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新兴细胞和基因疗法（CGT）正在改变医学领域，为患者提供传统药物无法实现的针对性和个性化治疗。截至目前，针对血癌的CAR-T细胞疗法，针对血液系统疾病的基因工程造血干细胞以及治疗一系列罕见疾病的基因疗法，如遗传性视网膜营养不良症和脊髓性肌萎缩症 (SMA)已是市场上已经获批的产品。然而，进入下一阶段，还需要面临一些挑战。对于CGT来说，作为基本的安全性和有效性特征，通过控制活性剂量、时间和部位来精确调节治疗细胞或基因的活性水平至关重要。但目前，治疗性细胞的过度激活和基因治疗中的脱靶效应仍然是需要克服的重大障碍。当输注的CAR- T细胞过度激活时，CAR-T细胞活性可能导致细胞因子释放综合征 (CRS) 和神经毒性，而基因疗法可能会破坏非目标基因的功能或调节，从而导致严重不良反应。最近几年，合成生物学得到快速发展，正在提供新的解决方案来解决这些问题。新型Synthetic receptor（合成受体）平台已成为精确控制工程细胞功能的强大工具，用于微调治疗过程，例如通过识别和处理目标信号或生物标志物来调整剂量或生物活性分子的产生，合成生物学与治疗策略的融合可能会大大加速细胞和基因疗法向下一代的进化。2024年1月3日，国科大李伟团队在Nature子刊《Signal Transduction and Targeted Therapy》刊登了一篇综述文章，回顾了合成受体系统的当前知识，包括其特征和应用，以及设计和改进合成受体的策略，另外还讨论了开发和调整合成受体平台以编程新基因和细胞疗法的挑战。下面小编带大家一起了解一下这篇综述内容。合成受体概述对于功能性合成受体，至少有两个结构域：用于特异性结合的传感结构域（通常是单链可变片段scFv或纳米抗体），以及将传感信号转换为输出信号的执行器结构域。可以使用天然或人造结构来设计合成受体，通过重新连接细胞信号接受和传导的关系，赋予细胞特制的功能，图1总结了过去合成受体研究中关键发现的时间表。图1 过去三十年来合成受体的里程碑式研究成果近年来，模块化合成受体不断被设计和发展用于生物医学应用，如CAR 是一种合成受体，能够与靶细胞高度特异性地相互作用。另一种广泛使用的合成受体是合成Notch（synNotch），当靶向第二抗原时，能够有条件地驱动CAR的表达以及工程化T细胞中的额外信号（图2c）。此外，合成受体已被用来改造治疗细胞，这些细胞可以感知任意输入，例如小分子和疾病相关生物标志物，并在动物模型中分泌治疗分子以做出响应（图2d）。此外，具有紧凑尺寸的合成受体，如图2e所示的RASER（异常信号重新布线至效应器释放）可以通过AAV载体在靶向基因疗法中直接递送以治疗ErbB过度表达的癌症。图2 使用合成受体编程细胞和基因疗法除了生物医学应用外，合成受体已广泛应用于基础研究中，从而以受控和精确的方式研究细胞信号传导和行为的各个方面，包括细胞分化、迁移和形态发生。例如，研究人员已使用 synNotch 受体对工程细胞进行编程，使其响应近分泌信号传导而自组织成多细胞结构。同时，合成受体也可以作为合成正交形态原系统的一部分进行工程设计，以严格控制的方式对三维（3D）组织进行图案化（图2f）。多种类型的合成受体哺乳动物合成受体可以根据不同的分类标准进行分类，这里概述了根据四个不同原则分类的各种可用合成受体，并进一步讨论了它们的优势和局限性。1、细胞表面受体和细胞内受体根据结合配体的位置，合成受体可分为细胞表面受体（又称跨膜受体）和细胞内受体。细胞表面受体一般包括三种类型的跨膜受体（即酶联受体、G蛋白偶联受体和离子通道样受体），它们跨越质膜并将细胞外信号转换为细胞内信号。对于这一类别，每个合成受体包含一个胞外配体结合结构域、至少一个跨膜结构域和一个胞内效应结构域。除了CAR 之外， synNotch、SNIPR（合成膜内蛋白水解受体）、RASSL（仅由合成配体激活的受体）、Tango、MESA（模块化细胞外传感器），ChaCha、TCS（双组分系统）、嵌合细胞因子受体和GEMS（广义细胞外分子传感器）也属于细胞表面受体的范畴。细胞内受体可以位于细胞质或细胞核中，也可以锚定在细胞的细胞内膜上。Cal-Light（钙门控和光门控开关）、CHOMP、体内传感器、RASER（重新布线异常信号以释放效应器）、LOCKR（闭锁正交笼状蛋白）、COMET（可组合的哺乳动物转录元件）和POST（磷酸调节正交信号转导）属于细胞内受体的类别。值得注意的是，这里讨论的合成受体也可以称为合成蛋白开关。由于细胞内受体只能通过细胞内输入激活，因此其中许多受体被设计为由可以穿过质膜的化学分子诱导的开关。2、天然信号传导的受体与正交信号传导的受体激活的受体通过多个下游途径触发信号转导，顾名思义，根据驱动的下游途径（天然的或工程的），可以将合成受体分为基于天然信号传导的受体和基于正交信号传导的受体。基于天然信号的受体将内源信号通路重新连接到原始或定制的输出信号。此类合成受体包括 RASSL、CAR 、嵌合细胞因子受体、GEMS和GEAR。它们不可避免地会激活原有途径来驱动输出。其中，RASSL、CAR和嵌合细胞因子受体将内源性途径重定向到目的配体，从而执行所需的功能。虽然 GEMS 和 GEAR 通过内源通路生成新的定制输出，但它们可以同时导致内源转录网络的激活。另一方面，调节转录网络的能力是基于天然信号传导的受体比基于正交信号传导的受体具有独特的优势，允许执行自然和高度复杂的信号。如CAR是为了模仿TCR的功能，通过调节内源信号通路实现抗肿瘤活性，同时，CAR激活可以诱导额外的转基因（如激活的核因子）T细胞驱动的细胞因子表达，这是正交系统无法实现的。相比之下，基于正交信号传导的受体完全独立于内源信号传导途径。