AGO3

靶向半胱氨酸（Cys）的共价药物在癌症治疗中取得了巨大的成功。其中知名的分子包括靶向EGFR用于治疗非小细胞肺癌的奥西替尼（osimertinib）以及靶向BTK用于治疗B细胞淋巴瘤的伊布替尼（ibrutinib）。然而，这些药物在不同的肿瘤亚型中的表现差异很大。这意味着同一个半胱氨酸在不同的肿瘤细胞中可能有着不同的活性。而揭示半胱氨酸在不同肿瘤细胞中的活性差异，将有助于共价药物的理性设计。针对此，来自哈佛医学院的研究团队对25种肿瘤亚型的416支细胞器进行了基于活性的蛋白质组分析（Activity-Based Protein Profiling, ABPP）。具体而言，如下图A所示，首先使用三种广谱性较好的弹头KB02、KB03和KB05与细胞中的Cys反应。高活性的Cys会被弹头结合而低活性的不会。然后，使用DBIA去结合未反应的Cys。进而，通过富集与质谱分析，可以反过来推导各个Cys的反应活性。研究人员对高活性的Cys进行富集分析，发现在蛋白家族层面，微管结合蛋白的Cys往往具有高活性；从通路层面，Rho GTP酶通路上蛋白的Cys往往有高活性。不过，Cys活性和蛋白质的氨基酸丰度没有明显关系。此外，他们也发现，例如在PIK3CA·C301中，其活性在不同细胞系间有显著差异。他们将Cys的活性数据及其在蛋白家族、结构域与通路的分析结果总结成DrugMap数据库，并开源在网站上（drugmap.net）（上图B-G）。之后，研究人员对DrugMap进行了更深入的分析。首先，构建了一个深度学习模型，以一个Cys的结构描述符与附近氨基酸分布作为输入，预测该Cys能否与KB03结合。最后模型的AUC约为0.7，这表明Cys的局部结构特征与Cys活性相关（上图A-C）。为了进一步探讨这种相关性，他们对结构特征进行了富集分析。结果表明，满足中度裸露的、处在α螺旋或PPI界面上的、附近有碱性氨基酸的以及处在蛋白质口袋中的Cys有更高的活性（上图D-N）。在所有的Cys中，有些Cys在任何细胞系中都保持高活性，而另一些Cys在一些细胞系中活性高，在另一些细胞系中则活性低（上图A-B），后者所在的蛋白往往和细胞内的氧化还原机制相关（上图C）。基于此，他们先向K562细胞内加入还原剂tmTECP，发现Cys活性的分布显著右移；通过调节氧化还原通路来调节细胞内的氧化还原环境，发现加入KI696（提升抗氧化的NRF2的表达）或加入DOXY（减少细胞内过氧化氢的含量）会使得Cys活性的分布右移，而加入BSO（减少抗氧化的谷胱甘肽）或Piercidin A (提升NADH/NAD)均不会使得Cys活性的分布发生显著变化。（上图D-E）。上述结果表明，Cys的活性于细胞的氧化还原状态有关，并且不同的Cys的活性可能是收到不同氧化还原通路所调控的。他们还进一步给出了一个例子。例如，基因KEAP1的突变会提升NRF2的表达，进而提升细胞环境的还原性。事实上，发生该基因突变的细胞系中，多个Cys的活性发生显著变化（上图G-H）。不同的肿瘤细胞的氧化还原环境差异很大，这样进一步强调了分析不同肿瘤细胞Cys活性的重要性。进而，他们研究了蛋白质构象与Cys活性的关系。首先计算了同一个蛋白上，两两Cys，活性在不同细胞系上的相关性（这种相关性可能和蛋白质构象变化相关，即构象变化会协同影响多个Cys的活性）。这一计算发现，高度相关的Cys有着一些相同的特征，例如中等暴露（上图A-B）。在所有Cys对中，研究者注意到相关性最高的，在UGDH上的C64与C112（上图C）。其中，C112处在UGDH的一个构象变化区域附近（上图D）。加入UGDH的变构调节剂UDP-xylose，热稳定性实验表明UGDH的构象发生变化（上图E），而Cys活性测定实验则有解释Cys的活性提升（上图F）。这一结果表明UGDH·C112的活性与UGDH的构象有关。在最开始测定Cys活性的ABPP实验中，先加入弹头，再加入DBIA，会降低DBIA与Cys的结合率。然而，在一些体系中，他们观察到加入的弹头会促进DBIA与Cys的结合（上图G）。