AKT1S1

本文为转化医学网原创，转载请注明出处 作者：Tracy 【导读】 作为第一个被发现的，用于去除RNA甲基化修饰的m6A去甲基化酶，脂肪量和肥胖相关蛋白（FTO），在癌症发展中起着重要作用。因此，团队研究了FTO在GC肿瘤发生和进展中的生物学功能和致癌机制。m6A去甲基化酶FTO，通过调节SP1-AURKB-ATM通路，促进GC肿瘤发生和进展。这可能凸显出，FTO作为胃癌患者治疗反应和预后的诊断生物标志物的潜力。 2024年7月2日，兰州大学基础医学院魏虎来团队在期刊《Communications Biology》上发表了题为“RNA demethylase FTO participates in malignant progression of gastric cancer by regulating SP1-AURKB-ATM pathway”的研究论文。本研究重点介绍了FTO在GC发展中的作用，及其作为治疗靶点的潜力。团队结合生物信息学、临床数据、分子检测和功能实验，进行了全面的分析。 https://www-nature-com.libproxy1.nus.edu.sg/articles/s42003-024-06477-y#Sec1 研究背景 01 胃癌 （GC） 对全球公共卫生构成了严峻的挑战。2020 年，全球有超过100万例新发病例和769,000例死亡。尽管胃癌的诊断和治疗取得了进展，但晚期GC的预后，仍然很差，远处转移患者的五年生存率低于5%。因此，确定新的治疗靶点，了解GC发展的分子机制，对于改善GC的早期诊断至关重要。 最近，RNA修饰在癌症中的功能，引起了越来越多的关注。RNA中最普遍的甲基化形式，是N6-甲基腺苷（m6A），其失调与包括GC在内的癌症发病机制有关。例如，去甲基化酶ALKBH5通过调节PKMYT1 m6A， 抑制胃癌的扩散。通过控制miR-30c-2-3p/AKT1S1轴，METTL14介导的circORC5的m6A改变，可防止胃癌的进展。脂肪量和肥胖相关蛋白（FTO）是第一个确定的m6去甲基化酶，可特异性去除RNA m6。FTO在许多癌症中进行表达，对癌症的发展有明显的影响。 特异性蛋白1（SP1）是一种转录因子，可在细胞增殖、分化和凋亡过程中，增强癌基因的转录。例如，USP39通过稳定和去泛素化SP1，来促进肝癌细胞的肿瘤发生。LncRNA THAP7-AS1通过使CUL4B进入细胞核，来促进肿瘤发生。它由SP1转录触发，并通过METTL3介导的m6A修饰转录后维持。AURKB 是有丝分裂和顺铂耐药的关键调节因子，可促进GC的生长、发育和转移。ATM基因的种系突变，导致毛细血管扩张综合征，表现为对恶性肿瘤的易感性增加。 本研究的目的，是检查FTO在GC增殖和转移中的作用。团队发现了一种涉及SP1、AURKB和ATM的新型信号通路，这是GC进展所必需的，为开发针对GC的治疗策略，提供了潜在的生物标志物。 研究进展 02 在GC中发现FTO的上调，并与不良预后相关 为探究FTO在GC发展中的作用，团队基于TCGA数据集和当地入组患者，分析FTO表达水平、患者生存率和各种临床病理参数。与正常组织相比，GC患者恶性组织中的FTO明显上调。为了验证这一结果，团队收集了20个临床样本，并评估了FTO表达水平。如IHC所揭示的那样，恶性组织中FTO的蛋白质和mRNA水平，都高于癌旁组织、蛋白质印迹和qPCR。此外，生存曲线显示，FTO表达水平升高的患者，在首次进展（FP）、总生存期（OS）和进展后生存期（PPS）方面，表现出明显较差的预后。FTO的上调，与晚期神经浸润、肿瘤大小和淋巴结转移（LNM）显著相关。FTO的mRNA水平和蛋白质在人GC细胞（HGC27、MKN-45、AGS和SGC-7901）中的表达，显著高于人正常胃粘膜上皮细胞（GES-1）。总之，以上数据表明， FTO表达上调，并与GC患者的肿瘤发生和不良临床结果相关。 