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摘要：类器官是一种3D细胞组织，能够重现原生组织的某些结构和功能。近期的研究使得类器官作为研究组织发育、药物发现和潜在临床应用的宝贵模型而日益受到重视。体外成功培养类器官的要求与传统的单层细胞培养大相径庭。生成和成熟高保真类器官需要开发和优化环境条件，以提供生长和3D成熟的最佳线索，如氧合、机械和流体激活、营养梯度等。为此，我们讨论了用于类器官培养的四大类生物反应器：搅拌生物反应器（SBR）、微流控生物反应器（MFB）、旋转壁容器（RWV）和电刺激（ES）生物反应器。我们的目标是概述商业化和自行开发的生物反应器系统的最先进技术，它们对来自不同细胞和组织的类器官培养的好处，以及生物反应器技术的局限性，包括灭菌、可访问性、适用性和长期培养的便利性。最后，我们讨论了现有生物反应器技术的改进方向，以及它们如何被用来增强特定应用的类器官培养。 1.引言 近年来，类器官因其为研究器官发育提供了复杂的模型，并且是强大的疾病模型而日益受到重视。经过数十年使用“简单”的2D单层细胞培养进行体外研究的经验，人们越来越清楚地认识到需要更复杂的组织培养系统来准确再现新生和成熟人体组织的结构和功能。此外，类器官可能有助于更真实地模拟原生组织中看到的复杂性，包括与外来微生物的相互作用。类器官的使用的最新进展导致它们在疾病建模、癌症研究和人类发育研究中的日益增多的应用。 在本文中，“类器官”一词被定义为能够重现一些原生组织结构和功能的3D细胞组织。如今，类器官通常来源于干细胞，可能包括胚胎干细胞（ESCs）、诱导多能干细胞（iPSCs）或各种组织特异性成体干细胞，如间充质干细胞（MSCs）或脂肪组织来源的干细胞（ASCs）。与传统的单层细胞培养相比，类器官在基因和蛋白质表达、细胞极化以及宏观和微观组织组织方面与原生组织有显著的相似性。虽然我们将讨论一些用于其他3D组织培养构建的生物反应器，如胚状体（悬浮生长的干细胞聚集体）和球状体（任何球形细胞簇，无论结构复杂性或功能如何），我们的主要关注点将是生物反应器如何被用来增强类器官研究。正如这里所呈现的，最近的进展主要集中在iPSC技术上，它带来了许多优势，包括允许患者特异性类器官的发展，简化最终的医疗用途，并避免了围绕使用胚胎干细胞的潜在伦理问题[7]。此外，值得注意的是，类器官培养的优化侧重于特定组织的发生，而不是从干细胞生成整个生物体。最近的进展已经引发了关于从人类干细胞生成胚胎的伦理问题的讨论。有关人工子宫技术的研究确实存在，但这些主题不在本综述的范围之内。 传统上，“生物反应器”一词被用来描述设计用于生产生物材料的容器。商业生物反应器通常是大型罐体，大小从1000到10000升不等，通常包含一个搅拌或泵送机制，用于将液体进出罐体。这些大规模反应器旨在促进生物过程，例如从活细胞和生物体中生产抗体或其他蛋白质。这些设备的一个基本特征是能够调节环境条件，如pH值、溶解气体浓度、流速/搅拌速率和系统中的营养成分。虽然许多这些生物反应器是为培养细菌、酵母或其他微生物而开发的，但在大规模哺乳动物细胞培养以生产生物活性蛋白方面也取得了重大进展。此外，许多需要翻译后蛋白质修饰的生物技术产品通常是在大规模哺乳动物细胞批次培养中生产的，如中国仓鼠卵巢（CHO）或仓鼠肾（BHK）细胞，因为这些细胞可以进行糖基化和蛋白质折叠，这在细菌蛋白质中不会发生。随着哺乳动物细胞生产的生物反应器应用变得普遍，已经开发了额外的策略来更好地适应哺乳动物细胞的要求，特别是在氧气供应、代谢废物（例如，CO2、乳酸）的去除和限制过度剪切应力方面。 在本文的背景下，“生物反应器”指的是用于增强体外3D细胞和组织培养的任何设备。具体来说，我们将讨论生物反应器以及它们与类器官培养的关系，尽管这些技术中的大多数也可以用于其他组织培养构建。与用于大规模蛋白质生产的商业生物反应器不同，目前用于类器官培养的大多数生物反应器都很小，使用的培养基量少至几毫升。由于细胞培养基和补充剂的成本很高，大多数研究旨在限制生物反应器的尺寸。这样的生物反应器可以用于这些缩小尺寸的特定优化，改善细胞或组织培养的特定方面，如氧气和营养成分的浓度，或确定特定组织的最佳流速和剪切力。然而，如果需要，通常会考虑扩大特定生物反应器设计。许多潜在的类器官应用，如高通量药物筛选和基于细胞的治疗，需要大量的细胞或成熟的类器官。虽然在低密度下一致且相对简单，但单层培养在扩大规模时可能面临挑战。能够在保持试点研究小而经济有效的同时方便地扩大特定生物反应器技术的能力是非常理想的。 动态生物反应器有助于克服静态培养的许多限制，静态培养仍然是组织培养的“金标准”。静态2D培养不能准确再现体内环境的许多方面，包括营养物的可用性、气体交换、基质属性、废物去除等。使用生物反应器进行3D培养允许研究人员模拟在2D培养中找不到的许多环境特征，如增加的流体流动、信号分子和生长因子的梯度以及各种类型的刺激。为此，我们将讨论用于类器官培养最常用的生物反应器，包括搅拌生物反应器、旋转壁容器、微流控装置和电刺激生物反应器，如图1所示。本综述将深入探讨生物反应器对类器官培养的潜在好处和局限性。 图1. 用于类器官培养的常用生物反应器。(A) 带有轴向搅拌器（左）和径向搅拌器（右）的搅拌生物反应器。箭头显示流体运动方向。(B) 微流控生物反应器，具有用于灌注不同培养基的独立通道。(C) 旋转壁容器（RWV）生物反应器：（左侧）慢速转动侧壁容器（STLV）和（右侧）高宽比容器（HARV）。箭头显示旋转方向。(D) 电刺激生物反应器显示两个平行板电极。详见正文。 2.搅拌生物反应器  用于类器官培养的搅拌生物反应器（SBRs）的操作原理与传统的大规模生物反应器相似，后者经常用于商业生产生物分子。SBR培养的特点是其均匀的环境、简单的监测和关键培养参数的直接控制，特别是可扩展性。SBRs通常由一个圆柱形培养容器组成，该容器配备有一个搅拌器或搅拌器，可以由电机直接或间接驱动。通过两种类型的搅拌器产生流体动力学力：轴向流和径向流搅拌器。轴向流搅拌器的叶片以一定角度倾斜，将流向导向容器底部，而径向流搅拌器的叶片与搅拌器轴垂直，产生流向反应器壁的流动模式，如图1A所示。根据搅拌器配置、旋转速度和容器几何形状，可以调节流体动力学特性，如剪切力、营养交换和扩散，以满足培养的需要。这些的一些示例可以在表1中找到。这些搅拌器还执行各种功能，包括均质化、热质传递和通气。为了表征这些搅拌器的传递现象，包括氧气传递、营养混合和机械刺激，已经做出了重大努力。 2.1. 改善组织氧合 已经证明SBRs为细胞和类器官培养提供了许多优势，主要源于改善的质量传递和增强的氧合。研究工作表明，使用SBRs改善分化，介质搅拌可以导致细胞存活率增加和分化加速。Li等人证明，通过使用SBRs，在二维造血干/祖细胞培养中可以减少氧化应激。他们的结果显示，搅拌条件下改善了细胞存活率，并与静态条件相比，以更快的速率诱导分化。在三维组织培养（即类器官培养）期间，氧气和营养物质的静态扩散不足以满足发展中组织的需求，因为它们迅速增加大小和复杂性。直径超过1毫米的细胞球状体经常出现低氧、坏死的核心，周围有一层薄的活性细胞环（约100微米）。对于高氧消耗率的组织，如脑类器官，这个问题变得至关重要。Lancaster等人通过证明SBRs改善了氧气的可用性和营养吸收，从而产生了比在静态条件下生长的更大、更连续的复杂脑类器官来解决这个问题。 2.2. 实现适当的谱系进展和3D空间组织 祖细胞的增殖、分化和存活对于形成多层类器官组织至关重要。然而，由于类器官在早期和晚期分层阶段的不同需求，这一过程面临挑战。在静态体外培养中形成的复杂组织结构常因结构核心区域的缺血而停止发育，这是由于氧气和营养物的有限接触造成的。类似于移除建筑物的基础，这些内部组织层崩溃，可能损害更代谢活跃的外层的持续发展和组装。类器官组织层的结构复杂性通常取决于核心细胞存活的程度。为了改善类器官培养结果，有必要使用工具来增强氧气和营养物向内部组织层的扩散。使用SBRs实现这一目标的努力可以在钱等人的工作中看到，他们使用与12孔板结合设计的定制旋转生物反应器来生成前脑特异性脑类器官。与静止和轨道摇动条件相比，他们的SBR平台改善了氧气和营养物的扩散，促进了大而连续的皮层结构的形成。SBRs也被用于推进细胞培养中的谱系进展。Fluri等人表明，在搅拌瓶中培养的体细胞衍生的iPSCs，消除了对饲养细胞层、血清或昂贵的组织培养基质（例如，基底膜基质）的需求。他们的方法，称为悬浮培养重编程的iPSCs（SiPSCs），是通过在处理过的搅拌瓶中播种可诱导的次级小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs），并以65 RPM搅拌来实现的。次级MEFs在悬浮培养的前四天显示出比其对照组（粘附）更多的annexin V染色。当用多西环素培养时，发展了一群GFP阳性（具有重编程因子的细胞）和EdU阳性细胞，表明正在积极重编程的细胞。他们的结果显示，这些悬浮培养中重编程的细胞与使用传统的粘附单层条件的细胞相当。 2.3.类型和可定制性 最常见的SBR类型，搅拌瓶，是一个圆柱形的玻璃容器，其中单个细胞或小细胞聚集体被悬浮以形成所需的组织。作为最基础的生物反应器，搅拌瓶促进了培养基中氧气和营养物的混合，并减少了新生体外组织构建物表面的浓度边界层。对传统搅拌瓶设计的修改允许增加额外的功能，如营养物供应的连续灌注、废物移除、传感器探头的集成、pH控制系统和采样口。与其他培养系统（如传统的静态培养、旋转壁容器或微流控生物反应器）相比，SBRs可以轻松扩大规模。例如，钱等人使用齿轮驱动的搅拌平台组装改进的大脑区域特异性类器官。他们的SBR（SpinΩ）结合了十二个搅拌器，每个搅拌器都连接到一个齿轮上，由单个电机驱动，几乎所有3D打印组件都是使用3D打印技术在内部制造的。Schneeberger等人展示了使用搅拌瓶培养成熟肝类器官的多功能性。他们专注于大规模生产hiPSC衍生的肝脏类器官，以解决肝脏移植替代品的未满足的临床需求。他们的方法涉及从肝脏活检中分离出的单个细胞的扩增，并将它们播种在设置为85 RPM的搅拌瓶中，在11到14天内形成肝脏类器官。 为了诱导肝脏分化，将类器官转移到一个新的搅拌瓶中，并使用含有10% Matrigel的定制分化培养基进行分化，分化时间长达12天。如图2所示，第5天的光学显微镜图像以及苏木精-伊红（HE）和Villin-1染色表明，搅拌瓶中的类器官比对照组类器官展现出更多褶皱的形态和相同的极化。在搅拌瓶中培养始终导致肝细胞标记物（CYP3A4、ALB、MRP2）的上调和干细胞标记物（LRG5）的下调，对所有患者细胞均如此。分化第12天的广泛mRNA测序显示了多达（图2C）。通过增强MDR1特异性的Rhodamine123转运和增加在搅拌瓶中培养的类器官的糖原储存，证明了这些肝类器官的功能（图2D）。总体而言，这些结果表明，使用搅拌瓶大规模扩增患者特异性肝类器官以产生半功能性肝组织是一种有希望的方法，为更可行的临床应用铺平了道路。 图 2. 类器官在搅拌瓶中分化为功能性肝细胞。类器官在搅拌瓶中或在静态对照条件下分化了12天。(A) 光学显微镜图像、HE染色和对石蜡包埋类器官的管状标记物Villin-1的免疫组化分析。细胞核用苏木精进行对比染色。通过定量RT-PCR（B）和mRNA测序（C）确定分化类器官中肝细胞标记物的表达。(B) LGR5、CYP3A4、ALB和MRP2的转录水平。图表显示了五个不同供体的五次独立实验。使用冷冻保存的肝细胞作为阳性对照。* p < 0.05 (C) 来自三个独立供体的类器官在分化的第12天的mRNA测序。热图中显示了与相应静态对照相比，在搅拌瓶中第12天分化时上调超过四倍的基因。一些众所周知的肝细胞基因已进行了注释。(D) Rh123转运被确定为MDR1活性的读数，PAS染色表明类器官细胞中的糖原储存。详见正文。经Schneeberger等人许可改编。 2.4. SBRs的限制 尽管简单易行的SBRs具有吸引力，但高流体剪切和搅拌器不稳定等限制可能对剪切敏感的类器官培养引起关注。