MEGF10

摘要:免疫细胞疗法作为一种革命性的治疗方式，显著改变了癌症治疗。它是一种专业的免疫疗法，利用活的免疫细胞作为治疗癌症的生物制剂。与传统药物不同，细胞疗法被认为是“活药”，这些产品目前是定制的，需要先进的制造技术。尽管嵌合抗原受体（CAR）-T细胞疗法在治疗血液恶性肿瘤方面受到了行业的极大关注，但其在治疗实体瘤方面的有效性常常受限，导致替代性免疫细胞疗法的出现。肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）疗法、细胞因子诱导的杀伤（CIK）细胞疗法、树突状细胞（DC）疫苗以及DC/CIK细胞疗法旨在利用人体的自然防御机制来靶向和消除癌细胞，通常具有较少的副作用或风险。另一方面，如嵌合抗原受体-T（CAR-T）细胞、T细胞受体（TCR）-T、嵌合抗原受体-自然杀伤（CAR-NK）或CAR-巨噬细胞（CAR-M）等细胞疗法通常使用自体干细胞、同种异体或异种细胞，或基因修饰细胞，这需要更高水平的操纵，被认为是高风险的。这些高风险细胞疗法通常在肿瘤靶向和信号传导方面具有特殊特性，触发新的抗肿瘤免疫反应。最近，在抗肿瘤机制、细胞疗法产品设计和技术革新方面取得了显著进展。随着技术的快速整合和高度创新的格局，关键的未来发展方向已经出现。为了满足癌症治疗中细胞疗法技术进步的需求，我们在本研究中全面系统地调查了免疫细胞疗法的技术革新和临床进展。基于免疫细胞疗法的治疗机制和方法学特点，我们分析了这些疗法的主要技术优势和临床转化风险。我们还分析和预测了应用前景，为相关企业提供了必要的信息，以便他们做出关于研发方向选择的明智决策。 1.介绍 癌症是一种利用多种逃逸机制来逃避抗癌免疫的全身性疾病，并且显著改变了整个免疫系统的功能和组成。抗癌疗法的发展跨越了一百年，其在消除癌细胞的同时，对健康组织的损害最小化，效果和特异性不断提高。为了实现这一目标，免疫细胞疗法在现有方法中脱颖而出，成为改变游戏规则的解决方案。2017年，美国食品药品监督管理局（FDA）批准了两种嵌合抗原受体-T（CAR-T）细胞疗法，即Kite Pharma公司的axicabtagene ciloleucel（Yescarta）和诺华公司的tisagenlecleucel（Kymriah），用于治疗淋巴瘤。这些批准标志着加速抗癌治疗发展的一个重大里程碑。 免疫细胞疗法的基本概念是通过向患者提供具有所需功能的细胞来增强免疫反应，以对抗癌症。它不仅重新激活了现有的免疫反应，还推动了新的免疫反应参与到抗癌努力中。免疫细胞疗法的反应通常涉及多种免疫细胞类型的激活和协作，包括抗原呈递细胞，如树突状细胞（DCs）和巨噬细胞，T淋巴细胞（T细胞）以及自然杀伤（NK）细胞。一个肿瘤负担的免疫系统不仅在免疫细胞数量上失衡，而且在调节抗癌免疫反应的分子和信号通路上也表现出功能异常。因此，精确地施用适当的治疗策略是必要的，以防止免疫细胞疗法的次优效果。 根据不同的癌症类型及其机制，免疫过程的各个领域为治疗干预提供了途径。方法包括，例如，提取和扩增具有预先癌症识别能力的免疫细胞（例如，肿瘤浸润免疫细胞），外部分化有效细胞类型[例如，细胞因子诱导的杀手（CIK）细胞] ，以及基因修饰细胞以实现特定识别和肿瘤细胞消除[例如，T细胞受体（TCR）工程，嵌合抗原受体（CAR）] 。在这篇综述中，我们将讨论最新的免疫细胞疗法，总结应用于使各种类别的疗法得以实现和优化的策略，并提供未来的展望。 2.用低风险免疫细胞疗法治疗癌症 低风险免疫细胞疗法旨在利用患者的自身免疫细胞来消除癌细胞。需要注意的是，“低风险”强调了细胞疗法领域内某些疗法相对更安全、副作用更少，这些疗法属于再生医学或先进治疗药物产品（ATMPs）。低风险免疫细胞疗法包括四种关键技术：肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）疗法、CIK细胞疗法、树突状细胞（DC）疫苗和DC/CIK细胞疗法。为了更全面地理解这些方法，深入研究支持每种细胞疗法的基本机制和临床进展至关重要。 2.1.TIL细胞疗法 TIL是自然存在于实体肿瘤微环境（TME）中的单核细胞，包括肿瘤内肿瘤浸润淋巴细胞（iTILs）和基质肿瘤浸润淋巴细胞（sTILs）。sTILs主要是效应记忆T细胞，与iTILs相比更容易被检测到。作为一群已经接触过肿瘤组织的异质性淋巴细胞，TIL被“预训练”来攻击癌细胞，同时保留健康细胞。在小鼠肿瘤模型中，这些异质性细胞显示出治疗晚期癌症的潜力，第一种人类TIL疗法导致转移性黑色素瘤显著退化。实体瘤缺乏理想的肿瘤标记，使得针对肿瘤相关抗原（TAAs）的靶向变得具有挑战性。TIL作为具有多样受体的多克隆细胞，为实体瘤提供了独特的治疗选择。与基因修饰的免疫细胞相比，TIL在克服治疗实体瘤的异质性方面表现出优越性，尤其是像黑色素瘤这样高度异质性的肿瘤。此外，它们具有注射后迁移至TME的关键趋化因子受体，与CAR-T细胞相比，它们的低非靶向毒性归因于T细胞成熟过程中的负选择。 TIL可以从切除的肿瘤组织中分离出来。鉴于TIL在原始TME中的稀缺性，可用于扩增的TIL数量有限，以及阻碍TIL抗肿瘤细胞毒性的额外因素（例如，Treg、肿瘤相关巨噬细胞、髓源性抑制细胞和各种免疫抑制分子）。TIL的生产和扩增是TIL疗法成功的关键步骤。TIL体外扩增涉及快速扩增协议（REP）。在REP前期，TIL用高剂量白细胞介素（IL）-2进行初步扩增。有些方法涉及选择肿瘤特异性TIL进行进一步扩增，而其他方法则扩增大量TIL以保持疗效。在REP阶段，同时给予高剂量IL-2和抗CD3，并使用辐照的同种异体外周血单核细胞（PBMCs）作为饲养细胞，直到获得足够数量的细胞。然后，经过质量控制的扩增细胞产品准备好后，就可以进行淋巴细胞耗竭后的患者给药。 自Rosenberg等人在1988年成功将TIL疗法应用于转移性黑色素瘤患者以来，一系列临床试验相继出现。1996年，TIL疗法首次在涉及113名患者的临床研究中用于治疗非小细胞肺癌（NSCLC）。结果显示，TIL结合IL-2是NSCLC的有效治疗，与II期或IIIa期NSCLC相比，IIIb期NSCLC有选择性益处。在初步成功后，TIL疗法的后续发展旨在提高治疗其他肿瘤类型的疗效，包括皮肤、肾脏和胃癌。这些发展中的具体方法旨在阐明TIL细胞类型的组成及其与临床结果的相关性。例如，成功生成肿瘤浸润B淋巴细胞（TIBs）已被发现可以预测转移性肾细胞癌（mRCC）患者的改善临床结果。另一项关于TIL治疗胃癌的研究揭示了TIL的组织学亚群与不同的生存时间相关。目前，TIL疗法的临床转化仍处于初步阶段，缺乏长期临床观察。然而，初步成功表明有机会开发有前途的治疗性TIL，具有更高效的分离和扩增方法，以及与其他抗肿瘤疗法的潜在替代组合。 2.2.CIK细胞疗法 CIK细胞是具有混合T细胞和NK细胞样表型的异质性免疫效应细胞。