C-type lectin-like receptors (CLRs)

摘要：近几十年来，疫苗一直是预防病原体传播和癌症的非凡资源。即使它们可以由单一抗原形成，但添加一个或多个佐剂是增强免疫信号对抗原反应的关键，从而加速并增加保护效果的持续时间和效力。它们的使用对于脆弱人群，如老年人或免疫功能低下的人尤其重要。尽管佐剂非常重要，但只是在过去的四十年里，对新型佐剂的寻找才有所增加，发现了新的免疫增强剂和免疫调节剂类别。由于涉及免疫信号激活的级联反应的复杂性，它们的作用机制仍然不甚了解，即使得益于重组技术和代谢组学，最近已经取得了显著的发现。本综述着重于研究中的佐剂类别、近期作用机制研究，以及纳米输送系统和可以化学操纵以创造新型小分子佐剂的新型佐剂类别。 1.引言 佐剂——根据该词的拉丁语词源（adjuvare，意为“帮助”）——被定义为添加到疫苗中以增强免疫系统对抗原的反应并延长其持续时间的物质。在疫苗开发中使用佐剂利用了这些物质可以提供的许多好处，例如减少每次接种剂量所需的抗原量和加强接种的频率，或通过延长其半衰期改善抗原成分的稳定性，从而增强其免疫原性。佐剂可以根据其作用机制、化学性质或来源（合成、天然、内源性）进行分类。佐剂超级家族包括许多不同的物质，特别是能够激活或增强免疫信号或传递系统的小分子或大分子。免疫增强剂是能够在成人或脆弱人群中激活免疫信号的化合物；其中包括模式识别受体（PRRs）的激动剂，如RIG-I样受体（RLR）、干扰素基因（STING）、Toll样受体（TLR）和NOD样受体（NLRs）。传递系统是能够改善和延长疫苗保护的佐剂，如乳液和纳米制剂，类似于脂质体、病毒样颗粒和病毒体。根据所需的免疫反应类型，抗原应与适当的佐剂或佐剂组合正确配制，以获得尽可能少的副作用的最佳反应。到目前为止，已经开发出适当的配方，特别是通过结合不同的佐剂家族，尤其是铝盐与脂质体或乳液。确定适当的佐剂组合可能极为重要，目前许多临床研究正在进行中，以研究它们在不同病理情况下的疗效，特别是在癌症方面。由于佐剂的应用范围从病原体到过敏、自身免疫性疾病和癌症，需要正确理解关键机制，以便只针对特定途径，避免潜在的毒性。即使疫苗试验遵循严格的指导方针，多年来也出现了许多关于其安全性的担忧，特别是在COVID-19疫苗接种活动期间。疫苗的潜在毒性有时归因于所含佐剂。最近还对最成熟和最安全的佐剂，如铝衍生物的潜在毒性表示担忧。即使铝含量在许可的佐剂中每剂从0.8到0.125毫克不等，但近年来出现了关于神经毒性和自闭症的担忧。相比之下，其他研究表明铝的神经毒性是在长期服用后发生的，监管机构将铝在食品中的可容忍周摄入量（TWI）限制在每公斤体重1毫克。有趣的是，有时佐剂由脂质构成，如纳米制剂的脂质体，或其他内源性无风险大分子。EMA和FDA已经批准了47种疫苗，但这些制剂中包含的大多数佐剂是最早的铝佐剂类成员，或脂质体制剂。这种选择可能是由于这些佐剂类的已知耐受性，以及寻找新化合物的相关成本。事实上，近年来发现了不同类别的小分子免疫增强剂；然而，与药物一样，这些化合物需要适当的、耗时的临床前和临床试验来评估它们的疗效和安全性。在最近和最有趣的类别中，报告了几种PRR激动剂，对成人群体具有有希望的结果。最近的研究表明，能够通过线粒体应激途径激活免疫反应的小分子具有通过PRR途径激活免疫反应的效力。本综述着重于作用机制，开发的佐剂类别，特别强调可以针对的新的途径，以创建新的佐剂。 2.佐剂作用机制 尽管佐剂通常用于数十亿剂疫苗的配方中，但其作用机制仍然不甚了解。因此，深入理解作用方式和参与免疫系统对病原体反应的免疫机制是开发新佐剂的关键步骤。最近，人们非常关注更深入地理解疫苗佐剂如何刺激免疫反应。由于最近在免疫学研究方面的进展，已经有可能阐明佐剂作用的一些机制，如储存效应和细胞因子和趋化因子的释放，免疫细胞在注射部位的动员，适应性免疫反应的诱导，增加抗原免疫原性，以及抗原呈递细胞（APCs）的激活。阐明佐剂发挥作用的所有机制将提供关于自适应免疫如何由先天免疫促进的关键信息，并有助于开发新的强效疫苗。可以使用广泛因素对佐剂进行分类，包括它们的物理化学特性、起源和作用模式；最受欢迎的分类方案将疫苗佐剂分为两组，传递系统和免疫刺激剂。另一类佐剂由粘膜佐剂组成，可以作为传递载体或免疫刺激化合物，如壳聚糖及其衍生物（N-三甲基和单-N-羧甲基壳聚糖）、霍乱毒素（CT）和热敏肠毒素（LTK3和LTR72）。表1中报告了新的传递系统佐剂。传统上，传递载体仅作为免疫刺激佐剂的储存库，以激活先天免疫系统的细胞。由于现在有证据表明一些传递机制可以激活先天免疫，这种分类不再准确。事实上，传递载体佐剂既作为抗原载体，又通过激活先天免疫系统引起局部促炎反应，导致免疫细胞被招募到注射部位。抗原-佐剂复合物通过作为病原体相关分子模式（PAMPs）激活模式识别受体（PRR）途径。这些现象导致先天免疫细胞的激活，导致细胞因子和趋化因子的释放，这是免疫增强剂佐剂利用的相同作用模式。免疫佐剂（表1）是通过直接刺激先天免疫系统来增强抗体产生的免疫增强剂化合物。此外，作为免疫调节剂的佐剂可以刺激特定类型的细胞因子的产生，从而增强免疫系统的反应。例如，铝盐、弗氏佐剂和CpG寡脱氧核苷酸已被报道能够诱导产生和释放一些参与调节先天和适应性免疫的细胞因子，如干扰素（IFNs）、干扰素-γ（IFN-γ）和白细胞介素（IL2和IL12）。已有几种细胞因子被报道作为免疫增强剂佐剂，刺激抗原特异性血清/粘膜抗体和细胞介导的免疫。在这类物质中，最知名的细胞因子佐剂是粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、IFN、趋化因子和一些白细胞介素（IL-1, IL-2, IL-12-IL-15, IL-18）[15]。此外，免疫刺激剂对于招募免疫细胞（如巨噬细胞、中性粒细胞和树突细胞（DCs））、激活APCs以及疫苗在注射部位的长期积累非常有用。最近的研究将Toll样受体（TLR）与自身免疫系统联系起来，发现了TLR激活先天免疫系统导致适应性免疫和炎症反应诱导的机制，确保了持久保护。 佐剂可以作为传递系统，捕获、吸附或聚集抗原，并随时间缓慢释放它们。这种被称为"贮存效应"（图1a）的机制发生在注射部位，佐剂通过防止由于肝脏清除导致的抗原移除，增强了疫苗的半衰期，并确保了免疫系统的持续刺激，从而产生高抗体滴度。多年来，许多通过贮存效应发挥作用的佐剂被描述出来，如脂质体、乳液（油包水和水包油）、病毒体，以及脂质或聚合物纳米颗粒（NPs）。其中一些已被开发来模拟病原体膜，以运输、保存和释放抗原，并同时增强其免疫原性功能。几种类型的脂质体，如传统的脂质体、多层囊泡（MLVs）或固体核心脂质体，也通过促进贮存效应发挥作用。油包水乳液，如完全弗氏佐剂（CFA），以及一些NPs也通过确保持久免疫反应的贮存效应发挥作用。 图1. (a) 贮存效应及细胞因子和趋化因子的募集。(b) 免疫细胞的募集和炎症体的激活。 颗粒佐剂可以通过利用几种机制诱导免疫反应，例如上调细胞因子和趋化因子的释放，诱导注射部位的炎症状态，激活炎症级联反应，并招募先天免疫细胞。例如，油包水（o/w）乳液MF59和AS03刺激免疫细胞（中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞和树突细胞）的募集，这些细胞将抗原和佐剂运输到更接近的淋巴结。免疫细胞在注射部位的募集诱导半胱氨酸蛋白酶的激活，导致进一步释放趋化因子（IL-18、IL-33、IL-1β），吸引其他树突细胞并延长这一现象（图1b）。此外，MF59和AS03在注射部位增加了CCR2、白细胞募集趋化因子（例如CCL2、CCL3和CCL5）以及集落刺激因子3（CSF3）的表达。同样，明矾在注射后诱导局部促炎微环境，引发补体级联反应，导致从血液流中招募免疫细胞。炎症体是先天免疫系统的重要组成部分。它们是针对病原体的有效免疫反应所必需的。当炎症体被激活时，细胞分泌促炎细胞因子，如IL-18、IL-33和IL-1β，这些细胞因子增强适应性免疫反应（图1b）。炎症体是由工作成分组成的细胞质蛋白信号通路，如富含亮氨酸的重复（LRR）C末端或DNA结合域（HIN200）、caspase-1效应物和适配蛋白ASC，这些蛋白激活炎症caspases。粒细胞、T细胞和B细胞、单核细胞、肝细胞、神经元、小胶质细胞和朗格汉斯细胞都表达炎症体，负责识别病原体并启动先天免疫反应。当炎症体被激活时，它蛋白水解裂解前caspase 1，释放活性形式，将前IL-1β和前IL-18转化为活性物种。ILs从细胞释放后，启动炎症并诱导保护免受病原体侵害的免疫反应。此外，IL-18激活淋巴细胞并刺激T细胞和B细胞的增殖，自然杀伤细胞（NKs）的活性，以及IFN-γ、TNF、IL-1和IL-2的分泌。因此，作为炎症体激活剂的佐剂是增强和维持免疫反应强度的成功策略。这些佐剂通过类似的机制激活炎症体，包括溶酶体降解、cathepsin释放和活性氧（ROS）的形成。在炎症体激活剂中，可以找到如铝盐、壳聚糖、皂素、鞭毛蛋白和合成阳离子聚合物等佐剂。铝盐诱导溶酶体损伤，诱导参与炎症体形成的cathepsin B的产生，特别是NOD样受体蛋白3（NLRP3）；活性炎症体触发caspase-1并刺激细胞因子的释放。壳聚糖和由合成阳离子聚合物制成的纳米颗粒激活NLRP3炎症体，并增强多种白细胞介素（IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A和TNF）、IFN和IgG滴度的分泌，增强细胞和体液免疫反应。 佐剂可以通过一系列机制增强疫苗的免疫反应，如贮存效应和刺激先天免疫。先天免疫代表了针对病原体的第一道防线。事实上，早期识别病原体是发展适应性免疫反应的关键步骤。佐剂可以通过激活细胞模式识别受体（PRRs），识别PAMPs和损伤相关分子模式（DAMPs），刺激抗原呈递细胞（APCs）。由于在先天免疫系统中的中心作用，PRRs代表了新佐剂的战略目标。在PRRs超家族中，区分为表面和内体受体的Toll样受体（TLRs）是很有前途的佐剂目标，因为它们可以诱导信号通路，从而诱导关键转录因子的产生，如核因子-B（NF-B）。佐剂也可以用于靶向内体PRRs，如寡聚化结构域样受体（NLRs）和视黄酸诱导基因I样受体（RLRs）（图2a）。定位与它们的性质密切相关；事实上，血浆TLR识别病原体蛋白和脂质，而内体受体则由核酸激活。TLR通过MyD88途径诱导NF-kB，导致促炎细胞因子的释放。基于TLR的佐剂复制了感染期间产生的PAMPs，因此可以非常有效地对抗通常诱导PRRs的病原体或疾病。尽管PRR激动剂具有出色的免疫刺激性效果，但它们作为疫苗佐剂的使用受到高制造成本的限制，这代表了未来临床应用的限制。APCs，如树突细胞（DCs），表达各种PRRs，使它们能够识别多种病原体成分。当PRRs被PAMPs激活时，它们启动复杂的信号级联反应，导致细胞因子和趋化因子的产生，包括干扰素（IFNs），增强抗原呈递能力，以及DCs向淋巴组织的迁移，在那里它们与T细胞和B淋巴细胞相互作用，启动和塑造适应性免疫反应。成熟的DCs也可以刺激naive CD4+ T细胞分化为不同的T辅助（Th）亚群（例如，Th1和Th2细胞），帮助B细胞产生抗体。