OCLN

要点速览 1 生物信息学分析和免疫组化染色显示，特应性皮炎（AD）皮损中CLDN1、CLDN4和OCLN的表达显著下调。 2 体外实验表明，IL-4和IL-13通过Jak/STAT6信号通路下调人永生化角质细胞（HaCaT）和正常人表皮角质形成细胞（NHEKs）中的CLDN1、CLDN4和OCLN表达，并增加细胞旁葡聚糖的通透性。 3 本维莫德通过激活芳基烃受体/芳烃受体核转位蛋白（AHR/ARNT）通路上调CLDN4和OCLN的表达，并诱导NRF2核转位减少角质形成细胞（KC）中的活性氧（ROS），从而抑制IL-4/IL-13诱导的CLDN1下调和STAT6磷酸化。 研究背景 AD是一种慢性炎症性皮肤病，病因涉及遗传易感性、皮肤屏障损伤和免疫失调。AD病变的特征包括表皮海绵状病变（细胞间隙增大）和T细胞浸润，特别是T辅助细胞2（Th2），Th1、Th17和Th22细胞也有参与。 紧密连接（TJ）封闭细胞间隙，是维持皮肤屏障功能稳定的重要结构。TJ蛋白包括claudins（CLDNs）、occludin（OCLN）、JAM-A、tricellulin、zonula occludens（ZO）和angulins等。既往研究发现，在AD中，这些TJ蛋白的表达往往下调，导致皮肤屏障功能受损，进而促进AD的发展和炎症反应的加剧。 AHR是一种细胞内转录因子，近年来其在AD发病机制和治疗中的作用引起了广泛关注。既往研究表明，AHR参与了TJ的调控。在AD病变中，AHR蛋白的表达增加。也有报道称，IL-4可以在信号转导子和转录激活子6 (STAT6) 依赖的方式下诱导和激活B细胞中的AHR。 我国自主研发的创新药物——本维莫德，已被证明对银屑病和AD有效。作为一种AHR激动剂，本维莫德可促进KC分化，并通过其内在特性和部分诱导NRF2通路基因来降低ROS水平，显示出抗氧化活性。北京大学人民医院张建中教授团队进一步分析了Th2细胞因子（IL-4/IL-13）和本维莫德对TJ调控的影响，为AD的治疗提供新的策略。该研究成果于2024年3月表于《Journal of Investigative Dermatology》杂志，（IF=5.7）[1]。 研究结果 1 在AD皮损中，TJ蛋白的表达水平普遍下降 通过生物信息学分析，基于多个基因表达数据集（GSE130588、GSE133477、GSE32924和GSE133385）发现：在AD皮损中，CLDN1和CLDN4的mRNA水平显著低于非病变皮肤，而OCLN的mRNA水平在AD皮损和非皮损中均比正常皮肤显著降低，但在皮损和非皮损之间无显著差异（图1a,b,c）。免疫组化染色进一步证实，AD皮损中的CLDN1蛋白表达显著低于正常皮肤，而CLDN4和OCLN的蛋白表达虽有下降，但差异不显著（图1d）。 图1：生物信息学分析及免疫组化染色评估AD皮损中CLDN1、CLDN4和OCLN的表达水平； 注：*P < .05, **P < .01, ***P < .001, ****P < .0001 2 IL-4、IL-13和IFN-γ能够单独下调TJ蛋白的表达 使用不同浓度的细胞因子（IL-4、IL-13、TNF-α、IFN-γ和IL-17A）处理HaCaT和NHEKs，结果显示，IL-4、IL-13和IFN-γ显著下调了HaCaT中TJ蛋白（CLDN1、CLDN4和OCLN）的mRNA和蛋白水平，而TNF-α和IL-17A则没有显著影响（图2a,b,c），且IL-4/IL-13之间没有协同效应。在NHEKs中，IL-4/IL-13处理显著降低了CLDN4和OCLN的蛋白水平，但对CLDN1的蛋白水平影响不显著（图2d,e）。 