它们是通过将人的外周血单核细胞(PBMC)或脐带血单核细胞与干扰素γ(IFN-γ)、抗CD3抗体、重组人IL-1和IL-2一起体外孵育生成的。CIK细胞独特地表现出不依赖主要组织相容性复合体(MHC)的肿瘤靶向，减少异体反应，并能够攻击各种类型的肿瘤[3]。在体外培养过程中，CIK细胞分泌各种细胞因子，激活巨噬细胞、NK细胞和CD8+ T细胞的细胞毒性活性，从而直接抑制肿瘤细胞的生长并促进间接杀伤效应。CIK细胞诱导凋亡基因和抗肿瘤基因的表达，进行细胞毒性活性并促进肿瘤细胞凋亡。它们的肿瘤杀伤效应主要是通过通过粘附分子淋巴细胞功能相关抗原-1/同源配体细胞间粘附分子-1(LFA-1/cam-1)与肿瘤细胞上的抗原结合的机制。这促进了MHC-I或MHC-II分子的表达，导致增强的呈递、激活、识别和直接杀死肿瘤细胞。 活化的CIK细胞分泌各种细胞因子，包括IL-2、IL-6、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和其他细胞因子，不仅直接增强细胞毒性效应和抑制肿瘤细胞，而且还通过调节免疫系统间接杀死肿瘤细胞。IFN-γ主要由CIK细胞产生，增强NK细胞、巨噬细胞和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的活性。它还可以促进肿瘤细胞上MHC-I分子的表达，导致CTL杀伤增加。最近的研究表明，CIK细胞分泌的IFN-γ可以促进慢性淋巴细胞白血病(CLL)细胞上ICAM-1的表达，对细胞毒性效应细胞的凋亡诱导产生积极影响。肿瘤细胞的凋亡基因也可以被CIK细胞激活，因为这些细胞表达FasL，一种属于TNF超家族的Fas配体，它诱导肿瘤细胞凋亡。Verneris提出，某些肿瘤细胞(如黑色素瘤和卵巢癌)通过FasL诱导淋巴细胞凋亡来逃避免疫清除，但它们对CIK细胞敏感。这是因为，在CIK细胞的诱导过程中，Fas敏感或活化的T细胞通过IFN-γ等细胞因子的作用或激活诱导的细胞死亡机制被选择性地消除。结合CIK细胞中抗凋亡基因的高水平表达，这些因素使CIK细胞能够耐受表达FasL的肿瘤细胞诱导的凋亡。 尽管存在复发和无反应的担忧，CIK细胞的异质性使它们能够靶向并杀死各种肿瘤细胞。自1991年引入CIK细胞疗法以来，已有5000多名患有不同肿瘤类型的患者，包括肺癌、乳腺癌、脑癌和结直肠癌，参与了CIK细胞疗法。CIK细胞(或CIK细胞与DCs结合)的临床试验已超过80项，全球范围内。CIK细胞的治疗潜力超出了它们与NKG2D的相互作用，包括抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)轴。与其他免疫疗法、常规化疗或放疗一起，CIK疗法表明了协同的抗肿瘤效应，不断发展并是治疗癌症的有希望的途径。虽然临床前景是有希望的，但一些公开讨论是必要的。比较CIK细胞与其他免疫细胞输注后的毒性效应，最小化额外的支持性护理，确定与其他免疫疗法相比的优势，了解与CIK细胞在癌症微环境中的串扰的关键决定因素，并在多个中心推广这种方法需要探索。 2.3.DC疫苗 操纵患者的自体DCs对肿瘤组织进行"疫苗接种"是一种有前景的方法。DC疫苗涉及用TAAs处理体外培养的DCs，如肽、蛋白质、DNA/RNA或病毒。DCs将吸收抗原，然后在仔细控制的培养过程中激活。DCs作为强大的抗原呈递细胞，在影响免疫系统方面发挥着至关重要的作用。虽然未成熟的DCs处理外来抗原，触发成熟和迁移到淋巴结，成熟的DCs可以在TME内促进肿瘤耐受，可能导致T辅助型2反应。 通常使用体外成熟并用抗原脉冲的自体单核细胞的DC疫苗，在不同的肿瘤患者中显示出良好的耐受性和最小的毒性。然而，抗原特异性免疫反应的幅度和持续时间通常较弱，限制了客观的临床反应。尽管在儿童肿瘤中的反应有限，正在进行的研究集中在增强疫苗生产的每个步骤。策略包括扩大DC来源，提高免疫原性，优化抗原选择，开发新的免疫佐剂，并探索同时进行的免疫调节或化疗。 Sipuleucel-T是唯一获得FDA批准的自体DC疫苗，为有效治疗成人恶性肿瘤，特别是去势抵抗性前列腺腺癌带来了希望。通过培养患者的PBMCs与一种重组蛋白(PAP-GM-CSF)，该蛋白由TAA[前列腺酸性磷酸酶(PAP)]和GM-CSF组成。这种开创性的疫苗代表了DC疫苗领域的重大进步，展示了在成人和儿童恶性肿瘤中改善结果的潜在途径。在临床试验中，DCs主要用于与CIK细胞、免疫检查点抑制剂(ICI)以及化疗和放疗的组合免疫疗法中，以改善结果。研究表明DCs能够激活自然杀伤T(NKT)细胞，或同时激活CD4+和CD8+ T细胞。 2.4.DC/CIK细胞疗法 当多种低风险免疫细胞疗法一起使用时，可以实现积极的协同效应，特别是在DC和CIK的共同应用中，这种协同作用尤为明显，旨在增强身体对疾病的免疫反应。CIK细胞以其广谱的肿瘤杀伤效应而闻名，但由于缺乏特异性识别能力而受到限制。DC目前被认为是最有效的抗原呈递细胞，最新研究表明，CIK和DC之间的相互作用会在两个群体中引起免疫刺激性表面分子表达的变化。实际上，将DC与CIK细胞共培养发挥了互补作用，相互促进成熟，共同增加抗肿瘤活性，并展示了有希望的协同效应，甚至在以前对CIK有抵抗力且之前没有与DC共培养的肿瘤细胞系上也是如此。DC分泌的细胞因子，如IL-2、IL-12和IFN-γ，增强了CIK细胞的成熟，导致CIK细胞中CD3+、CD8+和CD56+亚群的水平增加。值得注意的是，DC分泌的IL-12显著增加，显著增强了CIKs的细胞溶解功能。此外，这种协作环境还减少了IL-10的分泌和调节性T细胞（CD4+CD25+ Treg细胞）的数量，减弱了它们对肿瘤免疫的抑制作用，增强了CIK细胞的肿瘤杀伤效应。同时，CIK细胞增强了DC的抗原呈递特异性和共刺激分子的表达，有助于整体增加抗肿瘤活性。此外，DC和CIK细胞的共培养抑制了人类端粒酶逆转录酶(hTERT)蛋白的表达，抑制了端粒酶活性，阻碍了肿瘤细胞的增殖。基于上述机制，以相互适应和协同作用为特征的DC-CIK疗法，已成为近年来肿瘤治疗领域的研究焦点。基础和临床研究迅速发展，并证明了在显著增强抗肿瘤免疫方面的有效性。尽管存在轻度移植物抗宿主病(GvHD)的担忧，试验经验表明结果是可控的。案例研究已经证明了安全性和提高的疗效。DC/CIK细胞疗法针对免疫系统的各个方面，实现了更全面的抗病方法。这在复杂情况或难治性恶性肿瘤中尤其有益，其中多种免疫功能障碍起作用。总的来说，低风险免疫细胞疗法可以帮助增强免疫系统识别和消除有害实体的能力，从而改善健康结果。这些疗法的协同效应有潜力显著提高基于免疫的治疗的有效性，并为患者提供更好的结果。然而，评估和定制这些疗法的精确组合和剂量以确保其对个体患者的安全性和有效性至关重要。 3.高风险免疫细胞疗法的技术进展 高风险免疫细胞疗法使用自体干细胞、同种异体或异种细胞，或基因修饰细胞，所有这些都需要进一步的操纵和评估。这些疗法的设计非常适合其预期目的。这些治疗刺激针对肿瘤的新免疫反应，通常有潜力重振现有的反应。