RAD21

黏连蛋白Cohesin介导细胞分裂过程中姐妹染色体的黏连，还参与染色质三维结构的形成和维持1，对哺乳动物细胞基因组DNA的稳定性有着非常重要的影响。黏连蛋白的失活突变在多种癌症中高频出现，但前期的研究表明黏连蛋白功能缺失导致的姐妹染色体黏连错乱引起的染色体非整倍性可能不是致癌的主要原因2，这表明黏连蛋白功能缺失导致基因组不稳定乃至肿瘤发生的分子机制仍待进一步挖掘。2023年7月27日，北京大学生命科学学院和北大-清华生命科学联合中心胡家志课题组在Nature Genetics发文揭示了黏连蛋白Cohesin功能缺失导致致癌基因突变的分子机制。他们发现黏连蛋白缺失会导致休眠复制源在S期早期的大量激活，从而干扰正常的DNA复制时序，进而导致基因组不稳定性的剧增，从而引起部分致癌或者抑癌基因的突变。该研究是本课题组转录调节DNA复制起始的工作的延续，也拓展了我们对基因组三维结构调节DNA复制而维持基因组稳定性的分子机制的理解，还纠正了领域内早前部分研究认为黏连蛋白失活不影响DNA复制时序的错误认识。为探究黏连蛋白失活的影响，作者在人K562免疫细胞和小鼠胚胎干细胞中构建了生长素介导的Degron系统，用以快速降解黏连蛋白Cohesin的核心组分之一——RAD21（图1a）。与之前报道一致，该系统只能部分降解RAD21（~70%）。为排除RAD21未降解细胞对实验结果的干扰，作者仅分选RAD21彻底降解的细胞用于后续分析（图1b），而之前的两项相关研究均未排除这部分细胞的影响，因此对实验结果造成了干扰。作者首先采用实验室前期开发的检测DNA双链断裂的高通量测序方法——PEM-seq3进行定量分析（胡家志课题组开发出优化基因编辑和追踪DNA修复的新方法），发现RAD21缺失将导致全基因组的DNA断裂水平提高至原来的3-5倍（图1c）。这说明黏连蛋白在维持基因组稳定性方面发挥着极为重要的作用。图1 RAD21降解造成大量基因组双链断裂发生。（a)染色质loop及 Cohesin复合体示意图。（b）K562细胞中RAD21 AID蛋白降解体系构建与验证。1#和4#为构建成功的RAD21-mAID-mClover细胞系，简称RAD21-mAC。（c）PEM-seq方法从MYC和TP53位点分别检测RAD21降解后染色体易位频率。（d）RAD21降解导致的DSB热点基因。（e）TCGA数据库子宫内膜癌样本中热点基因与Cohesin蛋白亚基共突变情况。进一步分析发现RAD21缺失导致的DNA断裂富集于147个热点基因，其中超过三分之一与癌症和其它疾病高度相关（图1d）。此外，这些热点损伤基因与黏连蛋白的失活存在显著共突变的关系（图1e），这表明黏连蛋白的失活突变可能是相关癌症或疾病发生发展的核心原因之一。通过分析这些DNA损伤的分布位置发现，染色质三维结构的改变和转录水平的轻微扰动不是黏连蛋白降解导致DNA损伤的主要原因。但作者发现RAD21降解导致的DNA损伤非对称性地分布于DNA双链，且该非对称分布与DNA复制过程中后随链的关键产物——冈崎片段的分布方向一致（图2a）。此外，黏连蛋白的降解还导致DNA复制速率下降且停顿复制叉增多（图2b, c），这些数据均表明黏连蛋白与DNA复制的稳定有着重要的关系，其缺失可能通过影响DNA复制而导致基因组不稳定性。目前已知DNA复制是细胞基因组不稳定性最大的来源。作者通过绘制细胞的DNA复制时序，发现黏连蛋白的降解导致了约30%基因组区域的DNA复制时序提前（图2d, e），且DNA损伤的热点基因大多位于DNA复制时序异常的区域（图2f）。图2 RAD21降解导致复制时序紊乱和复制压力。（a）PEM-seq检测RAD21降解后细胞中染色体易位断裂位点偏向性与OK-seq相似。