图2：IL-4/IL-13对HaCaT及NHEKs中TJ蛋白表达的影响； 注：*P < .05, **P < .01, ***P < .001, ****P < .0001 3 IL-4/IL-13和IFN-γ诱导的HaCaT中TJ蛋白表达下调是通过Jak/STAT6信号通路介导的 使用Jak1/2抑制剂芦可替尼、STAT6抑制剂AS1517499和STAT1抑制剂氟达拉滨预处理HaCaT。结果显示，芦可替尼剂量依赖性地抑制了IL-4/IL-13和IFN-γ诱导对TJ蛋白（CLDN1、CLDN4和OCLN）mRNA表达的影响（图3a），而STAT6和STAT1抑制剂也有效抑制了以上细胞因子诱导的TJ蛋白下调（图3b）。 此外，单独使用IL-4、IL-13或IFN-γ处理KCs会增加细胞旁葡聚糖通量，而同时使用IL-4/IL-13处理则导致更显著的葡聚糖通量增加。用1 mM 芦可替尼预处理HaCaT，可以有效抑制由IL-4/IL-13或IFN-γ诱导增加的葡聚糖通量（图3c）。 图3：Jak/STAT通路参与IL-4/IL-13/IFN-γ诱导的HaCa中的TJ蛋白下调； 注：*P < .05, **P < .01, ***P < .001, ****P < .0001 4 AHR通路和ROS在IL-4/IL-13诱导的TJ蛋白表达下调中起重要作用 IL-4/IL-13能够上调HaCaT和NHEKs中的AHR（图8a），使用Jak抑制剂芦可替尼、STAT6抑制剂AS1517499和ROS抑制剂二苯乙烯碘化物预处理后可以消除这种上调效应。IL-4/IL-13对典型的AHR通路产物CYP1A1或AHR抑制因子的表达没有影响（图4b）。沉默AHR mRNA的表达可以恢复IL-4/IL-13诱导下调的HaCaT中CLDN1的表达并减少CLDN4和OCLN的表达（图4c），同时增加了磷酸化的STAT6（图4d）。ROS抑制剂二苯乙烯碘化物抑制了IL-4/IL-13诱导的CLDN1下调，但不影响CLDN4或OCLN（图4e）；同时抑制了IL-4/IL-13诱导的磷酸化的STAT6及AHR上调（图4f和g）。 图4：AHR通路和ROS参与IL-4/IL-13诱导CLDN1、CLDN4和OCLN表达下调； 注：*P < .05, **P < .01, ***P < .001, ****P < .0001 5 本维莫德通过激活AHR/ARNT通路来上调CLDN4和OCLN表达，并阻断IL-4/IL-13或IFN-γ诱导的细胞旁葡聚糖通量增加 本维莫德依赖性地上调HaCaT和NHEKs中的CLDN4和OCLN表达，但不影响CLDN1的表达（图5a）。500 nM的本维莫德抑制了由IL-4/IL-13或IFN-γ诱导的跨细胞葡聚糖通量增加（图5b），且不影响细胞增殖（图5c）。本维莫德促进了AHR的核转位（图5d）并上调了CYP1A1和CYP1B1的表达（图5e），而敲除AHR或AHR核转位因子，或用AHR拮抗剂CH-223191预处理，可阻断本维莫德对HaCaT和NHEKs中CLDN4和OCLN表达的影响，同时，本维莫德处理后AHR蛋白水平也有所下降，但AHR mRNA的表达没有明显改变(图5f、g）。 图5：本维莫德通过AHR/ARNT通路上调CLDN4和OCLN的表达，并阻断IL-4/IL-13e或IFN基因诱导的细胞旁葡聚糖通量； 注：*P < .05, **P < .01, ***P < .001, ****P < .0001 6 本维莫德可抑制IL-4/IL-13诱导的STAT6磷酸化、TJ蛋白表达下调 本维莫德促进NHEKs中NRF2的核转位（图6a），并上调NQO1的表达；并能抑制IL-4/IL-13诱导的NHEKs中ROS的产生（图6b）和HaCaT中STAT6的磷酸化（图6c）。本维莫德还抑制了IL-4/IL-13诱导的HaCaT和NHEKs中TJ蛋白表达下调（图6d,e）。另外，本维莫德对IFN-γ诱导的STAT1激活或CLDN1下调没有影响，可恢复CLDN4和OCLN的表达（图6f）。 