在这里，我们描述了CAR-T、T细胞受体-T(TCR-T)、CAR-NK和CAR-巨噬细胞(CAR-M)等高风险免疫细胞疗法的特征设计、转染方法、细胞来源和克服抑制性TME的方法。此外，我们还提供了对即将到来的趋势的见解。 3.1.CAR的设计 CAR是工程化的受体蛋白，为免疫细胞提供了一种新的能力，可以识别癌细胞表面的特定抗原，从而可能触发免疫细胞消除癌细胞的专长。当前研究表明，即使是对CAR结构的微小修改也会显著影响治疗结果。它通常由三个模块化域组成：细胞外域、跨膜域和细胞内域。细胞外域：靶向的艺术。细胞外域包括用于目标结合的ScFv和铰链区域，通常是CAR工程细胞中的免疫球蛋白(Ig)样域铰链，并通过跨膜域锚定到细胞膜上。通过CAR的细胞外域引入了驱动免疫细胞激活的新功能，包括T细胞、NK细胞和巨噬细胞。CAR工程免疫细胞可以识别癌症特异性目标表位，而不受MHC和共受体的限制，使它们在寻找和杀死癌细胞方面更有效。CAR工程免疫细胞已经从针对单一抗原发展到针对两种不同的抗原，以优化治疗阴性抗原癌细胞逃逸或失去抗原的复发，并且与任一抗原的结合都会触发CAR工程免疫细胞的激活。这可以通过几种方式实现（图1A-C），例如将一个双顺反子载体转导到一个细胞中，编码两个独立的CAR分子，或将一个编码双价CAR分子的载体转导到细胞中，或两种不同的CAR工程免疫细胞产品的共同给药，或将两个编码不同CAR的载体共转导到一个免疫细胞中。这些方法对于B细胞淋巴性白血病尤其有前景，特别是对于复发或难治性B细胞急性淋巴性白血病(B-ALL)，因为临床研究表明CD19/CD22共转导CAR-T细胞和CD19/CD22双特异性CAR-T细胞具有显著的疗效。同样，I期临床试验表明，双特异性CD20/CD19 CAR-T也可用于治疗复发和难治性B细胞恶性肿瘤患者，在治疗28天后的总有效率为82%，显示出治疗的安全性和有效性。此外，Wang等人证明CD19/CD22双顺反子CAR-T与单特异性CD19或CD20 CAR-T细胞相比，在体外和体内具有等效或更好的功能。除了ScFv的优化外，细胞外区域也得到了改进。与直接作用于目标细胞的传统CAR不同，研究人员提出了一个新概念：模块化CAR(modCAR)。这种CAR-T（图1D, E）通常与其适配器一起工作，适配器的一端结合到细胞上，另一端用于识别和结合肿瘤表面抗原。适配器分子可以是单克隆抗体、抗体片段（图1D）、小分子或任何结构（图1E），可以针对至少一个所需的抗原，并介导目标细胞和效应细胞之间的交联。它提供了一种高度灵活、可定制和通用的方法，以快速优化效应细胞活性，潜在地实现智能抗原靶向。 图 1. CARs的设计策略。展示针对肿瘤的CARs设计示意图。(A) 通过将编码两个独立CAR分子的双顺反子载体转导到单个细胞中，可以产生双顺反子CAR工程化细胞。(B) 通过将编码串联CAR分子的载体转导到细胞中，产生双价CAR。(C) 通过两种不同的CAR工程免疫细胞产品的联合给药（上图）或将编码不同CAR的两个载体共转导到免疫细胞中（下图），实现双特异性，但产品将复杂且昂贵。可以使用抗体（D）或其他适配器（E）生成modCAR。(F) 设计“装甲”CAR共表达分子，包括细胞因子和/或趋化因子，以提高效果和持久性。(G) 通过添加分泌蛋白和结合剂，并利用特殊设计的配对机制执行AND、NOT和OR布尔逻辑门，实现SynNotch CARs。这也可以通过使用特殊设计的转录因子和转录机制（H）来实现。CAR：嵌合抗原受体；modCAR：模块化CAR。 装甲CAR（图1F）被设计为分泌细胞因子或其他分子，帮助抵消肿瘤微环境（TME）的免疫抑制特性，可能提高CAR工程细胞的持久性和有效性。有时被称为第四代CAR或TRUCKs（T细胞重定向以启动抗原非限制性细胞因子引发的杀伤），它们为CAR靶向组织提供了一种多功能治疗，超越了传统CAR-T细胞的能力。TRUCK概念目前正在通过共表达分子如趋化因子配体或基于第二代或第三代CAR的细胞因子组合来探索。其中，IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、IL-23以及这些分子的各种组合正在进行早期阶段的试验。值得注意的是，IL-7和IL-15被发现可以促进CAR-T细胞的增殖，而IL-12和IL-18增强了T细胞的效应能力。此外，表达特定分子的工程CAR-T细胞，如CCL-19（C-C基序趋化因子配体19）或CCL-217，化学吸引其他免疫细胞或CAR-T细胞向附近的癌细胞移动。这增强了免疫细胞的渗透和CAR-T细胞的存活，导致CAR-T细胞的有效性增加。 CAR设计的更近期发展是合成Notch（SynNotch）受体（图1G, H），它提供了一种精确的靶向策略，允许精确控制CAR工程细胞的激活，同时通过整合可诱导的开关来最小化非靶向效应。一个典型案例使用布尔逻辑和逻辑门的原则，共定位依赖的蛋白开关（Co-LOCKR）可以通过满足所有条件时的构象变化来激活AND、NOT和OR布尔逻辑门。体外已证明针对癌细胞的特异性，但在临床应用中仍面临各种挑战。 细胞内域：信号传导和细胞功能。细胞内域由一系列共刺激域组成，CAR的分类基于共刺激域的数量。第一代CAR仅由CD3ζ组成，而第二代CAR除了CD3ζ外还包含一个共刺激域，第三代CAR则涉及一个以上的共刺激域以及CD3ζ。在T细胞中，已构建了第一代CAR，包含编码抗2,4,6-三硝基苯酚（TNP）抗体可变区域的重排基因片段，与α或β T细胞受体（α或β TCR）链的C区之一相连。转导T细胞后，这种结构可以稳定地表达在T细胞表面，并且可以MHC非限制性地识别肿瘤细胞，但在临床试验中显示出较弱的抗肿瘤效果。第二代CAR-T借鉴了T细胞激活的经典信号，并增加了一个共刺激分子，如4-1BB（也称为CD137）或CD28，这显著提高了CAR-T细胞的激活水平和增殖能力。临床数据支持接受第二代CAR-T细胞治疗的患者对其肿瘤负担有延长和有效的控制。新发现的共刺激分子目前包括诱导性共刺激分子（ICOS）、OX40（也称为CD134）和CD40等。第二代CAR结构在临床实践中使用最广泛。第三代CAR-T细胞包含两个共刺激分子，导致增强的细胞毒性。在临床试验中，当共同给药淋巴瘤患者使用针对CD19的第二代CAR-T细胞（具有CD28共刺激域）和第三代CAR-T细胞（具有CD28和4-1BB）时，观察到更长的持久性和更好的扩张。然而，目前仍有有限的临床数据可用于单独评估第三代CAR-Ts。在一项研究者发起的试验中，HD-CAR-1，一种第三代CAR-T疗法，在复发/难治性ALL的成年患者中进行了评估。在90天的研究期结束时，80%的患者实现了完全缓解（CR）。此外，最近的研究表明，配备4-1BB和CD28共刺激域的CAR-T细胞增强了T细胞记忆表型，与只有一个共刺激分子的细胞相比，表现出更好的增殖和细胞因子释放水平。 