（b）RAD21降解导致复制叉速率减慢。（c）RAD21降解导致复制叉停顿增加。（d）RAD21降解导致部分基因组区域复制时序提前。（e）K562细胞基因组中31.6%的区域在RAD21降解后发生复制时序的显著提前。（f）热点基因的复制时序变化情况，每个方格表示一个基因，红色和蓝色分别表示复制时序的提早和延迟。为探究复制时序改变的原因，作者采用了该实验室前期开发的用于鉴定DNA复制起始的测序方法——NAIL-seq4（Genome Biology | 胡家志实验室揭示转录调节DNA复制起始的分子机制），发现RAD21的降解导致约25%更多的DNA复制源在S期早期被激活（图3a, b）。这些早期复制起始位点具有经典复制源的特征，为休眠复制源（dormant origins）。这些在早期被异常激活的复制源导致了DNA复制时序的提前（图3c）。休眠复制源在正常情况下只在DNA复制中晚期偶尔起始，只有在面临DNA复制压力时才会大量激活。而休眠复制源在S期早期的提前激活需要消耗更多的复制相关因子，从而引起复制压力，这可能是RAD21缺失导致基因组不稳定性的重要原因之一。定点敲除c-MYC基因附近的染色质环的锚点，将导致染色质环内部作用的减弱，从而引起DNA复制起始在染色质环内部的激活，并进而引起DNA损伤水平的增加（图3d）。这些数据揭示了Cohesin缺失→DNA复制起始位点增加→DNA复制时序紊乱→DNA损伤水平上升的逻辑关系，为深入理解黏连蛋白Cohesin在DNA复制过程中的功能提供了更多的解释。图3 RAD21降解导致复制起始位点增加并引起DNA双链断裂。（a）RAD21降解后（4#）NAIL-seq检测到的早期复制起始信号（EdU/HU）和所鉴定的早期复制起始位点（Early replication initiation zones, ERIZs）。(b)饼图统计1#和4#RAD21-mAC细胞中RAD21降解后ERIZ信号强度分类和比例。（c）K562中四类ERIZ区域在RAD21未降解和降解的细胞中所处的复制时序密度图。（d）c-MYC区域染色质环锚定位点的敲除（绿色方块）造成橙色阴影区域染色质相互作用（q3C-seq）减弱，早期复制起始信号（NAIL-seq）增强和DSB（END-seq）的增加。原文链接：https://rdcu.be/dhUmX会议推荐会议详情会议名称：2023（第14届）细胞与基因治疗国际研讨会暨抗体工程与创新免疫治疗技术论坛暨2023细胞免疫治疗专业委员会年会主办单位：生物谷、梅斯医学、同济大学附属同济医院、南京可缘大会时间：9月22-23日大会地点：上海 大会规模：1500人2010年至今，生物谷联合各合作单位已经顺利召开了13届细胞与基因治疗国际研讨会，与全球致力于细胞治疗行业同仁们一同成长沉淀，在提供行业信息交流平台的同时，也为基础研究提供了技术/产品等产业化的孵化平台。基于此，本届会议将继续以转化医学为切入点，以基础研究与临床应用相结合，针对细胞治疗的临床前沿研究、临床监管、治疗规范、细胞治疗安全性，免疫细胞新型疗法、实体瘤治疗、干细胞与癌症、抗体药物、核酸药物、基因编辑、肿瘤免疫治疗等热门议题进行讨论，诚邀国内外产学研医专家共聚，共绘产业发展新蓝图！长按识别二维码立即报名参会