这归因于正交合成转录因子（syn-TF）或正交信号转导系统的使用，因为它们不能识别内源性调控元件并激活内源性信号级联。然而，一些syn-TF（如基于dCas9 的TF和基于TALE的TF）可以编程内源基因表达，而不需要额外的合成启动子。值得注意的是，最广泛使用的正交转录因子是非人源的（如酵母和细菌），因此在临床应用中具有很高的免疫原性风险。使用包含源自人TF的DNA结合结构域和激活结构域的人源化 syn-TF 将大大降低免疫原性风险，而这些融合的转录因子仍然能够激活内源性信号传导。3、可溶性配体结合受体和表面配体结合受体合成受体可以高特异性可溶性和表面结合的配体。根据配体的特性，相应的合成受体可分为可溶性配体结合受体和表面配体结合受体。多种配体呈可溶形式，包括大多数化学分子、激素、细胞因子、生长因子、细胞内可溶性蛋白和一些从膜蛋白上切下的肽（如癌胚抗原 CEA)。上面列出的可溶性分子可以诱导可溶性配体结合受体的活化，例如Tango、ChaCha、MESA、嵌合细胞因子受体、CHOMP、GEMS LOCKR、和POST。通过使用可以穿过质膜的化学分子，已经开发出了几种细胞内合成受体（如POST、CHOMP 和LOCKR）。同时，当受体的配体结合域位于质膜、细胞表面受体（如Tango、ChaCha、MESA 和 GEMS）之外时，它们也可以充当细胞外配体。对于肽/蛋白质配体，在大多数情况下，它们无法进入细胞，因此作用于细胞表面受体，随后触发下游细胞内信号级联反应。固定细胞质膜上的表面结合配体，可以反式激活相邻接收细胞上的细胞表面受体。CAR和synNotch是典型的表面配体感应受体，理论上不能被可溶性配体激活。可溶性配体结合受体通常通过配体诱导的二聚化来激活以触发下游信号传导，而表面配体结合受体需要配体-受体相互作用产生的机械力来激活下游信号传导。因此，可溶性配体结合受体（例如嵌合细胞因子受体和GEMS）可以在长距离运输后由配体诱导激活，而表面配体结合受体（CAR和synNotch）只能以近分泌方式发挥作用。4、部分模块化受体和完全模块化受体根据合成受体是否完全由可重构组件组成，我们将其分为部分模块化受体和完全模块化受体。可以通过设计人工识别结构域同时保留天然信号转导域来构建部分模块化受体，或者保留天然识别结构域同时设计人工信号转导域。前者可以将内源信号通路重新连接到新配体（如 CAR、嵌合细胞因子受体和GEMS），而后者可以通过天然配体（如Tango、ChaCha和dCas-synR）激活替代通路。因此，前者可归类为天然信号传导的受体，后者可归类为正交信号传导的受体。完全模块化的合成受体，具有经过设计的识别域和信号转导域，包括 synNotch、SNIPRs、MESA和 LOCKR可以执行新功能，而不以正交方式破坏内源性途径。值得注意的是，用于完全模块化合成受体模块化组装的组件，可以源自天然存在的成分（synNotch、SNIPR 和MESA）或从头设计的成分（LOCKR）。合成受体工程在这里，将重点介绍四种单次跨膜合成受体的发展和迭代，即CAR（图3a）、synNotch（图4a）、MESA（图5a）和GEMS（图5b）。图3 嵌合抗原受体（CAR）的设计和工程化嵌合抗原受体 (CAR)CAR 是一类最著名的合成受体系统，目前，CAR已应用到T细胞、NK细胞和巨噬细胞等免疫细胞中。此外，包括不变自然杀伤T（iNKT）细胞、粘膜相关不变T（MAIT）细胞和γδT（γδT）细胞在内的先天T细胞也被认为是有前景的免疫效应细胞，这些细胞表现出内在的抗肿瘤微环境（TME）能力和移植物抗宿主病 ( GvHD )的风险最小。CAR主要由胞外结构域(ECD)、跨膜结构域(TMD)和胞内结构域(ICD)组成(3a )，其结构的模块化特点，极易于修改和重新设计。胞外域可分为信号肽 (SP) 和配体结合结构域 (LBD)，前者促使跨膜受体蛋白定位至质膜，后者则特异性识别抗原。LBD通常是抗体的scFv，通过柔性多肽连接子将抗体轻链和重链可变区连接起来。除了简单地scFv之外，CAR 还可以由两个不同的抗原识别结构域组成的双特异性抗体（也称为“串联CAR”）（图3c）。因此，串联CAR-T细胞可以识别单个癌细胞中表达的不同抗原（如Her2和IL-13和IL-13Rα2、CD19和CD20），从而减少肿瘤逃逸的可能性。除此之外，还有用于T细胞治疗的拆分、通用和可编程 (SUPRA) CAR 系统（图3c）。在该系统中，传统的 CAR 架构分为两个元素：（1）通过将 scFv 与亮氨酸拉链融合而形成的可溶性 zipFv；（2）通用zipCAR，包含细胞外同源亮氨酸拉链的剩余跨膜和细胞内结构域。通过添加不同的 zipFv 蛋白，表达 zipCAR 的独特 T 细胞可以重新靶向不同的肿瘤抗原。此外，SUPRA CAR 可以通过可溶性zipFv剂量微调T细胞，从而提高T细胞治疗的安全性和有效性。TMD 通常是跨越质膜的疏水性 α 螺旋，其功能是将CAR蛋白锚定到膜上。除了控制膜整合外，TMD 还调节 CAR 之间的关键相互作用，例如组装和激活。CAR中使用的TMD几乎全部源自天然T细胞蛋白，如CD8、CD28、CD4和CD3δ。另外也有学者从头设计TMD，调节CAR功能和CAR- T细胞活性，相对于常用的CD28 TMD减少了细胞因子释放。ICD充当传输激活信号的角色。大多数CAR的ICD都包含CD3δ衍生的信号传导部分，该部分具有三个基于免疫受体酪氨酸的激活基序 (ITAM)。从20世纪90年代衍生出来的第一代（1G）CAR到现在，CAR本身的结构一直在不断发展到第五代（5G）（图3b），旨在提高特异性并最大限度地减少脱靶毒性。1G CAR仅包含ITAM来提供激活信号传导，没有共刺激结构域。尽管1G CAR被证明能够在小鼠体内激活T细胞并控制肿瘤，但它们在随后的临床研究中未能实现抗肿瘤反应。