迄今为止，大多数涉及CAR-NK细胞的研究都使用了最初用于T细胞的CAR构建体。已开发出包含CD28或4-1BB共刺激域的第二代CAR-NK。最近的研究报告了含有4-1BB和CD3ζ细胞内域的CAR-NK，克服了抑制性信号并诱导了NK细胞特异性，导致杀死CD19+ aALL细胞。然而，已经为NK细胞专门创建了新的CAR设计，这些不同的CAR构建体对NK细胞的细胞毒性和细胞因子产生有不同的影响。研究表明，包含NK特异性共刺激域2B4（也称为CD244）的CAR-NK细胞显著增强了对肿瘤细胞的细胞毒性活性，诱导快速增殖，增加细胞因子产生，并减少凋亡。这表明与NK细胞上的常规4-1BB CAR相比，NK细胞特异性激活信号在CAR性能中起着至关重要的作用。此外，利用不同信号域的CAR构建体，如CD3ζ、DAP10和DAP12，在原代NK细胞或NK92细胞系中表现出不同的抗肿瘤活性。具体来说，具有CD3ζ信号域的CAR与包含DAP10域的CAR相比表现出优越的性能，而使用DAP12域的CAR优于包含CD3ζ域的CAR。 CAR-M细胞与CAR-T细胞具有相同的结构和代级分类，但它们的细胞内信号域的功能不同，主要用于增强吞噬作用。CAR-M细胞能够直接利用CD3ζ细胞内域来传递吞噬信号。Fc受体（FcRγ）的γ亚基和具有多个表皮生长因子样域的蛋白10（Megf10）也可以作为细胞内信号域。最近的结果表明，添加串联的PI3K招募域增加了癌细胞的吞噬。CAR-M的首个临床试验是第一代产品，其细胞内域包含CD3ζ，并且I期临床试验结果显示了有希望的初步安全性和有效性结果，并获得FDA的快速通道指定。 4.提高基因转移方法的效率 在免疫疗法中引入核酸，包括基因表达和CRISPR基因编辑，是一个至关重要但具有挑战性的步骤。近年来，由于经济上的好处，非病毒转染技术越来越受欢迎，克服了与病毒载体制造相关的劳动密集和昂贵程序以及cGMP（现行良好生产规范）合规性的监管要求。例如，可以利用转座子或移动遗传元素实现高效且持久的转基因表达，在产生稳定的CAR-T细胞方面引起了极大的兴趣。此外，电穿孔或机械穿孔使免疫细胞（如用于CRISPR-Cas9表达）的基因组编辑核酸的短暂表达成为可能，并已在基于mRNA的人类T细胞修饰中进行了探索。这些非病毒转染技术在程序简便性、容量和吞吐量以及有利的安全性方面提供了优势。与非病毒转染相比，病毒转导方法在临床环境中是普遍的模式，并且被广泛认为是转染具有挑战性的细胞类型（如免疫细胞）的高效方法。常用的病毒载体，如腺相关病毒载体和腺病毒载体，不能整合到宿主基因组。然而，逆转录病毒载体和慢病毒载体可以整合，并且表现出高传递效率，使它们非常适合转导高度复制的细胞，如免疫细胞。Tecartus104和Yescarta3，均由Kite Pharma生产，依赖于γ逆转录病毒（GRV）载体将CAR构建体转导到T细胞中，而Kymriah则使用慢病毒（LV）载体进行转导。通常，γ-逆转录病毒和LV系统经常用于将基因转移到T细胞中，研究表明它们通常产生30%-80%的转导效率。然而，安全性、效率和便利性问题是必须考虑的问题。与T细胞相比，病毒基因传递到原代NK细胞已被证明既具有挑战性又效率较低，可能由于NK细胞的固有特性。研究表明，使用逆转录病毒载体成功转染原代扩增的NK细胞，实现了27%-52%的单轮转染效率，并且在两轮转染后达到47%-75.4%。虽然逆转病毒已广泛用于最近的临床前和临床研究中生产CAR-NK细胞，但缺乏针对原代NK细胞的高效基因转移方法仍然是使用NK细胞进行免疫疗法的主要障碍。此外，与逆转录病毒转染相关的插入突变和对原代NK细胞活性的有害影响是临床应用中的主要限制。与逆转录病毒载体相比，基于慢病毒的转染对基因毒性和插入突变的风险较低。然而，原代NK细胞在LV转导中表现出低效率，需要多轮转染。最近，Bari等人证明，使用狒狒包膜糖蛋白变体（BaEV-LV）伪型的LV载体显示出比使用泡状口炎病毒糖蛋白（VSV-G-LV）伪型的转导效率高出20倍以上，这是用于伪型LV载体的第一种且仍然最广泛使用的糖蛋白。他们通过这种转染方法成功地在来自不同供体的约70%的原代人类NK细胞中表达了CD19-CAR，这些CD19-CAR NK细胞有效地且特异性地根除了CD19阳性肿瘤细胞。BaEV-gp伪型慢病毒带有肿瘤特异性CAR，在NK92细胞中显示出近100%的转导率，在iPSC衍生的NK细胞或激活的原代NK细胞中为50%-80%。因此，它可能是NK细胞CAR基因转移的有希望的载体。此外，使用长臂猿白血病病毒（GaLV）包膜蛋白伪型的慢病毒可以有效转导原代NK细胞。电穿孔和脂质体介导的方法也用于在NK细胞中传递外源基因。与上述病毒转染相比，这些方法提供了更快的转基因表达、降低的凋亡水平、更小的个体间差异和更高的基因转移效率。然而，外源DNA通常不会整合到目标细胞的基因组中，导致转基因的短暂表达在转染后约3-5天内下降。但是，当与DNA整合技术结合时，这些方法可以产生稳定转染并表达转基因的细胞。DNA转座子是可以通过切割和粘贴机制在载体和染色体之间有效转座的移动DNA元素。PiggyBac（PB）和Sleeping Beauty（SB）是迄今为止最常用的两种转座子系统，并且在与其他系统相比时，在哺乳动物细胞中显示出最高的转座活性。通过将含有CAR的质粒转染到iPSC中，以及转座酶DNA，成功稳定地创建了CAR-iPSC-NK细胞，表达CAR分子。与病毒载体相比，转座子系统提供了许多好处，如更低的免疫原性、增加的生物安全性、降低的生产成本以及能够转移具有接近9-10 kb货物容量的基因片段的能力。这些优势使其成为将CAR整合到NK细胞基因组中以实现持久表达的有力选择。然而，完全利用转座子系统对原代NK细胞进行转染需要优化，例如通过电转染提高转导效率和细胞活性。 巨噬细胞由于其识别和响应外来核酸的能力，比造血系统中的其他细胞更难转染和对遗传操作具有抵抗力。Bobadilla及其同事创建了一种基于HIV-1的慢病毒（LV）系统，该系统已被证明在通过Vpx诱导的SAMHD1降解后，能够有效地将转基因传递给骨髓细胞。Klichinsky的团队利用了一种复制缺陷的嵌合腺病毒载体Ad5F35，有效地将CAR传递给巨噬细胞，并同时促进M1表型的表达，最终增强了其抗肿瘤活性。这些结果强调了基因工程巨噬细胞在癌症免疫疗法中的潜力。与生成CAR-NK细胞的方法类似，转座系统也被用来将感兴趣的基因整合到宿主基因组中。 4.1.新型细胞来源方法推动现成的免疫细胞治疗产品 迄今为止，所有商业批准的癌症免疫细胞疗法都依赖于自体使用，即所使用的源材料是患者的自己的细胞。尽管这种方法已被证明有效，但仍存在重要的限制，例如在处理快速癌症进展的患者时，制造所需的等待时间不受欢迎，患者T细胞功能障碍可能导致制造失败，提取健康淋巴细胞时同时提取的恶性白血病细胞可能导致产品污染，高生产成本，标准化的复杂性，以及重新给药的机会受限。因此，当前的研究工作集中在开发同种异体疗法上，以克服自体疗法的限制。