他们猜测这可能是因为弹头结合了另一个Cys，使得蛋白构象发生变化，从而促进当前Cys与DBIA的结合（称之为“反向可靶性”）。为了验证这一点，他们选择了反向可靶性出现比较厉害的RACK1蛋白。这个蛋白上有多个Cys，其中除了C182有正向可靶性，其余均为反向可靶性（上图H）。据此，他们推测弹头与C182结合后，会引起蛋白质构象变化，使得其与Cys更容易与DBIA结合。他们通过热稳定性实验验证了这一猜想（上图I-K）。此外，他们通过将已报道的，会引起构象变化共价药物加入蛋白中，发现也会引起其他Cys反应活性的变化。据此，可以看到Cys的活性受蛋白质构象调控（上图L-M）。接着又研究了点突变与Cys活性的关系。他们首先研究了Cys活性与相关基因表达量之间的关系，发现有些Cys的活性（如ACTL8·C197和AGO3·C238）与表达量线性相关，但总体上确没有很强的相关性（上图A）。不过，他们发现Cys的活性与该蛋白的突变压力有很好的线性相关性（上图B-C）。这表明Cys活性可能与附近的点突变相关。他们寻找了其中一个例子。例如在PRDX5中，在发生突变的HCC1395细胞系中，其Cys活性会远高于未发生突变的其他细胞系（上图D-F）。在分析完DrugMap中的规律后，他们进一步挑选了DrugMap中活性高、表达量多且重要的两个Cys靶标（上图A-B）开展药物设计。在NFκB1靶标上，他们用先前的ABPP方法筛选了一个4000+的商业Cys弹头库，从中筛选出了苗头化合物SH-7346。该苗头化合物相比另一个苗头化合物SH-6484有着更好的Cys选择性。苗头化合物被进一步改造为先导化合物SH-1696（上图C-D）。通过点突变实验、质谱检测与晶体，他们验证了SH-1696的确与NFκB1·C61结合（上图E-G）。SH-1696能抑制肿瘤细胞增殖，其IC50为4.916 μM。从机制上，SH-1696能显著降低NFκB1相关基因的表达（上图H-J）。在SOX10靶标上，研究人员通过U257细胞的增殖表型，对1000个Cys弹头的库进行筛选，最终获得了苗头化合物2-A01，并进一步改造为先导化合物SH-0029，其抑制增殖的IC50为11.85μM（上图E-F），并通过点突变实验验证了SH-0029与SOX10·C71结合（上图G）。有趣的是，虽然有着不错的IC50，SH-0029与SOX10·C71的结合程度并不高（上图H）。由于SOX10·C71位于PPI位点附近，他们采样SH-0029是通过影响PPI作用来调控蛋白的。对次，作者进行了排阻色谱实验与Co-IP实验，发现SH-0029能促进SOX10二聚化，从而抑制细胞的增殖表型（上图I-K）。进一步发现SH-0029可以广谱抑制51种肿瘤细胞系的增殖。RNA-Seq实验表明SH-0029能抑制增殖相关基因的表达。综上，本文通过大量的ABPP实验，构建了Cys在不同肿瘤细胞亚型中的活性变化（DrugMap），并据此总结出了Cys活性与局部结构特征、细胞内氧化还原状态、蛋白质构象以及周围点突变的存在相关。作者挑选了DrugMap中的两个靶点（NFκB1·C61与SOX10·C71），并进一步筛选和改造出了全新的共价抑制剂，能显著抑制肿瘤细胞的增殖。本文也为未来靶向Cys的共价肿瘤药物的设计提供了新的思路。参考文献Takahashi M, Chong HB, Zhang S et al. DrugMap: A quantitative pan-cancer analysis of cysteine ligandability. Cell. 2024 Apr 17:S0092-8674(24)00318-0. doi: 10.1016/j.cell.2024.03.027. 声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！长按关注本公众号   粉丝群/投稿/授权/广告等请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓

小核酸药物，是近年来新药研发的重要类型之一。虽然，其分支ASO、siRNA正处于高产出阶段，但仍存在一些技术问题无法解决。有研究者将目光聚焦到激活机制的saRNA，以期寻求技术与领域的突破，并已有产品进入到临床开发。小核酸药物「再次出发」。01saRNA发现历史&技术特点最早提出激活RNA的概念，可追溯到上世纪60年代，有研究者认为存在一类只分布于细胞核的RNA，可与受体基因结合，形成序列特异性复合物并诱导相关基因转录对应的RNA。但在当时并未引起足够的重视。2006年，科学研究发现在p21、VEGF等多个基因的一定距离的转录起始点启动子区域设计短双链RNA（dsRNA），可上调相应靶基因的表达，并将这种具有靶向激活靶基因的短核苷酸双链命名为saRNA。saRNA，作为一类非编码RNA，结构类似于siRNA，但生物学功能完全相反。siRNA可以分别与AGO1、AGO2、AGO3和AGO4四种蛋白结合以获得活性，而saRNA只能被特异性地加载到AGO2蛋白行使功能。目前接受程度较高的RNAa基因调控模型为：1）外源性saRNA被加载到细胞质中的AGO2蛋白上；2）AGO2蛋白通过切割和丢弃其中一条RNA链，形成一个活性的AGO2-RNA复合物，并进入细胞核；3）AGO2-RNA复合物将结合到基因组DNA序列或DNA相连的反义转录本序列，进一步形成RNA诱导的转录激活复合物；4）该复合物与hnRNPs、RNAPⅡ和各种转录因子结合，诱导靶基因表达。图1 saRNA结构与作用机制图片来源：Molecular Therapy:Nucleic Acids Vol.31 March 202302saRNA药物设计相较于siRNA，saRNA技术的开发投入远不如siRNA广泛及具商业化特点的积累，目前有研究者提出如下序列设计原则：1）目标序列从靶基因的正义链序列上筛选；2）saRNA靶点选择在正义链转录起始位点上游-1200～-200 bp的区域；3）每个靶点长度的碱基数相对固定；4）靶点碱基的GC含量在40%～65%范围内；5）不能够出现连续4个以上相同的核苷酸；6）第19个碱基是A；第18个碱基是A或T，最好是A；第七个碱基最好是T；第20-23个碱基最好是A或T；7）选择目标序列时避开易受DNA甲基化影响的位点。类似于siRNA，saRNA同样可能引发脱靶效应，即以序列特异性或非序列特异性的方式诱发非预期的基因活性。为了避免序列特异性脱靶反应，所设计的序列还应该进行序列BLAST以避免与人类基因组其他核苷酸序列有显著同源性。另外，saRNA结构的修饰被证明可以阻断脱靶效应，这部分的工作进行的相对广泛。图2 特异性上调抑癌基因表达的saRNA序列图片来源：DOI:10.3781/j.issn.1000-7431.2019.55.49503saRNA抗肿瘤特点及主要品种saRNA，通过作用于基因调控序列的特异位点，诱导基因转录，这已经得到学者们的普遍认同，并成为新的肿瘤研究热点。这一点不同于早期的siRNA，以及ASO类药物。目前，技术较成熟的小核酸领域药物当属ASO和siRNA，但上述二者的获批适应症主要集中于遗传疾病、罕见病领域，众多已上市品种中，无肿瘤适应症获批。而saRNA开发的起点，即以肿瘤领域为主，这大不相同于“传统”小核酸药物，这也是其受关注的重点原因之一。如p21、p53等肿瘤领域著名靶基因及靶点，均为saRNA开发的方向内容。图3 激活寡核苷酸靶向肿瘤抑癌基因图片来源：Molecular Therapy:Nucleic Acids Vol.31 March 2023但由于saRNA药物开发仍处于早期阶段，目前进入临床的品种并不多。最具代表性的saRNA产品当属MTL-CEBPA，临床用于肝癌的治疗，目前最高临床阶段为II期。据文献报道，CEBPA是一种转录因子，可调节肝脏稳态，CEBPA表达下调与多种致癌过程有关。研究者将小鼠结肠癌细胞系CT26注射到对抗PD-1治疗敏感的小鼠中用以构建小鼠结直肠癌模型，然后注射MTL-CEBPA和PD-1抑制剂。MTL-CEBPA或PD-1抑制剂单独处理的动物肿瘤体积差异并无统计学意义，而同时注射PD-1抑制剂和MTL-CEBPA组的肿瘤体积明显小于对照组，说明MTL-CEBPA和PD-1抑制剂具有协同作用，且同时注射PD-1抑制剂和MTL-CEBPA的肿瘤组织CEBPA mRNA表达量更高（8.69倍，P＜0.0001）。