原因可能是单独的CD3z不足以激活静息T淋巴细胞或触发最佳量细胞因子的产生。为了解决这些问题，2G CAR通过在1G CAR的基础上合并共刺激域（图3b），在肿瘤抗原刺激时能够发出第二个信号，这一改进实现了细胞因子产生、CAR-T细胞持久性和抗肿瘤功效的增强。3G CAR结合多个共刺激域进一步增强CAR-T细胞效力，尽管在体外和体内均已证明了包括延长持久性和增强抗肿瘤功效在内的潜在益处，但一些临床结果并未证明3G CAR-T细胞具有显著优势。由于现有数据是从相对较小的异质样本中获得的，因此得出结论还为时过早，需要进一步的大规模研究来充分评估其可行性。4G CAR是从2G CAR改造而来，可组成或诱导分泌细胞因子（如IL-10、IL-12、IL-7、IL-15、IL-18 和 IL-23），从而协同宿主免疫细胞增强肿瘤杀伤能力。然而，实际上，释放的细胞因子在进入循环后可能会发生全身副作用。在一项临床研究中，修改了肿瘤浸润淋巴细胞 (TIL)，使其在NFAT诱导启动子的作用下表达IL-12，从而治疗转移性黑色素瘤。结果观察到大多数患者会产生严重的毒性，这可能归因于分泌的IL-12。因此需要更多的临床试验数据来评估其安全性和有效性。与4G不同，5G CAR的免疫调节因子表达模块被新的共刺激结构域取代，该共刺激结构域可以激活CAR-T细胞内的特定信号传导途径。基于这一原理，多种方法不断涌现，如将 IL-2 受体β链（IL-2Rβ）添加到CAR中，被抗原激活后，IL-2Rβ结构域可以激活JAK激酶和STAT3/5 信号通路，这可以使CAR-T细胞以最小的毒性实现抗肿瘤效果和体内扩增。然而，它可能会增加CRS的风险，因此在转化研究中应当谨慎。然而，最大限度地减少CAR 免疫细胞的脱靶和脱肿瘤毒性仍然具有挑战性。在此背景下，下一代CAR的开发已经开始（图3c）。例如，双CAR或synNotch CAR的组合逻辑控制可以通过两种或更多种抗原的存在来增强肿瘤靶向特异性。另一方面，通过开关CAR进行的安全控制可以微调CAR 活性，而终止开关CAR可以管理CAR-T细胞的存在时间。这些都是未来提高CAR-T细胞免疫治疗安全性的策略。此外，目前正在研究的大多数 CAR-T 细胞都是通过将CAR构建体插入自体T细胞中，而不破坏内源性TCR基因。在这种情况下，可以避免引发GvHD的风险。然而，患者的身体状况和免疫细胞状态通常不稳定，为了促进同种异体“现成”CAR-T细胞移植，使用核酸内切酶敲除TCR α链(TRAC)，从而破坏TCR的表达，可以成功防止移植物抗宿主的风险。如利用CRISPR/Cas敲入使得CAR编码基因能够精确整合到外周T细胞的TRAC位点中，这不仅有利于同种异体 CAR-T 的细胞产生，而且还增强了T细胞效力。然而，最近的研究表明，内源性 TCR 在促进 CAR-T 细胞在动物模型和患者体内的持久性方面发挥着关键作用，这指出在肿瘤免疫治疗中平衡从 CAR-T 细胞中去除内源 TCR 的复杂影响至关重要。合成Notch受体 (synNotch) 对Notch受体的深入研究为Notch受体的分子机制提供了重要的见解。模块化和独立于天然配体的机械力触发信号传导等内在特征，使Notch受体非常适合模块化嵌合受体工程。可以利用这一点，将天然 Notch 受体的跨膜核心结构域（图4a）以及细胞传感结构域和细胞内执行结构域组合创建新的synNotch 受体系统。图4 合成Notch (synNotch) 受体的设计和工程化其中synNotch可以正交地发挥作用来控制细胞分化、空间模式和布尔决策，synNotch还可以感知肿瘤抗原，然后驱动CAR的表达（如上所述的synNotch CAR），这使得仅通过双抗原识别激活的AND门控T细胞的工程化成为可能。另外，synNotch使CAR-T细胞能够产生特定的治疗反应，如以非常精确和局部的方式分泌细胞因子和抗体。与传统CAR 的激活驱动 T 细胞产生天然细胞因子谱相比，synNotch可以自定义控制细胞因子的表达。synNotch 受体与 CAR的更强大组合正在兴起，以实现精确有效的癌症杀伤，这让synNotch成为应用于癌症免疫治疗的另一种具有潜力的合成受体系统。尽管在实际的生物医学应用方面仍然存在挑战和局限性，但研究人员正在努力找出可能的解决方案。如天然Notch受体具有反式和顺式相互作用模式共存的固有特征，因此，当同源配体与受体存在于同一表面（顺式）时，由于顺式抑制，无法实现激活。为了避免顺式抑制，采用“flippase-out”策略在flippase重组酶转基因果蝇中实现 synNotch 及其配体的互斥表达。另外，synNotch 受体激活通常需要高水平的配体，这对于其他合成受体系统也很常见。而最近的一项研究报告了 synNotch 的改进版本esNotch，通过添加天然Notch衍生的细胞内疏水序列，使得配体激活水平降低了14.6倍（图4b）。此外，还有人修改了synNotch系统，形成合成膜内蛋白水解受体 (SNIPR)（图4b），实现了配体水平降低并增强了配体诱导的信号。同时，SNIPR可以通过人源化模块实现完全人源化，最大限度地降低免疫原性风险。还有人通过用化学诱导二聚化（CID）结构域取代传统的蛋白质特异性识别结构域，在synNotch的基础上衍生出正交化学激活细胞表面受体（OCAR）系统（图4b）。在小分子的诱导下，细胞上的工程化OCAR 可以形成异二聚体，并通过释放 synTF 来触发信号激活。当OCAR系统与传统的synNotch在同一细胞上共表达时，OCAR的一部分将通过卷曲螺旋相互作用被 synNotch 受体隔离，从而使OCAR无法被诱导剂激活。当synNotch受体被相应细胞激活时，OCAR可以恢复其对诱导剂的反应性，从而通过添加诱导剂进一步增强synNotch信号传导。