值得注意的是，CAR-NK是一种有前途的同种异体细胞疗法，对实体瘤和血液肿瘤都没有主要的毒性副作用。它是一种更简单、可重新注射且更经济的通用治疗。然而，目前的治疗还没有显示出强大的疗效和/或长期持久性，NK细胞更难进行工程改造。CAR-NK细胞的研究主要处于临床前和早期临床试验阶段，很少有临床试验报告。尽管如此，通用的同种异体CAR-NK细胞在癌症治疗中仍然显示出巨大的潜力。目前，CAR-M主要是一种自体疗法，但“现成的”同种异体CAR-M已经出现，并正在进行进一步研究。 为了开发同种异体方法，必须系统地解决最重大的风险：免疫排斥和移植物抗宿主病（GvHD）的发展。免疫排斥可以限制治疗的效力，因为接受者的免疫系统可能会排斥移植物。GvHD可能是致命的，由供体T细胞内源性αβ TCR复合体识别宿主肽-人类白细胞抗原（HLA）复合体，导致组织损伤。为了解决同种异体风险，可以采用两种主要策略。第一种是在供体αβ T细胞上除了引入CAR转基因外，进行额外的遗传改造。另一种是选择替代的细胞来源或亚群，如诱导多能干细胞（iPSCs）、脐带血（UCB）细胞、γδ T细胞、记忆T细胞亚群、病毒特异性T细胞（VST）等（VST）等。 为了消除内源性αβ TCR介导的GvHD，最直接的方法是破坏编码T细胞受体恒定（TRAC）α链的基因。Eyquem等人开发了一个案例，通过腺病毒转染和CRISPR-Cas9敲入技术将CAR构建体整合到TRAC位点，同时诱导CAR表达和TCR失活。与随机整合相比，CAR表达可以由内源性TCR启动子调节，并在暴露于抗原时模仿TCR转录，防止恒定和过度的T细胞激活，这可能导致T细胞分化和耗竭。此外，研究结果表明，这些TRAC-CD19 CAR-T细胞在小鼠ALL模型中显示出比用逆转录病毒编码的CAR的T细胞更大的抗肿瘤效力。此外，除了CRISPR-Cas9，基因编辑技术，如TALENs和锌指核酸酶（ZFNs），也被发现在消除TCR表达以创建“通用”供体T细胞方面有效。然而，尽管TCR缺失的CAR-T细胞降低了GvHD的风险，它们的长期持久性更短，可能是由于免疫排斥。因此，科学家们敲除了β2-微球蛋白（B2M）基因以限制HLA I分子的表达。这种方法防止了同种异体CAR-T细胞通过它们的TCR被识别为外来的，但仍然容易受到宿主NK细胞的裂解。因此，一项研究利用突变B2M融合蛋白来解决这个问题。为了提高在激活的同种异体CAR-T细胞生产过程中HLA-II消除的效率，一些学者提出抑制CIITA或HLA-DRA、HLA-DQA和HLA-DPA基因。 iPSCs具有无限的增殖和分化潜力，使它们成为创建大量同种异体HLA组合库的理想资源。通过从库中选择与HLA匹配的iPSC来源，可以最小化宿主和移植物之间的免疫排斥风险，但必须进行严格的质量控制以确保安全，因为未分化的、增殖的iPSCs可能引发不良结果。Wang等人产生了缺乏HLA-I/II、B2M和CD155的低免疫原性iPSC衍生的CAR-T细胞。研究表明它们通过在体内发挥效应功能来抑制肿瘤进展的有效性。此外，iPSCs也为生产符合临床需求的CAR-NK和CAR-M细胞铺平了道路。与分化的NK细胞或巨噬细胞相比，iPSCs可以更有效地被工程化以稳定表达CARs。Li等人通过向培养基中添加各种细胞因子和促分化蛋白来修改培养基，以将CAR转染的iPSCs分化为CAR-NK细胞。这些iPSC衍生的CAR-NK细胞在体外和体内都表现出强大的抗肿瘤活性。Zhang等人建立了骨髓/巨噬细胞分化方案，诱导CAR-iPSCs分化为骨髓细胞系，成功生成了足够的CAR-iMac细胞（iPSC衍生的CAR-M细胞）。然而，当在小鼠模型中进行测试时，CAR-iMacs的效力受到限制。总体而言，iPSC衍生的工程免疫细胞的发展涉及复杂的生产程序，需要精确的细胞产品制造和质量保证，以支持更广泛的临床应用。 γδ T细胞表达TCRγδ，以HLA非依赖的方式识别恶性细胞。它不需要消除TCR表达或信号，并且GvHD的风险很低或不存在。研究表明，γδ CAR-T细胞表现出与传统的αβ CAR-T细胞相似或更大的细胞毒性效果，在体内没有观察到GvHD。然而，它们在体外的细胞毒性能力持续时间较短。此外，抗CD20的γδ CAR-T细胞在B细胞淋巴瘤的动物模型中取得了有希望的结果，目前正在进行I期临床试验。值得注意的是，已经鉴定出以HLA非依赖方式针对多种肿瘤的TCR，这些TCR来自αβ和γδ TCR库，允许工程化免疫细胞攻击患者之间常见的肿瘤特异性抗原。 脐带血（UCB）提供了一个容易获得的NK细胞和同种异体T细胞的来源。它们富含γδ T细胞和造血干细胞（HSCs），尽管总细胞数量有限。来自脐带血的CAR-T细胞在体内表现出增强的肿瘤抑制作用，减少了IL-10的分泌，并降低了调节性T细胞（Tregs）的比例，表明其治疗潜力有所提高。Van Caeneghem等人从脐带血中分离出CD34+ HSCs，然后生成CAR-T细胞。这些CAR-T细胞具有原始表型（CD45RA+ CD62L+），不表达TCRαβ复合体，显著降低了GvHD的风险，并有效地消除肿瘤细胞。 记忆T细胞的特征是CD45RA−CD45RO+表型，它们不太可能发展成GvHD，也不太可能迁移到表现出GvHD的器官。研究表明，与分化的对应物相比，T记忆干细胞（TSCM）和中央记忆T细胞（Tcm）具有优越的增殖和干性潜力，在T细胞转移后的临床研究中表现出高扩增和持久性。 VSTs具有能够识别病毒抗原的TCR，如巨细胞病毒（CMV）、Epstein-Barr病毒（EBV）等。经过CAR改造的VSTs在实体瘤中表现出有希望的结果，但与CARs相比，工程化针对肿瘤的转基因TCR VSTs更具挑战性。在肿瘤细胞中表达EBV相关抗原的霍奇金淋巴瘤患者中，CAR-VST细胞的输注显示出良好的耐受性和缓解率。针对HER2的CAR-VST细胞产品在CMV血清阳性和进行性胶质母细胞瘤患者的I期临床试验中显示出安全性和临床效果。值得注意的是，可以建立VST库，以覆盖大多数患者，并适当匹配的线，促进CAR-T或TCR-T向肿瘤的重定向用于临床。 PBMCs通常来自外周循环或脐带血等。它是临床目的的主要NK细胞来源。来自PBMC的NK（PB-NK）细胞可以从HLA匹配和不匹配的供体中分离出来，扩大了潜在供体池。通常，它们表现出成熟的表型，增殖能力降低，细胞毒性增加，没有GvHD的风险。Töpfer等人已经证明，表达CAR的NK细胞系YTS以及PB-NK细胞可以成功地重定向对抗前列腺干细胞抗原（PSCA）阳性肿瘤，导致治疗的小鼠中有相当一部分完全消除肿瘤。一种短暂表达间皮素靶向mRNA CAR的CAR-PBMC细胞产品，MCY-M11，已进入临床试验（NCT03608618），它是一种混合产品，包含多样化的CAR工程化T细胞亚群、单核细胞和B细胞群体，展现出理想的功能和免疫表型特征。 