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恐惧记忆是生物体适应复杂生存环境的一种保护性机制，它使得动物遇到潜在危险时迅速做出防御性行为。但是，过强的恐惧记忆可能发展成为创伤后应激障碍（posttraumatic stress disorder, PTSD）等疾病。目前，PTSD的常用治疗策略为暴露疗法，但仍有部分病人无法从暴露疗法中获益，且暴露疗法后恐惧记忆仍有较高自发恢复的风险。PTSD也无十分有效的药物治疗策略，舍曲林、帕罗西汀等抗抑郁药可作为二线疗法，减轻PTSD伴发的抑郁症状，但对PTSD的核心症状，即恐惧记忆的反复重现无效。因此，有必要进一步研究恐惧记忆的调控机制，以寻找PTSD等恐惧记忆障碍性疾病的治疗新靶点和新策略。2023年9月6日，《Cell Reports》在线发表了浙江大学基础医学院/浙医二院的胡薇薇/蒋磊和药学院陈忠团队的最新研究成果“Postsynaptic histamine H3 receptors in ventral basal forebrain cholinergic neurons modulate contextual fear memory”。该研究揭示了腹侧基底前脑（ventral basal forebrain，vBF）胆碱能神经元上组胺H3受体（H3R）调控情景恐惧记忆的细胞特异性作用与亚细胞分布特异性作用，为PTSD等恐惧记忆障碍性疾病的精准干预提供了潜在新靶点。组胺是中枢神经系统中的一种重要神经递质，与学习记忆、睡眠觉醒和摄食代谢等脑功能密切相关。组胺在脑内存在四种受体，其中H3受体（H3R）主要表达在中枢神经系统，相关药物的外周副作用可能较少，被广泛认为是中枢神经系统疾病极具潜力的药物靶点。H3R是组胺的自身受体，在组胺能神经的突触前膜负反馈调节组胺的合成与释放。但H3R也分布在非组胺能神经元中，这部分H3R的功能尚不清楚。该团队利用Cre-LoxP系统选择性敲除谷氨酸能（CaMKIIα-Cre; Hrh3fl/fl）和胆碱能（ChAT-Cre; Hrh3fl/fl）神经元中的H3R。在系列行为评估后，他们发现ChAT-Cre;Hrh3fl/fl小鼠中情景恐惧记忆特异性增强，而线索恐惧记忆及其他类型记忆（如时序记忆、物体位置记忆、空间工作记忆和空间参考记忆等）均未受影响。同时，CaMKIIα-Cre;Hrh3fl/fl 小鼠的认知功能也未见异常。这些结果提示H3R在恐惧记忆的调控中发挥细胞类型特异性作用，而胆碱能神经元中的H3R特异性调节情景恐惧记忆。通过全脑cfos标记，他们发现H3R的缺失特异性促进了在情景恐惧记忆提取过程中vBF胆碱能神经元的激活。进一步利用基因干预、离体电生理以及化学遗传学等技术，他们明确了vBF，而非其他胆碱能神经元富集脑区内侧隔核（medial septum，MS）或Meynert 基底核（nucleus basalis of Meynert，NBM），是胆碱能神经元中H3R调节情景恐惧记忆的关键脑区，提示了H3R在情景恐惧记忆调控中的脑区特异性作用。传统观点认为H3R主要在突触前膜发挥功能。意外的是，他们利用视紫红质（rhodopsin）与H3R的融合蛋白（OptoH3R）实现光（λ=473 nm）介导的H3R进行时空特异性调控，发现虽然背侧海马（dorsal hippocampus，dHP）是vBF胆碱能神经元调控情景恐惧记忆的重要下游脑区，但是激活dHP内胆碱能神经元末梢突触前膜的H3R并未影响情景恐惧记忆。相反，激活vBF胆碱能神经元胞体上突触后膜的H3R特异性抑制情景恐惧记忆。另外，非常有趣地发现尽管激活vBF胆碱能神经元胞体突触后膜H3R和dHP胆碱能神经元末梢突触前膜H3R均可显著抑制情景恐惧记忆提取过程中dHP内乙酰胆碱的释放，但激活vBF胆碱能神经元突触后膜H3R对乙酰胆碱释放的抑制作用更强。此外，情景恐惧记忆提取过程中，激活vBF胆碱能神经元突触后膜H3R，而非dHP胆碱能神经元末梢突触前膜H3R，可显著抑制vBF胆碱能神经元的激活。这些结果提示了H3R在情景恐惧记忆调控中的亚细胞分布特异性作用，是vBF胆碱能神经元突触后膜H3R，而非dHP胆碱能神经元末梢突触前膜H3R，特异性调控情景恐惧记忆。综上，该研究揭示了vBF胆碱能神经元上H3R调控情景恐惧记忆的空间特异性作用，明确了其细胞类型特异性及亚细胞分布特异性作用的特征，为PTSD等恐惧记忆障碍性疾病的精准干预提供了潜在新靶点，为H3R相关药物的开发与应用提供了重要的实验依据。郑艳榕老师、樊丽诗博士和博士生方卓雯为该论文的共同第一作者；胡薇薇教授、陈忠教授和蒋磊副教授为通讯作者。