由于其作用机制，OCAR 系统表现出内在的关闭开关，在出现毒性或故障时可用作安全开关（图4b）。模块化细胞外传感器架构 (MESA)与synNotch受体一样，模块化细胞外传感器架构（MESA）受体也利用synTF的蛋白水解释放，其易位到细胞核并启动转录激活以执行正交信号而不中断内源信号通路（图5a）。但与需要表面配体诱导机械力的 synNotch 受体不同，31 MESA 受体通过可溶性配体触发的受体异二聚化发出信号，执行随后的蛋白水解切割。图5 模块化细胞外传感器架构（MESA）和通用细胞外分子传感器（GEMS）的设计和工程每个MESA受体包含两种不同的单次跨膜蛋白，因为它们的胞内结构域是不同的（图5a），MESA 受体还包含三个模块结构域，通过 synTF 释放将细胞外配体结合输入转导为细胞内转录输出。通过设计细胞外传感器结构域，MESA受体可以重定向到新的配体。然而，MESA架构的也需要高水平的配体独立激活，这可能是由于运输期间或细胞表面上的瞬时受体二聚化所致，而TMD 优化可以降低配体激活水平并提高输出目的信号（图5c）。另外，在一项研究中，利用计算设计，使用 split-TEVp 系统进行 MESA 优化（图5c），也实现了低配体水平和高倍数诱导。同时，有报道设计了一种类似的基于 dCas9 的合成受体系统，称为“dCas9-synR”（图5c），该系统能够将天然输入信号与自定义的输出响应程序的直接激活相偶联。广义细胞外分子传感器（GEMS）对EpoR结构和信号传导机制的深入研究，刺激了基于EpoR支架的嵌合细胞因子受体的发展。这些嵌合细胞因子受体（如SD1D2g-1A）含有细胞外scFv、细胞外EpoR D1D2以及TMD结构域，和细胞因子受体的细胞内结构域（如gp130和EpoR）（图5d）。这些嵌合细胞因子受体可以由配体依赖性开/关调节，并模仿天然细胞因子受体系统的功能。在此原型基础上，对GEMS系统进行了合理的设计和工程化。GEMS受体包含源自具有F93A突变的促红细胞生成素受体(EpoR)的标准跨膜支架(图5b)，消除了促红细胞生成素的敏感性。细胞外识别结构域可以进行模块化替换，以响应各种细胞外可溶性配体。胞内结构域采用各种信号传导域将输入重新分配到不同的内源性途径（如JAK/STAT、PI3K/Akt、PLCG和MAPK/ERK）。在最近的报告中，GEMS 平台已发展成为通用工程激活调节剂 (GEAR)和模块化双特异性细胞外受体 (AMBER)。GEAR系统通过DNA结合模块将内源信号诱导的synTF核转位和基于dCas9的基因表达结合起来（图5e），由不同受体（包括 GEMS 受体）激活的各种途径（如NFAT、NFκ、MAPK或 SMAD）可以整合到工程化的GEAR中。AMBER系统是一种基于 DARPin 和 GEMS 的可编程接收器（图5e），它继承了这两个系统的特性和优点。因此，AMBER可以被设计和精炼，以模块化和可预测的方式与新的可溶性配体结合。为了概念验证，GEMS及其衍生物已应用于体外和体内工程设计细胞以进行疾病治疗（图2d ）。结论和观点合成受体的设计和工程取得了巨大进步，合成受体系统的不断进化加速了其生物医学应用和临床转化。作为最成功的案例，CAR 走在了最前沿，已有6种CAR-T细胞疗法获得FDA批准，还有很多正在进行临床研究（ClinicalTrials.gov）。此外，包括CAR-NK和CAR-M在内的其他CAR工程细胞也在转化研究中得到广泛研究。展望未来，该领域的一个重要目标是揭示设计原理，以指导具有所需特性和功能的合成受体的合理设计。越来越多的报告利用计算设计策略来工程和改进合成受体系统，如CAR、MESA 和从头蛋白质开关。其中，从头设计的蛋白质已被纳入合成受体工程中。预计未来可以通过从头设计策略或生成语言模型来设计各种有价值的合成受体。选择功能性合成受体系统，并将其与免疫细胞整合，可能会突破合成受体应用的界限并开发新的细胞疗法（图6）。值得注意的是，不同合成受体系统的组合可以表现出协同效应并进一步增强其性能，研究表明synNotch CAR-T细胞通过组合抗原识别显著增强其安全性和抗肿瘤效果或超低的抗原密度识别。随着工程干细胞疗法的出现，合成受体也可用于工程化iPSC衍生的细胞产品（图6b, c），有可能用于通过程序化通信增强其与宿主微环境的生存和植入能力（图6b）。然而，由于存在一些关于干细胞治疗的预防性数据和批评态度，未来的试验需要进一步研究干细胞治疗本身的安全性和有效性。同时，在临床前和临床研究中也需要谨慎解决对遗传物质（如转基因免疫原性）和引入的遗传修饰的安全性的担忧。图6 合成受体的潜在治疗应用不断扩大此外，合成受体还可以对体内基因疗法进行编程，从而提高安全性和有效性（图6d）。体内基因治疗的一种有前途的方法是利用腺相关病毒（AAV）系统将治疗性遗传物质递送到人体中。尽管 AAV 作为新型基因疗法越来越多地用于临床试验，但其有限的包装容量（约4.7kb）阻碍了上述大多数合成受体的装载。为了满足临床需求，需要设计或筛选尺寸紧凑的合成受体递送载体，如当下火热的LNP。此外，具有最小免疫原性的人源化合成受体对于推进基因治疗以及工程细胞治疗也至关重要。总之，具有所需功能的模块化合成受体已被设计并应用于治疗应用。与此同时，技术进步不断促进和加速合成受体系统的开发和进化，未来预计合成受体生物学会快速发展，并不断为程序化基因疗法和工程细胞疗法提高新的方向，而这是现有方法无法实现的。原文链接https://www-nature-com.libproxy1.nus.edu.sg/articles/s41392-023-01680-5#Sec14/