NKT细胞，也称为CD1d限制性T细胞，是一群具有T细胞和NK细胞特性的异质性T细胞。这些细胞主要识别非多态性CD1d分子，这是一种结合自身和外来脂质和糖脂的抗原呈递分子。I型NKT或iNKT细胞缺乏HLA限制，可能作为通用供体细胞发挥作用，但其在体内的持久性尚不清楚。研究表明，CAR19-iNKT细胞表现出抗淋巴瘤活性，并增强了消除脑淋巴瘤的能力。另一种同种异体NKT，表达带有CD28和IL-15的抗CD19嵌合受体，目前正在进行针对复发或难治性B细胞恶性肿瘤患者的临床试验（NCT03774654）。 4.2.修改肿瘤环境以治疗免疫细胞 低持续性和输注后不充分的增殖是实体瘤免疫细胞治疗有效性的重大挑战，这在很大程度上归因于免疫抑制性微环境，它作为癌症进展的积极推动者，而不是被动的旁观者。肿瘤细胞居住在这个由浸润和宿主细胞（如T细胞和巨噬细胞）、分泌因子（如IL-10和转化生长因子β（TGFβ））以及细胞外基质（ECM）组成的异质微环境中。这些组分可以相互作用，为恶性细胞的生长、迁移和转移创造一个支持性的环境，从而逃避免疫系统和肿瘤特异性T细胞。 为了根除肿瘤，科学家们已经开发了几种策略，以促进CAR工程化或TCR工程化的治疗免疫细胞迁移和渗透到癌症焦点，包括使用趋化因子受体如CCR2、CXCR2、CCR4、CXCR4等。这些研究表明，CAR-T、TCR-T和NK细胞显示出增加的肿瘤渗透率，导致肿瘤缩小和增强的抗肿瘤效果。 然而，将基因工程免疫细胞渗透到肿瘤中只是抗击癌症的第一步。有时，可能需要直接转化方法来修改免疫抑制性微环境。使用免疫检查点抑制剂，如抗PD-1、抗PD-L1抗体和抗CTLA4抗体，可以改善免疫抑制性TME。然而，它可能导致药物抗性的出现、T细胞耗竭和复发，有时甚至可能导致危及生命的毒性。阻断TME中的TGF-β信号是提高检查点抑制剂效果和增强抗肿瘤反应的替代方法，由于其在肿瘤信号、重塑和代谢中的关键作用。临床证据也表明TGF-β信号与对检查点阻断剂无反应的患者之间存在相关性。为了解决这个问题，已经开发了双功能抗体-配体陷阱，使用针对CTLA-4或PD-L1的抗体与TGFβ受体II外域（TGFβRIIecd）融合。它可以在TME中隔离TGF-β，耗尽Tregs，并促进CTL共刺激。此外，通过转导显性负TGFβ受体-II（dnTGFβRII），开发了TGFβ抗性肿瘤特异性T细胞，并在动物模型和临床研究中显示出治疗益处。 另一种新策略是利用TME中高浓度的免疫抑制信号分子，通过引入一个嵌合开关受体（CSR），如PD-1:CD28、TIGIT:CD28、CTLA-4:CD28、TGF-βRII:4-1BB、Fas:4-1BB。CSR由PD-1、CTLA-4或TGF-βRII的细胞外域和CD28或4-1BB的细胞内域组成。T细胞与CSR一起转导CAR或TCR，以产生工程化的CTL。这些工程化的CTL仍然与肿瘤细胞上的免疫抑制分子相互作用，但通过细胞内域传递共刺激信号而不是抑制信号。 最近，这种策略已经进行了临床测试。发现这些工程化的细胞有效地克服了免疫抑制性TME，例如分泌更多的IFN-γ，积累在肿瘤中，并展现出优越的抗肿瘤功能。 ECM为各种抗癌治疗创造了物理屏障。然而，巨噬细胞在调节ECM和表现出肿瘤归巢行为方面发挥着关键作用。CAR工程化的巨噬细胞被证明能够主动迁移到肿瘤部位，作为药物输送系统时，能够在抗原特异性环境中局部输送细胞因子和/或细胞毒素，显著改变免疫抑制性TME，并通过吞噬作用消除肿瘤细胞。Zhang等人使用CAR修饰的巨噬细胞解决了ECM引起的免疫细胞渗透不足的问题。体外研究表明，CAR-147巨噬细胞能够重塑肿瘤的ECM，诱导CD3+ T细胞渗透，并提高肿瘤微环境中IL-12和IFN-γ的水平，最终展现抗肿瘤效果。 4.3.临床研究进展 从临床进展的角度来看，自2017年FDA批准第一种CAR-T细胞治疗产品以来，全球已有10种CAR-T产品获得批准（补充表1）。自2013年以来，CAR-T、CAR-NK和TCR-T疗法的临床研究迅速增加，到2022年CAR-T细胞治疗的数量达到258例，值得注意的是，2023年的数据来自1月至10月（图2A）。从国家的角度来看，高风险细胞治疗的临床研究主要分布在美国和中国，占全球研究的80%以上（图2B）。CAR-T治疗的主要临床治疗目标是CD19、CD22、CD20和B细胞成熟抗原（BCMA）。在血液肿瘤中，增长最快的适应症是淋巴瘤和骨髓瘤。 图 2. 临床试验中的CAR-T、TCR-T和CAR-NK疗法。临床试验数据统计。(A) 2018年至2023年细胞治疗临床研究的数量，分为CAR-T、TCR-T和CAR-NK三个组。(B) 按国家分组的细胞治疗临床研究数量，分为CAR-T、TCR-T和CAR-NK三个组，Y轴在50到450之间中断。(C) 关于适应症的细胞治疗药物的临床进展，细胞治疗药物的分组与(A)相同，适应症分为液体和实体肿瘤。原始数据下载自 https://classic.clinicaltrials.gov/，更新至2023年10月30日。CAR-T：嵌合抗原受体T细胞；CAR-NK：嵌合抗原受体自然杀伤细胞；CNS：中枢神经系统；HPV：人乳头瘤病毒；TCR-T：T细胞受体T细胞。 目前，TCR-T有一种治疗产品在市场上，用于转移性葡萄膜黑色素瘤。总的来说，TCR-T在实体瘤中的进展速度通常比血液肿瘤快（图2C）。TCR-T的目标抗原主要集中在MART-1、HPV16-E6、NYESO、HPV16-E7等。在条件方面，TCR-T的临床研究主要用于实体瘤的治疗。这些实体瘤大多与病毒感染有关，例如与人类乳头瘤病毒（HPV）感染相关的宫颈癌。此外，TCR-T对头颈、肝脏和结肠的癌症的临床研究进展迅速（图2C）。在CAR-NK条件方面，血液肿瘤仍然是进展最快的，其中淋巴瘤条件进展更快（图2C）。CAR-NK的临床治疗目标主要是血液肿瘤的CD19、CD22和BCMA，以及实体瘤的PSMA、HER2、ROBO1和MUC1。总的来说，TCR-T和CAR-NK仍然处于早期临床开发阶段。到目前为止，CAR-M的临床研究仍然处于起步阶段，只有一个I期临床试验（NCT04660929）。 5.结论与展望 免疫细胞治疗在肿瘤治疗中的重要性日益增加。与传统的免疫治疗方式，如免疫检查点抑制剂和细胞因子相比，免疫细胞治疗表现出了更高的疗效、特异性，并倾向于引起可接受的副作用。当作为某些癌症的独立治疗手段时，特别是采用性T细胞转移疗法，在血液恶性肿瘤，如白血病和淋巴瘤中显示出了显著的成功。然而，由于免疫抑制性TME、肿瘤异质性、目标抗原表达低等因素，一些实体瘤对单独的免疫细胞治疗更具挑战性。在许多情况下，转向另一种免疫细胞治疗或将免疫细胞治疗与其他治疗策略结合使用，如化疗、放疗、其他免疫治疗或靶向治疗，通过不同的机制可能增强整体治疗效果。 目前，全球已有10种CAR-T产品获批，而DC疫苗和TCR-T各有一种获批产品。在低风险免疫细胞治疗方面，TILs和DC疫苗在治疗实体瘤方面显示出前景。