哺乳动物细胞对剪切敏感，可能会被过度的水动力力损坏。如果搅拌器的几何形状设计不当，可能会引入有害影响，抑制分化或破坏如纤毛和微绒毛等精细结构。例如，Ovando-Roche等人发现，尽管在SBRs中培养视网膜类器官改善了层状分化并增加了带有纤毛的光感受器的产量，但脆弱的晚期外段样结构有显著的损失。作者推测，由SBRs引起的剪切应力损害了这些精细结构的形成。然而，他们指出，通过确定平衡最大细胞产量和保护脆弱结构的最佳搅拌速率，可以限制这些影响。另一个限制，特别是对于定制构建和3D打印系统，如前述的SpinΩ，是增加的复杂性可能导致最终用户更多的技术困难。然而，这个问题一直在被研究人员考虑，正如后来研究创建的Spin∞，这是对SpinΩ系统的迭代改进，解决了一些关于灭菌和长期实验可靠性的问题。 3.微流控  微流控生物反应器（MFBs）是改善类器官培养的有前途的平台。MFBs结合了传统2D和3D培养方法以及其他生物反应器平台（例如，诱导流体动力力）的优势特征，同时提供了额外的好处，包括对微环境条件的增强控制和更高的通量。这方面的示例可以在表2中找到。通常，MFBs由一个或多个入口、一系列小通道和腔室以及一个或多个出口组成，如图1B所示。此外，它们通常使用光刻基模塑等微制造技术定制设计，具有从毫米到微米尺度的小的建筑特征。这些特性允许广泛的培养设备几何形状的可能性，为高度专业化的应用提供了一个动态平台。 3.1.功能和应用 MFBs的基本工作原理涉及使用泵将流体体积通过通道和腔室输送，这些泵可以是外部连接到设备或系统内部的。入口和输出访问端口在培养区域和外部环境之间进行接口。大多数MFB系统使用外部泵（例如，注射器或蠕动泵）通过管道连接到访问端口，产生一种灌注流。这种流的主要目的是持续提供氧气和营养物并清除废物。此外，次要入口（注射口）可以注入额外的补充物（例如，化学物质、生长因子、酶）。通道的几何形状强加的层流提供了一种机制，以定位和调节这些补充物的输送，允许对组织构建物周围的空间和时间微环境进行精确控制。在MFBs中实施了多种类型的传感器技术以提供实时实验数据。光学传感、光谱方法和电化学分析方法已用于监测关键过程变量，包括氧气、pH值、CO2、葡萄糖和温度。例如，张等人制造了一个集成了物理、生化和光学传感器的模块化传感MFB平台，用于肝脏和心脏类器官培养。该系统由蠕动泵、培养基储罐、生物电化学传感模块、物理/化学传感模块、流量控制面包板模块、气泡陷阱和类器官培养模块组成。这些组件通过管道依次连接形成完整的电路。培养基从储罐泵入，通过气泡陷阱，由流量控制面包板分配到类器官模块，然后泵入传感模块。生物电化学模块采用了一系列的电化学微电极传感器，这些传感器在抗体-抗原结合时检测氧化还原探针的电子转移活性。为了测量生物标志物，作者考虑了白蛋白和谷胱甘肽S-转移酶α作为肝脏生物标志物，肌酸激酶BM作为心脏生物标志物。这些微电极也可以清洗和再生以检测其他可溶性生物标志物。物理/化学传感模块与光学氧气和pH传感器以及温度探头集成。此外，在类器官培养模块底部集成的微型显微镜获得了实时原位形态图像。为类器官培养设计的模块由两个半腔室组成，嵌入在两层（顶层：PDMS，底层：PDMS/玻璃）之间，夹在两个刚性的PMMA支撑之间。肝脏类器官由聚集在明胶甲基丙烯酸（GelMA）中的人类原代肝细胞形成的肝小叶组成。使用类似的图案化技术，心脏类器官由hPSC衍生的心肌细胞（CMs）形成，这些细胞种植在富含纤维连接蛋白的GelMA的平行线（50-µm间距）中，然后用纤维蛋白凝胶层覆盖。3-4天后，作者观察到hPSC-CMs的排列和伸展，最终在平行线之间形成了细胞桥。他们的结果表明，肝脏类器官模块可以诱导肝细胞聚集成肝小叶（D5时细胞活性>85%），同时保持功能，如通过电化学生物传感器测量的白蛋白持续分泌所示。心脏类器官模块使种植的心肌细胞形成具有细胞桥的心脏类器官。使用迷你显微镜，他们观察到强烈且同步的跳动，速率约为每分钟60次，单批细胞内跳动速率均匀。 3.2. 类器官培养的优势 如前所述，使用微尺度几何形状精确调节微环境参数的能力是MFBs提供的独特优势，考虑到类器官培养的敏感性，这一点尤其重要。MFBs以受控方式输送氧气、营养物和其他补充物的能力对于改善类器官培养结果至关重要。因此，使用MFBs可能会提高类器官培养的质量，确保更均匀的发育，定向分化类器官细胞类型，并最小化传统培养技术或其他生物反应器平台通常导致的不可预测性、异质性和缺乏一致性。最后，鉴于类器官被特别培养以作为生理模型，模拟生理条件的能力（例如，产生梯度，应用时间信号分子，诱导或减少机械力）提供了一个动态平台，以模拟和研究细胞对特定刺激的响应。 3.3. 在类器官培养中的应用 最近，Fu等人展示了MFBs对多细胞球状体的形成、培养和分析的影响。在他们的工作中，使用雕刻的丙烯酸模具铸造（PDMS）通道微室制造了MFB。这篇论文强调了使用非传统光刻技术生成复杂几何形状的能力。简单来说，光刻技术用于在光敏聚乙二醇前体聚合形成微室内的U形结构阵列，从而制造了MFB。Balb/c 3T3成纤维细胞和人类肝癌细胞系HepG2悬浮液被装入MFB并困在其U形结构内。被捕获的细胞在8 µL/min的连续培养基灌注下使用蠕动泵培养，形成多细胞球状体。一旦形成球状体，流速降低到1.5 µL/min进行长期培养。他们的结果表明，在这个MFB中可以使用流体流动和单位重力沉降生成许多均匀的多细胞球状体。所使用的水凝胶的材料和几何形状允许有效的营养物和废物交换，同时保护类器官免受灌注引起的剪切应力的影响。 王等人介绍了另一种使用配备有可灌注微柱阵列的MFBs的方法，其中hiPSC衍生的肝类器官可以在长期培养中维持。他们的MFB是使用软光刻制造的，包括图案化的微柱和进出口端口，如图3所示。对肝类器官生长的分析涉及检查从第0天到第30天测量的平均直径的尺寸分布，如图2D所示。这些数据表明，类器官的分化进展与平均大小之间存在正相关。此外，与图3E中看到的静态培养相比，肝类器官在芯片上的灌注培养条件下表现出增强的细胞活性。这是通过第30天的活性半胱氨酸蛋白酶3的IHC染色确定的。定量分析揭示了静态培养中类器官内大量细胞死亡，大约12%的细胞显示出半胱氨酸蛋白酶3阳性染色（见图3F）。相比之下，使用MFB系统中的灌注培养可以提高细胞活性，这通过在动态环境中生长的类器官中半胱氨酸蛋白酶染色的显著减少来指示。 图 3. 使用简单的3D可灌注芯片系统从hiPSCs原位生成肝类器官的示意图，以及在芯片系统中hiPSC分化为肝类器官的特征分析。(A) hiPSC衍生的肝类器官体外分化过程。(B) 肝类器官芯片系统的配置。(C) 在肝类器官生成的不同阶段获得的球状体的代表性显微图像。比例尺：200微米。(D) 使用在芯片上生成的肝类器官的平均直径分析尺寸分布。(E) 在灌注或静态培养条件下，第30天肝类器官中凋亡细胞（绿色）的活性半胱氨酸蛋白酶3的免疫染色。比例尺：50微米。(F) 至少来自五个不同组织的类器官中半胱氨酸蛋白酶3阳性细胞百分比的定量分析。** p < 0.01，使用双尾学生t检验。经Wang等人许可转载。 使用MFBs培养类器官的优势的额外证据可以在Achberger等人进行的研究中找到。他们制造了一个MFB，被认为是一种视网膜芯片（RoC），以一种更接近生理条件的方式培养视网膜类器官（RO）和视网膜色素上皮（RPE）（见图4）。在这项工作中，在两个光刻PDMS晶片之间放置了一个多孔聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）膜，底部的一个包含培养基灌注通道，顶部的一个包含用于容纳RPE和RO的井。首先，在井底部的PET膜上涂覆了层粘连蛋白。随后，RPE种植在其上方并允许粘附到膜上。接下来，ROs放置在与RPE融合的膜上，每个井中添加了基于透明质酸的水凝胶。最后，培养基以20 µL/min的速率通过MFB灌注。他们的结果表明，与传统的静态培养条件相比，使用MFB平台形成外段的数量大约增加了三倍。有关更多详细信息，请参见图4。 图 4. 视网膜芯片。(A) 人类视网膜组成和体内细胞类型的示意图。RPE，视网膜色素上皮；(B) RoC（视网膜芯片）的照片（左）和RoC中RO（视网膜类器官）感光细胞和RPE相互作用的艺术家描绘（右）。(C) （上）RPE细胞被播种到装置中，（中）在培养24小时后形成密集的单层。（下）ROs和基于透明质酸的水凝胶直接从顶部装入到RPE上的井中。(D) 电子显微镜图像的代表性示例，展示了在RoC中培养7天后（上）的RO表面形成的类似外段的结构（箭头），在没有RPE的RoC中（中），或在培养皿中（下）。(E) 在RoC中与RPE一起培养181天后再加7天的RO的类似外段结构的高倍放大图像，显示了有组织的膜盘。(F) 每100微米RO周长上的段数比较RoC、没有RPE的RoC和培养皿培养的RO。* p < 0.05。比例尺表示(D) 5微米和(E) 1微米。经Acheberger等人许可改编。 3.4.MFBs在类器官培养方面的限制 尽管MFBs提供了诸多优势，但多重限制和相关挑战阻碍了它们的广泛应用。按照设计，需要复杂的结构来控制流体流动并产生最佳条件，这使得MFBs的制造变得困难且耗时。此外，生物反应器制造过程中使用的一些材料可能并非完全生物相容，可能会随时间降解，倾向于吸附和粘附不需要的生物分子。这些问题可以改变细胞行为，产生有害的副产品，并减少流体流动，这可能对类器官培养的成功产生不利影响。MFBs最突出的限制与其基础组件制造有关。例如，软光刻成型涉及在PDMS上图案化2D微特征，通常需要光刻胶模具制造。行业标准方法涉及使用光刻胶树脂（环氧树脂）在晶片（硅、石英）上形成模具，以实现高特征分辨率。这个过程需要洁净室、预处理设备（光罩制造、晶片准备）、专业的投影设备（UV、X射线、电子束）以及后处理（开发、清洁、表面处理）。尽管一些公司提供这种制造，但单位模具的价格高且根据图案复杂性和使用的材料而大不相同。此外，设计MFBs通常是一个需要多次修改以实现期望结果的迭代过程。因此，使用软光刻方法通常不可持续。 希望将MFBs纳入其工作流程的研究人员可能会遇到由于需要专门的知识和能力来制造或操作大多数定制或商业可用的MFB平台而造成的访问障碍。同样，由于需要保持流体动力学的精确控制并确保许多设备之间的一致性，扩大这些系统的规模进行更大规模的实验仍然是一个挑战。此外，长期实验可能会因为与环境的长时间接触而受到污染，主要是如果设备没有得到适当的密封或灭菌。因此，需要耗时的清洁和灭菌小型、复杂组件的程序，并带来额外的维护问题。 成功的长期类器官培养需要不断监测培养条件，并定期或持续评估类器官的发展和成熟。然而，MFBs的复杂性常常妨碍了快速且重复确定培养状态的能力，需要耗时的干预，通常包括从灌注系统中断开连接和从设备中移除培养组织。这种方法的替代方案将涉及额外的设备或技术，如专用传感器或原位显微镜；然而，这些通常昂贵和/或难以集成。此外，总体成本可能令人担忧，因为定制设备的制造或商业MFBs的获取可能很昂贵。如果生物反应器需要持续的设计修改、专有材料如低污染连接器，或者昂贵的消耗品如过滤器、试剂和培养基，尤其令人担忧。 4.旋转壁容器 旋转壁容器 （RWVs）起源于clinostat，这是一种可以使物体在轴（或多个）上旋转的装置，最早在19世纪初开发用于植物培养。RWVs最初由NASA开发，其工作原理类似于clinostat，它们使用圆形或圆柱形容器的旋转来产生低剪切混合和模拟微重力。RWVs通常有两种类型，一种是慢速转动侧壁容器（STLV，圆柱形）或高宽比容器（HARV，圆形），如图1C所示。已经证明，在任何类型的RWV中，细胞培养（细胞/细胞组装和培养液）与整个容器的同步旋转允许容器内液体的“整体”旋转，这导致这些生物反应器特有的温和、低剪切混合，同时也创造了模拟微重力的连续翻滚运动。STLV和HARV主要由于它们的整体形状和气源不同，STLV中的中央圆柱形氧气器和HARV壁上的气体渗透膜。