来自TCGA数据库的STAD（胃腺癌）和正常组织中的FTO表达水平。通过IHC（b）、Western blotting（c）和RT-qPCR（d）检测的GC患者癌性和癌副组织中的b–d FTO表达水平。e FTO表达水平高或低的STAD患者的首次进展（FP）、总生存期（OS）和进展后生存期（PPS）的Kaplan-Meier曲线。f 癌组织中FTO的上调与GC患者病理进展之间的关系。通过RT-qPCR（g）和Western blotting（h）法，测定人GC细胞系和正常胃黏膜上皮细胞中的GTO表达水平。 β-肌动蛋白用作RT-qPCR和蛋白质印迹测定的内部对照。*p < 0.05，**p < 0.01。 SP1是FTO的下游靶标，调节GC进展 已确认FTO可以促进GC细胞的增殖、迁移和侵入。团队通过使用FTO敲低和对照的AGS细胞中，使用m6A RNA甲基化测序，来研究m6A甲基化机制。团队发现，SP1的RNA甲基化水平，在FTO敲低组中显著增加。值得注意的是，转录组测序显示，SP1的转录水平在FTO敲低组中下调。实验数据表明， FTO通过去除其RNA甲基化，来控制SP1的表达。 FTO通过调节SP1-AURKB-ATM轴， 来促进GC的发展 为了进一步确定FTO是否通过特异性调节SP1-AURKB-ATM轴，来促进GC的发育，团队首先研究了FTO敲低后GC细胞的生物学功能，无论是否伴有SP1/AURKB过表达（NC、sh-FTO、sh-FTO+oe SP1、sh-FTO+oe AURKB）。实验结果表明，存活率或增殖性、菌落形成、迁移和入侵AGS和SGC-7901细胞的能力，明显受到FTO敲低（sh-FTO）的抑制，而过表达SP1（sh-FTO+oe SP1）或AURKB（sh-FTO+oe AURKB），几乎可以完全挽救。此外，SP1或AURKB过表达，几乎恢复了FTO敲低抑制的ATM和P38，以及增加的P53磷酸化。这些发现表明， FTO对SP1/AURKB表达的上调，通过释放ATM/P38赋予的P53抑制作用，在驱动GC的发展中，发挥了重要作用。 此外，团队将稳定的AURKB敲低 （AURKB-KD），AGS细胞皮下注射到裸鼠体内，以制作异种移植GC模型。实验结果表明，AUKRB是GC的促进因子。为了研究SP1-AURKB-ATM轴在GC发育中的临床意义，团队利用SP1抑制剂普利卡霉素，抑制AGS和SGC细胞中SP1的表达，发现SP1明显抑制AURKB的表达水平，以及磷酸化ATM和P38的水平；同时，上调磷酸化P53的水平。总之，以上实验结果表明， SP1-AURKB-ATM轴在GC的发展中，起着关键作用。 FTO-SP1-AURKB-ATM轴在气相色谱进展中的功能示意图。 研究结论 03 RNA表观遗传学，特别是可逆和动态的m6RNA甲基化，已成为癌变和癌症进展过程中，基因表达调控的关键方式。FTO在癌症研究中的重要性，正在增长，它能够调节RNA去甲基化。 本研究介绍了FTO在GC发展中的作用，及其作为治疗靶点的潜力。了解FTO在癌症进展中的作用，对于制定诊断和治疗GC的有效策略至关重要。因此，团队结合生物信息学、临床数据、分子检测和功能实验，进行了全面的分析。首先，团队发现， GC组织和细胞显著增加了FTO， 这与晚期神经浸润、肿瘤大小和LNM，以及不良预后有关。这一结果与先前的研究一致，该研究将FTO与各种癌症联系起来，强调了FTO在GC中的临床相关性。RNA甲基化测序结果显示，在GC细胞中敲低FTO后，许多基因的甲基化状态，特别是与肿瘤转移和代谢相关的基因的甲基化状态，发生显著改变。表明FTO可能通过调节RNA甲基化的稳态和恶性进展或代谢相关基因的去甲基化，在GC的发生和发展中，发挥明显的调控作用。在这个过程中包含的准确基因或途径，需要进一步探索。团队的研究证实， FTO促进了GC细胞活力、集落形成、迁移和侵袭， 为FTO在GC进展中的致癌作用，提供了令人信服的证据。