哺乳动物细胞间期核内基因组呈现高度有序的层级结构。2 m长的DNA经过不断压缩折叠储存在细胞核中并依次形成不同尺度的结构域：核小体、染色质纤维、染色质环、拓扑相关结构域（topologically associating domains, TADs）、区室（compartments）和染色体领地（chromosome territory），其中每一个层级结构都蕴含了丰富的DNA互作网络，共同实现细胞生命历程中的调控。基因组层级结构的形成与维持受到多种蛋白因子的调控，如架构蛋白、转录因子和非编码 RNA等。其中部分染色质环的形成依赖于CTCF、cohesin和装载复合物NIPBL-MAU2等架构蛋白，cohesin通过“环挤出（Loop extrusion）”的方式使染色质环逐渐增大，最终形成较为稳定的局部互作结构域，而 CTCF和cohesin结合在其基部。然而，cohesin和 NIPBL 协同促进染色质挤出的具体机制尚不明确。2023年6月28日，北京大学生物医学前沿创新中心（BIOPIC）、未来技术学院国家生物医学成像科学中心（NBIC），膜生物学国家重点实验室孙育杰课题组在Genome Biology杂志发表了题为Rad21 is the core subunit of the cohesin complex involved in directing genome organization的研究论文（图1），在这项研究中，作者使用超高分辨率显微镜成像技术揭示了cohesin复合物的RAD21亚基在cohesin装载和染色质结构调控中的独特作用。图1 论文截图本研究中，作者首先观察到RAD21的过表达导致染色质环被过度挤出，在细胞核中形成“意大利面”样的分布，而RAD21蛋白自身会聚集成簇（图2）。进一步研究发现，过度装载在染色质上的cohesin蛋白会形成“蝴蝶结”样结构并绑住TAD（图3），最终形成“念珠”状分布，而其他四种cohesin亚基的过表达却在细胞核内呈现均匀分布。图2 在HeLa细胞中过表达RAD21亚基后在细胞核内形成的“意大利面”样结构利用RAD21与装载复合物NIPBL-MAU2的互作突变体RAD21-LIS，生化实验及细胞成像实验证实了该互作的重要性，这种互作促进了cohesin在染色质上的大量装载，最终形成“意大利面”样分布。图3  RAD21过表达后RAD21和EMC7 TAD的超高分辨显微成像此外，本文通过分析Hi-C数据，对比了RAD21上调后和先前研究报道的同样能够造成染色质“意大利面”样分布的WAPL蛋白缺失对染色质不同层级结构（全基因组范围、染色质区室和TADs）的影响异同，以进一步解释RAD21在染色质结构方面的作用机制（图4）(Haarhuis et al., 2017; Wutz et al., 2017)。作者发现“意大利面”样分布形成后，在TAD的边角处积累了大量的互作信号，同时TAD之间的相互作用明显增加。但是，RAD21的上调对TADs的长度和数目并没有显著影响，并且TAD之间的边界的绝缘程度也没有显著改变，这一现象与WAPL缺失带来的结果不同。作者推测可能是RAD21的上调使得不同TADs被更加稳定地分隔，因此TADs长度、数目以及绝缘系数并未受到显著影响。这可能是其作用机制区别与WAPL，有待于进一步研究。图4  Hi-C数据分析RAD21上调对染色质不同层级结构的影响最后，结合临床数据和细胞实验，作者发现在乳腺癌病例中患者生存率的降低与RAD21的异常表达十分相关，而在乳腺癌细胞系中的免疫荧光成像表明，内源的RAD21呈现出与过表达RAD21的HeLa细胞中类似的簇状分布。结合RNA-seq和Hi-C分析，作者发现HeLa细胞中RAD21上调表达后会导致染色质compartment切换及癌症相关基因的显著上调，而这种基因组结构的异常可能会导致乳腺癌肿瘤的发生。综上所述，本研究深入研究了RAD21亚基促进cohesin装载过程的分子机制，同时提出了cohesin和装载复合物如何协同配合并促进染色质挤出的模型（图5），该模型对细胞内部三维基因组结构的构建具有重要的意义，此外本研究描述染色质状态与癌症病因之间的重要关系，为临床治疗的靶点信息提供了重要参考。