点击上方的 行舟Drug ▲ 添加关注作者｜朱亚芳，张自强，徐成*内容来源｜中国新药杂志 2020局部起效的皮肤外用制剂用途广泛，剂型多样。此类制剂辅料成分复杂，处方组成和制备工艺参数的微小差异就有可能导致产品不同的质量特性，从而影响药物的安全性和有效性。本文汇总了中国、美国、欧盟和日本的相关技术法规要求，介绍了体外一致性评价的指标和评价手段，并探讨了体内一致性评价的决策树和等效标准，力求为相关产品的研发质量提升提供参考。皮肤是人体面积最大的器官，具有保护、感觉、分泌、排泄、呼吸等功能，由外至内分为角质层、表皮层和真皮层，其中真皮层中分布有血管、汗腺和脂腺。局部外用制剂的治疗领域包括细菌感染、真菌或酵母菌感染、病毒感染、瘙痒、痤疮、银屑病、白癜风等[1]。这类局部外用制剂针对发病部位的不同，通过渗透作用到达不同的皮层，发挥治疗效果，其渗透过程多为被动吸收过程，无需提供能量。局部起效的外用制剂剂型多样，涵盖固体、液体、半固体等多种剂型，尤以半固体制剂居多，主要包括软膏剂、乳膏剂及凝胶剂。此类制剂辅料成分复杂，处方组成和制备工艺参数的微小差异就有可能导致产品不同的质量特性，从而影响药物的安全性和有效性。因此，在该类制剂研发过程中，需要结合各自剂型的特点，充分进行科学合理的评价，以达到与参比制剂质量和疗效一致，满足临床用药的替代性。同时，深入掌握该类制剂的评价体系，对建立已上市产品在生产过程中的有效质控策略具有重要的指导意义。本文仅讨论局部起效的经皮给药外用制剂，局部给药后全身起效的制剂不在讨论范围内。1 国内外政策法规人用药品注册技术要求国际协调会(ICH) 各成员国中，不同国家和地区对皮肤局部外用制剂审评审批的政策法规要求不一，体内外评价要点也不尽相同。本文对现阶段各主流国家或地区的技术要求进行了汇总，见表1。近年来，我国开始逐步规范和提高皮肤局部外用制剂的审评审批要求，2018 年7 月国家药品审评中心发布了《新注册分类的皮肤外用仿制药的技术评价要求( 征求意见稿)》，对皮肤局部外用制剂研发过程中的参比制剂选择、处方工艺开发、原辅包质量控制、质量研究与控制、稳定性研究、等效性评价方法等方面提出了明确的技术要求。美国FDA 于1995 年发布了《局部皮肤病皮质类固醇：体内生物等效性》指南文件，并在近年来持续发布了针对特定产品开发的非约束性指南。这些文件界定了仿制药提交申请时应该进行的检测测试项目。由于临床终点研究的复杂性，近年来美国FDA 已经接受了一些产品的替代生物等效性评估方法。在欧洲，局部外用仿制药一般不经历集中审评程序[14]，该类制剂往往是通过互认和分散程序后，再递交互认资料申请。此类申请仅适用于在欧盟内上市至少10 年，且具有公认疗效以及可接受的安全性的仿制药。在这种情况下，申请人可根据以前发表的非临床和临床数据，证明产品在拟申请适应证中的有效性和安全性。日本对皮肤局部外用制剂的等效性研究有详尽的要求，包括体外测试和体内测试，具体分为皮肤药代动力学试验、药理试验、未吸收药物测定试验、药代动力学(PK) 试验、临床试验、体外药效(PD)试验和动物试验等类别，并提供了经皮水分损失(transepidermal water loss，TEWL) 法和最大效应(Emax) 模型用于评价等效性[12]。其中，TEWL 法适用于起效部位为角质层本身或更深层次外用制剂的药代动力学试验，Emax 模型用于估算药效的持续时间。表2 汇总了不同国家或地区对皮肤局部外用制剂等效性提供资料内容的要求[15]。各国家或地区间的差异主要存在于对药动学终点和皮肤药代动力学的认可程度以及是否对溶液剂实施豁免政策等方面。2 体外和体内一致性评价的技术要点2.1 体外一致性评价良好的体外一致性是保证仿制药与参比制剂体内一致性的基本前提。通过查阅参比制剂的上市资料及逆向工程，可以确定参比制剂中的辅料种类及相关物化特性，从而定义仿制药产品的目标质量概况。一般，自研制剂需要与参比制剂保持辅料种类及用量的一致，即保证辅料用量为参比制剂相应辅料用量的95％～ 105％。在此基础上，如能与参比制剂具有相同的微观结构，则能进一步接近质量和疗效一致性的目标。对于皮肤局部外用的各种剂型，涉及的微观结构包括流变学指标、乳液类型(o/w 型和w/o 型)、液滴直径、活性成分特性( 晶型、粒度分布、溶解状态) 等。2.1.1 制剂学特性对于皮肤局部外用制剂的质量评价，需要进行各自剂型下的常规项目测试，以确保其含量、疗效、纯度和安全性，并应在稳定性试验期间持续监控，最终确认获得符合规范和监管要求的数据和产品。在开发和稳定性试验期间，应尽可能全面地研究各种指标参数，最终根据变化情况，酌情选择关键指标，制订入质量标准。性状：系对产品外观品质的定性描述，如颜色、气味、状态等。对于贮存过程中易发生颜色变化的品种，尤其需要注意颜色描述。对于非均相体系，应着重关注均匀性的考察，评价手段包括目测、显微观察等，应保证贮存期间乳膏不发生相分离、凝胶不发生渗水、混悬状态的制剂晶体不发生显著性增长或聚集。鉴别：可应用红外(IR)、高效液相色谱(HPLC)、紫外(UV) 等方法进行专属性评价。酸碱度：产品的酸碱度可能影响药物的稳定性和半固体产品的物理化学性质( 如乳液稳定性、流变行为)，甚至会影响抑菌剂的有效性和产品的黏度等。在这种情况下，需要缩小酸碱度范围以确保药物在货架期内的稳定性。应通过产品在不同酸碱度情况下的稳定性数据来证明设定的酸碱度范围的合理性。含量：含量是评价产品规格和给药剂量的重要指标，可用HPLC、微生物方法等多种手段测定。由于半固体制剂配方的复杂性，乳液及油性半固体制品在测定的前处理过程中应着重关注药物在提取步骤的回收率。含量均匀度：生产过程中，在灌装工序的不同时间取样检测，可用于确认整个批次产品在灌装过程的均匀程度；在同一包装容器内的不同位置取样，可用于确认和推测产品物相分离的可能性。相对密度：半固体制剂相对密度的变化受产品组成、工艺变化的影响，也可能受夹带空气的影响。