图6：本维莫德抑制IL-4/IL-13诱导的STAT6磷酸化、TJ蛋白表达下调； 注：*P < .05, **P < .01, ***P < .001, ****P < .0001 研究结论 该研究证实，IL-4/IL-13通过Jak/STAT6信号通路下调TJ蛋白（CLDN1、CLDN4和OCLN）的表达，从而导致KCs中TJ功能损害，促进AD发展。而本维莫德可以激活AHR/ARNT通路，上调CLDN4和OCLN表达，并诱导NRF2核转位减少ROS产生，从而抑制IL-4/IL-13引起的TJ损伤和STAT6磷酸化（图6g）。研究结果显示，本维莫德在保护表皮屏障功能中有潜在作用，为其用于AD治疗提供了新的理论依据，并为开发AD治疗药物提供了重要方向。 更多精彩 参考文献： [1]Wang X, Mao D, Jia J, Zhang J. Benvitimod Inhibits IL-4- and IL-13-Induced Tight Junction Impairment by Activating AHR/ARNT Pathway and Inhibiting STAT6 Phosphorylation in Human Keratinocytes. J Invest Dermatol. 2024 Mar;144(3):509-519.e7. doi: 10.1016/j.jid.2023.07.027. Epub 2023 Sep 20. PMID: 37734479. 免责声明 本微信文章中的信息仅供向医疗卫生专业人士提供科学信息，不可直接作为决策内容，中昊药业不对任何主体因使用本文内容而导致的任何损失承担责任。以上内容如涉版权请联系删除。

*仅供医学专业人士阅读参考阿尔茨海默病（AD）的关键病理之一就是β淀粉样蛋白（Aβ）的积累。早老素在淀粉样前体蛋白的加工过程中起着重要作用，PSEN1和PSEN2突变是早发性家族性AD的主要遗传因素之一。在之前的研究中，科学家发现实验性结肠炎小鼠的早老素失调，提示早老素可能在肠道稳态和炎症中也发挥了关键作用，而不仅仅参与神经系统疾病的发病机制。近日，德国埃尔朗根-纽伦堡大学的研究团队确定了早老素在维持肠道稳态中的重要作用。研究结果显示，实验性结肠炎小鼠和炎症性肠病（IBD）患者的肠道Psen1表达受损，肠上皮细胞中Psen1和Psen2同时缺失会导致小鼠自发性肠道炎症，并伴随着肠道屏障受损和菌群紊乱，还有可能发展为致命的严重虚弱。研究发表在GUT上。肠上皮细胞是保护胃肠道的有效屏障，肠上皮稳态紊乱可能导致胃肠道病理变化，包括IBS、克罗恩病和溃疡性结肠炎。除了腹痛和腹泻外，70%-80%的IBD患者还有可能出现体重减轻或者营养不良。Wnt信号通路和Notch信号通路是维护肠上皮稳态的主要途径之一，而早老素在这两条信号通路中也起到了关键作用。通过对实验性结肠炎小鼠和健康小鼠的结肠组织样本进行批量RNA测序，研究人员发现实验性结肠炎小鼠的Psen1表达显著下降。在克罗恩病和溃疡性结肠炎患者中，Psen1表达水平与疾病严重程度相关。Psen1在肠道中表达，并在肠道炎症过程中受到差异调控因此，研究人员首先测试了上皮细胞Psen1缺失时的肠道稳态。与对照组相比，Psen1缺失小鼠的肠道结构并没有明显变化，炎症相关因子水平也没有明显差异。单独缺失Psen2也不会对肠道稳态造成影响。但是，当Psen1和Psen2同时缺失，情况就变得有些不妙了，小鼠在胚胎早期就已经死亡。为了使研究能够进行下去，研究人员在Psen2缺陷小鼠中降低Psen1表达水平（iDKO小鼠），小鼠不仅体重显著降低，内窥镜检查也表现出自发性结肠炎和结肠显著缩短，炎症相关标记物显著上调。iDKO小鼠出现肠道炎症给小鼠口服荧光标记的葡聚糖类化合物，可以看到iDKO小鼠血清中标记物水平显著升高，表明iDKO小鼠出现了明显的肠道屏障缺陷。而上皮器官观察到荧光素黄也证明早老素缺失引起的屏障破坏缺失是肠上皮细胞功能缺失确实导致的。