图5 RAD21作为cohesin的核心亚基帮助细胞内“意大利面”样分布形成的模型论文链接：https://genomebiology-biomedcentral-com.libproxy1.nus.edu.sg/articles/10.1186/s13059-023-02982-1会议推荐会议详情会议名称：2023（第14届）细胞与基因治疗国际研讨会暨抗体工程与创新免疫治疗技术论坛暨2023细胞免疫治疗专业委员会年会主办单位：生物谷、梅斯医学、同济大学附属同济医院、南京可缘大会时间：9月22-23日大会地点：上海 大会规模：1500人2010年至今，生物谷联合各合作单位已经顺利召开了13届细胞与基因治疗国际研讨会，与全球致力于细胞治疗行业同仁们一同成长沉淀，在提供行业信息交流平台的同时，也为基础研究提供了技术/产品等产业化的孵化平台。基于此，本届会议将继续以转化医学为切入点，以基础研究与临床应用相结合，针对细胞治疗的临床前沿研究、临床监管、治疗规范、细胞治疗安全性，免疫细胞新型疗法、实体瘤治疗、干细胞与癌症、抗体药物、核酸药物、基因编辑、肿瘤免疫治疗等热门议题进行讨论，诚邀国内外产学研医专家共聚，共绘产业发展新蓝图！长按识别二维码立即报名参会

黏连蛋白（cohesin）是一种蛋白质复合物，主要由四个核心亚基组成，包括SMC1、SMC3、STAG1/2和RAD21。它在细胞分裂过程中起着重要的作用，参与染色体的结构维持、有丝分裂的准备、染色体分离等关键过程。在有丝分裂前期，黏连蛋白会把染色体的姐妹染色单体紧密地连接在一起，形成了称为染色体联会的结构。这有助于确保在有丝分裂时，每个染色体都能正确地被复制和分离，以保证遗传信息的准确传递。此外，黏连蛋白还参与了许多其他生物学过程，如DNA损伤修复、基因表达和基因组拓扑结构的维持等。但现在，美国国家癌症研究所（National Cancer Institute，NCI）的研究人员发现，这种蛋白质复合物还有另一个功能，这种功能可以回答癌症研究人员数十年来的一些困扰。Science Advances上3月1日发表的一项研究“Cohesin regulates alternative splicing”表明，黏连蛋白对选择性剪接（alternative splicing，也叫可变剪接）具有调节作用。图1 研究成果（图源：[1]）研究的作者之一、NCI的免疫学家Dinah Singer表示：“在急性骨髓性白血病（Acute myeloid leukemia，AML）的原发患者细胞中，存在黏连蛋白突变，从而导致剪接发生改变。”已经证实，在某些情况下，选择性剪接的异常调控可能导致癌症的发生和发展。这暗示，黏连蛋白在AML和其他类型的癌症的发展中也发挥了作用。“因此，我们有可能逆转生长表型，并在未来开展新的治疗途径。”在转录过程中，基因的编码区如果出现了不同的组合方式，就能够在不同的细胞类型或发育阶段中编码多种不同的蛋白质，这一现象就被称作选择性剪接。选择性剪接对于包括细胞发育和死亡在内的许多细胞过程都非常重要。图2 选择性剪接示意图（图源：NCBI）高达95%的编码蛋白基因会发生选择性剪接。当剪接发生突变时，剪接位点上的核苷酸会被插入或删除。这些剪接突变与AML中的一系列基因变异有关，其中20%的病例还表现出凝聚素突变。这促使研究人员调查黏连蛋白突变是否与选择性剪接相关联。在这项研究中，Dinah和她的同事们通过诱导黏连蛋白的核心成分——RAD21的降解，来耗尽人类直肠癌细胞系（HCT116细胞）中的黏连蛋白。当他们使用 RNA 测序研究这种耗尽对剪接模式的影响时，他们发现与对照组相比，黏连蛋白耗尽的细胞系中，各种不同形式的选择性剪接均受到显著影响。研究人员比较了HCT116细胞在黏连蛋白耗尽或未耗尽的情况下转录率的差异，发现黏连蛋白不是通过影响转录来间接影响剪接的。