它们还不同在于STLV可以容纳更大的体积，通常包括向生物反应器中/外持续灌注培养基。相比之下，HARVs提供更多的氧合，因此是类器官培养的首选设备，而STLVs经常用于需要精确控制氧水平的培养（例如，缺氧）。 4.1. 在类器官培养中的应用 RWVs对细胞培养和特别是类器官培养有多种好处（见表3中的示例）。作为RWVs最关键的方面之一，低剪切环境中混合的显著增强导致细胞性能提升。例如，通过在RWV中培养细胞，与搅拌瓶培养相比，人类细胞系中的重组蛋白产量增加了七倍。虽然传统的搅拌瓶也增强了细胞的营养可用性，但这些瓶中的高剪切环境对细胞造成了足够的损害，降低了它们的活性。关于RWV设计的多种变体，通过建模和实验，已经证明RWVs中的流体剪切应力明显低于其他类型的混合容器。RWVs中的低剪切混合对类器官培养至关重要，因为随着球状体的增大，它们往往会因为营养供应不足而发展出一个坏死核心。增强的培养基混合有助于缓解这种情况，但只有在不引入高剪切的不利影响的情况下才能实现。这种较低剪切的一个限制是，它可能限制了细胞的质量传输，从而限制了营养的可用性。 RWVs在类器官培养方面有多种特定用途。首先是球状体形成，通常通过在RWV中高密度培养细胞并允许它们自聚集来完成。RWVs中球状体的形成已经得到了很好的记录，显示了随时间的初始聚集和生长。另一个用途涉及体外扩增多能干细胞。一个挑战是，传统的2D干细胞培养通常需要昂贵的培养基和昂贵的基质来涂覆组织培养塑料以增加细胞粘附。RWVs可能是在悬浮中生长大量干细胞的有效工具，同时保持多能性，因为悬浮培养消除了对昂贵基质蛋白作为细胞培养基质的需求。Rogers等人在55 mL商业RWV系统中使用廉价的基于明胶的微载体培养人类间充质干细胞（hMSCs），以帮助胚状体培养。他们证明，使用7.5%明胶甲基丙烯酸（GelMA）微载体在RWV中，hMSC细胞群体在八天内可以扩大16倍。细胞保持了它们的脂肪生成和成骨分化能力，以及它们的免疫调节潜力。因此，RWVs已经成功地提供了一种不需要昂贵基质蛋白的可扩展的干细胞扩增方法。 使用RWVs将类器官分化为特定组织类型已经得到了广泛研究。例如，Wilkinson等人使用小型（4 mL）HARV型RWV通过将胶原蛋白包被的海藻酸盐珠和iPSC衍生的肺成纤维细胞或胎儿肺成纤维细胞播种到RWV中，并允许类器官自组装成复杂结构，来开发肺组织类器官。在这种情况下，使用RWV有助于形成用于疾病建模和药物筛选的肺组织模型。在另一项研究中，DiStefano等人尝试在RWV培养中生长视网膜类器官。在静态悬浮培养条件下进行10天的初始3D球状体形成后，一些新生的类器官被转移到生物反应器中，而对照组留在静态悬浮培养中。RWV中的类器官生长速度明显快于静态培养中的类器官，并且成熟得更早，如图5所示。具体来说，RWV类器官在第25天显示出的成熟度在对照组中直到第32天才能看到，减少了一周所需的培养时间。RNA-seq转录组分析被用来确认在RWV中维持的类器官的基因表达模式与体内视网膜的早期时间点相匹配。作者推测，增强的氧气、营养和废物交换导致了更快的生长和成熟。 图 5. 不同培养条件下类器官的生长。(A) 整个分化过程中的视网膜神经生长曲线。每两天测量一次每个类器官的最大横截面积（单位：微米²）。SSCi，静态悬浮培养中的完整类器官；SSCd，静态悬浮培养中的解剖神经视网膜；RWV，旋转壁容器生物反应器中的解剖神经视网膜。数据来自三次独立的生物实验（n = 3；每次实验量化三个类器官），并以均值 ± 标准误差表示。* p < 0.05 表示 SSCi 与 RWV 之间；# p < 0.05 表示 SSCi 与 SSCd 之间；t p < 0.05 表示 SSCd 与 RWV 之间。(B) 神经视网膜（NR）的形态，显示分裂细胞。磷酸组蛋白 H3（PH3，绿色）是增殖细胞的标记。细胞核用 DAPI（蓝色）染色。显示的是代表性图像。箭头指示与 PH3 相关的免疫染色。AP 显示类器官的顶端。比例尺：左侧 500 微米，右侧 50 微米。经 Distefano 等人（2018 年）[65] 许可转载。 4.2. 微重力模拟 最初，RWV 生物反应器是由 NASA 开发的，作为可能在地球上模拟微重力的细胞/组织培养场所。尽管这篇综述中之前的讨论集中在对一般类器官培养的益处上，但重要的是要记住，如果使用得当，RWV 还将产生约等于某些减少重力方面（约 10-3 × g），也称为“模拟微重力”（SMG）的类似物。例如，神经/神经内分泌 PC12 细胞（来自大鼠肾上腺肿瘤）已在 SMG 条件下进行了广泛研究。在对神经内分泌相互作用的进一步研究[67]中，在将单个细胞播种到 RWV 后，细胞聚集形成神经内分泌类器官，这些类器官被培养了长达 30 天。在 RWV 中 SMG 一天后，与静态条件（VueLife@ 袋子）相比，包括 ERK、p38 和 jnk 信号通路以及肾上腺素酶 PNMT 在内的几个通路被上调。在不同条件下培养 30 天后，将类器官皮下植入小鼠。只有在 RWV 中培养的类器官发生了显著的血管化。这项研究试图解释剪切应力和混合与微重力的效应。值得注意的是，在与 RWV 相同剪切应力的搅拌生物反应器中培养的 PC12 确实聚集了；然而，它们并没有显示出 RWV 培养类器官中的分化和组织。这些结果表明，微重力的效应可能独立于流体混合的效应。这一观察让人想起 Lelkes 实验室在 RWV 生物反应器动态环境中培养的神经内分泌类器官的早期研究，表明在 RWV 生长环境中的类器官中血管生成因子（例如，VEGF）的上调（见图 6）。在这项研究中，与静态悬浮培养相比，在 HARv 中生长的类器官看到了显著更多的血管化。 图 6. 在 RWV 中动态培养后植入小鼠模型的神经内分泌类器官中增强的血管生成。Bag：在组织培养袋中静态对照培养。HARV：在 HARV 型 RWV 生物反应器中动态培养。（上）使用与 FITC 偶联的 Griffonia simplicifolia 凝集素（绿色）标记血管的整个类器官成像，与相差（左）叠加。HARV 条件下显示出更密集的血管。（下）来自 Bag 和 HARV 条件类器官的切片的荧光成像，显示出 HARV 条件类器官中更好的形成的血管。经 Lelkes 等人许可转载。 4.3. 限制 尽管RWVs对类器官培养具有潜在优势，但存在一些限制，首先是对用户能力要求相对较高。细胞播种和培养基交换需要特别小心，以避免向容器中引入气泡。计算模型显示，RWV中存在一个气泡可能会产生相对于周围环境显著升高的局部剪切力区域。这是因为气泡倾向于停留在RWV的顶部，而液体继续围绕它旋转。由于它们的有害影响，从设备中去除任何气泡是必要的。去除气泡的一种方法是使用最近描述的“气泡隔离”HARV型RWV（见图7），在其中气泡不断地被隔离在一个沿着HARV总周长约80%的细外部同心通道中，并由一个细入口与主体连接。这种设计可以由低成本材料定制构建。此外，这种设计的变体将灌注纳入HARV，因此使用气泡捕获设计。通过不断地将来自更大储液器的培养基混合到HARV中，这种设计减少了频繁更换培养基的需求，简化了最终用户的操作。这对于将来可能需要扩大规模的项目尤为重要。 图 7. 新型气泡隔离生物反应器。(A) 无气泡时传统 HARV 设计的计算流体动力学（CFD）。(B) 无气泡时气泡隔离 HARV 的 CFD。(C) 由于存在气泡（箭头指示），传统 HARV 的 CFD 显示流体流动受到显著干扰。(D) 存在气泡（箭头指示）的气泡隔离 HARV 的 CFD。气泡被隔离在通道中，导致没有流动干扰。(E) 在传统设计中形成后带有气泡的球状体，显示小型、破碎的球状体。比例尺 2.5 厘米。(F) 在气泡隔离设计中形成后带有气泡的球状体，显示大型、形态良好的球状体。经 Phelan 等人许可改编。 用户的另一个挑战是确定正确的速度，以保持固体体旋转和RWV内类器官的连续自由落体之间的平衡。基于聚集体/类器官的大小/密度及其在容器中的沉降系数，最佳低剪切旋转所需的确切速度会有所不同。对于均匀培养，随着时间的推移，类器官的大小会增加，必须随着时间增加旋转速度以保持上述平衡。例如，DiStefano等人表明，他们需要在两周内将RWV旋转速度从20提高到27 RPM，以在视网膜类器官生长时保持固体体旋转。然而，对于在RWV中类器官大小和密度显著不同的异质类器官培养，可能无法找到一个适合所有颗粒的旋转速度。 RWVs的最后一个限制是它们设计内在的，即微重力模拟。虽然RWVs可以并且已经用于模拟各种组织中的微重力效应（如前所述），但用户必须考虑，当微重力模拟不是研究的预期焦点时，SMG环境实际上可能对培养产生有害影响。SMG的一些记录效应包括改变心脏细胞中的钙处理，减少软骨形成，以及干扰细胞分化途径，例如在SMG中进行的成骨分化期间成骨标记ALPL和OMD的下调。因此，必须设计适当的对照，以确定在RWV中培养的细胞的任何变化是由于增强的混合、低剪切应力还是微重力模拟。然而，由于SMG效应可能对特定的细胞和组织类型有害，并非所有类器官都适合在RWV中培养，特别是肌肉骨骼类器官，除非目的是研究SMG对那种组织的影响。 5.电刺激生物反应器  电刺激（ES）生物反应器在这里被定义为能够为在设备内培养的细胞和类器官提供某种类型ES的任何生物反应器。尽管向细胞提供ES有几种方法，如电容耦合和感应刺激，但最常见的方法是直接刺激。这涉及将电极直接插入感兴趣的细胞的培养基两侧，如图1D所示。使用这种方法，电流可以直接通过细胞和类器官/组织。一些组织被认为是“电刺激可兴奋的”，包含可以响应或产生电信号的细胞。体外培养的一些组织已经从外部电刺激中受益，作为调节生长、分化和成熟的一种工具。这些的一些示例可以在表4中找到。 在那些可兴奋的组织中，最重要的是神经组织（包括视网膜和其他周围神经组织）和肌肉（包括心脏组织）。心脏内源性电场有助于细胞分化、定向、增殖和各种信号因子的上调。在器官/组织层面，电场有助于组织和细胞的模式形成。 ES生物反应器系统在设计和使用的材料方面有所不同，但大多数包含相同的基本组件，即电极和一些专门提供刺激电力的系统。在大多数情况下，电刺激不是连续传递的；相反，它是使用特定频率、持续时间和幅度的电脉冲传递的。虽然一些ES生物反应器设计是基础的，即基本上由感兴趣的细胞/类器官两侧的两个电极组成，但一些设计可能更复杂。多电极阵列（MEAs）已广泛用于刺激和记录来自细胞单层的电信号，但最近已开发出用于向脑类器官提供ES的变体。这些最近的MEA发展集中在创建一个更复杂的3D MEA，能够在不刺激整个类器官的情况下刺激类器官的特定区域。 5.1. 类器官电刺激 ES的应用有助于可兴奋组织类器官的分化和成熟（见表4）。例如，干细胞衍生的心肌细胞在标准体外培养条件下无法完全成熟，因为它们缺乏成熟心肌细胞在体内的增强形态、电生理学、钙处理、收缩性和代谢。电刺激是用于增强3D类器官中心肌细胞成熟的方法之一。使用心脏胚状体/类器官，一项研究使用了一个定制的生物反应器，由嵌入到PDMS（聚二甲基硅氧烷）井侧面的碳棒组成（见图8A）。在分化的第23-30天，类器官受到电刺激，使用5 V/cm的幅度和2 ms脉冲，频率为0.5、1或2 Hz。总的来说，ES导致心脏基因表达和细胞-细胞连接的增加，如图8中总结的数据所示。此外，随着频率的增加，作者报告了对更高频率跳动的适应。对于2 Hz，停止ES后，类器官继续自发收缩在2 Hz或接近2 Hz，而非刺激的类器官表现出更慢的自发收缩。此外，在2 Hz条件下调节类器官使它们能够在3 Hz刺激下存活，而非调节的类器官在3 Hz ES下存活率降低。在另一项研究中，将刺激频率从1 Hz增加到2 Hz导致由hiPSC衍生的心肌细胞形成的心脏类器官中心脏肌钙蛋白表达和肌节组织的增加。 图 8. 用于电刺激的PDMS微生物反应器。(A) 微生物反应器设置示意图，显示嵌入PDMS中的碳棒电极。横截面视图显示PDMS井边缘的电极，中心有用于类器官的空间。细胞在特定频率下接受ES处理7天。