含水量：对于某些含有水的半固体制剂，需要监控水含量，如超过预定范围就会影响半固体制剂( 如软膏) 的微生物特性、物理和化学稳定性。增失重：使用特定包装形式的半固体制剂，特别是使用了塑料容器且含有挥发性物质的处方，应注意产品在密封状态下的质量变化。凝胶制剂中含有大量的乙醇时，需要定量分析乙醇含量。机械特性：测定项目包括黏度、稠度、弹性、可塑性、锥入度、黏附性、流变性等。半固体剂型通常显示非牛顿流体的流动特性，因此需要对不同剪切力下的流体特性进行测定和比较，尽可能地与参比制剂的特性相匹配。活性成分的混悬状态：如活性成分在制剂中处于混悬状态，则应重点关注其粒度、晶型及晶癖的变化；对于乳液型产品，应将乳滴大小作为药物释放和稳定性考察项目。抑菌剂含量：抑菌剂浓度应尽可能低，或与参比制剂一致。如果抑菌剂含量较低，可通过抑菌效力试验来确定稳定性试验中所需抑菌剂含量的下限。抗氧剂含量：抗氧剂含量可纳入产品的放行标准。稳定性试验期间，也可通过其他评价指标的稳定性( 如含量、有关物质等) 对抗氧剂用量的合理性进行评估。有关物质：确定杂质限度时应将药品的最大日剂量考量在内，通过ICH Q3B 的质控限和鉴定限来确认特性杂质和未知杂质的限度；此外，应通过构效关系来评估杂质的遗传毒性和致癌风险。残留溶剂：需注意残留溶剂的检测和控制。但如使用乙醇为溶剂，则乙醇应作为辅料考量，而非残留溶剂。包装：产品的包装应具有良好的视觉效果，并确保与内容物相容性良好。半固体制剂在稳定性试验过程中，应注重样品留样方向的问题：管装样品可考虑水平放置，以保证药物最大程度地接触管壁、管口和管尾；瓶装和罐装样品，应酌情考虑增加倒置对照组，增加与瓶口接触的风险考察。稳定性：皮肤局部外用制剂通常为非均相热力学不稳定体系，除常规的长期试验、加速试验外，应格外关注产品的冻融试验及开启稳定性试验。2.1.2 体外释放特性体外释放对于处方开发过程中评价半固体状态的皮肤局部外用制剂是至关重要的，因为药物必须首先从制剂中释放，才能扩散到皮肤中得以利用。尽管体外的释放速率可能不能完全反映药物透皮递送的速率，但可参考检测到的释放速率的变化来推测某些物理化学性质( 如原料药粒度、物理状态) 及工艺参数等变化带来的制剂内在质量差异，此类差异可能会最终影响制剂的疗效。通过考察药物的释放行为，可降低产品批次影响体内性能的风险[16]。释放曲线可不制订入成品的放行标准，但一般应作为产品开发和稳定性试验的考察项目。体外释放的测定方法包括流通池法、扩散池法、动态浸泡细胞法、改良的半固体容纳法、桨碟法等。以上方法中，以扩散池法最为简便和实用。美国药典(USP42)<1742> 章节收载了 3 种类型( 图1A ～ 1C) 的扩散池，用于半固体制剂的体外释放测定。这3 种扩散池测定原理相同，仅在载药端封口情况、尺寸设计、接收液流动效果等方面存在微小的设计差异，可根据特定产品的挥发性、流体特性和载药量等方面进行选择。除此之外，浸没池、流通池、桨碟法等装置( 图2) 也可用于评价皮肤局部外用制剂的体外释放。实际项目开发过程中，可根据制剂的具体情况选择适宜的装置。国家药品审评中心发布的《新注册分类的皮肤外用仿制药的技术评价要求( 征求意见稿)》在附件1 中对体外释放试验的设计要求、比较指标、结果评价有详尽要求。一般使用扩散池系统并安装人工膜，样品和接收液介质分别置于人工膜两侧，通过不同时间点取样，并多次重复( 一般建议6 个样本) 测定后，得到制剂的释放特征数据。以单位面积释放的药物量对时间平方根做图，可得到制剂的释放率，计算自研制剂和参比制剂的中位体外释放率比值的90％置信区间，如计算结果在75％～133.33％范围内，则视为二者等效[3]。2.1.3 体外透皮特性体外透皮试验的目的是使用人体或动物的离体皮肤模拟制剂在生理条件下的透皮过程，能在一定程度上反映制剂的临床有效性。目前，体外透皮试验一般采用扩散池法。《新注册分类的皮肤外用仿制药的技术评价要求( 征求意见稿)》在附件2 中列举了对体外透皮试验的试验次数、试验时间、试验条件、渗透药物量的校正等方面的基本要求。试验结果以平均渗透率作为判定自研制剂和参比制剂相似性的依据，在规定的试验时间或渗透率达到平稳后的1 个时间点和同一时间点渗透一半速率的时间点，自研制剂与参比制剂的平均渗透率之比如在0.7 ～ 1.3 范围内，则视为二者等效[3]。与此同时，应对试验次数、渗透率的变动和皮内滞留量进行测定和比对。2.2 体内一致性评价2.2.1 是否需要进行体内研究的评判近年来，有学者提倡参考口服固体剂型生物药剂学分类系统( biopharmaceutics classification system，BCS) 的模式对皮肤外用制剂建立局部给药分类系统(topical drug classification system，TCS)，分类标准参见图3[17—18]。该系统基于组分定性(Q1)和定量(Q2) 的等效性，结合皮肤局部外用制剂微观结构和体外释放速率的一致性(Q3)，将皮肤局部外用制剂分为4 类。如果皮肤局部外用制剂与参比制剂达到Q1 和Q2 一致，并且符合“FDA 扩大生产和批准后变更( 非无菌半固体制剂)”(SUPACSS)中Q3 一致的要求[19]，则将其归类为TCS 1 类；如果Q1 和Q2 一致、但Q3 不一致，则为TCS 2 类；如果产品具有不同的Q1 和Q2、但符合Q3 一致的要求，例如，赋形剂与参比制剂中的种类不同( 相对惰性) 但对体外释放速率没有显著影响时，可归类为TCS 3 类；如果产品的Q1、Q2 和Q3 都不一致，则归类为TCS 4 类。在该分类体系下，TCS 1 类和TCS 3 类剂型可允许生物等效性豁免；TCS 2 类和TCS 4 类不符合生物等效性豁免条件，需要进行体内等效性研究。