那么，肠上皮细胞出现了什么问题呢？免疫荧光染色和Western blot分析显示，iDKO小鼠肠上皮细胞的紧密连接相关蛋白（如E-Cadherin和occludin）水平显著下降。而失去了坚实肠道屏障的iDKO小鼠也失去了防止细菌扩散的能力，细菌迁移至远端器官，还会进一步引发系统性炎症反应。iDKO小鼠肠道屏障被破坏接下来，研究人员对小鼠给予抗生素来减轻菌群扩散的影响，发现小鼠炎症标志物水平下降，肠道炎症症状减轻，但是并没有挽救小鼠的体重下降。也就是说，还存在其他被我们忽略的疾病机制。于是，研究人员再次对iDKO的小鼠进行了RNA测序，共发现了4129个基因的差异表达，除了炎症反应、细胞迁移等相关通路改变之外，营养成分吸收和转运以及一些基础代谢通路也受到影响。iDKO小鼠肠上皮细胞功能及分化受到影响分析结果显示，分泌性肠上皮细胞的分化受到影响，吸收性肠细胞数量显著减少，这就导致小鼠肠道葡萄糖吸收严重受损，小肠肠上皮细胞的脂质积累完全被阻断，肝糖原大幅度减少，暗示Psen1/2双缺失小鼠的死亡可能是营养不良导致的。总的来说，研究首次揭示了早老素Psen1和Psen2在肠道稳态中的关键作用，可以通过影响肠上皮细胞分化平衡来维持屏障完整性，避免营养不良和肠道炎症的发展。参考文献：Erkert L, Gamez-Belmonte R, Kabisch M, et al. Alzheimer’s disease-related presenilins are key to intestinal epithelial cell function and gut immune homoeostasis[J]. Gut, 2024.本文作者丨王雪宁

引言肺炎链球菌（S. pneumoniae）是导致儿童和老年人高发病率和死亡率的主要人类细菌病原体。最近的研究强调了细菌致病性中外泌体（EVs）的作用。然而，链球菌外泌体（pEVs）对宿主-微生物相互作用的贡献仍不清楚。2024年4月21日，华中农业大学王湘如团队在Autophagy 在线发表题为“Streptococcus pneumoniae extracellular vesicles aggravate alveolar epithelial barrier disruption via autophagic degradation of OCLN (occludin)”的研究论文，该研究观察到，小鼠感染链球菌导致严重的肺损伤和肺泡上皮屏障（AEB）功能障碍。链球菌感染降低了小鼠肺组织和A549细胞中紧密连接蛋白OCLN（occludin）的蛋白表达，并激活了巨噬细胞自噬/自噬。在机制上，链球菌诱导自噬泡降解OCLN导致A549单层AEB损伤。链球菌释放的pEVs可以被肺泡上皮细胞内吞。通过蛋白质组学，作者对pEVs内的载体蛋白进行了分析，发现这些pEVs含有许多毒力因子，其中作者鉴定了一个类似真核丝氨酸-苏氨酸激酶蛋白StkP。内吞的StkP能够诱导BECN1（beclin 1）在Ser93和Ser96位点的磷酸化，启动自噬并导致自噬依赖的OCLN降解和AEB功能障碍。最后，在链球菌中删除stkP完全保护了感染小鼠免于死亡，显著减轻了体内OCLN降解，并在体外大部分阻断了pEVs引起的AEB破坏。总的来说，结果表明，pEVs在链球菌毒力因子的传播中发挥了关键作用。pEVs中的载体蛋白StkP能够与宿主靶蛋白通信，甚至劫持BECN1自噬启动途径，促进AEB破坏和细菌致病性。肺炎链球菌（S. pneumoniae）是一种常见的机会性人类病原体，是全球细菌性肺炎的主要原因。该细菌每年造成数百万人死亡，导致社区获得性肺炎、败血症和脑膜炎等侵袭性肺炎链球菌疾病。S. pneumoniae通常定植于人类鼻咽和上呼吸道，但当其传播到下呼吸道时可能引发严重疾病。