过去十多年，研究发现肠道菌群与人体健康及疾病有着复杂和紧密的关系[1]。
过去十多年，研究发现肠道菌群与人体健康及疾病有着复杂和紧密的关系[1]。
近年来的“明星肠道菌”——Akk菌，全称为嗜黏蛋白阿克曼氏菌（Akkermansia muciniphila），于2004年从人粪便中分离出来，是一种椭圆形革兰氏阴性细菌，名字就反映了它的习性，喜好黏蛋白[2,3]。
Akk菌虽然只占肠道菌群的3%，但其丰度与炎性肠病、肥胖和2型糖尿病风险呈现负相关性[4, 5]，还与癌症免疫治疗中PD-1/PD-L1抑制剂的疗效有正相关性[6]，有望成为下一代有临床应用前景的益生菌。
然而，Akk菌与人体互作机制仍未被解析清楚。已有研究发现，Akk菌通过调节宿主代谢起作用[7, 8]，潜在的分子基础可能是Akk菌细胞外膜的一种蛋白[9]，并且这种蛋白还可以调节宿主免疫应答[10]。小鼠研究表明，Akk菌能特异性地诱导T细胞的获得性免疫应答[11]。遗憾的是，这个研究没有找出Akk菌与T细胞作用的分子基础。但是，这些研究都强调了Akk菌对宿主免疫系统的调节。
近日，哈佛医学院的Jon Clardy和博德研究所的Ramnik Xavier教授领导的团队，通过细胞实验、基因组分析、光谱分析和化学合成等技术手段，发现Akk菌通过细胞膜磷脂诱导人体免疫细胞对特定细胞因子的分泌，并且能重置树突状细胞的活化阈值，调控后续免疫刺激，从分子基础、作用途径和生物效应上阐明Akk菌的免疫调节作用。该成果发表在Nature[12]。
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研究中使用的细胞实验技术是在3年前开发出来[13]。基本原理是在特定细菌提取物的刺激下，检测小鼠骨髓树突状细胞（mBMDC）分泌的细胞因子，以研究机体免疫细胞对不同分子物质的应答。树突状细胞是先天免疫系统的一部分，能识别病原体相关分子，并通过分泌细胞因子将信号传递到获得性免疫系统。
类似地，研究者将这套细胞检测技术用于研究Akk菌引起免疫应答的分子机制。在测试Akk菌培养液的多种成分（包括细胞团块和上清）后，研究者发现一种有效成分能引发细胞产生促炎细胞因子——肿瘤坏死因子α（TNFα）。
质谱（MS）和核磁共振（NMR）的初步分析发现有效成分中的主要物质是磷脂酰乙醇胺（PE）。在细菌中，PE是细胞膜磷脂的主要成分。进一步的核磁共振分析确定了有效物质的分子结构如图1，在标准脂质命名系统中的名称为a15:0-i15:0 PE。典型的PE具有一个甘油核心，在sn-3位置上是磷酸乙醇胺，在sn-1和sn-2上分别有一个脂肪酸脂。a15:0-i15:0 PE的特殊之处在于，两个脂肪酸支链上都有甲基，分别位于第12和13位置的碳原子。
功能强大的a15:0-i15:0 PE并不是随处可见！膜脂质能反映细菌的进化历史以及当前生存环境。在常见的肠道细菌中未发现a15:0-i15:0 PE，在能引起免疫反应的肠道细菌中也未找到。Akk菌隶属于疣微菌门（Verrucomicrobia），是肠道微生物中唯一一个来自疣微菌门的细菌[12]。在Akk菌中，a15:0-i15:0 PE是膜脂质的主要成分，占比约为50%。
这么有用的a15:0-i15:0 PE是否能被Akk菌合成呢？生物合成a15:0-i15:0 PE需要多个关联的生化反应，涉及多个反应酶。在Akk菌的基因组中，都能找到编码这些酶的基因，说明Akk菌具备合成a15:0-i15:0 PE的潜能。并且，在细菌培养实验中，研究者观测到Akk菌能合成a15:0-i15:0 PE，把“潜能”升级成了“硬实力”。
综上，从代谢分析、菌群系统发育位置、培养实验等多方面都揭示Akk菌能合成独特的生物膜磷脂。
免疫调控是个复杂而精细的过程，a15:0-i15:0 PE对细胞免疫应答是如何进行呢？在剂量-反应研究中，a15:0-i15:0 PE除了能上调细胞TNFα的分泌水平，也能提升IL-6（白介素-6）的分泌水平，但不影响IL-10和IL-12p70的分泌水平【图2】。
树突状细胞对细菌代谢物的应答需要病原体相关分子模式（PAMP）受体，通常为Toll样受体2（TLR2）和Toll样受体4（TLR4）。通过小鼠基因敲除实验，研究者发现TLR2是a15:0-i15:0 PE引起细胞应答的受体。在既往研究中，TLR2也参与Akk膜关联蛋白（Amuc_1100）对宿主细胞的免疫应答[9]。
由于Akk培养液中存在污染物质，为进一步研究化学构效关系(SAR)，研究者通过化学合成方法，人工制备a15:0-i15:0 PE。经测试，人工合成的a15:0-i15:0 PE具有与天然产物一致的光谱、色谱和生物特性。
既往化学构效关系研究指出，TLR2需要与TLR1或TLR6结合成异二聚体来产生免疫信号[14]。通过CRISPR-Cas介导的基因敲除技术，研究者发现TLR2-TLR1异二聚体是a15:0-i15:0 PE引起细胞免疫反应的关键【图3】。
以上实验是在小鼠来源细胞进行，在人源免疫细胞是否也能引发特异性反应呢？研究者从人外周血提纯的单核细胞，用天然和人工合成的a15:0-i15:0 PE分别刺激，发现了与小鼠细胞中类似的信号：TNFa和IL-6转录水平被显著上调， IL-23、IL-23A和IL-12B异二聚体的转录水平只有轻微变化。这表明，Akk菌也能通过a15:0-i15:0 PE引发人体免疫细胞的特异性应答。
最后，研究者在人单核细胞衍生出的树突状细胞（MDDC）中测试a15:0-i15:0 PE对两种典型免疫原的作用：Pam3CSK4（激发TLR2-TLR1）、LPS（激发TLR4）。
当对实验过程的剂量和时间进行多次尝试和控制后，研究者发现低剂量的a15:0-i15:0 PE处理能抑制18小时后Pam3CSK4和LPS引起的免疫应答，并且这个抑制作用在高剂量a15:0-i15:0 PE刺激和短间隔时间下不出现。这表明低剂量a15:0-i15:0 PE能“钝化”细胞对其他免疫原的反应，一方面能忽略低剂量刺激，另一方面能缓和高剂量刺激，这可能是Akk菌对免疫调节的潜在机制[15, 16]。
该研究发现和合成Akk菌引发细胞免疫应答的分子物质基础，并揭示免疫应答需要的TLR2-TLR1异二聚体，还描述了低剂量刺激对细胞水平免疫应答的影响。这为理解Akk菌对人体健康和疾病的影响提供了一个全景图：从分子物质基础、作用途径到生物效应。
这是一个跨领域合作的成功典范，研究者汇聚了Clardy实验室在化学、结构生物学和药学的特长，以及Xavier实验室在生物和免疫领域的专长。