TCS 是一种基于皮肤局部外用制剂的组成和理化性质提出的分类系统，采用体外释放试验作为控制产品质量的工具，是SUPAC-SS 体外释放速率应用的延伸。虽然暂未被监管机构公开认可，但如果被纳入监管理论和法规，则能减少不必要的体内等效性研究，降低研发和监管负担，从而在较大程度上促进皮肤局部外用制剂的开发和仿制，利于患者获得更多的治疗药物选择。《新注册分类的皮肤外用仿制药的技术评价要求( 征求意见稿)》中提及的等效性评价方法，对于不同剂型和起效部位的制剂有不同要求。本文据此梳理了相关内容，绘制出决策树，见图4。如果开发非溶液剂的剂型，并且与参比制剂的关键质量属性不完全一致时，则需要进行临床对比。2.2.2 体内等效性研究2.2.2.1 临床终点的等效性研究迄今为止，对于皮肤局部外用制剂的仿制药申报，大多数监管机构要求以临床终点研究证明其与参比制剂相关的治疗等效性，并以此为“金标准”，因为治疗等效性可应用于所有药物剂型。然而，皮肤局部外用制剂具有较高的差异性，临床数据具有高度可变性，使得该类研究终点相对不敏感。通常，临床研究会采用随机、双盲、平行的试验设计，并以安慰剂做对照研究。合适的临床终点选择极为关键，但临床终点受众多因素影响[20]，如疾病类型、体征指标、给药方案、病患人群等。此外需要大量受试者(>500 人)，昂贵且耗时。2.2.2.2 药效学终点的等效性研究皮质类固醇制剂在临床上可使用血管收缩性能试验测试制剂的药效学，以确定局部生物利用度结果。根据FDA 发布的工业指南《局部皮肤病皮质类固醇：体内生物等效性》[4]，可通过色度计在不同时间段测量局部皮质类固醇制剂的药效学反应，得到是否具有等效性的结果。由于操作程序相对简单，受试者例数较少，该类试验可用于局部类固醇制剂的处方工艺开发或确认[21]，以支持仿制药的申报。有文献表明，可借由类维生素A 引起的经表皮水分流失确定该类制剂的药效学终点[1]，但是目前尚未被监管机构广泛接受。2.2.2.3 药动学终点的等效性研究通常，皮肤局部外用制剂不用于全身吸收，因此体内药动学研究通常不适用于皮肤局部外用制剂。在某些情况下，由于作用位点是皮肤的深层位点，可能发生全身吸收。此种情况下，体内循环中药物浓度与治疗效果之间没有确定的联系，仅能推测和衡量可能发生的不良反应事件。仅在极有限的情况下，如全身有明显的药物吸收，药动学研究可用于证明皮肤局部外用制剂的生物等效性，如FDA关于利多卡因贴剂的等效性评价草案[22]。2.2.2.4 皮肤药代动力学目前，皮肤药代动力学不适用于支持监管和审评系统中的生物等效性研究。然而，皮肤药代动力学作为一种指导制剂开发和设计的潜在方法，可用于前瞻性研究，以佐证药物的临床疗效。有相关文献讨论了该方法的最新进展及局限性[23]，其局限性包括离体皮肤缺乏主动转运过程、与活体皮肤有较大区别、不能充分反映药物体内起效的真实过程。3 展望本文汇总了国内外关于皮肤局部外用仿制制剂的法规文件，及相关体外、体内的评价标准。目前，国内对于皮肤局部外用制剂，尤其是半固体剂型，相关的文件和技术要求较少，而这些剂型本身存在较高的技术难度和独特之处。要完成该类制剂的研发质量提升，需要学术界、制药企业和监管机构的长期计划和合作；期望通过促进皮肤局部外用制剂研发评估方法的健全，推进高质量皮肤局部外用制剂仿制药的申报和审批。文章信息源于公众号天咨医药，登载该文章目的为更广泛的传递行业信息，不代表赞同其观点或对其真实性负责。文章版权归原作者及原出处所有，文章内容仅供参考。本网拥有对此声明的最终解释权，若无意侵犯版权，请联系小编删除。学如逆水行舟，不进则退；心似平原走马，易放难收。行舟Drug每日更新 欢迎订阅+医药大数据|行业动态|政策解读

目前自免市场是全球仅次于肿瘤的第二大市场，整体规模已超过1200亿美元，2022年全球销售额超过50亿美元的27个超级重磅炸弹，自免药物占据7个席位，进一步讲，伴随发病率上升、无法治愈、终生用药特点将进一步加速整个市场强劲向上。另一方面，竞争相对温和：相较肿瘤白热化的竞争，自免市场相对蓝海。随着机制蓝图清晰，上中下游靶点变得明朗，生物大分子、小分子靶向药等不断推陈出新，带来一个又一个大单品。现任药王修美乐源自自免市场，下一任药王可瑞达源自肿瘤领域（推测），再往后谁又会接棒可瑞达？或可源自自免领域。细数自免领域超级大单品（年销售额~＞50亿美金）。2022年，阿达木单抗（艾伯维，TNFα）全年销售额达212亿美金，乌司努单抗97亿美金（强生，IL-12/IL-23 p40），奥瑞珠单抗60亿美金（罗氏，CD20），度普利尤单抗82亿美金（赛诺菲，IL-4/IL-13），维得利珠单抗51亿美金（武田，整合素受体），瑞莎珠单抗51亿美金（艾伯维，IL-23 p19），司库奇尤单抗47亿美金（诺华，IL-17）。过去由于疾病认知不足，加上支付能力受限，国内自免市场没起来过，当然这其中也有中医药原因，相比西方国家，这是我们国内的治疗特色及竞争格局，哪里有慢病，哪里有不能治愈，哪里就有中医药的身影，对于患者来说，是好事，对于民族药来说，也是好事，比起竞争和合理性，我想应该更探讨的是如何取长补短，做更多关于机制以及临床的研究，以期更好管理一项疾病。现在国内自免市场有了好转迹象（自2019年），离不开外资渗透教育、医患认知观念改善、支付能力变强等等原因，但这与欧美成熟市场仍有不小的距离，我们应该学会为未来买单，就像买保险一样（比起车房，我更愿意把钱拿去去买保险，紧接着，我又配置了一些保险的股票），防患于未然，很多自免疾病症状并不明显，但如果不管理，长期的慢性炎症，极大可能会带来一系列共病，引起系统性全身疾病，为时已晚。关于自免疾病，用三个词语概括国内外主流观念：疾病修饰、早期治疗、全程管理，前卫又实在。下面将聊一聊AD，特应性皮炎，一种困扰全球1.76亿人的自身性免疫性皮肤病。