几种细胞因子调节Th细胞分化；例如，如IL-12、IL-15和IL-27等细胞因子调节naive CD4+ T淋巴细胞向Th1细胞的发展。总之，Th1细胞主要响应于细胞内病原体，如病毒和一些细菌，而Th2细胞主要响应于大型细胞外寄生虫。DCs还能够刺激naive细胞毒性CD8+ T细胞成为活化的CD8+ T细胞。这种现象称为“交叉呈递”，对于诱导针对外源性抗原的强大和持久的细胞免疫，以及有效预防病毒疾病和癌症是必要的。目前尚不清楚外源性抗原是如何在DCs中处理并呈现给MHCI上的CD8+ T淋巴细胞的；然而，已经提出了两种不同的机制。在细胞质途径中，抗原通过内体囊泡进入细胞质，并被蛋白酶体降解。在囊泡途径中，抗原在溶酶体隔室中被降解，独立于蛋白酶体活性。铝、皂素和TLR佐剂可以利用这种机制。 图2. (a) 表面和内体 TLR 激活。(b) 增强抗原呈递。由主要组织相容性复合物（MHC）在抗原呈递细胞（APCs）上呈递的抗原，是激活适应性免疫的关键步骤。许多佐剂，如明矾、乳液和纳米颗粒（NPs），被认为通过"靶向"抗原到APCs，增强MHC的抗原呈递功能。迄今为止，尚不清楚佐剂增加抗原呈递的机制是否有助于适应性免疫系统的发展。例如，明矾已被证明可以增强树突细胞对抗原的摄取，以及延长抗原呈递的持续时间。抗原大小似乎在调节抗原呈递效率方面很重要。在早期内体/吞噬体中发现了大的脂质囊泡，它们增加了抗原呈递，而在晚期溶酶体中发现了较小的囊泡，它们减少了抗原呈递。 3.佐剂类型  3.1.铝盐  基于铝的佐剂（ABA）最早发现于1926年，目前是全球疫苗中最常用的佐剂。最初使用的铝佐剂是硫酸铝钾，通常称为"明矾"，通过将抗原溶液和佐剂与碱直接沉淀制备而成（明矾沉淀疫苗）。今天，抗原被吸附到预先形成的铝盐凝胶上（直接吸附），在商业制剂的标准化和可重复性方面提供了更多的优势。目前，传统使用的明矾几乎完全被类氢氧化铝（Alhydrogel?，Croda，丹麦Frederikssund）和非晶磷酸铝（AdjuPhos?，Croda，丹麦Frederikssund）所取代。两种新型佐剂是硫酸铝羟磷酸盐（AAHS），目前用于某些人类乳头瘤病毒（HPV）疫苗的配方和Imject? Alum（Pierce，Rockford，美国），由非晶碳酸铝和结晶氧化镁组成。在人类疫苗接种中，ABA主要用于针对破伤风、白喉、百日咳、脊髓灰质炎、甲型和乙型肝炎以及人类乳头瘤病毒（HPV）的疫苗。FDA批准的含有ABA的人类疫苗列表见表2。ABA也在兽医疫苗中广泛应用，用于预防细菌、病毒和寄生虫感染。 尽管使用历史悠久，但关于ABA（铝盐佐剂）免疫刺激特性背后的机制仍需进一步阐明。最初，ABA的佐剂特性首先归因于"贮存效应"。根据这一假设，抗原颗粒从不溶性盐颗粒中缓慢释放到体内，随着时间的推移，允许抗原对免疫系统的长期暴露和强化的免疫刺激，从而产生更高的抗体滴度。然而，最近的发现挑战了这一理论，证明抗原在接种部位的保留并不是免疫反应所必需的，而是接种部位炎症的程度才是佐剂效应的解释。因此，除了作为缓释系统外，ABA对免疫刺激还有其他主要影响，如先天免疫细胞的募集和激活、炎症介质的释放以及通过诱导Th2细胞激活适应性免疫。 给药后，先天炎症细胞，如中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、树突细胞（DC）和单核细胞，被招募到注射部位。尽管许多免疫佐剂的活性基于Toll样受体（TLR）信号，但铝盐显然不引起基于TLR的反应。与在细胞损伤后释放到细胞质中的不溶性单体尿酸钠（MSU）晶体的尿酸类似，已经显示ABA的颗粒性质促进了巨噬细胞的吞噬作用和APCs中抗原的摄取。此外，ABA的细胞毒性诱导了热休克蛋白（如hsp70）和其他DAMPs（如MSU形式的尿酸）的分泌。NLR家族含吡啉结构域3（NLRP3）是核苷酸结合寡聚化结构域（NOD）样受体家族（NLR）的成员，是一种细胞质模式识别受体（PRR），在调节先天免疫信号中起着至关重要的作用。NLRP3通过钾离子外流激活，作为膜完整性的感应器。当被ATP、石棉、硅石、铝佐剂或MSU等刺激触发时，NLRP3与适配蛋白凋亡相关斑点蛋白含有CARD（ASC）和非活性前caspase-1结合形成NLRP3炎症体多聚体复合物。前caspase-1的自蛋白解剪切为活性caspase-1，将促炎细胞因子前体pro-IL-1β、pro-IL-18和pro-IL-33裂解为它们的活性和分泌形式。有假设认为，铝盐可能通过直接方式激活NLRP3炎症体，通过吞噬溶酶体损伤和随后的cathepsin B释放，或者通过MSU的间接释放。除了NLRP3介导的炎症外，哨兵细胞极化为活跃的巨噬细胞和APCs，增加了吞噬体活性氧物种（ROS）的产生，吞噬体酸化干扰和通过低氧诱导转录因子-1α（HIF-1α）的细胞代谢重编程，是最近揭示的对ABA免疫刺激特性有贡献的其他机制（图3）。 图 3. 基于铝的佐剂（ABA）的效果。 哨兵细胞激活为抗原呈递细胞（APCs）对适应性反应至关重要，从而将先天免疫与适应性免疫联系起来。ABA通过主要组织相容性复合体II类（MHCII）分子增加活化树突细胞上的抗原呈递。MHCII抗原呈递位点激活CD4+ T细胞，这些细胞分化并激活B细胞，进而主要产生IgG，推动体液免疫。铝盐优先增强抗体介导的免疫反应，通过TFH细胞和IL-4信号，结果产生IgG1并诱导Th2细胞分化，这些细胞通过IgE推动嗜酸性粒细胞炎症反应。与强烈的Th2反应相比，明矾对需要Th1细胞介导保护的感染效果较差。在小鼠研究中，已证明明矾间接抑制Th1反应，原因是IL-4激活。通过Th1反应产生的淋巴因子是补体固定IgG2a抗体的基本诱导因子，因此是巨噬细胞的刺激因子。此外，先天免疫系统的细胞可以发展适应性特性（“训练免疫”），并且铝佐剂可能涉及训练免疫的诱导。然而，NLRP3炎症体和caspase-1在抗体反应诱导中的作用仍然存在争议。经过近一个世纪的使用，铝盐仍然是疫苗佐剂的里程碑，因为它们具有确立的安全性和有效性记录。ABA非常耐受，并且仅报告了一些轻微的局部反应，如注射部位疼痛、肿胀、红斑，以及罕见的肉芽肿和过敏反应，这些反映了它们通过炎症体激活、促炎介质、吞噬细胞积累和抗体产生的作用模式。在一些免疫接种对象中还描述了接触性皮炎的罕见病例，注射后头痛、关节痛和肌痛以及持续性肿胀。有关铝佐剂长期毒性的辩论引起了广泛关注，包括如阿尔茨海默病（AD）、慢性自身免疫和多发性硬化症等影响。由佐剂引起的自身免疫综合征（ASIA）指的是一组不良效应，包括海湾战争综合征、巨噬细胞性肌筋膜炎、硅肺症和与佐剂暴露相关的接种后现象。此外，由于铝离子在AD的发病机制中被牵连，人们对ABA的生物持久性和潜在神经毒性提出了担忧，但这种相关性从未被证明。尽管需要进一步的知识来更新和确认ABA的安全概况，但作为佐剂的铝盐的风险-效益概况仍然极其积极，并确认它们作为疫苗佐剂的黄金标准。 3.2.STING激动剂佐剂 环状GMP-AMP合酶/干扰素基因刺激因子（cGAS/STING）途径是先天免疫系统胞质模式识别受体（PRRs）网络的一部分，监测细胞质以感知危险刺激。途径的刺激激活下游的核因子-κB（NF-κB）和干扰素调节因子3（IRF3），增加I型干扰素（IFN-1）和其他促炎细胞因子的转录，从而增强抗原呈递和免疫反应。cGAS/STING在免疫调节中的关键作用使其成为免疫疗法的重要靶点，特别是与癌症相关的，并且是使用STING激动剂作为有前途的疫苗佐剂的理由。STING激动剂（图4）主要在肿瘤学和病毒学中应用，包括环状二核苷酸（CDNs）、非核苷小分子（NCDNs）、胞质双链DNA（dsDNA）、锰离子、可电离脂质和聚合物。如20,3-环状鸟苷酸-腺苷酸（cGAMP）、环状二聚鸟苷酸（c-di-GMP）或环状二聚腺苷酸（c-di-AMP）等环状二核苷酸是途径的天然激动剂，但它们由于高极性和由于外切核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶（ENPP1）酶降解导致的短半衰期，其药代动力学（PK）特性较差，大大限制了它们的使用。为了改善环状二核苷酸的PK特性，已经测试了如ADU-S100的磷酸衍生物，ENPP1抑制剂也是一个有前途的新策略。为了选择活性更好的候选物，寻找模仿CDNs和STING结合构象的刚性类似物的研究导致了一类新的激动剂，即大环桥接刺激剂（MBS），如E7766。为了克服环状二核苷酸的PK限制，研究还集中在NCDNs上，如黄酮类5,6-二甲基黄酮-4-乙酸（DMXAA）和α-芒果苷，以及二聚酰胺苯并咪唑（diABZI）衍生物，这些在肿瘤免疫疗法和针对严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）方面取得了有希望的结果。 图 4. 小分子STING激动剂的二维结构 作为触发STING途径的一种方式，诱导细胞质双链DNA (dsDNA) 释放的策略也被采用，例如使用放疗、基于明矾的佐剂，以及化疗药物，如顺铂或多柔比星。无机锰被发现能激活cGAS，并通过增强第二信使cGAMP的产生，充当STING的间接激动剂。在其他激动剂类别中，我们列举了聚合物，如壳聚糖或PC7A，以及基于纳米粒子的可电离脂质。目前在临床试验中的STING激动剂总结在表3中。 cGAS/STING信号的触发因素是细胞质dsDNA，这是细胞损伤的重要标志。因此，cGAS作为直接的DNA受体，催化dsDNA转化为第二信使cGAMP，这诱导了STING的激活和寡聚化。STING寡聚体激活TANK结合激酶1 (TBK1)，它招募IRF3并通过NF-κB诱导I型干扰素刺激基因的转录。下游自噬的诱导和NLRP3炎症体的激活增加了病原体清除，并在自身免疫和炎症性疾病、衰老以及与肿瘤相关的炎症中具有重要意义。STING激动剂通常与环状二核苷酸有关，如cGAMP、c-di-GMP和c-di-AMP，它们作为各种微生物的代谢产物被发现。 STING途径的激动剂能直接诱导树突细胞的成熟和MHCII分子的上调，增加抗原呈递、T细胞的启动，并通过炎症细胞因子间接促进前述效应。STING激动剂还增强适应性免疫反应，通过IgG1和IgG2的产生、脾脏生发中心的诱导以及记忆B细胞的刺激来增强体液免疫。此外，I型干扰素诱导CD4 T细胞分化为Th1和TFH细胞，显著帮助B细胞的启动，也促进CD8 T细胞的激活和增殖，这对抗击耐药肿瘤细胞很重要。通过STING刺激协调的多种免疫反应使得这一途径成为免疫疗法的一个有吸引力的靶点。尽管cGAS/STING的急性激活无疑对病原体和癌细胞有益处，但慢性激活可能导致由IFN驱动的系统性炎症，引发细胞因子风暴（细胞因子释放综合征），类似于败血症。除了可能诱发系统性炎症反应外，STING过度刺激引起的其他主要问题包括缺乏细胞和组织特异性以及淋巴细胞毒性。这些前提，加上具有挑战性的药代动力学特性，使得STING激动剂的全身给药情况复杂化，它们通常在肿瘤内给药。使用药物载体技术，如纳米粒子、基于脂质的载体和抗体至关重要，以实现更选择性的靶向，结合改善的传递和功效。尽管它们的药代动力学具有挑战性，且全身使用的疗效指数较窄，STING激动剂代表了一个非常有前途的佐剂类别，需要优化它们的制剂以进一步提高其佐剂性。 