此外，CIK治疗与其他免疫策略结合使用时显示出协同抗肿瘤效果。这些方法通常由具有不同功能特性的异质细胞组成，为治疗相对高异质性的恶性肿瘤提供了优势。另一方面，高风险免疫细胞治疗，如CAR-T和TCR-T，通常以目标为导向且高度特异性，使它们特别适合相对快速增殖的恶性肿瘤。在血液肿瘤中，CAR-T和TCR-T已经得到临床验证，它们在治疗实体瘤方面的应用正在稳步进展。而基于其生物学特性，CAR-NK和CAR-M在治疗实体瘤方面具有固有优势。TCR-T专注于特定的肿瘤相关抗原(TAA)和新抗原，使它们在外来抗原，如与病毒相关的恶性肿瘤中受益。研究人员目前正在努力突破包括CAR-T在内的细胞治疗技术的瓶颈。新的细胞来源和方法降低了GvHD和其他风险，为“现成的”或同种异体细胞治疗创造了机会，这些治疗可以事先准备好，并在需要时轻松地给多个患者使用，实现更快的诊断和癌症治疗。此外，针对CAR的新颖设计最小化了对健康组织的损害，并与传统治疗相比减少了副作用。某些设计甚至为治疗实体瘤提供了可能性。此外，修改肿瘤环境和诱导记忆T细胞的策略已使实现长期效果成为可能。 同时，由于这些疗法新颖、复杂和技术性，它们可能对公共卫生和个体患者构成以前未探索的风险。TIL细胞治疗、DC/CIK细胞治疗和DC疫苗被认为是低至中等风险。风险因素包括生产中使用的生物活性物质，如抗体、细胞因子、血清、生长因子和抗生素，以及在保存、冷冻、解冻和冷链运输过程中的产品稳定性和活性风险。此外，产品本身可能存在固有风险，如不完全去除肿瘤细胞或其他不需要的细胞，以及与归巢、植入、迁移和增殖相关的潜在并发症或产品活性降低。然而，高风险免疫疗法需要更多的操作，无论是使用基因修饰细胞、自体干细胞，还是同种异体或异种细胞，都需要额外评估。在临床上，这些疗法有时可能触发细胞因子风暴和细胞因子释放综合征(CRS)，这两种都是危及生命的全身性炎症综合征。因此，这些产品的风控管理考虑相应更具挑战性。必须仔细评估产品与患者之间相互作用产生的即时和延迟影响的潜在风险。这些风险包括不希望的免疫原性及其相关效应，包括CRS、GvHD、移植物排斥、过敏反应、超敏反应和免疫缺陷。此外，评估与患者细胞的预期和非预期基因修饰相关的潜在风险也很重要，包括细胞功能的改变、细胞凋亡、生长或分化的变化、插入突变或基因毒性，以及恶性转化的可能性。 然而，准确评估免疫细胞治疗的风险仍然具有挑战性。一些真正的风险超出了预期或在临床前研究中没有被揭示。了解风险在临床研究中无处不在，并且被定义为在特定时间内发生不良结果的可能性。评估免疫细胞治疗风险的可接受水平涉及权衡各种因素，而不仅仅是绝对风险，还要考虑可能随之而来的潜在治疗益处。与患有较轻肿瘤或癌症的患者相比，存在适当治疗方法的癌症指征，患有危及生命的晚期或严重恶性肿瘤的患者可接受的风险水平要高得多。 总体而言，免疫细胞治疗的技术壁垒相对较高，创新驱动力强，技术发展多样。近年来的进展显示了爆炸性增长。尽管CAR-T、TCR-T和DC疫苗已获批准，但其他免疫细胞治疗仍处于早期临床和临床前研究阶段。低风险疗法，如TIL，由于无法完全消除Tregs，面临有限的效果。CIK细胞治疗在获取和扩增方面遇到困难。DC肿瘤疫苗受到缺乏理想的肿瘤特异性抗原、TAA免疫原性弱、难以有效诱导免疫原性DC以及体外DC致敏方法的静脉再灌注无法有效激活DC分化和成熟的阻碍。高风险细胞治疗在克服肿瘤异质性的障碍方面仍有很长的路要走。CAR-T细胞仍面临效应T细胞耗竭、细胞因子风暴和免疫抑制微环境等挑战。TCR-T细胞治疗的挑战包括如何减少TCR不匹配和针对新抗原的最小选择。CAR-NK疗法正在经历遗传操作和细胞增殖困难。尽管CAR-M可能成为一种有前景的抗癌疗法，但它们尚未完全实现。临床研究需要确认肿瘤相关巨噬细胞在决定TME是否可以将针对肿瘤的CAR-M转化为支持肿瘤表型方面的高适应性。尽管如此，免疫细胞治疗在抗癌疗法的未来发展中仍具有至高无上的潜力。人们普遍认为，快速的技术革新将使这些疗法成为高效的癌症治疗手段，显著改善治疗效果，推进人类医疗保健。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

Won-Suk Chung及其同事们发现，压力诱导产生的糖皮质激素，能够通过糖皮质激素受体-MERTK途径来促使星形胶质细胞“吃掉”更多的兴奋性突触，从而引起早期生活压力导致的异常行为。 童年时期经历虐待和情感忽视等压力事件，会对一个人的行为、情感、认知等产生持久深远的影响。大量流行病学研究提出，早期生活压力与成年后抑郁症、焦虑症等心理障碍的患病风险密切关联。 当大家将目光聚焦于早期生活压力对大脑结构和功能的改变时，有证据表明，早期生活压力可能导致突触丢失和神经回路连接异常，进而引发行为和情绪的异常表现，但是其中具体机制并不明了。 近日，韩国科学技术研究院的Won-Suk Chung等人的最新研究成果发表在Immunity期刊上，为我们解开了这个疑惑，揭示早期生活压力捣毁神经突触的机制。 他们发现，早期生活压力条件下产生的糖皮质激素通过激活相应受体，能够促进星形胶质细胞吞噬神经突触，导致兴奋性突触丧失。 将星形胶质细胞上与吞噬相关的关键蛋白MERTK，或糖皮质激素受体敲除，能够很大程度上防止经历早期生活压力的小鼠发生兴奋性突触丢失、神经元活动异常、行为异常的现象[1]。 论文首页截图 在之前的工作中，Won-Suk Chung等人发现，大脑胶质细胞表达多种受体，如MEGF10和MERTK。其中，星形胶质细胞凭借这些受体来特异性吞噬兴奋性突触，而小胶质细胞则特异性吞噬抑制性突触。通过修剪多余的枝丫，胶质细胞维持着神经回路的稳态和可塑性，对于认知功能至关重要[2]。 此次，他们从FDA批准用于临床的2261种化合物中，鉴定出38种增强星形胶质细胞吞噬作用、15种抑制其吞噬作用的化合物。在增强吞噬作用的化合物里，有32%属于人工合成的糖皮质激素。 影响星形胶质细胞吞噬作用的药物 这引起了研究者们的注意。糖皮质激素是应激事件中由肾上腺分泌的应激激素，经血液传递，与相应受体结合来调节各种细胞反应。 研究结果显示，糖皮质激素处理的48小时内，星形胶质细胞中的Mertk mRNA保持较高水平，而MEGF10等其它吞噬相关受体的mRNA水平没有发生改变；使用糖皮质激素受体（GR）拮抗剂米非司酮，可以有效阻断糖皮质激素的这种效果。 借助遗传学手段敲除或过表达MERTK等吞噬相关受体，也可以得到同样的结论，即糖皮质激素的强化效果，是通过激活星形胶质细胞上表达的糖皮质激素受体、诱导MERTK表达来实现的。 糖皮质激素会引起星形胶质细胞中的吞噬相关受体MERTK表达水平增加 难道说，压力正是通过糖皮质激素，来让星形胶质细胞胃口大开、疯狂啃食突触的吗？ 通过将新生儿小鼠与母鼠隔离，研究者们构建了早期生活压力小鼠模型（ESD）。 