然而，根据TCGA数据库的分析，FTO（或SP1）的表达，与胃癌的分级、分期或亚型之间，没有显著关系。此外，团队将SP1和AURKB确定为FTO的下游靶标，揭示了参与GC进展的信号转导轴。肿瘤具有独特的微环境，来控制肿瘤细胞的命运。AURKB作为FTO/SP1/AURKB通路的下游关键节点，可以影响GC的肿瘤微环境。TCGA分析显示，AURKB与基质评分呈负相关， 这意味着AURKB高表达肿瘤的免疫细胞，浸润程度相对较低。 免疫细胞相关性分析显示，AURKB的高表达，可导致B细胞、T细胞（CD4或CD8）、NK细胞、DC、巨噬细胞和CAFs的免疫富集降低。更重要的是，实验结果表明，GC中FTO/SP1/AURKB信号表达的增强，也可能通过调节肿瘤免疫微环境，来深入控制其恶性进展，这可能对患者的治疗和预后非常不利。团队还发现，FTO至少通过上调SP1表达和AURKB来增强GC细胞的恶性，而AURKB又通过增加ATM和P38的磷酸化来激活它们，导致P53 失活。P53是一种肿瘤抑制因子，在维持基因组稳定性和限制异常细胞增殖方面，起着重要作用。P38磷酸化并激活多种转录因子，包括P53。P38 MAPK通过调节细胞中的EMT，在肿瘤细胞侵袭和转移中起重要作用。研究表明，CLIC1通过ROS介导的P38 MAPK信号通路，调节胃癌细胞的迁移和侵袭。与两者相关的信号通路，在细胞周期的调控中，具有广泛的作用，是肿瘤治疗的研究热点。这为驱动GC发展和转移的潜在分子机制，提供了新的见解。 表明FTO可能是GC治疗的潜在靶点。 靶向FTO活性或表达，可以通过破坏致癌信号轴，来抑制肿瘤生长和转移。团队的工作还为开发FTO特异性抑制剂，作为GC治疗的新型疗法，奠定了基础。 然而，团队的研究，主要依靠体外实验和异种移植小鼠模型，来研究FTO在GC中的功能。虽然为GC进展，提供了有价值的细胞和分子见解，但这些方法，可能无法完全概括人体中发生的复杂肿瘤微环境和相互作用。因此，在更具临床相关性的模型中，这些将是有益的。例如，患者来源的异种移植物或类器官培养物，这些模型更忠实地反映了人类GC的异质性和复杂性。 总之，团队目前的工作，为FTO在GC进展中的作用，提供了全面的证据。团队阐明了FTO通过调节SP1-AURKB-ATM轴，来促进细胞增殖和转移。 研究结果强调了FTO、SP1、AURKB和ATM，作为GC治疗的预后生物标志物和治疗靶点的潜力。 这项研究拓宽了科学界对GC发展的分子过程的理解，并为开发创新的诊断工具和靶向治疗奠定了基础。虽然团队将SP1-AURKB-ATM轴确定为FTO调控的主要下游通路，但不能排除FTO也靶向其他信号通路，以促进GC进展的可能性。进一步探索替代的下游途径和相关的细胞过程，将使科学界能够正确理解FTO在GC开发中的作用。 【关于投稿】 转化医学网（360zhyx.com）是转化医学核心门户，旨在推动基础研究、临床诊疗和产业的发展，核心内容涵盖组学、检验、免疫、肿瘤、心血管、糖尿病等。如您有最新的研究内容发表，欢迎联系我们进行免费报道（公众号菜单栏-在线客服联系），我们的理念：内容创造价值，转化铸就未来！ 转化医学网（360zhyx.com）发布的文章旨在介绍前沿医学研究进展，不能作为治疗方案使用；如需获得健康指导，请至正规医院就诊。

西奈山伊坎医学院金坚教授团队长期深耕于靶向蛋白降解领域，致力于蛋白降解药物的设计与开发，以及推进这些技术的临床应用与转化。该团队已经成功开发了多种靶点的PROTAC，克服了传统小分子药物的种种缺陷，为靶向蛋白降解领域的研发不断注入强心剂。包括：组蛋白甲基转移酶NSD家族NSD2/3，激酶家族AKT和ALK，EGFR以及表观遗传家族靶点EZH2等。此外，金坚教授团队也开发了其他新型PROTAC技术：1、叶酸笼罩的Folate-Caged PROTACs，该类PROTAC进一步提高了PROTAC的细胞选择性。