使用邻近连接分析（Proximity ligation assays，PLAs）技术，研究人员观察到黏连蛋白的RAD21亚基与剪接因子U1-70、调节剪接因子FUS的共定位，这说明黏连蛋白直接和剪接因子相互作用。图3 正常条件下黏连蛋白亚基RAD21和剪接因子U1-70的显微镜图像（图源：[2]）先前的研究发现，溴结构域蛋白BRD4与黏连蛋白有许多功能相似之处，都在整个细胞周期中发挥作用，此外，BRD4 还有助于调节细胞内和体内的选择性剪接。那么，BRD4与黏连蛋白是否相互合作来调节剪接呢？研究人员单独或一起耗尽了细胞中的BRD4与黏连蛋白，发现，单独耗尽和同时耗尽的剪接模式并不相同，即BRD4与黏连蛋白各自调节了一部分的剪接，同时还共同调节另一部分的剪接。PLAs和免疫共沉淀的结果，以及重组黏连蛋白与重组BRD4结合能力的测试结果则进一步表明，黏连蛋白直接与BRD4相互作用。研究人员还通过使用独立的、公开可用的患者样本RNA测序数据集研究了黏连蛋白在AML中的作用。用于分析的三组数据中，第一组患者黏连蛋白发生突变但剪接因子没有发生突变，第二组患者剪接因子发生突变但黏连蛋白没有发生突变，第三组对照组黏连蛋白和剪接因子都未发生突变。若黏连蛋白突变不是影响选择性剪接的一个因素，则第一组和第三组的剪接模式应该没有差异。结果发现，在具有黏连蛋白突变的样本中观察到独特的剪接模式。为了进一步证明黏连蛋白突变直接影响选择性剪接，研究人员分析了两个经过单点突变改造的小鼠胚胎干细胞克隆，结果观察到与剪接因子的相互作用减少并改变了剪接模式，证明了因果关系。瑞典隆德大学癌症中心医学遗传学家Kajsa Paulsson评价这项研究说：“新发现的黏连蛋白的这种功能非常令人兴奋。黏连蛋白与多种常见癌症类型有关，但其潜在机制仍然是个谜。了解这些突变，将是推进靶向治疗开发的一大步。”有了这项发现，科学家们可以更深入地研究黏连蛋白在癌症发生和发展中的作用。这也意味着我们可以通过针对黏连蛋白来治疗AML和其他类型的癌症。不过，这项研究仍然存在一些局限性。例如，科学家们只使用了少量的AML患者样本，需要更多的研究来确认这些发现是否普遍存在于其他癌症类型中。此外，这项研究并没有研究黏连蛋白的具体机制，这是下一步的研究方向。总的来说，这项研究为我们提供了一个新的视角来理解癌症的发生和发展。通过发现黏连蛋白的另一种功能，科学家们可以探究更多与癌症相关的问题，并开发新的治疗方法。 责编|风立宵校对|风立宵End参考资料：[1]Singh AK, Chen Q, Nguyen C, et al. Cohesin regulates alternative splicing. Sci Adv. 2023 Mar;9(9):eade3876. doi: 10.1126/sciadv.ade3876. [2]https://www-the-scientist-com.libproxy1.nus.edu.sg/news-opinion/mutated-cohesin-throws-dna-splicing-out-of-whack-resulting-in-cancer-70998 本文系生物探索原创，欢迎个人转发分享。其他任何媒体、网站如需转载，须在正文前注明来源生物探索。  往期精选 围观 ‍Nature：头发变白的机制找到了！白发变青丝或不再是梦！ 热文通过食补这种氨基酸就可以逆转衰老？发现驱动衰老的关键蛋白！ 热文肠道细菌还会影响受损肌肉的再生？T细胞在其中起到关键作用！ 热文心跳不仅是生命体征，还是大脑掌握时间的节拍器！ 热文 降压药物无效？超声肾脏神经去除术或成为高血压患者的替代疗法！ 点击“阅读原文”，了解更多~