(B-G) 通过免疫染色测量心脏分化和成熟标志物的量化，包括肌钙蛋白T（B）、连接蛋白43（D）、肌节计数（F）、肌钙蛋白I（C）、间隙连接蛋白α1（E）或肌蛋白（G）的qPCR。所有误差条显示均值的标准误差（SEM），* p < 0.05。经Eng等人许可改编。 虽然这些研究试图确定ES是否会增强心脏类器官的成熟，但ES也已被用于诱导早期心脏分化。例如，Ma等人使用IonOptix C-Pace商业刺激系统，在类器官形成后七天开始ES，并观察到在ES开始后仅两天就出现了跳动的心脏类器官（与无ES的7天相比）。在ES培养2周后，与对照组相比，自发的钙离子通量增加，使用受心脏肌钙蛋白报告器控制的工程化GCaMP钙指示剂观察到这一点。有了ES，表达心脏肌钙蛋白和Nkx2-5细胞的比例增加，许多离子通道和心脏转录基因上调，通过RNA-seq分析显示。作者得出结论，电刺激本身，即不使用任何外部化学信号，可以改善早期心脏分化。 ES生物反应器也已被用于增强神经类器官的培养。旨在刺激从小鼠皮层神经元培养的皮层脑类器官，Zhang等人设计了一种交错电极系统，如图9[89]所示。该系统被用于对野生型（WT）和神经调节蛋白1基因敲除（NRG1-KO）神经类器官施加ES。比较了有无电刺激的WT和NRG1-KO系。ES暴露导致NRG1-KO类器官的神经突数量和长度改善，并增加了突触形成标志物的表达，包括NCAM和PSD95，表明ES能够挽救表型并促进功能障碍神经元的发展（见图9了解更多细节）。 图 9. 电刺激对初级神经类器官的影响。(A) 使用3D共聚焦成像拍摄的MAP2免疫荧光图像。条件为WT（野生型）、NRG1（神经调节蛋白1基因敲除）、WT ES和NRG1基因敲除后进行ES。所有细胞均为小鼠前额叶皮层的初级神经元。(B) 量化的神经突长度 (C) 神经元数量。(D) 每个聚集体的细胞数量。* p < 0.05 与野生型基线相比；** p < 0.01 与野生型基线相比；*** p < 0.001 与野生型基线相比；# p < 0.05 与NRG1-KO基线相比；## p < 0.01 与NRG1-KO基线相比；### p < 0.001 与NRG1-KO基线相比。误差条表示标准误差（SEM）。经Zhang等人许可转载。 Sefton等人研究了电刺激对由小鼠神经前体细胞形成的神经球的形成和分化的影响。使用由铂丝制成的电极，他们发现体外刺激增加了细胞存活率和形成的神经球大小。此外，电刺激导致显示神经元和少突胶质细胞标志物的细胞比例增加，而表现出星形胶质细胞标志物的细胞比例下降。这表明电刺激可能影响神经细胞在早期阶段的命运决定。 5.2. 商用系统与定制系统 已有多种商用设备用于细胞和类器官的电刺激；据我们所知，最常见的系统是IonOptix公司的Culture Pacing System (C-Pace)。该系统包括一系列使用碳电极的定制组织培养板，这些电极从板盖延伸至培养表面。这还包括用于创建ES脉冲的信号发生器，这些脉冲已被用于提供ES至定制电极。具体来说，IonOptix系统已在多项使用ES培养类器官的研究中使用，因为它作为即插即用解决方案，用于为细胞/类器官培养提供ES的便利性。然而，一些研究人员更倾向于开发完全定制的ES设置，本文前面提到了一些。选择这样做的原因可能包括能够进一步定制系统，包括使用不同的电极材料、不同的培养容器，以及对刺激参数更具体的控制。此外，定制设计的系统可能允许纳入商用系统中没有的功能，例如添加培养基灌注或结合电刺激和机械刺激。另一个因素是成本，因为许多定制系统可以内部制作，成本相对较低。如上所述，最基本的ES系统主要只涉及将电极插入组织培养板，这可能以非常低的成本完成。 6.讨论/未来展望  生物反应器在体外培养类器官方面变得越来越有价值。与传统的静态培养相比，生物反应器更能支持许多组织类型的类器官的生长、分化和成熟。此外，先进的生物反应器技术已开始解决类器官培养固有的许多问题，例如为更大的3D组织构建物提供足够的氧气和营养物供应。我们讨论的大多数生物反应器的主要目的，即搅拌式、微流控和旋转壁容器生物反应器，是为更大的类器官和其他组织构建物提供所需的增强混合和质量传递。实现这种质量传递的方法在不同的生物反应器技术之间有显著差异，每种生物反应器技术都有其优点和缺点。搅拌生物反应器（SBRs）提供的简单性降低了进入门槛，吸引了来自不同研究领域的研究和研究人员。然而，这种简单性可能阻碍了一些用户引入修改（例如，连续灌注和局部应用试剂/生物分子）的能力。微流控生物反应器（MFBs）提供的控制水平允许用户精确调节流体流动和组成（例如，试剂、生长因子）；然而，高制造成本、操作复杂性和维持无菌性的挑战限制了它们在类器官培养中的广泛应用。同样，旋转壁容器（RWVs）也允许调节流体流动，并有提供模拟微重力环境的额外好处，但它们也遭受了一些与MFBs相同的挑战。 电刺激在这里有点不同，因为许多电刺激设置不提供任何介质混合或流体流动。这些平台的主要目标“只是”提供电刺激。然而，这让我们想到了我们认为类器官生物反应器技术中缺少的一个方面：组合生物反应器。很难找到任何设计用于提供多种类型刺激的生物反应器系统的示例，这些刺激适用于类器官培养。事实上，有一些生物反应器，例如设计用于通过2D支架进行电刺激和间质流动的生物反应器。像许多其他生物反应器一样，这个生物反应器并不是为球形类器官培养设计或优化的。未来研究结合多种技术，如带有嵌入式电极以进行刺激和电监测的微流控装置，可能对类器官培养有所帮助。我们认为生物反应器技术中缺乏的另一个值得注意的方面是缺乏为类器官提供机械压缩/张力刺激的生物反应器。这可能的一个原因是大多数类器官培养发生在悬浮中。然而，尽管许多体外组织构建物和细胞已被证明从机械刺激中受益，但这些通常在缺乏我们先前所述的类器官结构和功能要求的2D或基本3D构建物上进行。 我们已经讨论了各种不同生物反应器的商业和定制版本。需要注意的是，尽管定制的生物反应器通常代表着与商业销售系统相比成本显著降低的替代方案，但它们也带来了自己的挑战。这些挑战始于生物反应器的构建，特别是关于材料选择。当准备与细胞培养直接接触的材料时，重要的是确保材料对细胞兼容，并适合长期暴露于细胞培养条件。虽然商业生物反应器可能利用聚苯乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯和玻璃等材料，但这些材料在实验室环境中代表着重大的制造挑战。相反，大多数定制的生物反应器是由相对容易制造的如亚克力、PDMS和3D打印材料制成。然而，这些定制生物反应器的灭菌可能是一个挑战。虽然商业设备通常是一次性使用并销售无菌包装，或设计为可高压灭菌的，但实验室制造的生物反应器必须通过其他方式进行灭菌。虽然微流控生物反应器常用的玻璃和PDMS可以高压灭菌，亚克力和3D打印材料必须使用乙醇、氢氧化钠或微波炉的协议进行灭菌，正如其他地方所描述的。在灭菌输入/输出端口和连接器时必须小心，因为这些通常是污染的来源，特别是在长期培养中。尽管存在这些困难，定制的生物反应器通常代表着低成本和更易接近的替代昂贵的商业解决方案。由于它们在设计上的灵活性，与商业生物反应器相比，它们提供了更大的控制和定制。 我们期望在未来看到显著发展的一个领域是将更先进的基因工程方法纳入类器官培养。虽然类器官发展中肯定有一些使用基因编码荧光标记的例子（如前所述），但它们的使用尚未普及。鉴于基因编码标记的许多优点，特别是在监测基因表达变化方面，以及新基因工具允许如此轻松地生成这样的细胞系，这些工具的使用在未来几年应该会变得更加普遍。同样，如单细胞RNAseq等强大的工具，允许更全面地测量基因表达，价格迅速下降；因此，它们可能会被广泛用于分析类器官培养。 虽然这篇综述讨论了许多目前正在用于生成和培养类器官的生物反应器技术，但重要的是要讨论这些类器官的一些潜在应用。从理论上讲，这篇综述中讨论的每一种技术进步都使该领域更接近于成功地将类器官技术用于移植、药物发现和治疗各种疾病的个性化医疗。允许更快、更便宜地制造类器官，并能更好地重现原生、健康和病变组织的技术，将有助于促进类器官在临床环境中的应用。然而，以这种方式使用类器官带来了许多重大的技术挑战。任何新的类器官系统都必须经过验证，以证明它与原生系统相当，并能够以可比的方式反应。来自不同患者的iPSCs的差异可能导致患者特异性类器官的质量变化。当使用iPSC衍生的类器官进行植入时，任何未分化的干细胞仍然存在肿瘤或畸胎瘤形成的风险。由于这些原因及更多原因，生物反应器代表着强大的工具，可以用来生成更一致的批次类器官，并且在它们在体内植入后的分化和可塑性方面更明确，从而带来更好的转化和临床结果。 总之，已经使用了各种生物反应器来改善类器官培养的许多方面，包括组织特异性类器官的存活、分化和成熟，以及多能干细胞的维持和扩增。使用生物反应器精细控制和操纵体外环境对于成功培养类器官至关重要。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

摘要：干细胞(SCs)在细胞治疗、组织工程学和再生医学以及药物和生物技术应用上有着巨大的前景。干细胞具有自我更新的能力，并且可分化为特定的细胞类型（取决于干细胞的分离来源）。然而，干细胞应用在临床上需要用到高质量和高数量的干细胞，这就需要干细胞的大规模扩大，然后有效且均匀的分化为功能性衍生物。传统的细胞维持和扩张依赖于利用塑料培养板和异种培养基的二维(2-D)培养技术，这种方法下，细胞扩大程度有限，且长期传代后，细胞往往失去克隆和分化能力。最近，干细胞扩增的新方法强调三维（3-D）细胞生长以模仿体内环境。本文献对近期使用二维和三维技术培养干细胞所涉及的球体、生物材料和生物反应器的最新进展提供了一个综合性的概要。此外，还讨论了实现细胞数十亿倍增长面临的潜在挑战。 1引言干细胞具有自我更新和分化为特定细胞的能力，并由其来源和分化程度来定义干细胞类型。多能干细胞能够无限制的自我更新和分化为体内200多种细胞中的任何一种。多能干细胞总共有两个来源。首先，胚胎干细胞(ESCs)是由着床前囊胚内细胞团衍化而来，其多能性由包括核心转录因子、八聚体结合转录因子4(OCT4)、性别决定区域Y-方框2(SOX 2)和抑制性突变体同源框(NANOG)的内在调控网络调控。第二，诱导的多能干细胞(IPSCs)是通过异位或升高表达对于诱导体细胞多能性必不可少的4种转录因子而获得的：OCT4，SOX2，Kruppel样因子4(KLF4)，和MYC原癌基因(C-MYC)。另一种类型的干细胞，间充质干细胞(MSCs)是从成人中如骨髓和脂肪组织或围产期组织，例如脐带、脐带血、胎盘和羊水等来源中分离出来的。MSCs以在塑料培养板上贴壁生长为特征，表现出克隆性生长。它们对间充质细胞表面标记物、CD 90、CD 73、CD 29和CD105表现阳性，对造血系标记物、CD 45、CD 34和HLA-DR表现阴性。与多能干细胞不同，间充质干细胞是多向潜能的，只分化为有限的细胞类型，如成骨、软骨和脂肪细胞。此外，其自我更新和分化潜力取决于其分离来源。此外，来自成人组织的间充质干细胞也会受到老化和可能改变遗传稳定性的环境压力的影响。与成人MSCs相比，从围产期组织中获得的MSCs具有更高的生长和干细胞生长潜力。因此，对干细胞的研究有助于阐明基本的生化和发育过程。他们也在体外疾病模型，组织工程学，再生医学和细胞治疗，以及药物应用方面显示出巨大的潜力。并且，干细胞还可用于药物的发现和开发。所有这些用途都需要高质量细胞的大规模生产。传统上，干细胞在二维(2-D)塑料培养板中以单层的形式扩增，常常需要未知或异种材料，包括但不限于附着基体，细胞因子和生长因子，以及血清。使用异源或动物源培养基可以潜在地传播病原体，并且由于所用材料批次差异，其培养重复性受限。单层培养需要通过常规传代来保持细胞的自我更新和潜能，这对于细胞的大规模扩张是非常低效率的。此外，二维附着改变了细胞的形状和几何结构，导致细胞变扁和细胞内细胞骨架和细胞核形态的改变，这反过来又改变了基因和蛋白质的表达。已有研究发现，细胞外基质(ECM)的组成和成分也能发出促进细胞分化的生化和机械信号。