2、基于寡核苷酸链的TF-PROTACs，成功实现了对不可成药转录因子的降解。3、光诱导PROTACopto-PROTAC，实现了PROTAC的可控激活。4、靶向WDR5 和Ikaros的双靶点PROTAC5、开发新型的E3连接酶KEAP1配体，并成功用于BRD3/4的降解。进一步拓展了靶向蛋白质降解的有限工具箱。前言AKT是癌症治疗的一个重要靶点。近年来，在开发ATP竞争性的活性位点和变构位点的AKT抑制剂方面取得了重大进展，多款AKT小分子抑制剂获批临床。此外，研究人员也开发了多种基于AKT活性位点的PROTAC，包括MS21。MS21可以有效诱导PI3K/pten通路突变的肿瘤细胞中AKT的降解，并有效抑制肿瘤细胞增殖生长，但在KRAS/BRAF突变细胞中却显得束手无策，无法降解AKT蛋白。近日，西奈山伊坎医学院金坚教授团队和Ramon E. Parsons团队在知名药物化学期刊JMC上发表题为“Novel Allosteric Inhibitor-Derived AKT Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACs) Enable Potent and Selective AKT Degradation in KRAS/BRAF Mutant Cells”的文章。作者开发了首个基于变构位点的新型AKT  PROTAC 62，并且化合物62在KRAS/BRAF突变的癌细胞以及PI3k/pten突变的癌细胞中均显示出强效的AKT降解活性和抗增殖活性。此外，62在通过腹腔内给药的小鼠体内表现出良好的生物利用度和PK性质。作者 | 缪可研AKT靶点介绍AKT（蛋白激酶b）是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，属于丝氨酸蛋白激酶家族。AKT作为人类癌症中最常见的PI3K/AKT/m-TOR信号级联的中心节点，在调节癌症特征中发挥关键作用，如细胞增殖、代谢、转移、侵袭性和肿瘤细胞的存活（图1）。AKT由三个高度同源的亚型组成，AKT1/2/3，它们都有三个进化上保守的结构域：一个N端PH结构域，一个中心激酶催化结构域和一个C端调控结构域。研究表明，AKT的过度活化和过表达与许多总体预后较差的人类癌症有关。图1.AKT介导的信号通路AKT小分子抑制剂研究进展AKT是一种极具临床潜力的药物靶点。在过去数十年来，基于AKT领域的药物研发已经取得了积极的研究成果，多款AKT小分子抑制剂相继获批临床，包括靶向AKT活性位点的小分子抑制剂：GSK690693、GDC-0068、AZD5363和靶向AKT变构位点的抑制剂：MK-2206、ARQ-092、TAS-117。进展最快的是罗氏的GDC-0068和阿斯利康的AZD5363，目前均处于临床三期。然而，基于活性位点的AKT抑制剂具有严重的副作用，包括高血糖、血小板减少和感染，而AKT变构抑制剂在人体临床试验中也表现出有限的疗效。图2.进入临床试验的AKT小分子抑制剂已报道的基于活性位点抑制剂的AKT PROTAC基于靶向蛋白水解嵌合体PROTAC或分子胶的靶向蛋白降解技术（TPD）是一种通过降解致病靶蛋白来治疗疾病的治疗策略。通常，由PROTAC或分子胶诱导的泛素−蛋白酶体系统（UPS）介导的降解可以同时靶向癌蛋白的催化和非催化结构域，这可能产生比小分子激酶抑制剂更大的疗效。近年来，研究人员已经开发了多种靶向活性位点的AKT PROTAC（图3），其中，MS21是已报道最有效的AKT降解剂，然而MS21不能有效诱导携带KRAS或BRAF突变的癌细胞中AKT的降解。为了克服MS21等靶向活性位点PROTAC在携带KRAS/BRAF突变的癌细胞较差的降解AKT能力。作者另辟蹊径，试图从AKT的变构抑制剂切入，开发新型的靶向变构位点的AKT降解剂。图3.已报道的靶向活性位点的AKT PROTAC下面让我们一起走进这篇文献：1. 