3.3.TLR配体 3.3.1.Toll样受体 市场上的大多数疫苗主要由单一佐剂组成，但通常保护性免疫反应并未达到有效使用疫苗的标准。因此，显著的Toll样受体（TLR）是先天免疫的关键组成部分，提供防御性炎症反应以抵御入侵的病原体。人类TLR包括10个成员（TLR1-10），可以跨越细胞表面（TLR1、2、4、5、6、10）或定位在内质网膜（TLR3、7、8、9）上，并参与不同PAMPs（表4）的识别。PAMPs的结合诱导TLR同二聚体（TLR3、4、5、7、8、9）或异二聚体（TLR1/2或TLR2/6）的形成，将两个toll/IL-1受体（TIR）结构域聚集在一起，允许适配蛋白MyD88（髓样分化初级反应-88）与复合物结合。TLR3是唯一结合不同适配蛋白的受体，即含有TIR结构域的适配蛋白-诱导干扰素-β（TRIF）蛋白。与其他TLR不同，TLR4信号可以通过涉及MyD88信号适配蛋白或TRIF的两条独立途径进行。一旦激活，TLR将增加免疫细胞的迁移并引发适应性免疫反应。 由于TLRs作为免疫增强剂，它们的激动剂可以用作疫苗佐剂。疫苗产生的免疫反应类型取决于由特定TLR及其适配蛋白激活的信号通路。虽然大多数TLR途径导致Th1免疫反应，TLR2诱导Th0、Th1或Th2反应，TLR3激活NF-κB途径。表1总结了疫苗配方中使用的几种TLR激动剂，TLR激动剂的结构报告在图5中，临床试验中的TLR激动剂在表5中。 3.3.2.TLR2激动剂 TLR2可以识别许多PAMPs，因为它们可以与TLR1和TLR6形成异二聚体。L-pampo是由PAM3CSK4（PAM3）、TLR1/2、聚(I:C)和TLR3构成的复杂系统，是一种有效的佐剂。它在乙型肝炎病毒（HBV）疫苗中使用，诱导细胞介导的免疫反应，增加CD4+ T细胞水平。目前，它正在作为使用RBD（受体结合域）、S1抗原和RBD-Fc作为病毒抗原的SARS-CoV-2疫苗的佐剂进行研究，已被证明能引发强烈的体液和细胞免疫反应。 TLR2识别细菌脂蛋白，因此，由细菌LPS衍生的合成脂肽作为疫苗佐剂被开发出来。MALP2（巨噬细胞激活脂肽2，图5）来源于支原体发酵，利用TLR2-MyD88信号通路激活免疫细胞。PAM2CSK4和PAM3CSK4是两种作为疫苗佐剂评估的TLR2激动剂，用于对抗利什曼病、疟疾和流感。由于它们的尺寸、化学复杂性和疏水性，TLR2激动剂通常不用于疫苗开发，即使在固相自动肽合成研究可以帮助发现新的更简单的衍生物。 图5.小分子Toll样受体激动剂的2D结构。TLR2激动剂（紫罗兰色上部） 面板）、TLR4 激动剂（青色，中间面板）、TLR 7/8 激动剂（绿色，下面板）。 3.3.3.TLR3激动剂 TLR3是内体受体，能够检测病毒dsRNA。聚(I:C)是一种结构类似于病毒RNA的佐剂。它能够诱导IFN-I和IFN-III的产生，并刺激Th1细胞因子反应。MVS途径（RIG-1和/或MDA5）的激活会导致人类毒性，因此开发了新的聚(I:C)衍生物，聚(ICLC)和聚(IC12U)。 聚(ICLC)是一种聚-L-赖氨酸羧甲基纤维素，能刺激干扰素的产生。它诱导炎症体和补体系统的表达，并在针对恶性疟原虫、HIV和癌症的疫苗候选中使用，显示出引发Th1反应的强能力。由于这种佐剂的高度免疫刺激性和对血清核酸酶的高抗性，设计了聚(IC12U)。这种新物质显示了尿嘧啶和鸟嘌呤残基的错配，导致毒性较低（不与MDA5结合），以及IFN-I的产生减少。 3.3.4. TLR4激动剂 TLR4通过MD-2（髓样分化因子-2）和CD14识别细菌脂多糖。LPS的免疫刺激性活性是由于脂质A区域，并且脂肪酸链的变化反映了不同的生物活性。Eritoran是一种TLR4-MD2激动剂。它是一种由脂质A衍生的合成物，其特点是含有四个脂质链，其中一个含有顺式双键。3-O-去酰基-40'-单磷酸脂质A（MPLA，图5）和葡萄糖基脂质A（GLA）表现出低致热性和强免疫增强特性。LeIF（利什曼原虫真核起始因子）和neoseptins（合成肽模拟化合物，图5）是两种非糖脂配体，它们不像LPS，但能够像天然配体一样激活TLR4。在THP-1细胞中筛选激活NF-κB途径的小分子化合物，发现了一种属于吡啶并吲哚类的特定TLR4激动剂（1Z105，图5）。1Z105被确定为安全的TLR4激动剂，其他研究目前正在进行中。TLR4可以激活一个强大的TRIF介导的细胞反应，其特征是多能CD8+/CD4+ T细胞的存在和对癌症和传染病的CTL活性增强。 3.3.5.TLR5激动剂 TLR5由多种免疫细胞表达，参与细菌鞭毛蛋白的识别。配体与TLR5的结合诱导炎症途径的激活，释放包括TNFα、IL-1β、IL-6和一氧化氮在内的炎症介质，引发Th1和Th2反应。当与抗原一起给予时，鞭毛蛋白诱导粘膜免疫反应，这对于保护免受呼吸和胃肠道感染至关重要。鼠伤寒沙门氏菌的鞭毛蛋白已与PR8流感病毒（IPR8）、HA（H5N1）或禽流感病毒（AIV）H5N1抗原配方，证明它能引发强烈的免疫反应，包括IgA的产生。对鞭毛蛋白的修改导致了嵌合鞭毛蛋白或活细菌中的鞭毛蛋白抗原复合物，如结核分枝杆菌、霍乱弧菌、化脓性链球菌、单核细胞增生李斯特菌、肠毒素大肠杆菌（ETEC）等，并在动物模型中使用。三种使用鞭毛蛋白作为佐剂的疫苗正在进行临床试验阶段，其中两种针对流感病毒，一种针对鼠疫耶尔森菌。 3.3.6.TLR7/8激动剂 TLR7/8能够诱导Th1免疫反应，并产生高水平的I型干扰素、IL-12、TNF-α和IL-1β。TLR7/8和TLR9激动剂能够激活并促进cDCs（常规树突细胞）和浆细胞样树突细胞（pDCs）的克隆扩展，动员CD14+ CD16+炎症单核细胞和CD14dimCD16+巡逻单核细胞。Imiquimod（R837，图5）目前已获批准并用于治疗生殖器疣、表浅基底细胞癌和日光角化病。另一种异喹啉衍生物resiquimod（R848）具有抗病毒和抗癌治疗用途，正在评估用于黑色素瘤治疗。已经开发了不同的结构相关的oxoadenine化合物，尽管需要其他临床前研究来证明它们的疗效。CL075是一种结构相关的杂环化合物，具有融合的喹啉-噻唑环。 3.3.7.TLR9激动剂 TLR9识别细菌DNA基序胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤（CpG）二核苷酸，通过MyD88途径激活免疫系统。CpG是已被修改以防止蛋白酶降解并用作佐剂的分子基序。CpG-CDNs能在自然杀伤细胞、B细胞和pCCS中引起强烈的趋化因子、细胞因子和抗体产生，并引发强烈的Th1型免疫反应。CpG1018是一种能够引发Th1型免疫反应的寡核苷酸。CpG1018是过去20年中批准的四种新型佐剂之一。即使它的使用最初在Hepliisav-B疫苗中受到限制，但目前正在评估用于对抗黑色素瘤和SARS-CoV-2的疫苗。MGN1703属于TLR9激动剂，是一种包含CG基序并呈现线性结构的小DNA分子。它由中间的双链DNA部分构成，两侧是单链结构。它作为疫苗的佐剂在癌症疫苗中进行了测试，在那里它激活了先天和适应性免疫反应，仅有轻微或暂时的副作用。它目前正在作为免疫调节剂单独或联合用于治疗恶性肿瘤，如黑色素瘤、小细胞肺癌和结直肠癌的I/II期研究中进行评估。 3.4.CLR配体 C型凝集素受体（CLRs）是病原体和受损组织来源脂质的免疫传感器，参与激活先天和获得性免疫。免疫反应可以通过CLRs细胞信号通路和其他PRRs（如TLR）的串扰来引发，导致不同信号通路的激活和特定细胞因子的表达。CLR触发的佐剂包括Curdlan、PGA-45、海藻糖二硬脂酸酯（TDB）和海藻糖二肉豆蔻酸酯（TDM），它们诱导强烈的Th17和Th1反应。 Curdlan在铜绿假单胞菌疫苗中使用，并诱导高水平的IL-17A和CD44+ CD62L-CD69+ CD4+ TRM细胞产生。Curdlan还能够激活树突细胞（DCs）并增强基于DC的抗肿瘤免疫，因此正在评估用于抗肿瘤免疫疗法。由于Curdlan的高度疏水性，开发了部分氧化的Curdlan衍生物β-1,3-聚葡萄糖醛酸，PGA-45聚合物，它能够刺激IKK-β的磷酸化并降低磷酸化Akt的表达，表明PGA-45可以激活多种细胞表面受体，包括TLR4和dectin-1。 海藻糖-6,60-二肉豆蔻酸酯（TDM）及其合成类似物海藻糖-6,60-二硬脂酸酯（TDB），能够通过与C型凝集素受体Mincle结合来激活巨噬细胞和树突细胞。TDB在结核病亚单位疫苗的临床研究中。TDB还可以独立于Mincle发挥作用，通过PLC-γ1/钙/CaMKKβ/AMPK途径诱导小胶质细胞极化为M2表型，使这种佐剂成为治疗神经炎症性疾病的治疗剂。 3.5.RLR配体 视黄酸诱导基因I（RIG-I）样受体（RLRs）是病毒感染的传感器，诱导产生I型和III型干扰素和炎症细胞因子，激活参与先天和获得性免疫反应的信号通路。RLRs可以检测病毒和宿主RNA，导致抗病毒反应，但如果RLR途径被无控制地激活，也会导致免疫病理。聚(I:C)激活RLRs途径，因为它模仿细胞中的病毒入侵，导致MAVS-IRF3/7级联的激活和IFN-β和ISGs的产生。IFN-β的表达取决于聚(I:C)的长度；短序列在髓样细胞中诱导IFN-β表达，而长序列在成纤维细胞中诱导IFN-β表达。这意味着使用特定激动剂刺激RLR途径将导致细胞特异性IFN-β表达的诱导，特别是在成纤维细胞中，与单核细胞和巨噬细胞相比，可以赋予更强的抗病毒状态。 4.辅助佐剂和佐剂配方  市场上的大多数疫苗只包含一种佐剂，然而，保护性免疫反应通常不足以实现疫苗的有效性。为了增强疫苗的效果，开发了许多佐剂配方。佐剂和抗原可以一起传递，使用两种流行的方法之一，共价偶联或将抗原和佐剂包装在传递机制中。适当的佐剂组合选择可以导致对疫苗免疫反应的补充或协同改善。例如，AS04中的明矾和MPL的联合使用在乙型肝炎病毒（HBV）和人类乳头瘤病毒（HPV）疫苗中显示出比仅使用明矾盐的相同疫苗更好的免疫反应。 4.1.脂质体 脂质体是球形颗粒，可以包裹抗原和免疫刺激性分子，保护它们免受降解并将其传递给APCs。脂质体由可生物降解、生物相容、无毒的磷脂组成，允许灵活的结构修改，以实现可调节的特性，如大小、表面电荷、膜柔韧性和药物装载模式。作为疫苗佐剂传递系统（VADS）的脂质体使用带来了许多优点，如高安全性和强烈的免疫反应。市场上的脂质体配方包括Epaxal和inflixal，分别用于对抗甲型肝炎和季节性流感病毒。另一种基于脂质体的疫苗是GSK（GlaxoSmithKline）开发的Shingrix，已获得FDA批准，用于带状疱疹病毒的老年人预防。 4.2.乳液 作为疫苗佐剂开发的乳液可以分为两种主要形式，完全弗氏佐剂（CFA）和不完全弗氏佐剂（IFA）。这两种佐剂都是油包水乳液，具有运输抗原和激活先天免疫系统的能力。CFA由矿物油、乳化剂和热杀死的结核分枝杆菌组成，促进免疫反应的刺激。然而，CFA可能会引起强烈、持久的局部炎症，并有在注射部位形成溃疡的潜力。IFA与CFA的成分相同，但不含有杀死的细菌M. tuberculosis。这种佐剂可以产生比没有它的相同疫苗更强大和持久的抗体反应。然而，IFA在疫苗配方中的使用受到其强烈副作用和毒性的限制，这是由高水平的非生物降解油和质量差引起的。 