2-D培养技术和其应用已在大多数原始和已建立的细胞系中得到实践，并标准化用于从显微镜使用和细胞计数到研究疾病进程和药物检测范围内的分析性试验。值得注意的是，2-D培养已经被用于定向分化干细胞成多种特定细胞，包括成软骨细胞、成骨细胞、脂肪细胞、心肌细胞，平滑肌细胞和肝细胞。然而，二维培养往往导致功能衍生物的缺失。研究还表明，二维单层培养不能准确再现动物生理学，并证明不足以验证药物发现。总之，二维培养条件缺乏模拟干细胞微环境、动态和特定的三维(3D)微环境所需的复杂程度，而微环境负责调控体外干细胞的走向。在体内原生的三维微环境允许细胞、胞外基质组分和梯度营养、氧气、废物之间复杂的空间相互作用。三维微环境的影响是可以轻易在多能性干细胞中得到阐释：当注入另一个胚胎的内细胞团时，仍保持多能性，但由于外部诱因，在注射到动物其他部位时，干细胞自发分化为三个胚层。此外，在活体性腺、肠隐窝、毛囊和体内骨髓中也发现了支持多能干细胞的微环境，在此环境下，受体细胞释放信号控制多能干细胞持续自我更新或种系特异性分化。凭借体内微环境中的诱因，多能干细胞移植出微环境将导致其分化为不同细胞系的细胞。为了解决干细胞二维培养所面临的各种问题，开发了三维培养方法，通过体外模拟干细胞微环境的胞外基质的组成和稠度将生理相关性和仿生微环境相结合来控制细胞的命运。然而，三维培养干细胞的维持和扩大仍然是一个挑战，主要是因为需要为不同类型的细胞进行培养条件的优化和分析。因此，阐明重要的干细胞维持机制是有必要的，包括有助于干细胞进行均匀和可持续扩增的同时不丧失遗传稳定性或分化潜能的生物材料信号传递和机械力。近年来三维培养扩增干细胞，在数量和质量上已能够用于临床、制药和生物技术应用，本文聚焦在这些方面的进展。此外，我们将报告近期在二维培养方面的一些重要进展，因为这些技术在历史上导致了干细胞生物学的重大发展，并对早期的研究进行了回顾。总的来说，本文综述了多能干细胞的增殖和分化方面的最新进展。 2二维培养技术2.1 多能干细胞的维持与分化 2-D培养研究聚焦在未分化干细胞特有的自我更新状态-干性的维持上，维持通过外部因素进行，如细胞及其三维微环境间的机械力，可以转换成能够控制细胞形态和功能的生物线索。多能干细胞通常生长在涂有帮助附着的细胞外基质成分(如明胶、基质胶或胶原蛋白)或小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)饲养层的塑料培养皿上。小鼠胚胎干细胞可通过在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层或含有小鼠胚胎成纤维细胞释放的细胞因子-白血病抑制因子（LIF）的培养基中培养来维持它们的多能状态。然而，补充白血病抑制因子不足以维持人胚胎干细胞的多能性，还需要在培养基中添加成纤维细胞生长因子2(FGF-2)和转化生长因子β1(TGFβ1)。最近的证据表明，这些差异不是物种特异性的，而是发育差异性的。例如，人类胚胎干细胞和小鼠外胚层干细胞表现为扁平形态和低克隆性，而小鼠胚胎干细胞表现为三维凸圆形态，且单细胞克隆生长良好。最近的研究表明，通过在培养基中加入ROCK抑制剂以保护单个细胞免受凋亡从而提高细胞的增殖。已经提出在胚胎发育中有两个连续的多能状态，一个早期原始状态，之后是活化状态，各自派生出小鼠胚胎干细胞和人胚胎干细胞。原始多能干细胞是一种早期全能细胞，能够分化为胚胎外组织和胚胎组织，而活化细胞来自于发育更高的状态，只分化为胚胎组织。事实上，最近的研究已经证明人类胚胎干细胞在多能性上有能力从活化状态恢复到原始状态，这将大大提高人多能干细胞在培养时的增殖能力。此外，以下途径提高了胚胎干细胞的二维扩张： 使用成分明确和无异质的培养基和附着基质，分别如E8培养基和人源重组蛋白玻连蛋白。然而，由于二维培养方法扩增多能干细胞费力，成本昂贵，而且需要高水平的专业知识，所以多能干细胞的均衡扩张仍然难以实现。多能干细胞可分化为来源于所有三个胚层的细胞类型。一般来说，二维培养条件有利于多能干细胞的非特异性分化。然而，通过控制胞外基质、生长因子和附着基质的组成和组织，多能干细胞可以定向分化到特定的细胞系，这些物质可以发出决定细胞命运的机械信号。胚胎干细胞和诱导多能干细胞都可以使用类似的方案进行分化，但是，由于体细胞的本性和用于产生多能干细胞的方法，诱导多能干细胞表现出更大的变异性。在单层培养中使用特定的诱导培养基，胚胎干细胞已被定向分化为外胚层、中胚层和内胚层细胞类型，包括成熟的神经元和神经胶质细胞，成骨细胞，心肌细胞，肝细胞。单层培养的一个巨大优势是它允许对细胞的分化进行均匀的处理。因此，在利用合成基质进行二维培养和逐步地受控分化人类胚胎干细胞方面均取得了进步。例如，在单层培养中，使用MEF条件培养液然后再用激活素A和骨形成蛋白处理，胚胎干细胞被预先分化为包括心肌细胞的中胚层细胞类型的效率约为30%。不过，补加糖原合成酶激酶3和Wnt抑制剂可使胚胎干细胞向心肌细胞分化效率变为约80%-90%。同样地，分步策略也被用来分化胚胎干细胞，先分化为内胚层细胞，肝祖细胞，然后利用特定的生长因子分化为肝细胞。同样，使用补充了sonic hedgehog 蛋白拮抗剂以形成皮质样神经元的神经分化培养基，小鼠胚胎干细胞也被分化为外胚层细胞类型。 然而，分化的神经元是异质性的，在体外不能显示特定的神经元特征。尽管分化较快，但二维培养的胚胎干细胞分化时往往获得分化细胞的混合群体。2.2 骨髓间充质干细胞的维持与分化与多能干细胞不同的是，骨髓间充质干细胞是自然粘附的，不需要异种基质来附着在培养板上，尽管它们通常是在含有动物血清的培养基中培养的。然而，最近，无异种物质的特定培养基已可用于扩大培养骨髓间充质干细胞。当培养基添加可溶性因子时可以保持胚胎干细胞的干性，而确切的骨髓间充质干细胞自我更新的机制尚不清楚。然而，模拟体内的微环境，如缺氧(2%O2)，已被证明能增强骨髓间充质干细胞的干性，引起细胞显著增殖，而且在6周培养期内不丧失多样性分化潜能。 骨髓间充质干细胞在二维培养中的扩增效率很低。通常，细胞扩增是在多个组织培养瓶中生长以增加骨髓间充质干细胞大规模附着和繁殖的表面积。均匀的分布、生长和收获过程对于最大限度地减少异质性和提高细胞产量都很重要。在体外成功地培养骨髓间充质干细胞需要了解影响这些细胞增殖和诱导分化的信号通路。大量研究表明骨髓间充质干细胞在二维培养中分化为成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞以及心肌细胞。这通常是通过使用细胞特异性分化培养基来实现的及通过翻译和转录基因表达及胞外基质的组成进行评定。然而，骨髓间充质干细胞在单层中的扩张会导致表型的改变，使纺锤形的骨髓间充质干细胞在传代过程中表现出一种宽而扁平的形态，进而反过来改变细胞的命运和分化潜能。特别是，与利用球粒或球体进行高密度细胞培养方法相比，2-D培养的骨髓间充质干细胞软骨分化效率较低。尽管骨髓间充质干细胞在2-D培养中具有限制性，但骨髓间充质干细胞被报道分化为多种细胞类型，不仅有中胚层细胞，而且有外胚层系细胞，包括视网膜前体细胞和感光细胞，神经细胞，以及肝细胞样细胞和胰岛样细胞等内胚层细胞系。然而，在体外诱导分化往往不足以产生功能上有活性能力的细胞。例如，骨髓间充质干细胞向视网膜神经节前体样细胞的瞬态分化被报道，这表明骨髓间充质干细胞在扩大培养过程中可能被去分化。虽然骨髓间充质干细胞是一种很有前途的细胞替代和免疫调节的来源，但要应用于临床仍有必要提高其分化方式。3三维培养技术由于二维培养技术的固有问题，人们试图设计三维培养方法以更好地再现初始的微环境。因此，如图1所述，我们探索了几种方法在静态和动态条件下，利用各种含有或不含生物材料的三维培养系统来维持、扩展和分化干细胞。 3.1 静态三维培养3.1.1 球状体 最简单的三维培养方法之一是形成多细胞聚集体或球体，在没有补加物质的情况下，细胞和胞外基质之间进行三维相互作用。这些球体已被广泛应用于各种贴壁细胞类型，由强制或自发聚集技术形成，包括悬滴、旋转培养或悬浮培养中的低粘着培养板。球体由高度增殖、非增殖和凋亡细胞组成，氧气和营养物质向球体中心的扩散有限，导致低氧环境的加剧。由于球体的异质性，使得球状体被更多地应用于与同质细胞增殖进行比较，研究其复杂的三维细胞结构、细胞分化和肿瘤生物学。代表性地，多能干细胞通过形成称为胚状体(EBS)的三维球体来诱导分化，这种胚状体能够自发分化为所有三个胚层。通过在培养基中添加细胞因子或生长因子，模仿胚胎发育和促进异质分化从而诱导分化为各种特定的细胞类型。尽管如此，固有的异质性使定向分化的再现性和胚状体的高通量筛选技术复杂化。胚状体的大小和数量已被发现影响分化效率，如在心肌细胞和造血分化。研究表明，分化也可以通过变化胚状体的大小来控制。由于胚状体是由多种微环境组成，对氧和其他可溶性因子的利用率不同，细胞在胚状体中的位置可以差异性地调节细胞命运。此外，大的胚状体倾向于分化为内胚层和中胚层细胞类型，而较小的胚状体倾向于分化为外胚层。 与二维培养条件相比，三维球体培养从表型分析、肝细胞基因和蛋白质的表达以及细胞排泄胆汁代谢产物能力等方面提高了胚胎干细胞的肝细胞分化能力。胚胎干细胞的三维球体培养在内皮细胞管形成、功能胆管分化，肝祖细胞的植入潜能及造血分化中旁分泌信号发出等方面也有改善。总之，三维球体培养产生了胚胎干细胞的功能衍生物。然而，球体的长期悬浮培养常常导致细胞的聚集，由于在聚集体中营养物质和氧气的向里扩散和废物的向外扩散受到限制而导致坏死中心。与胚胎干细胞相比，短期球体培养已被用于间充质干细胞的维持和扩大。当传代培养回到2-D培养条件时，球体培养生长的骨髓间充质干细胞呈现未分化形态，与贴壁培养的骨髓间充质干细胞相比，胞外基质沉积提高，分化潜能增强。骨髓间充质干细胞在三维球体培养时克隆生长和多能性增强，并且miRNA表达提高，多能基因，OCT 4，SOX 2和NANOG启动子区的乙酰化作用增强。此外，短期培养3天的间充质干细胞球体表现出更高的抗癌因子和抗炎因子的表达，分别包括IL-24、TNFα相关的凋亡诱导配体，CD 82和TNFα刺激基因/蛋白6(TSG-6)和斯钙素-1。这些研究表明，三维球体培养可改善间充质干细胞的治疗性能。另一研究表明，球体培养的骨髓间充质干细胞对猪模型移植后的保留、存活和整合均有改善作用。然而，长期球体培养的骨髓间充质干细胞已经被证明能有效地诱导分化。 与单层培养相比，在三维球体中生长的骨髓间充质干细胞显示出更高的软骨分化，以及在体外和体内的成骨分化，并且大鼠颅骨缺损骨再生增强。利用这些方法进行大规模的干细胞扩大是很困难的，因为无法控制聚集体的大小，从而导致球体的聚集、球体坏死/凋亡，以及细胞增殖的抑制。这需要通过搅拌或掺入生物材料来尽量减少球体团聚，这将在3.2.1和3.2.2节中讨论。 3.1.2 生物材料天然和合成的生物相容性材料和生物降解材料可以提供各种生物信号和不同程度的机械强度。在体外培养时，生物材料已越来越多地被整合在一起以模拟干细胞生态位的生物化学和生物物理特性，从而帮助引导细胞自我更新或分化为特定的细胞系。天然生物材料的引入可能导致不同水平的诱导信号，细胞附着和支架完整性。天然生物材料，包括琼脂糖，纤维连接蛋白，1型胶原蛋白(Col1)，透明质酸(HA)，壳聚糖和海藻酸钠，也可以被功能化，但在体外更难控制，因为它们经常将生物信号传递给细胞。因此，生物材料可以帮助细胞维持与分化。然而，诸如批次间的差异性以及异种培养基成分引起疾病的可能性等问题限制了它们的使用。合成聚合物，如聚乙二醇(PEG)、聚-l-赖氨酸(PLL)、聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚己内酯(PCL)和聚-dl-乳酸-乙醇酸(PGLA)，随着交联基团的加入常被最终功能化。聚乙二醇聚合物可能是最常研究的，因为它们无毒，易被功能化，并且表现低蛋白质吸附，因此它们应用于人类生物医学是安全的。天然生物材料和合成聚合物正越来越多地被用作三维支架材料以维持、扩增和分化干细胞。