特应性皮炎（AD），也称为特应性湿疹，是一种慢性、瘙痒、复发的炎症性皮肤病，多数发病于婴儿早期和儿童时期，但可以持续至成年期。通常在flares （复燃，活动期）和静止期间波动，部分患者表现为慢性活动性疾病，确切机制尚不明确，与表观遗传、遗传、免疫、环境、皮肤屏障障碍相关。这种疾病可严重影响患者及其家人的生活质量，带来严重社会经济后果。目前，科学界认为Th22和Th2细胞因子的失衡导致的角质形成细胞破坏，是驱动AD及促其发展的重要因素，涉及到的细胞因子有IL-4（皮肤屏障功能）、IL-13（皮肤屏障功能）、IL-22（表皮增生）、IL-31（瘙痒）、TLSP（TH2细胞分化）和IFN-γ（慢性皮损）。此外，由于表皮屏障蛋白聚丝蛋白突变导致的皮肤屏障功能受损，也可能增加微生物和过敏原的渗透，这在AD的发生发展中扮演重要角色。表现为皮肤瘙痒、干燥和反复出现的红疹，皮疹可以出现在身体任何部位，并随年龄增长发生改变。在婴儿中，皮疹主要发生在头皮、面部、手和脚上；在儿童时期，皮疹通常出现在膝盖和肘部内侧以及颈部前部等部位；在青少年和成年人中，皮疹通常发生在眼睑、脚踝和手腕上，膝盖和肘部的褶皱。此外，由于瘙痒的皮肤抓挠，可能会引起皮疹渗出或结痂。强烈的瘙痒会扰乱睡眠，极大影响患者及亲属的生活质量。AD常采取阶梯治疗模式，根据疾病严重程度，从外用药，光疗，到系统用药。对于轻度AD患者，在基础治疗的前提下，根据皮损状态及部位选择合适强度的TCS、TCI或PDE-4抑制剂，必要时口服抗组胺药治疗过敏并辅助止痒；中度AD患者，建议选用合适强度的TCS、TCI或PDE-4抑制剂快速控制症状并主动维持治疗，减少复发，儿童患者较大面积急性发作时，可以使用湿包裹治疗快速控制症状，慢性期较大面积可以使用窄谱UVB、小剂量UVA1光疗。上述治疗效果不佳或者不耐受，可考虑系统抗炎治疗；重度AD患者，尽早启动系统抗炎治疗并联合外用药及光疗。截至2023.04.14，全球共有876项资产布局AD适应症，已知靶点排序分别为JAK-1（22个）、IL-17A（18个）、IL-23（18个）、immunoglobulin heavy constant epsilon（16个）、IL-12B（16个）、TYK2（16个）。下图为Datamonitor healthcare对AD领域有潜力的药从商业及临床吸引力进行的分析，目前赛诺菲的dupilumab无论是商业价值还是临床价值都是最高的。Informa预测，特应性皮炎药物市场将在2022-31年大幅扩张，美国、日本和五个主要欧洲市场（法国、德国、意大利、西班牙和英国）的销售额将从56亿美元增长到161亿美元，复合年增长率为11.2%，受驱于几种靶向免疫调节剂。赛诺菲的Dupixent于2017年获得批准，多年来一直是治疗特应性皮炎的唯一品牌全身治疗药物。Dupixent通过靶向共享的IL-4受体α来阻断白细胞介素（IL）-4和IL-13信号传导。尽管预期内竞争会加剧，但随着市场渗透率提高，仍呈向上趋势。额外生物制剂的增长和进入将推动特应性皮炎市场呈大面积扩张趋势，lebrikizumab和tralokinumab将更特异性地针对IL-13通路；Mitchga（nemolizumab），一种针对IL-31受体的抗体，治疗重心为瘙痒。新批准的JAK抑制剂将进一步推动AD市场，目前作为后线治疗的选择（放在生物制剂后面）。第一代pan-JAK抑制剂Xeljanz上市后安全性研究结果公布后(用于≥50岁至少伴有一项心血管风险因素的风湿患者），该类药物的安全性受到质疑，但我们要意识到这项研究的人群（与AD多为儿童人群不符）。目前二代JAKi有了更好的选择性，并没出现重大心血管不良事件或恶性肿瘤风险升高的情况，即便如此，这类药物仍受到担忧，可能不利于市场增长。尽管如此，Rinvoq（乌帕替尼）在三期临床研究中（Heads Up），头对头打败Dupixent，同时本身口服拥有更大的给药便利性。Heads Up研究是首个直接比较乌帕和dupilumab用于AD的疗效和安全性的研究。这是一项随机、双盲、多中心、活性对照24周IIIb期研究，探索相比dupilumab，乌帕替尼用于治疗692例成人中重度AD的疗效和安全性，按照1：1随机分配至乌帕替尼（30 mg，qd）组或dupilumab组（300 mg，sc，Q2W），主要终点为16周EASI 75，次要终点为16周NRS自基线变化、ESAI90和EASI100等。结果显示，相比dupilumab，乌帕替尼可以显著改善ESAI75@16w（71% vs 61%，p=0.006）,并在所有关键次要终点中优于dupilumab，NRS@1w（31.4% vs 8.8%，p＜0.001）,ESAI75@2w（43.7% vs 17.4%，p＜0.001），ESAI100@16w（27.9% vs 7.6%，p＜0.001）。接受upadacitinib治疗的患者严重感染、疱疹性湿疹、带状疱疹和实验室相关不良事件的发生率较高，而接受dupilumab治疗的患者结膜炎和注射部位反应的发生率更高。（仅截图部分安全性数据）总体来说，相比dupilumab，无论在缓解程度还是起效时间上，乌帕替尼都体现出更强的优势，瘙痒一周可以改善，部分患者甚至当天就能改善，皮损两周可以改善。在控制瘙痒方面的优势，让乌帕替尼可能更受患者青睐。但仍需观察长期安全性。国内AD领域布局者截至2023.04.14，国内共147项pipeline布局AD适应症，其中有88款pipeline处于临床I期至注册期（特指AD适应症阶段）。从靶点来看，布局由高到底的分别为：IL-17A、IL-4受体、JAK-1、TYK-2、IL-23、IL-12B等。共涉及64家企业，三生国健、康方生物、江苏恒瑞、信达生物皆入局其中。