4.2.1.Montanide Montanide 是一个包括油包水和水包油乳液在内的大型家族，它已被用于兽医和人类疫苗中。MontanideTM 的生物可降解性质减少了与 IFA 类似物理结构的许多细胞毒性特征。在注射部位形成储存库，有助于抗原的逐渐释放，这是这种基于油的佐剂的作用机制的一部分。产生集中并防止恶化的抗原，并促进吞噬作用 。Montanide ISA 51 和 ISA 720 已在涉及癌症、艾滋病、疟疾或自身免疫疾病的疫苗的多项临床试验中使用。Montanide ISA 201 和 ISA 206 则被用于口蹄疫疫苗。 4.2.2.MF59 MF59 是一种水-油乳液佐剂，由角鲨烯组成，角鲨烯是一种生物可降解且与人体兼容的油，是人体的正常成分，在 pH 6.5 的 10 mM 柠檬酸钠缓冲液中通过表面活性剂 Tween 80 和 Span 85 稳定，平均粒径小于 200 纳米。它首次在 1997 年在欧洲被批准用于人类疫苗（Fluad），现在已在超过 30 个国家的超过 1 亿人中使用。其作用机制类似于明矾盐，具有在注射部位的储存活性，刺激局部先天免疫反应。肌肉中 MF59 的给药激活了强大的细胞和体液免疫反应，释放 ATP 并上调细胞因子和趋化因子，这反过来促进了白细胞的募集、抗原摄取和迁移到淋巴结以激活 B 细胞和 T 细胞，结果比明矾盐更有效。MF59 具有可接受的安全性和良好的耐受性，自 1997 年以来已施用了数百万剂。 4.3.AS0佐剂系统 AS0 佐剂系统基于经典佐剂分子的组合，如明矾、乳液和脂质体。它们由葛兰素史克公司开发，以实现最大的佐剂效果和可接受的耐受性，结合免疫刺激分子，如 TLR 配体等。这些经典佐剂和免疫刺激剂的各种组合旨在针对目标人群（包括儿童、老年人和免疫功能低下的个体）的病原体个性化适应性免疫反应。 4.3.1.AS04 AS04 由 3-O-去酰基-40'-单磷酸脂 A（MPL）组成，这是从革兰氏阴性细菌 Salmonella minnesota 分离出的脂多糖（LPS）的去毒形式，吸附在明矾盐上 。MPL 在保持较低毒性的同时，通过 TLR4 激活保留了 LPS 的免疫刺激性，当吸附在明矾上时。TLR4 在先天细胞上的信号传导介导了 AS04 的佐剂作用，与明矾的内在免疫调节特性相结合。我们可以在乙型肝炎病毒（HBV）Fendrix  和人乳头瘤病毒（HPV）Cervarix  疫苗中找到 AS04，与仅用明矾盐佐剂的相同疫苗相比，显示出更好的免疫反应。 4.3.2.AS03 AS03 是一种角鲨烯油包水乳液佐剂，与 MF59 类似，结合了表面活性剂聚山梨醇酯 80 和 α-生育酚（维生素 E），结果具有较低的反应原性并具有更好的安全性。2009 年，欧洲委员会批准了 AS03 佐剂疫苗 Pandemrix 的商业化，2013 年食品药品监督管理局授权了 AS03 佐剂流感 A（H5N1）单价疫苗 。它也用于 SARS-CoV-2 重组蛋白疫苗（CoV2 preS dTM）。α-生育酚的抗氧化和免疫刺激性特性与 MF59 相比，促进了免疫增强反应，调节了某些细胞因子和趋化因子的表达，如 CCL2、CCL3、IL-6 和 GM-CSF。此外，AS03 通过刺激 NF-κB 激活免疫系统，这导致肌肉和引流淋巴结中细胞因子和趋化因子的释放，并促进先天免疫细胞的迁移。此外，AS03 可以促进 CD4+ T 细胞特异性免疫反应，这可能导致持久的中和抗体产生和更高水平的记忆 B 细胞 。为了增加其免疫原性，使用两种强效免疫刺激剂，QS-21（来自 Quillaja saponaria 的皂苷）和 3-O-去酰基-40'-单磷酸脂 A（MPL），产生了 AS02。 4.3.3.AS01 AS01 佐剂是两种强效免疫刺激组分的组合，TLR4 配体也在 AS04 中使用（MPL）和分离纯化的皂苷部分（QS-21），在脂质体中配制。它用于带状疱疹疫苗 Shingrix 和疟疾疫苗 Masquirix 。临床前研究表明，QS-21 作为佐剂增强了抗体以及细胞介导的免疫反应 ，但作为疫苗中的单一组分佐剂，它的耐受性较差。在 AS01 中，脂质体中的胆固醇允许它结合 QS-21 并抑制其反应原性。MPL 通过 TLR4 激活先天免疫系统，而 QS-21 激活引流淋巴结中副皮质窦巨噬细胞（SSMs）中的 caspase 1。两种已建立的佐剂分子的结合引发了先天免疫的协同激活，结果大于独立组分的总和，激活了不是由任一组分单独触发的新途径，增加了表达 IL-2、IFNγ 和 TNF 的多能 CD4+ T 细胞。AS01 作为佐剂在带状疱疹疫苗中的使用已获批准，该疫苗用于老年人，具有高疗效，并在非洲有限的运动中实施的疟疾疫苗。 4.4.免疫刺激复合物 免疫刺激复合物是另一种具有强大佐剂活性的疫苗传递载体。它们是球形的，笼子状的自组装颗粒，大小约为 40 毫米。ISCOMs 由 Quillaja 皂苷、胆固醇、磷脂和抗原组成。没有抗原的颗粒被称为 ISCOM 基质。ISCOM 抗原可以是原生病毒的包膜蛋白、细胞膜蛋白或通过极性相互作用含有疏水域的肽 。ISCOMATRIX® 是使用与 ISCOMs 相同的材料开发出来的，但没有抗原，可以在疫苗配方中添加，使得使用更加多样化，并消除了疏水抗原的限制。树突状细胞（DCs）和 ISCOM 相互作用可以改善结合抗原的交叉呈递 。因此，有效地诱导了 CD4+ 和 CD8+ 抗原特异性 T 细胞反应。诱导细胞毒性 T 细胞、平衡的 Th1/Th2 反应和持久的抗体反应都是 ISCOM 疫苗的记录效果 。其他 ISCOM/ISCOMATRIX 疫苗已针对 HIV、HPV 和癌症利用抗原 NY-ESO-1 进行了临床试验。在所有情况下，研究都显示出良好的安全性和耐受性，以及诱导体液和细胞免疫反应。尽管具有这些特点，但由于一些皂苷在高浓度下具有毒性，因此对人类疫苗中使用 ISCOMs 的安全性问题已经阻止了其使用 。 4.5.类病毒颗粒 类病毒颗粒（VLPs）是与病毒大小相似的二十面体纳米颗粒（范围在20至800纳米之间），它们具有自我组装衣壳蛋白的能力。它们是非感染性颗粒，因为它们没有遗传物质。VLPs由具有重复表位的外部病毒壳组成，这些表位被免疫系统识别为非自身，并产生快速且持久的免疫反应，即使没有佐剂。它们可以通过使用不同的技术和细胞系统，如大肠杆菌、酵母（酿酒酵母和毕赤酵母）、杆状病毒、哺乳动物细胞、植物细胞或无细胞系统，由各种病毒类型生产。 历史上的VLPs制造方法包括一个称为“先组装后纯化”的多步骤方法。第一步包括衣壳蛋白在表达细胞载体内的自发组装。第二步则提供新形成颗粒的纯化。有时需要将VLPs拆解后再重新组装，以获得纯化的颗粒并提高质量。另一种VLPs的制造方法提供了使用无细胞体外组装，颠覆了传统的自我组装方法。特别是，体外系统被用作一个平台，在衣壳蛋白表达和纯化后诱导其自发组装，无需拆解新形成的VLPs。在市场上，两种重要的佐剂疫苗使用这种类型的纳米颗粒，即乙型肝炎（HBV）和人乳头瘤病毒（HPV）疫苗。当前的乙型肝炎疫苗是一种利用酿酒酵母作为表达载体的重组DNA疫苗，包括用于预防乙型肝炎感染的乙型肝炎表面抗原（HBsAg）。这种疫苗已被证明至少可以提供10年的免疫力。 在HPV疫苗中，非包膜HPV病毒颗粒包含双链DNA（dsDNA）。L1和L2蛋白组成衣壳的主要和次要结构蛋白，具有二十面体对称性。酿酒酵母是目前用于表达L1蛋白的载体。VLPs和佐剂（AlP）的结合导致强烈的免疫反应和90%的宫颈癌保护。 4.6.病毒体 病毒体是一种药物传递系统，由病毒包膜和病毒或其他病原体的成分组成。它们由重组流感病毒包膜形成，包含血凝素（HA）、神经酰胺酶（NA）和磷脂，并且像VLPs一样缺乏病毒遗传物质。第一个基于病毒体的疫苗是在1975年开发的，这允许研究这种类型疫苗的有效性。自那以后，有两种疫苗已经上市，用于预防甲型肝炎（Epaxal）和流感（Inflexal）。 病毒体结构中HA的存在允许保持受体结合能力，增加免疫原性和膜融合活性，但由于缺乏病毒RNA，病毒体在结合后不能在细胞中诱导感染。病毒体可以将抗原输送到抗原呈递细胞（APCs）的细胞质中，并诱导细胞毒性T淋巴细胞反应，使它们成为完美的传递系统。然而，由于佐剂质量较差，病毒体在激活APCs和鼓励交叉呈递方面效果不佳。使用更强的佐剂可以克服这种固有限制。最近开发了一种基于病毒体的创新流感疫苗，结合了TLR4配体单磷酸脂A（MPLA）和金属离子螯合脂质DOGS-NTA。病毒体可以诱导强烈的体液和细胞免疫，与自然感染和其他强效佐剂相当。由于其极高的耐受性和安全性，这种传递系统已获得FDA批准用于人类。除了针对流感和甲型肝炎的两种基于病毒体的疫苗外，还有几种疫苗正在进行临床试验，包括针对HIV、HPV、RSV和疟疾的疫苗。 5.佐剂设计和开发的新见解 如前所述，在过去20年中，发现了新的免疫激活佐剂类别，能够增强免疫功能低下和老年人等脆弱人群的免疫反应。有几种佐剂类别可用，每种都有其自身的优势和劣势。油包水乳液等传递系统是有效且安全的系统，尽管有可能产生局部或系统性不良效应。最近的研究表明，PRR信号在几个人群中可以改变，降低了疫苗配方的保护效果。例如，防止胎儿排斥的免疫机制以及老年人中TLR途径的失调或遗传多态性的存在。出于所有这些原因，选择适当的佐剂配方对于提高效果而不降低风险-效益比至关重要。从化学角度来看，蛋白质数据银行存储库上有几种与特定配体共晶的蛋白质晶体结构，有助于通过计算机辅助药物设计寻找新化合物。报道的STING和TLR小分子激动剂的大多数结构是杂环化合物，模仿核苷酸。即使在这种情况下，也已经开发了许多具有不同应用的结构相关化合物，包括在癌症疾病中广泛应用的激酶抑制剂和作用机制不太明确的配体或人类辅因子的配体。另一个需要考虑的方面是存在用于合成肽的高通量全自动仪器。最近已经做出了努力来合成复杂的高分子量肽和糖蛋白。此外，已经开发了使用天然成分的新型复杂纳米配方，如来自昆虫的功能化聚合物。所有这些方面都非常有前景，并为佐剂发现的发展开辟了新的场景。 6.结论 佐剂是疫苗配方的关键组成部分的大家族。它们的使用在历史上最重要的疫苗接种活动中至关重要，包括脊髓灰质炎、猪流感和最近的COVID-19大流行。即使已经取得了良好的结果，但还需要更多的努力来增加疫苗对耐药病毒的保护，并减少额外加强针的需要。重组技术、DNA筛选和生物信息学研究已经阐明了新的机制和免疫信号通路的关键参与者。还需要更多的努力来识别更有效的佐剂，以对抗未来的大流行并增加对抗癌症的成功率。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