另，同样可重点关注的品种还有我国国内开发的RAG-01，处于临床I期，是一款首创作用机制的特异性靶向激活肿瘤抑制基因p21的双链saRNA药物，通过RNAa机制激活p21基因的表达，以抑制肿瘤细胞增殖、诱导细胞凋亡和衰老。临床前药效研究表明，通过开发公司的小核酸递送系统，RAG-01的治疗能够显著抑制动物模型中膀胱癌肿瘤的生长，并展示充分的安全性。图4 全球范围开发的saRNA相关肿瘤靶点进展（文献举例）图片来源：Molecular Therapy:Nucleic Acids Vol.31 March 202304saRNA技术布局公司当前，基于saRNA技术进入临床的产品极少，从而对应的开发公司也相对不多。如上所述的MTL-CEBPA，原研单位为The University of Texas Southwestern Medical Center，其在药物研发领域的布局较广，技术类型涉及小分子化药、aav产品、RNA产品等，疾病领域集中于肿瘤和神经系统。另，MiNA Therapeutics公司的pipeline对MTL-CEBPA相关信息进行了重点介绍，具体如该品种的AACR年会公开信息、临床Ib期对实体瘤的联合治疗、单药用于肝癌治疗的I期临床等。图5 MiNA Therapeutics聚焦的疾病领域与开发项目图片来源：https://minatx.com/pipeline/#section_three值得一提的是，RAG-01的开发公司中美瑞康，其技术重点布局于saRNA，在国内以及国外均处于领先地位。其研发管线聚焦于目前尚无靶向治疗药物的疾病，包括单基因遗传病（例如基因突变导致的单倍体剂量不足）。对于这些疾病，RNA激活通过增强转录来补偿或消除基因活性的损失。借助于全球领先的SCAD™，LiCO™，和GLORY™递送平台技术，中美瑞康布局了多样化的管线项目，涵盖中枢神经系统、神经肌肉、眼科、肝脏和肿瘤等疾病治疗领域。图6 中美瑞康-pipeline图片来源：https://cn.ractigen.com/pipeline/05结语新技术的开发与推进，是新药领域前进的要素之一，saRNA无疑满足这一点，尤其是从基因治疗的角度来看。RNA激活技术在存在较大潜力的同时，同样存在着诸多问题，如不成熟的激活序列筛选、稳定性较差的人工合成saRNA、目标基因的激活效果不佳、不同细胞调控方式的差异性、很难满足肿瘤组织长周期的抑制作用等等。但上述存在的技术问题很难阻止saRNA的开发与发展，且已有显著的研究成果产生，并获得资本方的认可。未来几年，该领域很大可能会快速产出部分产品，但更期待的无疑是最终的临床数据。参考资料：1.中国血液流变学杂志.2022;32(1).doi:10.3969/j.issn.1009-881X.2022.01.0352.Molecular Therapy:Nucleic Acids Vol.31 March 2023.doi.org/10.1016/j.omtn.2022.12.016.3.TUMOR Vol.39,January 2019.DOI:10.3781/j.issn.1000-7431.2019.55.4954.Journal of Chinese Oncology,2019,Vol.25,No.9.doi：10.11735/j.issn.1671-170X.2019.09.B0125.https://cn.ractigen.com/about-us/6.https://cn.ractigen.com/pipeline/7.https://minatx.com/声明：本内容仅用作医药行业信息传播，为作者独立观点，不代表药智网立场。如需转载，请务必注明文章作者和来源。对本文有异议或投诉，请联系maxuelian@yaozh.com。责任编辑 | 金银花转载开白 | 马老师 18996384680（同微信）商务合作 | 王存星 19922864877（同微信） 阅读原文，是受欢迎的文章哦