该项目得到了科技部“重点研发计划”与“科技创新2030-‘脑科学与类脑研究’重大项目”，国家自然科学基金“区域联合基金重点支持项目”、“面上项目”和“青年项目”以及浙江大学上海高等研究院繁星科学基金的资助。感谢王绪化研究员在病毒构建方面给予本课题重要的帮助与建议。感谢浙江大学基础医学院公共技术平台方三华老师、刘莉老师、章道会老师在仪器使用、行为评估等方面给予本课题技术支持。原文链接：https://www-sciencedirect-com.libproxy1.nus.edu.sg/science/article/pii/S2211124723010847?via%3Dihub

目前临床上使用的ADC在大多数情况下依赖于有效的内化和细胞内溶酶体的转运，以实现连接子的生物切割，从而释放药物。此外，被切割后的药物必须从溶酶体中逃脱，才能达到其治疗效果。然而，并不是所有的肿瘤抗原都能确保上述有效的ADC处理，特别是在实体瘤中，而且目前内化的ADC对获得性肿瘤耐药机制也很敏感。肿瘤微环境 (TME) 中的胞外 ADC 裂解可以作为传统ADC的有价值的替代方案。在这种情况下，一旦药物释放则可以被动地扩散到肿瘤块中，穿透并杀死邻近的抗原阴性的肿瘤细胞，从而最大限度地发挥“旁观者效应”。TME在实体瘤中的特异性靶向可以通过使用大量和选择性地存在于细胞膜上的弱的或非内化的抗原(例如CAIX、VEGFR、钙粘附素)、细胞外基质的成分(例如纤连蛋白和Tenascin-C的剪接变体、纤维蛋白、IV型胶原、αvβ3整合素)或由TME中的肿瘤细胞分泌的蛋白质(例如VEGF)来实现。如果药物能够选择性地从TME中释放，所有这些将是ADC治疗的极佳靶点。已经发现基于二硫化物或多肽的连接子针对非内化肿瘤靶点的生物可切割ADC的显著治疗效果。含有二硫键的连接子的胞外裂解被认为是由于死亡细胞释放还原剂(如谷胱甘肽)，导致更多的细胞死亡，从而释放更多的还原剂。此外，肿瘤细胞外参与肿瘤血管生成、侵袭和转移的蛋白水解酶(如组织蛋白、基质金属蛋白酶和尿激酶型纤溶酶原)水平升高，靶向TME中肿瘤细胞外部的非内化抗原蛋白酶敏感的ADC在几种小鼠异种移植模型中也被证明有效。然而，与细胞内的生物切割相比，细胞外的生物切割不是普遍存在的，而且效率较低。因而最近研究人员探索了ADC连接子被化学触发的方法(图1)。在这种方法中，ADC与细胞外肿瘤靶点结合，并且未结合的ADC从血液中清除后，然后静脉注射外源化学探针(激活剂)，在与ADC连接子选择性和快速反应时进而释放药物，从而绕过对肿瘤生物学的依赖来释放药物。由于ADC的高抗原密度和激活剂典型的快速药代动力学，体内试剂浓度和反应时间都很低，因此这种方法需要使用快速和高选择性反应，例如生物正交。图1. 点击化学ADC机制示意图经典点击释放反应：IEDDA哒嗪消除正交裂解反应反式-环辛烯 (TCO) 和四嗪之间的逆电子需求 Diels-Alder (IEDDA) 反应是最快的生物正交化学反应，该反应是哒嗪消除正交裂解反应的基础。它在TCO烯丙基位置上引入氨基甲酸酯连接的有效载荷。在第一步(点击)中，TCO和1，2，4，5-四嗪衍生物(激活剂) 做出快速而有选择的反应，产生几种DHP互变异构体。然后1，4-DHP异构体在第二步电子级联消除中快速释放含胺的有效载荷和二氧化碳（图2）。图2. IEDDA哒嗪消除MOA示意图四嗪触发的哒嗪消除是稳健且广泛适用的，具有良好的 TCO 连接子和四嗪激活剂稳定性，同时在体外和体内具有快速和高产的释放。使用嵌入 ADC 的可裂解连接子中的 TCO 的一个缺点是，与用于生物偶联的典型 TCO 相比，由于烯丙基取代基的空间位阻，对四嗪的反应性降低。为了进一步提高点击反应性，潜在地降低体内剂量水平，开发了一种新的点击释放策略，仍然基于TCO和四嗪之间强大的哒嗪消除反应，但使用TCO作为激活剂，并将四嗪嵌入连接子(图3)。在这样的系统中，可以使用sTCO的衍生物来释放有效载荷，其相对于四嗪触发的哒嗪消除，点击反应性提高了三个数量级。图3.从四嗪触发的药物释放转变为TCO触发的药物释放，以提高点击反应性点击化学ADC的应用第一个点击可切割的ADC是基于带有TCO-Dox的CC49单抗（DAR约为2），靶向非内化的肿瘤抗原TAG72(图4)。该ADC是非常稳定的，在荷瘤小鼠中显示出和亲本CC49抗体相似的PK特性。然而激活剂的低点击结合反应限制了其进一步应用。图4. 基于抗TAG72(CC49)抗体与阿霉素偶联的第一代点击切割ADC第二代可点击切割的ADC，选择了具有较短半衰期的TAG72靶向Diabody。