基于ARQ-092 PROTAC的设计思路及合成研究表明，与ATP竞争性结合的AKT活性位点抑制剂优先结合激活的AKT（磷酸化的AKT，p-AKT）。由于在KRAS/BRAF突变的肿瘤细胞系中，磷酸化AKT蛋白水平较低，这就影响了与ATP竞争性结合的活性位点抑制剂的效果，从而导致耐药。与靶向活性位点抑制剂不同，AKT变构抑制剂可以结合并稳定AKT的失活形式。因此，靶向AKT变构位点的PROTAC有可能在含有KRAS/BRAF突变的癌细胞中参与结合失活的AKT，这就可能诱导MS21耐药肿瘤细胞系中AKT的降解。首先，作者选取了AKT变构抑制剂ARQ-092作为AKT PROTAC的靶头化合物，随后通过对ARQ-092与AKT1的晶体复合物进行分析，作者发现ARQ-092中的左侧苯环伸向溶剂区（图4）。因此，作者选用该位点作为连接位点进行衍生化，分别合成了末端是羧基和氨基的化合物1（末端羧基）和2（末端氨基）。随后，作者基于化合物1和2开展PROTAC合成工作。图4. ARQ-092与AKT1的晶体复合物及化合物1和2的化学结构VHL配体VHL-1和CRBN配体泊马度胺是最常用的两种E3泛素连接酶配体。作者同时采用这两种E3配体，分别合成了基于VHL配体和CRBN配体两种类型的AKT PROTAC。最先开展的是基于化合物1（末端羧基）的PROTAC合成（图5）。其中，化合物3-20是基于VHL配体的PROTAC，作者分别合成了不同长度的聚乙二醇和烷烃链两种类型PROTAC。同时作者也合成了基于泊马度胺的PROTAC 21-32，同样采用了不同长度的聚乙二醇和烷烃链两种连接链类型。图5.基于化合物1的AKT PROTAC接下来，作者合成了基于化合物2（末端氨基）PROTAC 33-61（图6）。其中，化合物33-49是基于VHL配体的PROTAC，化合物50-61是基于泊马度胺的PROTAC。并且作者同样也考察了不同长度的聚乙二醇和烷烃链的连接链类型，其中化合物33-41和57-61是聚乙二醇类型的PROTAC，化合物42-49和50-56是烷烃链类型的PROTAC。图6.基于化合物2的AKT PROTAC2. PROTAC蛋白降解能力初筛实验接下来，作者在PC3细胞系（人前列腺癌细胞）上筛选合成的PROTAC 3-61对AKT蛋白的降解能力（图7）。蛋白降解实验表明基于VHL配体的PROTAC比基于泊马度胺的PROTAC具有更强的降解能力，且烷烃链比聚乙二醇链更有效。作者从构效关系研究发现了PROTAC 20、48和49具有较强的AKT降解能力，并可以有效抑制下游信号传导，如：p-akt、p-pras40和p-s6。图7. 化合物3-61的蛋白降解实验3. 基于最优化合物20的进一步结构优化及后续生物活性研究有研究表明，VHL-2（VHL-1中苄位甲基取代的结构）对VHL具有更高的亲和力。因此，作者选用了降解活性最好的PROTAC 20进行进一步结构改造，将20中的VHL-1替换成具有更高亲和力的VHL-2，得到了PROTAC 62。作者也分别合成了化合物63和64作为阴性对照化合物（图8）。图8. PROTAC 62及阴性对照63和64的化学结构首先，作者分别测试了PROTAC 62、63、64及靶头化合物ARQ-092对AKT三种不同亚型（AKT1、AKT2、AKT3）的酶抑制活性（图9）。实验结果显示，相较于靶头化合物ARQ-092，PROTAC表现出减弱的抑制活性，但对于AKT1/2/3都具有抑制活性。图9. PROTAC 62、63、64及ARQ-092的酶活测试接下来，作者测试了PROTAC 62、63、64在MS21（已报道的降解活性最好的靶向活性位点PROTAC）耐药且KRAS突变的结直肠癌细胞系SW620的降解活性（图10）。实验结果表明，化合物62能够呈现浓度依赖方式有效诱导SW620中的AKT降解，且DC50为23±16 nM，而阴性对照63和64无降解活性。图10.