具有可调力学性能的支架允许调控细胞活力、增殖和分化。限制在聚集体中心的细胞对氧和营养物质的可用性将导致休眠，并最终导致坏死/凋亡，通过这种方式，这种支架结构能够减缓对悬浮培养中干细胞的存活和生长有消极影响的细胞聚集现象。加入可溶性因子，如细胞因子或生长因子，或通过用于固着依赖性增殖的粘附配体进一步功能化，支架为用于干细胞自我更新和分化的胞外基质生产提供了构架。这些材料通过静电纺丝、溶剂浇铸、气体发泡、三维打印和自组装等多种技术形成了具有明显不同孔径、弹性、附着力和抗拉强度的支架。两种类型的支架通常用于干细胞的三维培养。首先，预制或刚性支架需要细胞播种，或细胞迁移到支架。由于基底刚度、机械信号和生物材料信号对干细胞的分化非常重要，因此这些支架常用于分化步骤中。第二类支架在支架形成时自组装包裹细胞。生物材料的自组装通常通过各种交联方法来促进达成。物理交联支架通常被称为可逆凝胶和可通过pH或温度的可逆变化形成，获得机械力弱的支架。而通过化学交联形成的支架则会产生共价键，倾向于形成机械力坚固的支架。由亲水生物材料制成的水凝胶支架模仿天然软组织完全水合化的胞外基质，所以通常被用于干细胞的培养。 水凝胶的组分也可以用药物、细胞因子和生长因子进行修饰，以支持细胞在体外的生长和分化以及细胞在体内的整合。水凝胶支架的尺寸限制了三维培养的规模由于在静置培养中营养物质的扩散问题。一般来说，在三维水凝胶支架中维持胚胎干细胞需要通过支架降解来进行类似于二维培养的常规传代。人多能干细胞在温敏性水凝胶中的培养，每隔5天传代一次，至50代以上，约95%的细胞群体保持多能性。同样地，诱导多能干细胞在高孔电纺聚苯乙烯三维支架上呈现聚集体生长，在无异种条件下无数代的细胞保持了多能性和分化潜能。然而，理想的三维培养系统应该在减少常规传代需要的同时支持多能干细胞扩大，因此也限制了细胞的操作。透明质酸底物常被用于支持多能干细胞的生长，因为透明质酸出现于胚胎发生过程中且在未分化细胞中高表达。另外，采用不同硬度的改性透明质酸水凝胶研究了三维培养条件下机械强度对胚胎干细胞的影响；通过模拟着床前囊胚内细胞团的微环境，胚胎干细胞在较软的水凝胶上生长最好的支持了胚胎干细胞在无饲养层和在小鼠胚胎成纤维细胞条件培养液中的增殖和多能性。在光聚合透明质酸凝胶中延长三维培养20天0传代的人胚胎干细胞保持了多能性和自我更新潜力，这表明3-D水凝胶提供了一个支持胚胎干细胞紧凑克隆生长的仿生微环境。 我们最近报道了用巯基功能化右旋糖酐(Dex-SH)和四丙烯酸酯功能化的聚乙二醇(PEG-4-acr)自组装的三维水凝胶对小鼠胚胎干细胞进行0传代维持培养达到超过6周以上。图2A描述了同时包封胚胎干细胞的自组装支架的形成原理，并在图2C-E对包封细胞的克隆生长进行了描述。有趣的是，胚胎干细胞的生长是独立固着的，因为支架缺乏粘附配体。此外，在培养的相当长一段时间内，生长在三维水凝胶中的胚胎干细胞内的三个多能性标记物OCT 4、NANOG和KLF 4的表达增强。在一些研究中也有类似的观测结果表明，维数和诱导生物材料信号都能影响胚胎干细胞的自我更新机制。例如，在用PGLA，胶原蛋白和壳聚糖制备的三种不同支架中培养的胚胎干细胞中，观察到了干性基因的差异调控，可上调OCT 4的表达，下调SOX 2的表达；而NANOG仅在壳聚糖支架中高度上调。综上，可以推测支架微环境在影响细胞-基质通讯中起着重要作用。三维培养的胚胎干细胞中多能性基因的上调机制值得未来继续研究下去。虽然在水凝胶支架中进行胚胎干细胞的三维培养有很大的发展前景，但进一步优化加入粘附配体和生长因子，可能有助于人胚胎干细胞的增殖。 通过在体外模拟生化和机械信号，应用三维支架分化胚胎干细胞衍生物可改善以下过程：软骨形成，成骨生成，造血作用，神经形成，心肌细胞分化和肝细胞增殖。例如，Col1支架与纤维连接蛋白联合诱导形成血管和内皮分化，而加入层粘连蛋白则导致心肌细胞分化。 在合成自组装肽支架和纳米纤维支架中的三维培养促进胚胎干细胞向成骨样细胞的分化。而添加明胶的纳米纤维PCL支架支持诱导多能干细胞的软骨分化[156]。与N-钙粘蛋白衍生肽(His-Ala-Val-Asp-Lle)结合的聚乙二醇水凝胶诱导小鼠胚胎干细胞的神经分化。经adhesive cue、RGD(Arg-Gly-Asp)序列修饰的藻酸盐支架支持胚胎干细胞和视网膜组织衍生物的视网膜分化。为了研究力学性能对细胞分化的影响，我们将胚胎干细胞植入预制的聚二甲基硅氧烷(PDMS)支架上，支架的高弹性使其能够将机械信号传递给细胞。同样地，PDMS支架可以用于研究基体弹性的影响以及压缩或拉伸力的应用(图3)。在三维PDMS支架材料中进行小鼠胚胎干细胞的三维培养，由于PDMS基质的弹性和压力的传导，导致了选择性软骨分化。PDMS生长的胚胎干细胞多能性标记基因表达水平下降，同时软骨祖细胞基因标记增加。我们评估了PDMS支架培养小鼠胚胎干细胞7天后施加24小时压力(0.05MPa)的影响。在PDMS中生长的胚胎干细胞在压力下表现出分化成成纤维样形态(图3C-E)。因此，仿生支架有助于研究用于组织工程和移植应用的胚胎干细胞衍生物的分化和生成过程。间充质干细胞成纤维样细胞形态与肌动蛋白细胞骨架的组织结构和粘着斑的分布密切相关。 尽管骨髓间充质干细胞的特征之一是在二维培养条件下贴壁生长，但对于在三维培养中附着的必要性存在着相互矛盾的报导。当支架与分别从纤维连接蛋白和层粘连蛋白衍生而来的粘着配体，RGDSP(Arg-gly-Asp-Ser-Pro)，和与IKVAV(Ile-Lys-Val-Ala-Val)序列在较小程度上结合时，光封装在非降解聚乙二醇水凝胶中的间充质干细胞表现出有所提高的存活率，这与在2-D粘附培养的间充质干细胞中的发现相似。应用补充有和未补充RGD序列的三维透明质酸水凝胶，研究了水凝胶支架中的间充质干细胞的扩散和增殖作用。骨髓间充质干细胞在两种水凝胶中均有增殖，但仅在RGD序列修饰的支架中观察到细胞的扩散。增殖受到基质硬度、交联密度、RGD浓度和随浓度的变化的支架降解速率的限制。然而，研究结果表明，即使没有细胞粘附配体，水凝胶降解显著提高了骨髓间充质干细胞的存活率。同样，我们观察到在Dex-SH/PEG-4-ACR自组装支架中的脐带来源的骨髓间充质干细胞(图4A)没有显示明显的增殖或骨髓间充质干细胞成纤维样形态(图4B-C)。用1型骨胶原蛋白纤维制备了dex-SH/PEG-4-acr自组装支架，粘附的Cy3标记的骨髓间充质干细胞显示成纤维样细胞形态，共聚焦显微镜下观察到了细胞增殖(图4D-E)。骨髓间充质干细胞的三维培养可以提高体内移植的适应性，促进体内免疫抑制的吲哚胺2，3-双加氧酶、IL-6、M-CSF、IL-10、转化生长因子β、HGF和PGE 2因子的分泌。据报道，培养的间充质干细胞能改善细胞植入的预后。例如，在三维骨胶原-支链淀粉水凝胶中生长的骨髓间充质干细胞可诱导分泌血管生成细胞因子，血管内皮生长因子-a(Vegf-a)和单核细胞趋化蛋白-1(Mcp-1)。水凝胶培养间充质干细胞移植物分化为成纤维细胞和内皮细胞，从而促进创面愈合和新生血管生成。封装在3-D 透明质酸水凝胶的骨髓间充质干细胞与巨噬细胞共培养后，CD 16和HLA-DR更低，CD 206表达增加，这显示其可能更适合用于移植。有趣的是，与在2-D培养条件下生长的间充质干细胞相比，三维维骨胶原-支链淀粉水凝胶中生长的骨髓间充质干细胞具有增强的自我更新能力和多能基因，OCT 4、SOX 2和KLF 4的表达。模拟体内微环境的三维培养条件也被研究以分化间充质干细胞。支架的机械刚度和载荷性能促进了骨髓间充质干细胞分化为不同的特定细胞系。例如，较软的基质诱导间充质干细胞分化为神经和β胰岛细胞，以及分化为软骨细胞和脂肪细胞，然而，增加基质刚度则支持间充质干细胞分化为成肌细胞和成骨细胞。更坚硬的基质也能增强整合素结合和诱导成骨分化。模拟接合作用的压缩力通过动力传导支架增加间充质干细胞中软骨生成基因的表达，诱导间充质干细胞向软骨细胞分化。 含有胶原蛋白的支架作为结缔组织细胞外基质的主要成分，已被用于分化间充质干细胞为中胚层细胞系，包括成骨细胞，软骨细胞和心肌细胞。骨髓间充质干细胞在模拟软骨细胞外基质的透明质酸组成的三维支架中培养分化为软骨细胞系。 骨髓间充质干细胞在机械性强的多糖-壳聚糖组成的三维支架中培养，促进其成骨分化。相反，脐带来源的间充质干细胞在软的3-D藻酸盐支架中分化为神经元。因此，对于诱导间充质干细胞分化为特定细胞系来说，优化三维支架的组成和力学性能是非常重要的。总之，通过利用机械信号、可溶性因子的空间梯度、细胞-细胞和细胞与胞外基质间的交互作用，现有的培养技术可提高维持和扩大间充质干细胞的三维培养。这些研究可以揭示基本的细胞生物学过程和机制。在静态培养中使用单个支架进行大规模细胞扩大仍是一个挑战。如果支架的大小增加，由于支架中的氧、营养物和废物的进出扩散，支架中心的细胞生长可能受到限制。往动态培养体系包括搅拌和流注灌注系统中补料的方法，目前正被用于控制培养条件，使体外生长更加均匀。3.2 动态三维培养治疗、制药和生物技术应用都需要大量的同质高质量细胞，传统的二维培养技术是不可行的。动态生物反应器有助于在高密度下培养细胞，使细胞生长可重复，并使在二维培养细胞扩大时最小化其可见的可变性。生物反应器中细胞的大规模扩大需要有明确的、规范化的培养条件，包括pH值、温度、溶解氧浓度以及代谢产物和废物的去除。在静态培养中，当细胞在高浓度下接种、还原氧和营养物质转移和大细胞聚集增加细胞死亡时，会发生细胞聚集。 生物反应器有多种设计，从单个细胞的扩大或分化到整个组织的培养均可广泛应用。由于成本低，使用方便，旋转瓶是最常见的，通过内部叶轮允许改变搅拌速度连续搅拌悬浮细胞。这种方法导致水动力剪切力，使细胞与氧气和营养物质混合，获得一个更均匀的环境，然而，过度的搅拌导致细胞死亡。因此，旋转壁容器被设计为通过水平旋转来限制剪切力，允许在没有内部搅拌机制的情况下进行培养混合。培养参数可以通过流量灌注系统来控制，使营养物和废物持续交换，与分批式生物反应器系统对比，由于时间推移，代谢物和废物积累，后者在规模上和培养时间长度上都受到限制。因此，必须定期更换培养基，以限制废物堆积的抑制作用，或者就必须在多个生物反应器中接种细胞以实现大规模的细胞扩大。最后，模拟组织生理学，利用压缩力和拉伸力的机械力生物反应器已经被开发出来，并且越来越多地用于接合组织为细胞分化进行工程构建。这些技术可以通过使用生物材料(即微载体和微胶囊)来进一步改良，如下文所述的，这些生物材料可用于高浓度悬浮培养的细胞的生长。总的来说，细胞的生长和命运取决于培养条件，包括细胞接种密度、培养基成分和生物材料的掺入。3.2.1 微载体微载体，约100-300μm的小珠，由各种材料组成，包括聚苯乙烯、明胶、葡聚糖和胶原蛋白，合成后具有多样的多孔性和形貌。悬浮培养中，它们为固着依赖型细胞提供了粘附表面。细胞在微载体上的粘附可以优化，以促进细胞的扩增或分化。微载体还限制了细胞的聚集，并为细胞生长到高密度提供了大量的表面面积，从而可以通过酶解离收集浓缩的细胞。旋转瓶和微载体的动态培养技术已被证明支持人胚胎干细胞向高密度增殖。通过在微载体表面包被粘附蛋白已实现多能干细胞的附着。纤维素微载体包被一类胞外基质蛋白-人工基底膜，被用于人类胚胎干细胞长期扩大和维持。纤维素微载体包被胞外基质蛋白，如玻连蛋白，层粘连蛋白或PLL，已被证明能促进干细胞的多能生长。事实上，在无异种无动物来源材料的条件下，在连续灌注生物反应器系统中观察到附着在微载体上的人类胚胎干细胞的生长速度增加了12倍。利用微载体进行三维培养的其中一个主要优点是可以利用分化培养基进行扩增和随后分化为特定的细胞系。利用微载体对人类胚胎干细胞进行更高质量的扩大，体现在其形成胚状体的效率比在二维培养条件下生长的细胞高10倍。微载体也被发现支持分化胚状体为血液血管母细胞，血液血管母细胞可分化为造血细胞和内皮细胞。胚胎干细胞向心肌细胞的扩大和分化都是通过使用微载体旋转培养技术实现的。 胚胎干细胞衍生的心肌细胞表达细胞特异性转录因子、离子通道基因和肌动蛋白。