这种Diabody与TCO连接的MMAE有效载荷，通过PEG连接子连接到工程化的Cys 残基上，从而产生了一个点击切割的ADC（tc-ADC）(图5)。其具有高肿瘤摄取，并在血液和其他非靶组织中的水平非常低。通过小鼠体内进行药代动力学研究，在ADC和激活剂给药之间选择两天的间隔，因为此时ADC从血液中几乎完全清除。对于激活剂，开发了一个小分子，含有一个高释放的3，6-双烷基四嗪基序和一个调节清除的PEG11-DOTA，当用量为0.33 mmol/kg，即可与肿瘤结合的TCO发生完全反应。图5. 第二代可点击切割的ADC (tc-ADC)这种新的点击可切割ADC(tc-ADC)与非结合ADC(nb-ADC)和vc连接MMAE制备的 vc-ADC在过表达TAG72的结直肠癌(LS174T)和卵巢癌(OVCAR-3)模型中进行了比较了评估。研究发现，点击化学tc-ADC处理的小鼠耐受性良好，没有明显的毒性迹象。小鼠在两周内接受四个周期的tc-ADC和激活剂治疗后，肿瘤显着且持久地消退，而vc-ADC只显示了有限的治疗效果（图 6）。图6.tc-ADC对卵巢癌(OVCAR-3)小鼠模型的治疗效果除了哒嗪消除反应外，还探索了其他一些生物正交切反应在ADC中的应用。最近，Chen研究小组着手建立了基于金属的生物正交切反应转化为连接子切割反应。这些切割反应的速度可以与哒嗪消除反应一样快，甚至更快。为此，该小组对24种不同的含有铜、钯、钌、镍、钴和铁的物种进行了系统的调查，在所有被测试的化合物中，铜(I) complexes对含有炔丙氧基乙酰或炔丙基官能团的连接子显示出有效和快速地裂解，并释放含胺或含酚的有效载荷。新开发的含有炔丙基的连接子被用来将Dox或etoposide偶联在抗HER2 抗体上(图7)。这些ADC被证明在铜(I)-BTTAA作为化学激活剂的存在下释放药物并在体外杀死HER2过表达的细胞。然而，铜(I)络合物在体内的潜在毒性以及在生物环境中随着时间的推移而不稳定，因而基于金属的生物正交点击ADC具有一定的安全风险。图7. 含有炔丙基的连接子将Dox或etoposide偶联在HER2 抗体的点击化学ADCLiu研究小组开发了一种生物正交切割反应，该反应源于有机去保护反应，而不是点击连接反应。该小组合成了一种包含邻位氨基甲酰亚甲基硅基-酚醚体系的芳香族连接子，并使用氟化物或氟化物转移剂去除硅基，随后进行电子重排，导致含有氨基的有效载荷和二氧化碳的释放。在PBS中，在三氟硼苯丙氨酸(Phe-BF3)的存在下，24 h内释放了90%的有效载荷，而在过氧化氢、谷胱甘肽、半胱氨酸存在下，只观察到很少的有效载荷释放。Phe-BF3模拟天然苯丙氨酸，并通过LAT-1被肿瘤细胞主动摄取。因此该研究小组开发了一种含有叔丁基二甲基硅基官能化苯酚(TBSO)的连接子，并用它将曲妥珠单抗连接到MMAE上，从而获得了一种化学上可切割的内化ADC(图8)。在HER2阳性胃癌移植瘤(BGC823)的概念验证研究中，证实了MMAE的释放。其中先是4.5 mpk ADC给药，然后在48和96 h后给与15 mg/ kg Phe-BF3。质谱 (MS) 分析证实，相比对照组，在注射了 ADC 和激活剂的小鼠的肿瘤中存在大量游离 的MMAE。图8. 含有TBSO的连接子将曲妥珠单抗连接到MMAE上的点击化学ADC小编小结点击化学反应具有很大的应用潜力。点击化学ADC可以不依赖于肿瘤生物学来激活它们，因而允许将范围扩大到非内吞的癌症靶点，并通过选择适当的有效载荷获得更强的旁观者效应。在异质性的实体肿瘤中，细胞外切割可能提供更均匀的药物分布，从而增加治疗效果。然而点击化学反应的临床应用对试剂的安全性和足够的体内稳定性和反应性提出了很高的要求。到目前为止，只有Tagworks开发的哒嗪消除反应被证明具有临床潜力。但相信随着技术的积累以及成熟，新一代点击化学ADC有望在患者群体中得到更广泛的应用。参考文献Chemical Linkers in Antibody–Drug Conjugates (ADCs).Triggered drug release from an antibody–drug conjugate using fast “click-to-release” chemistry in mice.Chemically triggered drug release from an antibody-drug conjugate leads to potent antitumour activity in mice.A bioorthogonal system reveals antitumour immune function of pyroptosis.