摘要：双特异性抗体（bpAbs）能够结合抗原上不同且不重叠的表位。这种独特的结合模式使得bpAbs除了单特异性抗体和双特异性抗体（bsAbs）之外，还能发挥新的机制作用，使其成为多种适应症（包括肿瘤学和传染病）的有效治疗手段。双特异性结合可以带来更高的亲和力和特异性，促进拮抗作用，锁定目标构象，并导致高阶目标聚集。这些抗体-目标复合物可以引发强烈的激动作用，增强免疫效应功能，或导致目标快速下调调节和溶酶体转运。这些特性不仅对治疗性抗体具有吸引力，而且越来越多地被探索用于其他模式，如抗体-药物偶联物、T细胞接合器和嵌合抗原受体。近期在bpAb工程上的进展已经使得构建越来越复杂的格式成为可能，这些格式开始在临床上显示出希望。 1.引言 在2022年美国新批准的药物中，抗体疗法占了30%。在开发中的抗体中，观察到高度工程化分子的数量显著增加，包括双特异性抗体（bsAbs）。双特异性抗体（bpAbs）是bsAbs的一个子集，对同一分子靶标的特有、不重叠的表位具有特异性。这种独特的结合模式建立于30多年前，能够实现差异化的作用机制（MoAs）。在过去十年中，随着临床试验中首次取得成功，bpAbs的治疗潜力已变得明显。这些开创性的分子为当今临床开发中越来越多的bpAbs铺平了道路（表1）。本综述提供了bpAbs的不同格式和MoAs、当前的临床管线和前景的概述。 2.双特异性格式 在抗体发现和工程方面的进展使得组装针对不同表位的结合域的bpAb格式越来越复杂，这些格式采用不同的架构。格式的选择取决于目标生物学和提议的MoA。关键的设计考虑因素包括目标表位、单个结合域的数量和性质、半衰期延长和效应功能介导域的添加，以及确保所有域正确组装成功能性bpAb的策略。后者可以简单到将单个域与灵活的链接器串联在一个单一蛋白中，或者在含有结晶片段（Fc）域的bpAbs中，取决于多达四个不同蛋白与相应的引导突变在重链（HCs）和轻链（LCs）中的配对。预测有效的表位对是困难的，无论是通过理性设计还是通过抗体混合物。因此，能够高效地生成和筛选给定bpAb格式中的大量表位对矩阵是关键。除了功能性和可行性之外，在选择bpAb格式时，开发性考虑至关重要。早期对bpAbs的生物物理责任进行测试可以减少动物研究和临床试验中失败的风险。同样，bpAb格式的选择可能影响下游制造和质量控制，因为bpAb格式复杂性可能导致不良的开发性或由于bpAb格式复杂性导致的错配副产品。 迄今为止在临床上测试的bpAbs不仅具有多样的格式，而且还涉及大量单个结合域（图1）。单链抗体格式，如单域抗体（sdAbs）和单链可变片段（scFvs）特别容易在双特异性格式中配对。因此，首批进入临床的两种bpAbs，ALX-0651和BI 1034020，由串联的sdAbs组成。基于抗体片段的bpAbs通常在循环中的半衰期较短，需要进一步工程化以提高暴露量。小尺寸使sdAbs成为嵌合抗原受体（CARs）的理想构建块，如双特异性CAR-T疗法ciltacabtagene autoleucel（cilta-cel）和OriCAR-017所突出的。 迄今为止在临床上测试的大多数bpAbs具有更规范的、含有Fc的架构，可以根据HC轴的对称性进行分类（图1）。对称bpAbs由相同的HC或HC/LC对组成，而不对称分子由具有不同结合域的不同半部分组成。四价分子MEDI4276和BAT2022是对称bpAbs的例子。 图1. 在临床试验中评估的双特异性抗体结构。条纹域代表常见的轻链VL或IgG4 Fc。REGN5093-M114每个抗体平均含有3.2个非特异性结合的药物。MBS301不包含增强六聚体化的突变；*药物与抗体的比例和结合位点与所示示例不同。 对称型双特异性抗体（bpAbs）由相同的重链（HC）或重链/轻链（HC/LC）对组成，而不对称型分子则由不同的两半组成，具有不同的结合域。四价分子MEDI4276和BAT2022是对称型bpAbs的例子，具有2+2的价数（每个整数描述分子中存在的相同亲和位点的数量），并且单链可变区片段（scFv）或单域抗体（sdAb）分别附加在HC的N端或C端。 另一方面，KN060是一个对称型双特异性抗体，具有串联的sdAb臂，没有轻链。类似于KN060，三特异性抗体TAVO412通过串联的sdAb臂实现双亲和位点靶向，该臂嵌入在更复杂的不对称格式中。 不对称型双特异性抗体通常依赖于Fc突变，以促进双特异性抗体产品的纯化或指导异二聚体形成。例如，REGN5093的两个HC被设计成对蛋白A具有不同的亲和力，允许纯化异二聚体产品。 另一方面，GEN3009是一个不对称型双特异性抗体，具有Fc域导向突变，确保两个不同的HC正确配对。除了HC异二聚体外，正确的LC配对对不对称型双特异性抗体来说可能是一个挑战。在GEN3009的例子中，通过两个亲本抗体的温和体外反应实现正确的配对，允许HC重组而不打乱原始的LC配对。REGN5093展示了一种避免LC配对问题的整体策略，它由两个不同的HC与两个相同的LC配对组成。这些共同的LC可以直接从具有定义的LC多样性的发现平台中获得，如REGN5093的例子，或者从现有的LC中工程化，如anbenitamab和GR2002。 ISB 1442和SAR441236是不对称型双特异性抗体的例子，它们通过增加Fab或scFv结构域扩展了免疫球蛋白G（IgG）结构，分别实现更高的价数，甚至在SAR441236的情况下实现三亲和位点结合。较小的不对称格式，如基于片段-Fab的zanidatamab或基于片段的TNB-738也可以被利用。Zanidatamab将scFv结构域与完整的Fab臂配对，而TNB-738从两个sdAb中衍生出其结合臂，并添加了一个惰性的LC以便于制造。除了免疫球蛋白折叠，双亲和位点设计的ankyrin重复蛋白（DARPin），MP0274，突出了替代框架的潜力。 Labrijn等人全面回顾了所有双特异性格式。 图2. 双特异性抗体的作用机制。(a) 双特异性抗体在顺式或反式中的强靶标结合的示意图。双特异性抗体可以解锁新的生物学活性，例如 (b) 双通路抑制，(c) 锁定外域在酶学上不活跃的状态，或 (d) 双特异性受体靶向以形成更高阶的复合物并引发激动作用。 (e) 另外，双特异性抗体在反式中的结合可以导致受体和Fc结构域聚集，从而快速内化和溶酶体运输或强烈的效应功能，特别是补体依赖的细胞毒性。 3.双特异性抗体的作用机制 3.1.双亲和位点靶向通过亲和力增强结合 与同一目标上的两个不同、不重叠的表位结合，导致双特异性抗体与其它抗体相比具有独特的属性。许多双特异性抗体显示出比它们的单亲和位点亲本抗体更强的结合力和更慢的解离速度。这是由于对同一（顺式）或不同（反式）目标分子上的两个不同表位的亲和力结合。亲和力定义为单个分子通过多个非共价相互作用的组合以及一旦建立了第一次相互作用，结合和重新结合事件的可能性增加。 针对不同表位的抗体片段可以通过亲和力链接来增加目标亲和力，如基于sdAb的、临床评估的双特异性抗体ALX-0651和BI 1034020所强调的。与单价或双价单克隆抗体（mAbs）相比，双特异性抗体的解离可以显著更慢，使它们成为优越的拮抗剂、反向激动剂或反向拮抗剂。顺式结合形成1:1的双特异性抗体目标复合物对于这些应用来说可能很重要，以避免不需要的激动剂活性。 除了表位选择，结合域的几何排列、sdAb连接优化和亲和力调节对于实现期望的作用机制（MoA）和最大化效果至关重要。Kast及其同事证明，结合域的几何形状对于人表皮生长因子受体2（HER2）的双特异性及四价融合蛋白的拮抗作用至关重要，某些配置显示出激动剂活性。同样，针对表皮生长因子受体（EGFR）的三价抗纤维连接蛋白融合蛋白的不同结构在受体下调中显示出不同的效果。对于基于sdAb的拮抗剂，最佳的取向和连接属性可以通过顺式结合实现超高亲和力。最后，临床双特异性抗体ISB 1442依赖于仔细调节的CD38和CD47亲和力以减少靶向毒性。ISB 1442的抗CD47 Fab已被设计为弱亲和力，以实现对CD47阳性红细胞的最小反应性。高亲和力的双特异性抗CD38臂能够在CD38低表达的肿瘤细胞上实现强烈的目标参与和高特异性。 双特异性抗体的高亲和力和缓慢解离也适合于招募免疫细胞。例如，刘及其同事通过融合两个针对不重叠表位的sdAbs与一个抗CD3 Fab，设计了一种T细胞结合抗HER2双特异性抗体。得到的构建物在HER2阳性细胞上的结合比相应的单特异性亲本分子增加了30倍，并在体内HER2低表达模型中显示出优越的肿瘤抑制活性。同样，Rennert等人设计了一种针对C型凝集素结构域家族12成员A（CLEC12A）的双特异性桥接蛋白，该蛋白由其分泌并招募抗CD19 CAR-T细胞。双特异性靶向实现的高亲和力导致增强的抗CD19 CAR-T细胞毒性。由于sdAbs的小尺寸，CAR可以直接配备双特异性抗体，如cilta-cel和OriCAR-017所示。这些CAR的高亲和力双特异性结合可以实现增强和持久的效果。如上所述，对于基于sdAb的拮抗剂，仔细选择表位和连接优化可能是关键。3.2.双特异性抗体能够实现双途径抑制，并且可以锁定受体和外酶的构象 结合两个不重叠的表位可以为双特异性抗体（bpAbs）解锁独特的活性。例如，通过针对低密度脂蛋白受体相关蛋白6（LRP6）的双特异性抗体实现了双通路抑制，同时阻断Wnt1和Wnt3a介导的β-连环蛋白信号通路，显著地没有激动剂活性。 或者，双特异性抗体可以通过物理限制其靶标来使其失活。针对HER2的双特异性DARPin的晶体结构揭示了结合和扭曲两个HER2受体，阻止了与EGFR家族成员形成具有信号能力的二聚体。 此外，针对CD38和CD73的双特异性抗体，包括临床双特异性抗体TNB-738，被证明通过将各自的细胞外结构域锁定在催化非活性状态来作为酶抑制剂。 尽管单独的亲本抗体没有显示出任何活性，但针对CD73的双特异性抗体具有亚纳摩尔级的活性，并实现了超过90%的抑制。 双特异性抗体可以形成免疫复合物，导致激动剂活性、快速目标内化、溶酶体运输和改善的免疫效应功能。 双特异性抗体的一个独特特性是它们能够通过同时在反式中结合两个不重叠的表位来形成高阶免疫复合物。目标交联是多种作用机制的基础，包括增强的激动剂活性、Fc介导的效应功能或清除可溶性目标以及受体下调。 双特异性抗体的聚集可以促进激动剂活性，特别是对于依赖交联以实现有效下游信号传导的受体。 双特异性抗体也可能独特地激活多组分受体复合物。例如，Shi等人设计了一种针对β-klotho的两个不同表位的双特异性抗体，β-klotho是成纤维细胞生长因子受体1c（FGFR1c）的共受体。 双特异性靶向既必要又足以引发强大的激动剂活性。双特异性抗体通过双特异性抗体增加Fc结构域的局部浓度，从而可以改善效应功能。 这种效应已在被单克隆抗体靶向的多价复合物中观察到，例如被治疗性单克隆抗体利妥昔单抗靶向的B细胞标记CD20。 双特异性抗体的结合可以扩展这种机制到更多的目标。例如，zanidatamab形成的大HER2聚集被证明比亲本单克隆抗体的组合导致更强的补体依赖性细胞毒性（CDC），这是由于Fc结构域的预组织和C1q沉积的增加。 这种效应在引入六聚体增强点突变的Fc结构域的针对CD37的双特异性抗体GEN3009中进一步放大。 尽管Fc聚集的效果不那么明显，但双特异性抗体已被证明也可以通过增加与自然杀伤（NK）细胞上的FcγRIII受体的结合来改善抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）。 类似地，通过针对白细胞介素6（IL6）的双特异性抗体聚集，增加了Fcγ受体在吞噬细胞上的结合，并促进了可溶性目标的快速清除。 交联的受体筏已被证明可以迅速内化并运输到溶酶体，导致目标的快速下调。 值得注意的是，交联效率及其相关效应可能取决于表位选择以及双特异性抗体：目标几何形状。 