同样地，使用胶原蛋白涂层的微载体，胚胎干细胞首次扩大到45倍，然后利用分化培养基将其分化为内胚层细胞系，特别是胰岛细胞和肝细胞。然而，还不确定使用微载体分化胚胎干细胞是否是可行的。在其中一项研究中，用搅拌式生物反应器中的微载体培养胚胎干细胞，其衍生的肝细胞分泌的蛋白质水平低于原代肝细胞。在悬浮培养中，微载体也被研究以放大间充质干细胞的增殖。骨髓和胎盘来源的骨髓间充质干细胞已使用微载体在动态生物反应器中培养放大。然而，与在静态培养瓶中的扩大相比，细胞活力和增殖能力更低。在动态生物反应器中生长并在微载体3-胶原包被葡聚糖基微载体上扩大时，来源于不同骨髓供体的骨髓间充质干细胞表现出不同的增殖率，在二维培养中表现出类似的生长特性。开展了相似的研究，检测了不同的微载体，观察到了来源于不同骨髓样品的间充质干细胞在SoloHill塑料珠上培养时的可再生生长，这意味着生物材料信号在间充质干细胞的增殖中起着重要作用。因此，确定合适的微载体对间充质干细胞的扩大具有重要意义。此外，各种培养参数，包括氧浓度、搅拌速率和养分交换是实现间充质干细胞的更高增殖的重要考虑因素。人们对利用微载体分化骨髓间充质干细胞表现出相当大的兴趣[195，208-210]。数个报导表明微载体有助于间充质干细胞分化为成骨细胞系[195]和软骨细胞系[208，209]。事实上，可生物降解的聚已酸内酯微载体支持胎儿的间充质干细胞在体外向成骨细胞分化，与二维培养的细胞相比，在移植时表达更高水平的成骨基因和钙沉积和等效的骨形成。同时释放转化生长因子β3的微载体表现出可提高骨髓间充质干细胞的软骨分化。在另一项研究中，在微载体上接种的间充质干细胞移植到小鼠骨关节炎模型后，表现出更高的软骨再生。尽管利用微载体在生长和分化骨髓间充质干细胞方面取得了一些成功，对已分化的细胞的功能状态仍应进一步地进行研究。3.2.2微型胶囊与主要有助于细胞附着到珠子表面的微载体相反，微囊化是将细胞固定在半渗透性材料或膜内的过程，允许细胞生长所必需的营养物质、氧气和生长因子进行自由扩散。球形囊内细胞微胶囊化过程不仅可用于对抗悬浮培养中的团聚和剪切力，同时也能防止移植后的免疫反应。依据所用生物材料的组成和生长因子的掺入，微胶囊微环境可以被调控以保持干性或诱导干细胞分化。通常在乳化或挤压过程细胞被胶囊化，在细胞周围形成保护性胶囊，并允许细胞在囊内生长。海藻酸和琼脂糖是两种最常用的生物分子，分别通过光交联和温度依赖凝胶化进行包封细胞。软性海藻酸胶囊通常用机械性强的聚合阳离子(即壳聚糖、聚乙二醇、PLL)涂层来提高胶囊的完整性。此外，由于琼脂糖胶囊缺乏粘附性能，它们可以通过加入其他生物材料来改良，如胶原蛋白或明胶，以促进细胞的附着和生长。维持细胞种群的活性和多能性以及同质性，是大规模扩大胚胎干细胞的必要条件。防止细胞聚集和改善条件使得允许营养物质、氧气和生长因子扩散是非常重要的。琼脂糖中的微胶囊可防止细胞聚集，并且使胚胎干细胞生长更快，而不发生坏死。一般来说，多能干细胞的包被已被证明能保护细胞免受化学和机械力，包括水力的剪切力，这种剪切力对悬浮培养中的细胞活性有负面影响。包裹在海藻酸钙水凝胶微胶囊中的胚胎干细胞在无异种条件下生长能延长培养期，而且不影响细胞活性和多能性。包裹在藻酸盐珠子中的胚胎干细胞分化成能够产生胰岛素的β细胞。此外，胚胎干细胞也被分化为能够分泌白蛋白和尿素的肝细胞，这提示微胶囊有助于胚胎干细胞分化为功能性内胚层衍生物。同样，微胶囊化也促进了胚胎干细胞的中胚层分化。在PLL包被的海藻酸钠胶囊中生长的胚胎干细胞分化为高水平表达Nkx2.5和GATA 4的心肌细胞。然而，被包裹在用RGD序列修饰的PEGDA微胶囊中和HA水凝胶微囊中的胚胎干细胞支持被分化为软骨细胞。在磷酸钙骨水泥微囊中培养可促进胚胎干细胞的成骨分化，促进骨再生。藻酸盐三维培养可促进胚胎干细胞向外胚层分化，和经透明质酸修饰的海藻酸钠可提高胚胎干细胞向表达突触标志的神经细胞分化。总之，三维微胶囊培养扩大和分化胚胎干细胞被证明可能是组织工程应用中不可或缺的。 微胶囊化的骨髓间充质干细胞常用于免疫调节，移植后导致纤维化减少，炎症减少。因为骨髓间充质干细胞的扩大更依赖于固着，用粘着配体和或胞外基质组分对微胶囊进行改性可以促进细胞的扩增和分化。与静态培养相比，动态培养提高了藻酸盐微胶囊包裹的间充质干细胞的增殖。然而，间充质干细胞包裹在加有粘附配体的海藻酸钠中仍能存活，但没有增殖，这表明单独附着对细胞生长而言是不够的。当海藻酸钠包裹的间充质干细胞被施加压力而非剪切力时，它们分化为软骨祖细胞。间充质干细胞包裹在用RGD序列修饰的藻酸盐微胶囊中可持续释放转化生长因子β1，诱导其分化，增加软骨生成基因表达和体外基质沉积，促进体内软骨再生。用钙改性海藻酸钠微囊三维培养时，间充质干细胞优先分化为软骨细胞系，也可观察到胞外基质的生产增强。通过矿化海藻酸钠和PLL包被的海藻酸钠，以及胶原蛋白和琼脂糖改性胶原蛋白和壳聚糖微胶囊处理，微胶囊技术还被用于促进间充质干细胞在动态三维培养中的成骨分化。除分化外，为体内修复退行性组织的同时尽量减少免疫反应，微囊化间充质干细胞可能被证明是间充质干细胞衍生物的一种有利的细胞传递方法。与微载体和微胶囊结合使用的动态生物反应器具有提高细胞的质量和数量的潜力。但是，许多挑战依然存在，包括细胞聚集后的分化潜力，基因表达改变，流体动力剪切力的产生和培养的可变性。 因此，需要进一步的研究，将动态生物反应器与生物和工程组分结合用于获得干细胞最优的扩大和分化。 3.2.3 微流体无论在体积还是尺寸上都是小规模系统的微流体越来越多地被研究用于培养细胞。它们可以通过灌注培养基交换和可溶性因子的化学梯度来模拟活体微环境来进行单细胞分析。他们被用来研究细胞分泌信号和微环境对干细胞命运的影响。这些进展导致了整个器官系统设备的发展，如模仿人体的微环境的“器官芯片”。微流体可以控制可溶的微环境，而微环境又可以调节细胞间的自分泌/旁分泌信号，以及水动力流速引起的剪切力。在微流体中灌注培养4天，小鼠胚胎干细胞在更高的流速时增殖，但在最慢流速下不增殖。在无饲养层的微流体室中培养小鼠胚胎干细胞形成集落，并表现出增高的 LIF表达，几乎是高于在宏观培养条件下分泌的140倍，提示内源性信号可能在决定干细胞的命运中起着重要的作用。 当LIF分泌受到抑制时，胚胎干细胞优先分化为中胚层细胞系。通过改变培养条件、流速和增强外源的生长因子，微流体培养系统也可用于诱导胚胎干细胞的分化。缓慢流动的微流体支持小鼠胚胎干细胞分化为神经元样细胞和雪旺细胞样细胞。此外，不连续灌注培养中流速的变化允许胚胎干细胞直接分化为心肌细胞和肝细胞，这些细胞在微流控培养系统中表现出功能表型和对药物治疗的反应。与多能干细胞相似，微流控培养系统可用于骨髓间充质干细胞的小规模增殖和受控分化。采用微流体微团培养法连续灌流培养，骨髓间充质干细胞增殖34倍。随后，诱导生长因子的加入导致了骨髓间充质干细胞(MSCs)向同质软骨分化。恒定微流体灌注培养使骨髓间充质干细胞向肝细胞样细胞分化，这种细胞表达细胞特异性基因并能够摄取低密度脂蛋白，暗示功能性细胞。微流控装置中极低流体剪切力的应用诱导了间充质干细胞的细胞迁移和成骨分化。通过微流控装置中的动态拉伸和周向应变模拟活体血管力学生物学，导致间充质干细胞分化为血管样细胞。经过IBMX(3-异丁基-1-甲基黄嘌呤) 和流体剪切力处理的骨髓间充质干细胞向神经细胞分化增加了3倍。微流控培养技术尚处于起步阶段，但有望用于阐明生物过程、组织工程学和制药应用。总之，多种三维培养技术对干细胞的增殖和分化均表现出增强作用。如图5总结的期望的应用，每个三维培养系统都有各自的优缺点。一般来说，这些技术在复杂性和可控性上都存在差异。例如，球体的形成是一种非常简单的技术，在没有生物材料加入的情况下，可使细胞与胞外基质进行三维的相互作用。然而，球体培养会导致细胞群体和微环境的异质性，包括坏死/缺氧核的形成。生物材料的加入可通过模拟体内胞外基质诱导生物化学和机械信号转导来提高细胞的生长和分化。要确定三维支架的合适的生物材料和力学性能则必须针对每种细胞类型和应用进行优化。此外，由于批间差异，生物材料来源的支架可能导致重复性差。 生物反应器支持干细胞的大规模生长和/或分化。静态生物反应器受到在没有生物材料(微载体或微胶囊)的情况下细胞聚集和受到批量更换培养基的限制。相反，通过搅拌和培养基灌注分散复杂的均质培养基和细胞，可使得动态生物反应器高度可控。然而，这些方法成本高昂，而且细胞还受到引入可被使用生物材料而限制的水动力应力的影响。在大规模培养过程中，需要进行额外的优化，以确定理想的培养参数和细胞分析手段。4挑战自从人类胚胎干细胞分离以来，在利用选择性培养基了解其自我更新、多能性和分化机制方面取得了重大进展。同样的，间充质干细胞从不同的组织中分离、培养并分化为中胚层系。此外，用于临床目的，新的无异质培养基已被开发用以培养干细胞。 然而，在造血干细胞和祖细胞等其他干细胞的繁殖方面的进展仍然很少。即使是胚胎干细胞和间充质干细胞的扩大和分化也面临着许多挑战。这些挑战包括： 4.1 培养的细胞的不均一性2-D培养技术固有的低效性、劳动密集性和昂贵性，对干细胞的扩大有一定的限制。此外，2-D培养产生了各种各样的干细胞和衍生物。胚胎干细胞和间充质干细胞在2-D培养条件下有非特异性分化的倾向。即使干细胞定向分化成特定的细胞系，通常也只是部分地完成，而且分化的衍生物缺乏功能性。此外，在二维培养条件下扩张的细胞的生存、整合和功能受到限制。总的来说，二维培养的规模扩大是很困难的，在2-D培养条件下常常不能成功模拟体内微环境以进行干细胞的维持和分化。4.2 克隆生长克隆生长与干细胞的自我更新有关。干细胞克隆生长的下降表明干细胞的自我更新能力降低且干细胞的扩大受到限制，对于成体干细胞如间充质干细胞来说尤其明显。已经证明，传代降低了间充质干细胞的克隆性生长，增殖能力和自我更新潜力。单细胞分离后，人胚胎干细胞生存不良，丧失克隆原性，限制了增殖潜能。单细胞的同步克隆生长对于获得同质细胞群体是很重要的。因此，骨髓间充质干细胞和多能干细胞培养方面的改进对于这些细胞的大规模和长期扩大来说是必不可少的。4.3生物材料通过加入生物材料以模拟天然3-D微环境的生物化学和生物物理特性通常能促进三维培养。多种天然和合成生物材料被用来开发合适的支架来模拟细胞在体内生长的条件。然而，通常很难确定哪种生物材料对于特定类型的干细胞的生长和分化是最适合的。例如，在培养中使用不同的生物材料引起的变异性和下降的可重复性。生物材料也已知在可能影响干细胞的维持和分化的信号转导中起作用。因此，需要进一步的研究以找到能提高培养细胞的质量和数量的合适的生物材料。4.4培养条件优化尽管有关干细胞生长和分化的文献数量迅速增加，但缺乏标准的细胞培养方法。2-D培养方法操作简便，常见，但效率不高。我们需要努力开发三维培养系统，这一系统虽然效率更高，但涉及到许多参数，包括培养基组成、生物材料、机械力、氧含量、pH值和培养基灌注量，这些参数对培养细胞的质量和数量均有影响。此外，细胞的聚集和养分/废物交换的扩散对培养方法的标准化也是非常重要的。这会导致细胞群体的异质性、坏死和细胞增殖的抑制。最近在使用各种生物反应器扩大或分化干细胞方面的进展令人鼓舞。与静态生物反应器相比，动态生物反应器展现出更大的应用前景。然而，动态生物反应器采用搅拌或培养基灌注会引入流体动力学剪切力，对细胞活率产生不利影响。4.5 机能活动任何培养方法的其中一个主要考虑因素是培养的细胞应具有最佳的活力，并具有与体内细胞相当的功能活性。这些细胞也应该能够在体内存活并整合到组织中。暴露于低氧应激下的细胞在移植后表现出更容易存活。因此，细胞的再生应该是一个重要的考虑因素，优先于考虑用于临床的目的。此外，开发从干细胞中获得分化均匀的细胞的有效方法可能有助于产生可重复的结果，但具有挑战性。未来的研究应该集中在研究暂时性因素，利用适当的生物材料来设计专门用于干细胞的生长和分化的微环境来仿真模拟体内条件。4.6 培养规模化目前迫切需要为各种生物医学应用生产大量高质量的细胞。目前的细胞扩增方法生产了数百万个细胞，而这些细胞是对个别病人有限的自体使用。