细菌可以通过通过肺泡上皮屏障（AEB）和血管内皮屏障而进入空气间隙进入血液，从而增加肺通透性。一般来说，肺叶炎的发展是由细菌粘附于肺泡上皮细胞，随后复制并引发宿主损伤反应所致。这些过程受到细菌分泌的产物与肺泡上皮以及随后的先天免疫防御之间的相互作用的驱动。然而，S. pneumoniae引起肺泡上皮屏障功能障碍的精确机制仍然不完全清楚。细菌膜囊泡（MVs）被确定为一种将特定货物运输到细菌的独特分泌途径。这些MVs，也被称为外膜囊泡（OMVs），在革兰阴性细菌中得到了广泛研究和表征，但在革兰阳性细菌中研究较少。最近的研究提供了证据表明，革兰阳性细菌也可以从细胞表面释放球形膜颗粒，称为细胞外囊泡（EVs）。这些EVs通过将细菌成分输送到宿主细胞中起到了在宿主-病原体相互作用中的作用，导致细胞毒性效应，从而增加了细菌的致病性。例如，从金黄色葡萄球菌（S. aureus）衍生的EVs已被证明能够激活Toll样受体，并在上皮细胞和巨噬细胞中诱导促炎细胞因子反应。尽管已观察到EVs内化到上皮和内皮细胞中会增加屏障通透性，但关于EVs如何破坏AEB完整性的证据仍然缺乏。巨噬/自噬是一种保守的溶酶体降解途径，可清除损伤的细胞器和蛋白质，从而避免多种细胞和器官的过度损伤和细胞功能障碍。一方面，自噬可以作为对外部刺激的保护性反应，例如缺氧下，它有助于防止内皮CLDN5的重新分布和异常积聚，从而减轻BBB功能障碍。然而，另一方面，过度的自噬会导致自噬细胞死亡，导致组织损伤。研究表明，自噬可以降解紧密连接蛋白（TJ蛋白）并增加肠道和呼吸道上皮屏障通透性。也有报道称，S. pneumoniae感染可以在人类肺泡上皮细胞（AECs）、人类角膜上皮细胞和小鼠骨髓来源的中性粒细胞中诱导自噬激活。细胞内的S. pneumoniae可以被细菌杀伤性自噬所识别，并且某些S. pneumoniae来源的蛋白质被认为是自噬激活剂，例如表面暴露的胆碱结合蛋白CbpC、形成孔的毒素肺炎链球菌裂素PLY和S. pneumoniae内切蛋白O PepO。然而，与S. pneumoniae感染相关的与自噬有关的AEB破坏的直接证据和基本机制仍然未知，并且S. pneumoniae EVs（pEVs）对这些自噬过程的操纵尚未被探索。从肺炎链球菌D39株中分离、纯化和鉴定pEvs的程序示意图（Credit: Autophagy）该研究证明了pEVs可以诱导肺泡上皮细胞中的自噬，导致AEB完整性的破坏。作者还发现pEVs在A549细胞中的内化导致MAP1LC3/LC3（微管相关蛋白1轻链3）-II的增加，这是自噬激活和自噬体形成的标志，以及通过自噬过程的OCLN（occludin）的降解。此外，作者确定了类似真核丝氨酸-苏氨酸激酶（eSTKs）蛋白StkP包含在pEVs中，内部的StkP发现诱导通过磷酸化BECN1（beclin 1）的自噬激活。综上所述，该研究表明，作为pEVs的载体的细菌蛋白质StkP可以在S. pneumoniae感染期间诱导宿主自噬，并指示了革兰阳性细菌EVs在通过自噬介导的细胞降解途径引起上皮屏障破坏中的一个以前未知的作用。总的来说，这些结果提高作者对pEVs及其载体对屏障破坏的细胞内影响的理解，为细菌致病性和宿主疾病进展提供了见解。原文链接https://www-tandfonline-com.libproxy1.nus.edu.sg/doi/full/10.1080/15548627.2024.2330043责编|探索君排版|探索君文章来源|“iNature”End往期精选围观一文读透细胞死亡(Cell Death) | 24年Cell重磅综述（长文收藏版）热文Nature | 破除传统：为何我们需要重新思考肿瘤的命名方式热文Nature | 2024年值得关注的七项技术热文Nature | 自身免疫性疾病能被治愈吗？科学家们终于看到了希望热文CRISPR技术进化史 | 24年Cell综述