快速内化和溶酶体运输使双特异性抗体成为抗体药物偶联物（ADCs）中越来越受欢迎的构建模块，它们推动了肿瘤输送和细胞毒素有效载荷的细胞内释放，如MEDI4276、REGN5093-M114和zanidatamab zovodotin所示。 与单特异性药物相比，针对叶酸受体α（FRα）的双特异性ADC IMGN151显示出优越的有效载荷输送。 由于这种效应与细胞表面FRα密度无关，人们推测IMGN151增加的有效载荷输送是通过增强FRα阳性细胞上的结合事件而不是聚集，这应该随着受体密度的增加而减少。然而，这两种机制并不是相互排斥的，需要进一步的研究来阐明IMGN151的作用机制。3.3.同时结合不同的表位可以克服抗性机制 在治疗病毒感染中常见的挑战是找到一种广泛中和抗体（bnAb），它结合在衣壳蛋白的保守区域，并产生持久的反应。单价抗体可以针对保守区域，但容易受到突变逃逸的影响，因为它们对病毒施加了选择性压力。类似于小分子药物的鸡尾酒疗法，bnAbs的组合已被证明通过降低单次突变逃逸变体的机会，有效减少单药治疗的抗性。 双特异性广泛中和抗体结合了鸡尾酒疗法的临床益处和单一药物剂量使用的便利性，使它们成为开发中令人兴奋的领域。 针对严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）的双特异性广泛中和抗体BAT2022，被证明能够结合所有主要的关注变体，包括一个不再被一个亲本抗体识别的受体结合域（RBD）突变体。 对于HIV，三特异性广泛中和抗体SAR441236和几个临床前分子通过针对病毒衣壳蛋白上的多个表位显示出前景。 防止抗性的多价靶向对于肿瘤相关抗原（TAA）的靶向也可能是临床上有用的。肿瘤细胞可以通过选择性剪接消除靶向的表位。人们推测，双特异性CAR-T细胞可以通过同时针对两个表位来防止肿瘤逃逸。 虽然进一步的机制研究将很重要，但这对于癌症免疫疗法是一个有趣的前景。虽然概念上不同，Spangler和同事证明了针对EGFR的三特异性靶向可以恢复对西妥昔单抗耐药的异种移植模型的疗效，这些模型在下游信号通路中有突变。 最有效的三特异性构建物实现了单独使用双特异性或单特异性构建物无法实现的受体下调水平。3.4.治疗应用和模式 迄今为止，大多数双特异性抗体已开发用于肿瘤学应用，并且随着cilta-cel的批准，首个基于双特异性抗体的细胞疗法已获批用于复发和难治性多发性骨髓瘤。 许多其他双特异性抗体目前正在早期临床试验中，用于血液癌症的治疗，包括ISB 1442和OriCAR-017，它们都处于治疗复发/难治性多发性骨髓瘤的I期。 对于实体瘤的治疗，许多双特异性抗体针对HER2，HER2是一种受体酪氨酸激酶，涉及包括细胞增殖在内的多种细胞功能。在20-25%的乳腺癌患者中观察到HER2的高水平过表达。 通过结合临床单克隆抗体曲妥珠单抗和帕妥珠单抗靶向不重叠的结构域IV和II，分别针对两个不同的HER2表位，以前已被证明可以显著改善治疗结果和预后。 HER2的重要性和双表位靶向的临床先例可能解释了管线中大量的抗HER2双特异性抗体，包括anbenitamab和zanidatamab，这是两个最先进的针对HER2的双特异性抗体。 其他杰出的肿瘤学靶标也通过双特异性抗体进行追求，包括通过REGN5093（-M114）和IMGN151分别针对间充质-上皮转化因子（MET）和叶酸受体α（FRα）。 在肿瘤学之外，临床候选药物SAR441236和BAT2022突显了双特异性抗体在传染病中的潜力。阻碍广泛实施针对急性感染的bnAbs的一个挑战是逃逸变体的出现，正如最近的SARS-CoV-2大流行所说明的那样。 针对单一表位的单克隆抗体只在突变逃逸变体发展并广泛传播之前有效，这使得既定的疗法无效。针对多个表位的bnAbs，如针对SARS-CoV-2的双特异性抗体BAT2022或针对HIV的三特异性抗体SAR441236，可以克服急性和慢性疾病中单突变逃逸变体的出现，允许持续使用和更持久的患者反应。 大多数临床双特异性抗体作为裸抗体发挥作用，以治疗病毒感染，通过相应的受体抑制或促进细胞信号传导，或者如TNB-738通过抑制酶活性。越来越多地，双特异性抗体被用于作为ADCs的一部分进行有效载荷输送，因为它们独特的作用机制促进了内化和溶酶体运输，如上所述。目前有六种双特异性ADC正在临床评估中，其中三种也在作为裸双特异性抗体进行研究。此外，双特异性抗体的高亲和力和选择性使其成为工程化高效T细胞招募者和CARs的有吸引力的选择。 在本节中，我们讨论了已在临床中进行测试或正在测试的双特异性抗体的结构、作用机制和活性，这些分子的数据是可用的。3.5.ALX-0651 Ablynx的ALX-0651，一种针对CXCR4的双特异性串联单域抗体，是第一个针对GPCRs的临床使用的生物制剂，并且据我们所知，是第一个进入临床的双特异性抗体（2011年）。虽然ALX-0651的单个单域抗体构建模块显示出中性拮抗剂活性，但双特异性ALX-0651不仅显示出更高的亲和力，而且还显示出针对CXCR4的反向激动剂活性。 临床前数据表明ALX-0651在阻断CXCR4介导的病毒进入以及诱导快速干细胞动员方面是有效的。尽管临床前数据支持开发，但由于缺乏对标准护理的优越性，ALX-0651已被终止。3.6.BI 1034020 BI 1034020是由Ablynx和勃林格殷格翰开发的一种双特异性、半衰期延长的串联单域抗体。这种双特异性抗体针对大脑中淀粉样蛋白β（Aβ）的两个独立表位，旨在用于阿尔茨海默病的治疗。BI 1034020的I期研究于2013年开始，但在发生与药物相关的严重不良事件后被终止。3.7.MEDI4276 MEDI4276是由Medimmune开发的一种针对HER2的抗体药物偶联物（ADC），于2015年进入临床。MEDI4276由一种基于曲妥珠单抗scFv的四价双特异性抗体组成，该抗体靶向HER2的域IV，并在mAb 39S的重链N端融合，后者靶向域II。这种双特异性抗体向HER2过表达的肿瘤细胞输送四个位点特异性结合的tubulysin有效载荷，在那里ADC被内化并运输到溶酶体以释放细胞毒素。与曲妥珠单抗和帕妥珠单抗的组合不同，MEDI4276可以交联受体，从而实现快速内化和通过将HER2从循环重定向到溶酶体降解，有效实现细胞质输送。异种移植肿瘤模型显示，MEDI4276对HER2低表达肿瘤以及对ado-trastuzumab emtansine耐药的肿瘤都具有高效性，从而满足了高度未满足的医疗需求。在I期剂量递增研究中，MEDI4276在HER2阳性乳腺癌和胃癌中显示出临床活性，但最终由于不利的毒性概况而被终止。3.8.西他卡苯自溶 Ciltacabtagene autoleucel（cilta-cel），据我们所知，是迄今为止第一个也是唯一一个获批的基于双特异性抗体的治疗。cilta-cel最初由Legend Biotech开发为LCAR-B38M，是一种第二代自体CAR-T疗法，特点是具有两个单域抗体的双特异性外结构域，这些单域抗体针对B细胞成熟抗原（BCMA）的不同表位。双特异性靶向实现了比单特异性构建更高的亲和力结合和卓越的功效。基于CARTITUDE-1 Ib/II期研究（NCT03548207）的深度和持久反应以及可管理的安全性概况，cilta-cel在2022年获得批准。总体反应率高达97.9%，甚至高于初始I期研究（NCT03090659）观察到的87.8%。有趣的是，cilta-cel的批准仅在idecabtagene vicleucel（ide-cel）批准后的一年，ide-cel是一种具有单特异性BCMA靶向的类似CAR-T疗法。虽然应该谨慎比较各自的临床试验，但双特异性cilta-cel似乎在反应率和反应持续时间方面都优于单特异性的ide-cel。3.9.Zanidatamab和zanidatamab zovodotin Zanidatamab（ZW25）是一种由Zymeworks专有的Azymetric Fc平台衍生的双特异性抗体，它结合了一个针对HER2域IV的scFv和识别域II的Fab臂。Zanidatamab跨细胞膜结合两个HER2分子，引起细胞膜上受体的明显重组。除了快速内化和下调外，Fc结构域的聚集引起了强烈的补体依赖性细胞毒性（CDC），这在曲妥珠单抗、帕妥珠单抗或它们的组合中是观察不到的。双特异性HER2结合在体内异种移植模型中显示出比曲妥珠单抗和帕妥珠单抗组合更优越的抗肿瘤活性。Zanidatamab在具有不同HER2表达水平的多种肿瘤患者中显示出安全性。目前正在进行多项临床试验，包括针对乳腺癌的II期试验(NCT04224272)和针对晚期胃食管腺癌的III期试验(NCT05152147)。Zanidatamab也在探索用于输送细胞毒性微管抑制剂。这种双特异性ADC，zanidatamab zovodotin(ZW49)，已被证明是免疫原性细胞死亡标志物的强诱导剂，并且对一系列HER2表达水平的乳腺癌和胃癌患者衍生的异种移植模型非常活跃。目前正在进行I期临床试验(NCT03821233)。3.10.MP0274 由Molecular Partners开发的MP0274通过DARPins实现双特异性HER2靶向，DARPins是可像串珠一样串联的替代框架。四价MP0274分子包含一个分别针对HER2域I和IV的DARPin，以及两个用于延长半衰期的人类血清白蛋白结合域。像基于IgG的抗HER2双特异性抗体一样，MP0274交联HER2受体，在各种HER2阳性细胞系和小鼠模型中显示出与曲妥珠单抗和帕妥珠单抗组合相当的抗肿瘤活性。然而，MP0274可能通过稳定AKT调节的叉头转录因子FOX03a导致诱导凋亡，展现出独特的作用机制。在HER2阳性实体瘤患者的I期研究中，MP0274显示出良好的暴露和有利的安全性概况。一位先前接受过曲妥珠单抗和帕妥珠单抗治疗的转移性乳腺癌患者对MP0274显示出持续反应，确立了临床概念验证。回顾性生物标志物分析揭示，这位患者是唯一一个携带HER2阳性、PI3K野生型遗传标志的患者，且在最高剂量水平，这表明在良好的MP0274暴露下，患者选择可能导致更高的反应率。然而，由于战略原因，MP0274的进一步临床开发已被停止。3.11.Anbenitamab和JSKN003 Alphamab Oncology基于曲妥珠单抗和帕妥珠单抗设计了一种双特异性HER2靶向抗体anbenitamab(KN026)。通过组合旋钮-入-孔和静电导向突变实现了相应HCs的异二聚体Fc配对。基于HER2相互作用残基的结构阐明，设计了一种可以与曲妥珠单抗和帕妥珠单抗HC分别有效配对的通用LC。由安进公司开发的双特异性抗体anbenitamab显示出比曲妥珠单抗和帕妥珠单抗组合更强的抗肿瘤活性，这一效果在不同HER2水平的多种肿瘤细胞系中均有体现，并且在小鼠模型中活性相当。初步特性分析表明，anbenitamab保留了其亲本单克隆抗体的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）和抗体依赖性细胞吞噬作用（ADCP），同时能够同时结合HER2的两个不同表位。anbenitamab于2018年进入临床试验，并在至少接受过一线治疗（包括曲妥珠单抗）的晚期转移性乳腺癌患者中显示出良好的安全性。 在第二项临床试验中，anbenitamab在HER2表达的晚期胃癌和胃食管结合部癌患者中表现出良好的耐受性。