即使是这样，也可能没有效果，因为最近的研究表明，更高浓度的移植细胞更有效。同种异体细胞治疗的多中心临床试验需要数十亿到数万亿的细胞。将细胞规模扩大到这一水平需要在培养基、培养设备和技术方面取得重大进展。细胞大规模培养的一个优势是在临床试验中可用于多种患者的细胞治疗，并且其结果可以相互关联。然而，大规模生产系统涉及到生物反应器和GMP设施，需要生物医学研究人员和工程师之间的合作。此外，一些技术的结合，包括用生长因子或配体修饰的生物材料以及其他生长参数以最优地生长和分化干细胞成特定的细胞类型，对细胞治疗、组织工程和再生医学等领域的进一步发展是必不可少的。5结论最近，在干细胞培养方面，特别是在使用生物材料和生物反应器方面被报导取得了重大进展。这些三维培养方法不仅克服了二维培养相关的局限性，而且也有潜力扩大细胞到如临床试验，制药或生物技术应用需要的十亿倍。用生物诱导、生物降解和生物相容性聚合物模拟在天然微环境中发现的胞外基质、维度和空间梯度进行细胞三维培养，不仅有助于扩大和功能的改进，而且适合于干细胞的定向分化。需要生物反应器和GMP设施的细胞大规模生产将受益于生物医学研究人员和工程师之间的多学科合作。尽管面临挑战，三维培养系统的进步将为加速干细胞用于治疗许多无法治愈的疾病的治疗性应用提供动力。 图2. 绿色荧光蛋白(GFP)标记的小鼠胚胎干细胞在自组装支架上的三维生长。(A)自组装支架形成和封装小鼠胚胎干细胞的示意图 (B)自组装支架的图像，(C-E)分别代表荧光绿色标记胚胎干细胞在Dex-SH/PEG-4-Acr自组装水凝胶中生长2,7和21天的复合共聚焦图像。3-D培养的胚胎干细胞表现出无分化的克隆生长。标尺= 100 μm. 图3.GFP标记小鼠胚胎干细胞在预制PDMS支架中的三维生长。(A)涉及机械力(压缩力或张力)的预制PDMS支架中植入胚胎干细胞的示意图  (B) PDMS支架的宏观图像，(C-E)分别代表绿色荧光标记的胚胎干细胞在预制PDMS支架中生长2天、7天和21天的共聚焦图像。在第7天，将胚胎干细胞接种到支架上以0.05 MPa压力压缩24小时，然后继续培养2周。压缩PDMS支架可诱导胚胎干细胞分化为软骨系，因其成纤维样细胞形态。标尺= 100μm  图4.来源于人脐带的Cy3标记的间充质干细胞在三维自组装支架中生长。(A)二维培养的间充质干细胞的光学显微图。(B-E)分别代表红色荧光标记的间充质干细胞在1型胶原蛋白 (Col1)缺失和存在的Dex-SH/PEG-4-Acr自组装支架中生长1天 (B和D)和7 (C和E)天的共焦图像。间充质干细胞在添加Col1的三维支架中培养时表现为成纤维样细胞形态。标尺= 100μm。 文章来源：McKee C, Chaudhry GR.Advances and challenges in stem cell culture.Colloids Surf B Biointerfaces. 2017 Nov 1;159:62-77. 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

关注并星标CPHI制药在线               丹酚酸B（Sal B）是从丹参中提取的水溶性成分，由3分子丹参素和1分子咖啡酸缩合而成的酚酸类化合物。丹酚酸B的化学结构中含有9个酚羟基，可以提供活性氢阻止脂质过氧化反应，其结构如下图所示。研究表明，丹酚酸B在不同的自由基生成系统均表现出较强的抗氧化、清除自由基的作用，丹酚酸B具有多种药理活性，可以通过多途径、多靶点发挥对血管的保护作用，在心血管疾病治疗中具有广泛的应用。       1、抗氧化       研究表明丹酚酸B能够清除氧自由基、抑制脂质过氧化反应，是已知的具有较强抗氧化作用的天然产物之一。研究发现丹酚酸B可以改善大鼠组织病理学损害，防止血清肌酸激酶（CK-MB）、心肌肌钙蛋白（cTnI）和乳酸脱氢酶（LDH）的渗漏，还能显著提高大鼠过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）和还原型谷胱甘肽（GSH）活性。在体外实验中，丹酚酸B能够降低培养上清液中LDH的活性和心肌细胞内活性氧（ROS）和丙二醛（MDA）水平，对心肌细胞凋亡起到一定的保护作用，也有助于提高其抗氧化性能。通过建立大鼠脓毒血症模型，采用酶联免疫吸附测定检测肌钙蛋白T、肌酸激酶同工酶、白介素-6（IL-6）水平，比色法检测超氧化物歧化酶的活性和MDA的含量，观察各组心肌组织病理变化，检测凋亡相关蛋白半胱氨酸蛋白-3、B淋巴细胞瘤-2、Bcl-2相关X蛋白等表达水平。发现丹酚酸B通过影响自噬蛋白，抑制大鼠体内氧自由基的释放，增强抗氧化应激的能力。       2、抗细胞凋亡       研究发现，丹酚酸B 能诱导心血管内膜的细胞凋亡，防止心血管内皮的增厚。对急性心肌梗死（AMI）大鼠给予丹酚酸B治疗后发现丹酚酸B可以抑制多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1（PARP-1）通路，改善大鼠心肌组织线粒体和细胞核的完整性，抑制心肌细胞凋亡。通过建立糖尿病（DM）模型发现丹酚酸B可能通过激活烟酰胺腺嘌呤二核苷酸依赖性酶（SIRT1）表达，抵抗由高糖培养诱导的心肌细胞氧化应激性损伤，以及心肌细胞凋亡。       3、对心肌梗死的保护作用       采用冠状动脉结扎方法构建大鼠心肌梗死( myocardial infarction，MI)模型，考察丹酚酸 B对 MI 的保护作用。结果显示，与对照组相比，丹酚酸B能够对MI发挥明显的心脏保护作用。机制研究表明，丹酚酸 B 主要通过抑制瘦素和内皮素-活性氧簇( endothelin-reactive oxygen species，ET-ROS) 的上调以及恢复心肌中心肌细胞肌浆网钙ATP酶2a( sarco/endoplasmic reticulum ATPase 2a，SERCA2a) 和受磷蛋白的正常表达，进而发挥保护心脏的作用。       4、抑制心肌细胞肥大的作用       在研究丹酚酸B对血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，AngⅡ) 诱导的新生大鼠心肌细胞肥大的影响中，结果表明，丹酚酸B能够抑制AngⅡ诱导的心肌细胞的肥大，同时发现心钠素和脑钠素mRNA 表达下降及细胞表面积减少。机制研究发现，丹酚酸B能够抑制聚腺苷二磷酸核糖聚合酶1［poly( ADP-ribose) polymerase-1，PARP-1］的活性，同时发现过表达PARP-1 能够减弱丹酚酸B抗心肌细胞肥大的效应，这些研究表明丹酚酸B具有很好的抑制心肌细胞肥大的作用。       5、对缺血/再灌注( MI/R)损伤的保护作用       在大鼠心肌缺血再灌注损伤的模型中，丹酚酸B可以降低损伤后血清CPK水平，缩小心梗面积。丹酚酸B还能明显抑制肾素-血管紧张素-醛固酮系统的激活，调节PGI 2和TXA2的水平，降低炎性细胞因子的释放。这些结果从抑制炎症反应的角度证实丹酚酸B对缺血再灌注心肌细胞的保护作用。在离体心脏和培养心肌细胞的缺氧复氧模型中，丹酚酸B也表现出类似的作用。研究显示，丹酚酸B与5-氮胞苷联合应用可诱导大鼠骨髓间充质干细胞定向分化为心肌样细胞，其作用机制可能是丹酚酸B促进骨髓间充质细胞分泌某些细胞因子，进而影响有利于心肌样细胞形成的基因NKX2.5、GATA-4的表达并促进心肌细胞结构蛋白的表达，从而诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化。骨髓间充质干细胞中的干细胞因子（SCF）是一种可能的趋化因子，对原始骨髓细胞向心梗区迁移、积聚和扩增起重要作用。不同浓度的丹酚酸B均可明显促进骨髓间充质干细胞分泌SCF，增强SCF mRNA的表达。利用丹酚酸B预处理内皮祖细胞和骨髓间充质干细胞的实验表明，丹酚B能增加内皮祖细胞增殖、黏附及迁移能力，促进新生血管的形成，改善心肌微环境，上调NKX2.5、GATA-4基因的表达，从而提高骨髓间充质干细胞向心肌细胞的定向分化。       此外，研究结果表明，丹酚酸B对缺血再灌注心脏的保护作用也与激活内源性保护机制有关。利用人脐静脉内皮细胞（HUVECs）的低氧模型，研究证实，丹酚酸B镁盐能通过抑制NO释放及eNOSmRNA表达的升高，拮抗Ca2+内流，对内皮细胞产生保护作用。在H2O2诱导的 HUVECs损伤模型中，丹酚酸B呈剂量依赖性地抑制内皮细胞CD54的表达，降低中性粒细胞的黏附率。此外，丹酚酸B还可以上调与内质网应激有关的蛋白-葡萄糖调节蛋白78（GRP78），从而防止氧化应激对HUVECs的损伤，这一作用与激活ATF6及PERK-eIF 2α-ATF4通路有关。       6、抗动脉粥样硬化的作用       丹酚酸B能够抑制多种因素诱导的人主动脉平滑肌细胞（HASMCs）内MMP-2、MMP-9表达的上调及COX的表达。体外实验还证实，丹酚酸B可以减轻主动脉内膜的增厚。应用人主动脉内皮细胞（HAECs）研究了丹酚酸B对细胞黏附分子表达的影响。结果表明，丹参水提物和丹酚酸B均能显著减少VCAM-1和ICAM-1的表达，减少人体单核细胞系U937与TNF-α处理的HAECs的结合，抑制TNF-α诱导的HAECs中NF- κB的激活。丹酚酸B的抗炎特性为阐明丹酚酸B的抗动脉粥样硬化作用提供了新依据。另有研究发现，丹酚酸B能够清除循环中的自由基，减少维生素E的消耗，间接阻止LDL被氧化修饰，起到延缓动脉粥样硬化发展的作用。       丹酚酸B还可以上调HUVECs中组织型纤溶酶原激活剂（t-PA）和血栓调节蛋白（TM）的表达，下调纤溶酶原激活物抑制剂（PAI-1）的表达提高HUVECs的纤溶活力。研究发现，丹酚酸B呈时间和剂量依赖性抑制TNF-α诱导的HUVECs细胞中PAI-1的表达，这种作用与NF- κB及ERK-AP1信号通路有关。这些数据提示丹酚酸B可以改变内皮细胞的基因表达，预防血管事件发生，具有防治血栓性疾病的应用前景。       动脉粥样硬化的发生还与血小板的黏附聚集相关。丹酚酸B通过抑制血小板释放各种递质和/或阻止血小板上胶原相关受体与胶原蛋白的结合，而对抗血小板的黏附。还有研究发现，丹酚酸B能够抑制血小板沉积于特异性肽段α2β1并特异性抑制抗 α2β1的抗体与血小板结合，并阻止可溶的α2β1相互结合为不可溶的胶原。       7、血管舒张作用       丹参水提物和丹酚酸B的血管舒张效应主要与抑制L型电压依赖性Ca2+通道有关，丹酚酸B较强的血管舒张效应及其在丹参水提物中的高含量提示丹酚酸B是中药丹参发挥血管舒张作用的重要组分。生理及病理状态下Ca2+激活的K+通道（BKCa）及ATP 依赖的K+通道（IKATP）对冠脉张力的调节都起重要作用。研究表明，丹参粗提物中只有丹酚酸B可以激活鸟苷酸环化酶，诱导平滑肌细胞BKCa通道的开放。       参考资料       [1]魏西羽,杨婷,刘厚汝等.丹酚酸B的药理作用研究进展[J].药学研究,2021,40(11):748-752.       [2]林超,刘兆国,钱星等.丹酚酸B在心血管疾病中药理作用研究进展[J].中国药理学通报,2015,31(04):449-452.       [3]汪芸.丹酚酸B对心脑血管疾病药理作用的研究进展[J].现代中西医结合杂志,2010,19(35):4634-4637.       作者简介：小米虫，药品质量研究工作者，长期致力于药品质量研究及药品分析方法验证工作，现就职于国内某大型药物研发公司，从事药品检验分析及分析方法验证。智药研习社近期课程报名来源：CPHI制药在线声明：本文仅代表作者观点，并不代表制药在线立场。本网站内容仅出于传递更多信息之目的。如需转载，请务必注明文章来源和作者。投稿邮箱：Kelly.Xiao@imsinoexpo.com▼更多制药资讯，请关注CPHI制药在线▼点击阅读原文，进入智药研习社~