化合物62在sw620中的降解实验随后，作者比较了62和MS21在其他几种携带KRAS或BRAF突变的癌细胞类型中的AKT降解效应（图11）。蛋白质印迹实验发现，化合物62可以有效诱导各种KRAS或BRAF突变的癌细胞中AKT的降解，而MS21表现出较差的AKT降解能力。图11. 62和MS21在各种携带KRAS或BRAF突变的癌细胞蛋白降解实验作者继续在SW620细胞系进行了蛋白降解机制研究（图12），实验结果表明化合物62可以以时间依赖的方式诱导AKT降解，并可以有效抑制磷酸化PRAS40蛋白水平。当加入NAE抑制剂MLN4924或蛋白酶体抑制剂MG132后，可以有效逆转AKT的降解效果。基于上述实验结果，作者认为化合物62诱导AKT蛋白的降解效果依赖于泛素蛋白酶体途径。图12. 蛋白降解机制研究实验为了探究PROTAC 62蛋白质组范围内的降解选择性，作者对化合物62进行了基于全局串联质谱标签TMT定量蛋白分析的蛋白质组学研究，实验结果表明化合物62不能降解其他靶点蛋白，具有较好的靶点选择性（图13）。图13.化合物62的蛋白质组学研究接下来，作者在SW620细胞系上测试了化合物62、靶头化合物ARQ-092、阴性对照64及降解剂MS21的抗增殖活性（图14）。从细胞集落形成实验可以看出，化合物62对SW620抑制活性与ARQ-092相当，而阴性对照化合物64和MS21表现出较弱抑制活性。图14. 化合物62、64、ARQ-092、MS21的细胞集落形成实验最后，作者对化合物62进行了PK研究（图14），评估化合物62在小鼠体内的生物利用度。实验结果发现在给药后0.5 h可达到最大血药浓度（Cmax = 1 μM），血药浓度保持在100 nM以上至少可维持12小时。这些结果表明，化合物62表现出较好的PK性质，在体内可以获得足够的血浆暴露。图14. 化合物62在小鼠血浆浓度测试总结金坚课题组报道了首个靶向变构位点的AKT PROTAC 62，PRORAC 62能够有效诱导KRAS/BRAF突变肿瘤细胞的AKT降解，这可能为靶向活性位点的MS21耐药KRAS/BRAF突变癌症提供一个潜在的策略。同时，化合物62表现出较强的降解活性、较好的靶点选择性以及较好的PK性质，这是靶向AKT PROTAC领域的一大步，也是靶向AKT领域的药物研发的一大步。参考文献1、Novel Allosteric Inhibitor-Derived AKT Proteolysis TargetingChimeras (PROTACs) Enable Potent and Selective AKT Degradation in KRAS/BRAF Mutant Cells.2、Exploiting the PI3K/AKT pathway for cancer drug discovery. Nat. Rev. Drug Discovery 2005, 4 (12), 988−1004.3、Harnessing the E3 Ligase KEAP1 for Targeted Protein Degradation. DOI: 10.1021/jacs.1c04841. J. Am. Chem. Soc.2021, 143, 37, 15073–150834、4、TF-PROTACs Enable Targeted Degradation of Transcription Factors.J. Am. Chem. Soc.2021, 143, 23, 8902–8910. doi.org/10.1021/jacs.1c03852扫码加入BiG生物创新社读者交流群，分享、交流纯粹的行业知识，非诚勿扰！BiGScientific Driven, Making Impact!创新生态丨医药论坛丨行业分析媒体公关丨BiG Webinar联系我们商务：Max   18662346610媒体：Kathy 17621909690