基于初步的积极活性，anbenitamab目前正在进行多项临床试验的评估，包括两项注册研究：作为HER2阳性晚期或转移性胃癌的二线治疗（NCT05427383），以及作为HER2阳性复发或转移性乳腺癌的一线治疗（NCT05838066），两者均与化疗联合使用。将anbenitamab与拓扑异构酶I抑制剂结合，得到了双特异性抗HER2抗体药物偶联物JSKN003，目前正在进行首次人体I期研究，针对晚期实体瘤（NCT05494918）。 3.12.额外的HER2靶向bpAbs 此外，MBS301、BCD-147、TQB2930和KM257是基于曲妥珠单抗和帕妥珠单抗的四种额外的临床阶段抗HER2双特异性抗体。MBS301结合了曲妥珠单抗和帕妥珠单抗的去岩藻糖化半抗体，它们在工程CHO细胞系中分别生产，并通过体外使用结-洞突变异二聚体化。从Fc结构域中去除岩藻糖可以增强ADCC活性，结合双特异性靶向，可在不同HER2水平的肿瘤细胞系中以及在小鼠模型中产生强大的活性。目前正在进行一项I期临床研究（NCT03842085），评估MBS301用于治疗HER2阳性复发或转移性恶性实体瘤的效果。Biocad的BCD-147采用了一种不对称scFv-Fab格式，并已在健康志愿者中进行了I期研究（NCT03912441）。结构相似的TQB2930由泰国天晴药业开发，正在研究用于HER2阳性实体瘤的裸抗体（NCT05380882）以及作为抗体药物偶联物（TQB2102）在HER2阳性乳腺癌（NCT06115902）和胃癌中的应用。最后，轩竹生物制药正在开发不对称的通用LC双特异性抗体KM257，目前正在临床研究中，用于HER2阳性实体瘤（NCT05320874）以及作为抗体药物偶联物（KM501）在HER2阳性晚期实体瘤（NCT05804864）中的应用。 3.13.SAR441236 针对HIV的有效广谱中和抗体（bnAbs）的识别和开发由于病毒的高遗传多样性而面临挑战。大型和小分子单一疗法在很大程度上失败了，因为选择性压力增加了突变逃逸变体的机会。使用bnAbs组合的临床前和临床研究表明，靶向多个表位可以提高疗效。 SAR441236，由赛诺菲公司进行的I期临床开发（NCT03705169），由具有双重特异性的交叉双变量Ig样（CODV-Ig）臂与具有第三独特特异性的Fab臂配对，使其成为一种三特异性广谱中和抗体。临床前体内数据表明，三特异性广谱中和抗体在减少病毒载量和预防非人灵长类动物（NHP）类似的人类免疫缺陷病毒（SHIV）病毒挑战模型中的感染方面更为有效。3.14.GEN3009 Genmab结合其专有的DuoBody和HexaBody技术，设计了GEN3009，这是一种针对CD37的双特异性抗体，具有增强的Fc介导的六聚体化。这种双特异性抗体包含互补的Fc突变，这些突变引导体外控制的Fab臂交换反应中的异二聚体化，并通过E430G突变增强六聚体化。由于双表位靶向加上增强的六聚体化导致的Fc结构域密度的局部增加，与单一亲本单克隆抗体或组合相比，在B细胞淋巴瘤细胞系以及患者来源的慢性淋巴细胞白血病样本中均显示出优越的补体依赖性细胞毒性（CDC）。Fc结构域聚集进一步增加了ADCC和ADCP，导致在几种细胞系衍生的异种移植模型以及患者来源的非霍奇金淋巴瘤异种移植中产生强大的抗肿瘤活性。GEN3009已在复发或难治性B细胞非霍奇金淋巴瘤患者中进行了首次人体试验（NCT04358458），但由于战略原因，最近停止了进一步的临床开发。3.15.REGN5093和REGN5093-M114 Regeneron的双特异性抗MET常见轻链抗体，REGN5093，作为抗体（NCT04077099）和作为抗体药物偶联物（NCT04982224）已进入临床。源自Regeneron专有的VelocImmune平台，REGN5093有效地抑制了配体独立的MET和HGF诱导的信号传导。DaSilva等人表明，REGN5093创造了具有2:2化学计量比的抗体-受体复合物，与单特异性抗体形成1:2复合物形成对比。这些更大的复合物可能导致REGN5093所见的MET降解，这是由于回收效率降低和bpAb：受体复合物的溶酶体流量增加所致。Regeneron进一步利用REGN5093的这一特性，通过在其上结合专有的细胞毒素美登素载荷来开发REGN5093-M114。该分子在MET依赖性和MET非依赖性肿瘤模型中均显示出疗效，进一步证明了双特异性抗体药物偶联物方法的效用。3.16.OriCAR-017 Oricell的双特异性GPRC5D靶向CAR-T细胞疗法，OriCAR-017，已进入临床，用于治疗复发和难治性多发性骨髓瘤（NCT05016778）。类似于cilta-cel，OriCAR-017 CAR包含串联的单域抗体，靶向GPRC5D上的两个不同表位。作者推测，双特异性靶向增加了他们的CAR-T细胞疗法的特异性和亲和力，从而提高了疗效。报告了有利的I期安全性和有效性数据，并支持OriCAR-017的进一步开发。3.17.SARS-CoV-2 中和双特异性抗体（bpAbs） MABS由SARS-CoV-2引起的全球大流行促使全球范围内的大量研究工作，多个研究小组展示了使用单域抗体（sdAbs）等抗体片段作为构建双特异性抗体（bpAbs）的基石的效用。 一些研究表明，双特异性抗体通过要求多个同时突变，大大减少了突变逃逸的发生率。与通常限于通过阻断RBD-ACE2界面来阻断的传统单价结合物不同，双特异性抗体的顺式结合显示了阻断和构象变化，而双特异性结合则在多聚体中进行了阻断和多聚体化。已进入临床的最先进的针对SARS-CoV-2的双特异性抗体BAT2022已完成了I期安全性和耐受性研究（NCT05518695）。BAT2022是一个对称的2+2 Fc含量分子，由一个sdAb分子连接到HC的C末端。BAT2022保持了其作为广谱中和抗体对抗多种SARS-CoV-2亚变体的有效性，展示了作为治疗性抗体的效用。多余的。3.18.ISB 1442 Ichnos Sciences的ISB 1442是一种基于专有的BEAT 2.0（基于TCR的双特异性抗体结合）平台的双特异性抗体，它与一个串联Fab臂上的两个不同的CD38表位具有高亲和力结合，并结合一个低亲和力的CD47 Fab臂以阻断吞噬细胞上的信号调节蛋白α（SIRPα）。低CD47亲和力旨在防止对红细胞的靶向毒性，同时在高亲和力双特异性CD38臂的引导下结合时实现强大的抗肿瘤活性。结合Fc突变以增强效应功能，ISB 1442不仅影响ADCP，还表现出ADCC和CDC。临床前数据表明，这种复杂的MoA可能比单一靶点药物具有更高的疗效和安全性。因此，ISB 1442目前正在进行一项针对复发/难治性多发性骨髓瘤患者的I/II期临床研究（NCT05427812）。3.19.TNB-738 Ancora Biotech的TNB-738是一种由Teneobio的专有转基因UniRat平台衍生的两个sdAbs组成的不对称抗CD38双特异性抗体，它们与不同的CD38表位具有高亲和力结合。TNB-738使用结-洞突变实现重链配对，一个完全沉默的IgG4 Fc以消除效应功能，以及在一个臂上使用惰性的kappa LC和CH1以提高可制造性。目前正在健康志愿者中进行I期剂量递增（NCT05215912），TNB-738通过酶抑制发挥作用。3.20.IMGN151 Immunogen的下一代FRα ADC已进入临床（NCT05527184），紧随其第一代FRα ADC mirvetuximab-soravtansine之后，该药物于2022年获得美国食品药品监督管理局（FDA）的加速批准。IMGN151包含一个scFv臂与一个mirvetuximab Fab臂配对，每个臂都结合FRα的独特和不重叠的表位。IMGN151的双特异性靶向模式增强了FRα阳性细胞上的结合事件，从而在高、中、低FRα表达的细胞系中实现了优越的载荷传递。双特异性抗体结合增加的传递以及更有效的连接子-载荷可能允许IMGN151比mirvetuximab soravtansine治疗更广泛的患者群体。 4.结论和展望 从单特异性单克隆抗体的组合中演变而来，双特异性抗体已通过2022年FDA批准的首个基于双特异性抗体的疗法证明了其临床安全性和有效性。临床管线中的双特异性抗体基于多种格式，除了存在Fc结构域以增强稳定性和效应功能外，没有明确的趋势。最终，生物学决定了双特异性抗体的设计。与传统的单克隆抗体、双特异性抗体甚至针对不同表位的单克隆抗体组合相比，双特异性抗体提供了独特的作用机制，使它们成为多种适应症有吸引力的治疗选择。双特异性抗体结合的亲和力可以实现高度选择性的肿瘤靶向，如双特异性抗体ISB 1442的特性，这些特性还可以使T细胞引导者或CAR-T细胞等治疗方式受益，正如双特异性CAR-T疗法cilta-cel的临床成功所突出的那样。目前正在临床测试的大多数双特异性抗体已被证明可以影响TAA聚集以改善受体激动、效应功能和/或有效的内化和溶酶体运输。除了治疗性单克隆抗体外，这种作用机制特别适合改善向肿瘤的细胞毒性载荷传递，正如目前正在评估的六种ADC所说明的那样。或者，双特异性结合可能通过增强结合事件来改善载荷传递，正如对IMGN151的推测。除了高亲和力结合和受体聚集，双特异性抗体已被用于其他作用机制，如双通路抑制、多组分靶标的激活，或者如抗CD38双特异性抗体TNB-738的例子，锁定一个在酶学上不活跃的状态。在传染病领域，双特异性抗体有希望解锁具有增强持久反应、对多样化病毒景观更广泛有效，并且可能大大限制突变逃逸变体出现的广谱中和抗体。该领域正从双特异性抗体转向三特异性抗体甚至更高级的抗体，以应对一些最具挑战性的人类疾病，如HIV和SARS-CoV-2。随着进入临床的双特异性抗体数量的增加，双特异性抗体在靶向治疗中具有巨大的潜力。目前的双特异性抗体临床格局显示出对HER2靶向药物及其依赖于受体聚集的相关作用机制的强大集中。HER2的突出可能可以用曲妥珠单抗和帕妥珠单抗的组合疗法的临床先例来解释。然而，随着新技术使更复杂的结构更容易获得，我们预计双特异性抗体的靶标和适应症的数量将大幅增加。以前用传统单克隆抗体在临床上失败的靶标可能因双特异性抗体的独特作用机制而变得可获得，并且可能出现特别适用于双特异性抗体的新靶标。正如SAR441236和临床前研究所强调的，三特异性或更高价的结构可以扩展双特异性抗体的效果，甚至解锁新的作用机制。通过首个双特异性抗体治疗的批准得到验证，双特异性抗体的临床管线正在迅速扩展，并将激发对这个独特的抗体类别进行更多研究，以充分利用双特异性抗体在靶向治疗中的潜力。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

