 论文共同第一作者、Treutlein团队博士生Sophie Jansen解释说，“这项技术可用于筛选参与疾病的基因。此外，我们还可以看看这些基因对大脑类器官内不同细胞的发育所产生的影响。” 检查前脑中的模式形成 为了检验他们的理论，这些作者选择了GLI3基因作为例子。该基因编码的转录因子GLI3可停靠在DNA上的某些位点，以调节另一个基因。当GLI3被关闭时，细胞中的分子机制被阻止读取该基因并将它转录为RNA分子。 在小鼠中，GLI3基因的突变可导致中枢神经系统畸形。它在人类神经元发育中的作用以前没有被探索过，但人们知道，该基因的突变会导致格雷格头-多指-并指综合征（Greig cephalopolysyndactyly syndrome）和帕利斯特-霍尔综合征（Pallister Hall Syndrome）等疾病。 大脑类器官发育的多组学图谱揭示了发育的层次和命运决定的关键阶段。图片来自Nature, 2022, doi:10.1038/s41586-022-05279-8。 沉默这个GLI3基因使得这些作者既能验证他们的理论预测，又能在细胞培养物中直接确定这个基因的缺失如何影响大脑类器官的进一步发育。Treutlein说，“我们首次发现，GLI3基因参与了人类前脑模式的形成。这在以前只在小鼠身上发现过。” 模型系统反映了发育生物学 她解释说，“这项新研究令人兴奋的是，它可以让你使用来自这么多个细胞的全基因组数据来推测单个基因发挥什么作用。在我看来，同样令人兴奋的是，这些在培养皿中制作的模型系统确实反映了我们从小鼠身上了解到的发育生物学。” Treutlein还发现了一个有趣的现象，即这种培养基如何产生具有与人类大脑结构相似的自组装组织——不仅在形态学水平上，而且（正如这些作者在这项新的研究中所展示的那样）在基因调控和模式形成水平上。她指出，“像这样的类器官确实是研究人类发育生物学的一种极好的方法。” 多用途的大脑类器官 对由人类细胞材料组成的类器官的研究有一个优势，即所获得的研究结果可以适用于人类身上。它们不仅可以用来研究基本的发育生物学，还可以研究基因在疾病或大脑发育障碍中的作用。例如，Treutlein和她的同事们正在用这种类型的类器官研究自闭症和异位（heterotopia）的遗传原因；在异位中，神经元出现在大脑皮层的正常解剖位置之外。 类器官也可用于测试药物，并可能用于培养可移植的器官或器官部分。Treutlein证实，制药行业对这些细胞培养物非常感兴趣。 然而，培养类器官需要时间和精力。此外，每个细胞团都是单独发育的，而不是以标准化的方式发育。这就是为何Treutlein和她的团队正在努力改进类器官并使得它们的制造过程自动化。（生物谷 Bioon.com） 参考资料： 1. Jonas Simon Fleck et al. Inferring and perturbing cell fate regulomes in human brain organoids. Nature, 2022, doi:10.1038/s41586-022-05279-8. 2. Mapping human brain developmenthttps://medicalxpress.com/news/2022-10-human-brain.html