这也是一个大海捞针式的研究。研究者把Akk菌的培养、分离和纯化实验重复了8次，最终在19g的提取物中获得15mg的a15:0-i15:0 PE，获得率为0.08%。
细菌分泌物中能引起免疫应答的物质通常是蛋白质或糖类[9]，虽然该研究只发现a15:0-i15:0 PE这一个有效分子，也不排除其他有效分子尚未被发现[17]。
文章的发现是在体外细胞培养中发现，Akk菌以及其产生的磷脂在活体中的作用仍有待研究，特别是a15:0-i15:0 PE的药物学研究。然而，该文章的研究框架可以应用于其他“明星菌”，推动菌与机体互作的分子机制研究。
参考文献：
1. Fan, Y. and O. Pedersen, Gut microbiota in human metabolic health and disease. Nature Reviews Microbiology, 2021. 19(1): p. 55-71.
2. Geerlings, S.Y., et al., Akkermansia muciniphila in the Human Gastrointestinal Tract: When, Where, and How? Microorganisms, 2018. 6(3).
3. Derrien, M., et al., Akkermansia muciniphila gen. nov., sp. nov., a human intestinal mucin-degrading bacterium. Int J Syst Evol Microbiol, 2004. 54(Pt 5): p. 1469-1476.
4. Depommier, C., et al., Supplementation with Akkermansia muciniphila in overweight and obese human volunteers: a proof-of-concept exploratory study. Nat Med, 2019. 25(7): p. 1096-1103.
5. Cani, P.D. and W.M. de Vos, Next-Generation Beneficial Microbes: The Case of Akkermansia muciniphila. Front Microbiol, 2017. 8: p. 1765.
6. Derosa, L., et al., Intestinal Akkermansia muciniphila predicts clinical response to PD-1 blockade in patients with advanced non-small-cell lung cancer. Nat Med, 2022.
7. Everard, A., et al., Cross-talk between Akkermansia muciniphila and intestinal epithelium controls diet-induced obesity. Proc Natl Acad Sci U S A, 2013. 110(22): p. 9066-71.
8. Greer, R.L., et al., Akkermansia muciniphila mediates negative effects of IFNγ on glucose metabolism. Nat Commun, 2016. 7: p. 13329.
9. Plovier, H., et al., A purified membrane protein from Akkermansia muciniphila or the pasteurized bacterium improves metabolism in obese and diabetic mice. Nat Med, 2017. 23(1): p. 107-113.
10. Ottman, N., et al., Pili-like proteins of Akkermansia muciniphila modulate host immune responses and gut barrier function. PLoS One, 2017. 12(3): p. e0173004.
11. Ansaldo, E., et al., Akkermansia muciniphila induces intestinal adaptive immune responses during homeostasis. Science, 2019. 364(6446): p. 1179-1184.
12. Bae, M., et al., Akkermansia muciniphila phospholipid induces homeostatic immune responses. Nature, 2022. 608(7921): p. 168-173.
13. Henke, M.T., et al., Ruminococcus gnavus, a member of the human gut microbiome associated with Crohn's disease, produces an inflammatory polysaccharide. Proc Natl Acad Sci U S A, 2019. 116(26): p. 12672-12677.
14. Akira, S. and K. Takeda, Toll-like receptor signalling. Nat Rev Immunol, 2004. 4(7): p. 499-511.
15. Belkaid, Y. and O.J. Harrison, Homeostatic Immunity and the Microbiota. Immunity, 2017. 46(4): p. 562-576.
16. Ansaldo, E. and Y. Belkaid, How microbiota improve immunotherapy. Science, 2021. 373(6558): p. 966-967.
17. Oh, S.F., et al., Host immunomodulatory lipids created by symbionts from dietary amino acids. Nature, 2021. 600(7888): p. 302-307.