▎药明康德内容团队编辑 过去，传统的小分子和抗体药物仅能靶向约20%的蛋白，其余约80%被视为“不可成药”。然而，随着靶向蛋白降解（TPD）机制的提出，尤其是在分子胶和蛋白降解嵌合体（PROTAC）技术方面取得的突破，这些“不可成药”靶点逐渐变得可及，显著扩展了可靶向的疾病机制和适应症范围。今天，药明康德内容团队将结合公开资料以及《自然》子刊Nature Reviews Drug Discovery近期发布的综述文章，带领读者深入了解蛋白降解领域的产业进展及其所面临的挑战。 扩大可及靶点范围 靶向蛋白降解技术，尤其是通过分子胶和PROTAC，大大扩展了可成药的靶点，使得此前难以触及的目标变得可行。传统上，一些蛋白如转录因子、GTP酶和鸟嘌呤核苷酸交换因子（GEF），因其表面光滑、缺乏结合位点，使得传统小分子抑制剂难以发挥作用，从而被认为“不可成药”。然而，分子胶和PROTAC降解剂利用E3连接酶的特性，募集这些难以靶向的蛋白进行泛素化，从而实现降解和抑制。例如，Monte Rosa Therapeutics开发的口服分子胶降解剂MRT-2359，通过引导E3连接酶与转译终止因子GSPT1的相互作用，实现GSPT1的降解。MYC转录因子是许多人类癌症的主要驱动因子之一，研究表明MYC活性依赖于GSPT1，通过降解GSPT1，MRT-2359可能破坏蛋白质合成机制，在MYC驱动的肿瘤中展现抗癌活性。最新的1/2期临床试验结果显示，在接受治疗的实体瘤患者中，MRT-2359在所有剂量（0.5 mg至2.0 mg）下均可降低GSPT1表达水平约60%。在6例生物标志物阳性患者中，2例出现部分缓解，1例病情稳定。 在PROTAC领域，Kymera Therapeutics开发的KT-333是一款潜在的“first-in-class”STAT3靶向降解剂。根据今年6月公布的1期临床试验数据，该药在多种血液恶性肿瘤中表现出抗肿瘤活性，包括两名经典霍奇金淋巴瘤患者的完全缓解。新闻稿中指出，KT-333是首款进入临床的靶向未成药转录因子的降解剂。Kymera还与赛诺菲（Sanofi）合作开发潜在的“first-in-class”降解剂KT-474，靶向过去被认为“不可成药”的IRAK4蛋白，该蛋白在先天与适应性免疫反应的交汇点起关键作用。该公司在7月宣布将扩大化脓性汗腺炎和特应性皮炎的2期临床试验，以加速推进该创新疗法的关键临床研究。 ▲靶向创新靶点的蛋白降解剂（图片来源：参考资料[1]） 靶向蛋白降解领域所面临的挑战 然而，靶向蛋白降解剂的发现与设计仍面临诸多挑战，尤其在识别和验证适合降解的靶点方面。与传统药物发现不同，传统的靶点识别依赖于对蛋白质结构的深刻理解，而靶向降解剂的开发则需要针对那些可能缺乏传统结合位点的蛋白质。因此，靶点发现通常依赖于无偏筛选技术（unbiased screening），潜在靶蛋白往往通过偶然发现而非理性设计获得。例如，分子胶通常通过E3连接酶上的独特结合位点来诱导靶蛋白的泛素化，但这些位点的发现常带有偶然性，这限制了有效降解剂开发的可预测性。 此外，设计有效的双功能降解剂还面临配体结合能力（ligandability）的挑战。双功能降解剂需要同时结合靶蛋白和E3连接酶，这使得找到可以连接两种不同分子的配体变得困难，同时还需保持药物的稳定性和有效性。由于这些结构上的要求，早期许多双功能降解剂主要靶向已有抑制剂的靶点，从而延缓了针对新靶点的降解剂的开发进程。即使成功识别出能结合靶蛋白的分子，确保降解剂在病变细胞中诱导目标蛋白降解而不影响健康细胞仍是一项复杂的平衡工作。研究人员必须细致调整降解剂的亲和力和特异性，以维持治疗窗口并减少脱靶效应，从而降低患者的副作用风险。 另一项挑战在于对新型E3连接酶的识别。目前，大多数正在开发的蛋白降解剂使用E3连接酶cereblon，因其具备与多种蛋白底物结合的特性。然而，若需将蛋白降解剂应用于更多靶点，则需识别新的E3连接酶，这一过程需要大量的发现与验证工作。 蛋白降解剂开发的创新策略 SEED Therapeutics是应对降解剂药物理性开发和创新连接酶识别挑战的先驱之一。该公司强调在分子胶药物开发中，选择适当的E3连接酶至关重要。其研发流程始于评估靶蛋白与E3连接酶之间的互补性，利用AlphaFold等计算工具并考虑E3连接酶在细胞内的位置；接着，在细胞模型中研究E3连接酶与靶蛋白的相互作用，验证其对靶蛋白的泛素化能力；通过高通量筛选发现合适的降解剂并进行验证；最终，通过药物化学优化提升药物的效能、特异性和稳定性。SEED公司主打项目包括一款基于DCAF15连接酶降解剪接因子RBM39的潜在“best-in-class”口服降解剂，预期可用于治疗神经母细胞瘤、肝癌等疾病，并计划于2025年进入临床试验阶段。最近在预印本平台bioRxiv发布的一项研究报告还介绍了一种通过天然E3连接酶Nedd-1靶向KRAS致癌蛋白的降解剂。癌症研究所蛋白质降解中心主任Zoran Rankovic博士指出，这类利用创新连接酶降解剂的开发将成为蛋白降解领域的重要趋势。 在提升药物治疗指数、减少降解剂对健康细胞的影响方面，一些公司采取了将降解剂与抗体偶联的策略。这种被称为抗体偶联降解剂（DAC）的技术，通过抗体实现组织特异性的递送，提升药物耐受性。2020年，学术期刊首次报道了DAC药物的研究进展。药明康德赋能基因泰克设计出了一款BRD4降解剂GNE-987，该药物在急性髓系白血病（AML）的异种移植模型中展现出显著的剂量依赖性体内活性，而单独使用靶向CLL1的抗体或未偶联的降解剂均未表现出体内活性。这些结果首次验证了DAC在靶向递送和克服降解剂不良药代动力学特征方面的有效性。 参考阅读：从诺奖到药物设计新宠，“强强联手”的DAC能否突破“不可成药”困境？ 2022年，Orum Therapeutics公司开发的抗体-GSPT1降解剂成为首个进入临床试验阶段的DAC候选药物，用于治疗HER2阳性实体瘤。随后，百时美施贵宝（Bristol Myers Squibb）于去年达成对Orum的收购协议，获得其潜在“first-in-class”的DAC疗法ORM-6151（现称BMS-986497）。这是一款创新的CD33靶向抗体偶联GSPT1降解剂，已获美国FDA批准进入1期临床试验，用于治疗急性髓系白血病和高危骨髓增生异常综合征。百时美施贵宝肿瘤发现部门负责人Neil Bence博士表示：“抗体结合方法是提升GSPT1降解效果及耐受性的理想选择。” 总之，靶向蛋白降解技术的进展标志着药物发现领域的关键性转变，分子胶和PROTAC的应用为治疗开辟了前所未有的可能性。通过扩展可成药的靶点范围，尤其是在治疗选择受限的疾病领域，该技术正重新定义对患者治疗的潜在影响。尽管该领域在设计和发现阶段仍面临诸多挑战，随着产业和学术界在科学与技术上的不断突破与创新，靶向蛋白降解技术有望在未来带来更多新药获批，造福广大患者。 ▲欲了解更多前沿技术在生物医药产业中的应用，请长按扫描上方二维码，即可访问“药明直播间”，观看相关话题的直播讨论与精彩回放 参考资料： [1] Protein degraders push into novel target space. Retrieved October 15, 2024 from https://www-nature-com.libproxy1.nus.edu.sg/articles/d41573-024-00170-9 [2] Monte Rosa Therapeutics Announces Interim PK/PD and Clinical Data for MRT-2359 in Phase 1/2 Trial for MYC-Driven Solid Tumors. Retrieved October 17, 2023, from https://www.globenewswire.com/news-release/2023/10/17/2761331/0/en/Monte-Rosa-Therapeutics-Announces-Interim-PK-PD-and-Clinical-Data-for-MRT-2359-in-Phase-1-2-Trial-for-MYC-Driven-Solid-Tumors.html [3] Targeting oncogenic K-Ras mutants with a small-molecule degrader through Nedd4-1. Retrieved October 15, 2024 from https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2024.04.26.591418v2.full.pdf [4] Kymera Therapeutics Presents New Clinical Data from the Ongoing Phase 1 Trial of STAT3 Degrader KT-333 at EHA Annual Meeting. Retrieved June 14, 2024 from https://www.globenewswire.com/news-release/2024/06/14/2898896/0/en/Kymera-Therapeutics-Presents-New-Clinical-Data-from-the-Ongoing-Phase-1-Trial-of-STAT3-Degrader-KT-333-at-EHA-Annual-Meeting.html [5] Kymera Announces Expansion of KT-474 (SAR444656) HS and AD Phase 2 Studies Following Interim Review of Safety and Efficacy. Retrieved July 9, 2024, from https://investors.kymeratx.com/news-releases/news-release-details/kymera-announces-expansion-kt-474-sar444656-hs-and-ad-phase-2 [6] SEED Therapeutics (SEED) Enters into Strategic Research Collaboration with Eisai Co., Ltd. to Discover and Develop Novel Molecular Glue Degraders for Neurodegeneration and Oncology Indications. Retrieved August 6, 2024, from https://www.globenewswire.com/news-release/2024/08/06/2924891/0/en/SEED-Therapeutics-SEED-Enters-into-Strategic-Research-Collaboration-with-Eisai-Co-Ltd-to-Discover-and-Develop-Novel-Molecular-Glue-Degraders-for-Neurodegeneration-and-Oncology-Indi.html 免责声明：药明康德内容团队专注介绍全球生物医药健康研究进展。本文仅作信息交流之目的，文中观点不代表药明康德立场，亦不代表药明康德支持或反对文中观点。本文也不是治疗方案推荐。如需获得治疗方案指导，请前往正规医院就诊。 版权说明：本文来自药明康德内容团队，欢迎个人转发至朋友圈，谢绝媒体或机构未经授权以任何形式转载至其他平台。转载授权请在「药明康德」微信公众号回复“转载”，获取转载须知。 分享，点赞，在看，聚焦全球生物医药健康创新