结果显示，早期生活压力小鼠的感觉皮层、运动皮层、额叶皮质等大脑区域里，星形胶质细胞中的糖皮质激素受体被激活，MERTK表达、溶酶体数量显著增加；小鼠的兴奋性突触数量显著减少，而抑制性突触数量无明显变化。 ESD小鼠的星形胶质细胞 接下来，研究者们发现，借助遗传学手段使小鼠星形胶质细胞上的糖皮质激素受体或MERTK特异性缺失，都可以防止早期生活压力引起星形胶质细胞吞噬作用增强、兴奋性突触丧失。 更重要的是，高架十字迷宫、三箱社交、悬尾试验等测试结果显示，星形胶质细胞上的糖皮质激素受体或MERTK特异性缺失后，小鼠由早期生活压力引起的焦虑状态、社交障碍、抑郁等症状得到了明显改善，基本正常化。与之相符，神经元活动监测结果也提示，这些小鼠神经元异常放电现象减少。 糖皮质激素受体缺失时，小鼠行为测试结果 进一步研究结果显示，在早期生活压力条件下，星形胶质细胞更偏向于吞噬GABA能兴奋性突触，而不是谷氨酸能兴奋性突触。而且，小胶质细胞吞噬抑制性突触的作用没有受到任何影响。 如此来看，早期生活压力对胶质细胞造成的不同影响，会引起大脑神经回路中兴奋性突触和抑制性突触被不同程度地“吃掉”、稳态失衡，从而导致小鼠异常的行为症状和神经元放电现象。 另外，利用模仿新生儿的人类皮层类器官（hCO，320天大）进行实验，研究者们也观察到，糖皮质激素能够诱导星形胶质细胞的糖皮质激素受体、MERTK表达水平提高，并促进其过度吞噬突触。这说明，压力通过糖皮质激素受体-MERTK途径来促进星形胶质细胞吞噬突触，这个机制可能在啮齿类动物和人类之间保守。 糖皮质激素处理促进人类皮层类器官中的星形胶质细胞吞噬突触 总体来说，Won-Suk Chung及其同事们发现，压力诱导产生的糖皮质激素，能够通过糖皮质激素受体-MERTK途径来促使星形胶质细胞“吃掉”更多的兴奋性突触，从而引起早期生活压力导致的异常行为。 关于小胶质细胞为何不受早期生活压力的影响，研究者们认为，这可能是由于在生命早期、大脑发育的关键阶段，小胶质细胞的糖皮质激素受体表达量较低，这限制其对压力引发的糖皮质激素做出反应。 这项研究成果提示我们，星形胶质细胞中的糖皮质激素受体-MERTK途径或许还与其它应激引起的脑部疾病相关，如精神分裂症。研究者们还强调到，目前儿童发生各种原因引起的炎症反应时，常使用糖皮质激素药物，现在需要我们对这些治疗方法进行重新评估。

摘要：基于嵌合抗原受体（CAR）免疫疗法的过继细胞治疗取得了巨大进展，美国食品和药物管理局批准了五种用于血液系统恶性肿瘤的CAR T疗法。然而，实体瘤的CAR免疫疗法明显落后。CAR免疫疗法在实体瘤中的一些主要障碍包括CAR T细胞制备、缺乏肿瘤特异性抗原、CAR-T淋巴细胞运输和渗透到肿瘤部位的效率低下、免疫抑制肿瘤微环境（TME）、治疗相关毒性和抗原逃逸。CAR自然杀伤（NK）细胞比CAR T细胞有几个优势，因为NK细胞可以由预先存在的细胞系或异基因NK细胞制备不需要进行主要组织相容性复合体（MHC）的配型；可以通过CAR依赖性和CAR非依赖性途径杀死癌症细胞；并且毒性较小，尤其是在细胞因子释放综合征和神经毒性。至少有一项临床试验显示了CAR-NK细胞治疗的疗效和耐受性。巨噬细胞是主要的免疫调节因子，可以有效地渗透到肿瘤中，并大量存在于TME中。免疫抑制性M2巨噬细胞与促炎性M1巨噬细胞在吞噬靶细胞方面有一样的效果。并且还可以诱导M2巨噬细胞分化为M1型。因此，开发用于癌症免疫治疗的CAR巨噬细胞以克服与CAR T/NK治疗相关的一些主要障碍，特别是在实体肿瘤中，具有重大的意义。尽管如此，CAR-NK和CAR 巨噬细胞都有其自身的局限性。这篇综合性综述文章将讨论CAR-T和CAR-NK治疗的现状和主要障碍，接下来将讨论将CAR巨噬细胞发展为癌症特异性吞噬细胞、抗原提呈物、免疫刺激物和TME修饰物的结构和前沿研究。背景：免疫疗法最近已经彻底改变了癌症治疗的方法，是继手术、放疗和化疗之后癌症治疗的第四个基石。这对于无法治愈的转移性肿瘤来说更是如此，现在在经历免疫治疗后一部分患者可以达到长期缓解甚至治愈。目前，免疫疗法研究探索并利用免疫系统的各个方面，其中最成功的案例是免疫检查点抑制剂（ICIs）和嵌合抗原受体（CAR）T细胞的过继细胞疗法（ACT）。其他免疫疗法方法主要在临床前研究和临床试验中。对于免疫检查点抑制剂，有1种抗体是针对细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白（CTLA-4）、6种PD-1抗体和PD-L1抗体已经被FDA批准针对超过15种不同类型的恶性肿瘤。相比之下，到目前为止，只有5种CAR-T疗法被批准用于治疗B细胞来源的血液恶性肿瘤。目前超过700个CART疗法的临床试验在clinicaltrails.gov上注册，其中许多试验集中于实体肿瘤。这篇综述文章讨论了CAR-T和NK细胞治疗的现状及其局限性，然后是新兴的CAR-巨噬细胞的治疗。CAR 结构初始T细胞的激活需要两个信号，一个是通过T细胞受体（TCR）与主要组织相容性复合体（MHC）上的抗原结合的第一信号；另一个是通过CD28的共刺激信号。TCR由两条高度可变的链组成通常为α和β链，有少数的T细胞是γ和δ链。这两条链形成抗原识别和结合位点，并由非常短的细胞质位点。除此之外，TCR与6个CD3受体（CD3εγ, CD3εδ andCD3ζζ）结合形成四种CD3受体蛋白（CD3δ,CD3γ, CD3ε and CD3ζ,），来形成1个八聚体的复合物。CD3的胞内结构域包含基于免疫受体酪氨酸的激活基序（ITAM），在TCR接合过程中传递主要信号。TCR-CD3复合物的主要信号和CD28与B7.1（CD80）或B7.2（CD86）结合的共同信号激活T细胞。CAR是一种合成的细胞表面受体，通常不依赖于MHC就可与靶细胞表面抗原结合将细胞毒性细胞与靶细胞结合。它的主要功能比如第一代CAR是替代TCR-CD3复合物并传递T细胞激活的主要信号；第二代和第三代CAR主要替代TCR-CD3复合物的信号和CD28的共刺激信号。CAR通常由四个区域组成：细胞外抗原结合区域、间隔或者铰链区、跨膜区和细胞内信号区域。抗原结合区域通常由抗体的重链（VH）和轻链（VL）通过链接器链接，形成单链片段可变区（ScFv），并决定其抗原结合特异性。有时，可以用一种与靶细胞上的受体结合的天然蛋白质或者肽来代替单链抗体。单链抗体识别并结合细胞表面标位来决定靶标特异性和TCR识别通过MHC呈递抗原的形式是不同的。铰链区域是一个间隔区域，它暴露了CART细胞表面的抗原结合区域，以便抗体与目标抗原结合。临床上常使用的铰链区通常来源于CD8、CD28或者IgG。铰链区域的长度根据经验由靶抗原的位置决定，靠近细胞膜的抗原需要较长的铰链，暴露在细胞表面的抗原需要较短的铰链。跨膜结构域的主要功能是将CAR固定在免疫细胞膜上。然而一些研究表明，该区域可以影响CAR的表达、稳定性、二聚化和信号转导。细胞内信号域在CAR的领域被广泛研究，以用来产生具有最活跃的抗肿瘤的CAR免疫细胞。当CAR参与时，细胞内信号域会传到信号激活免疫细胞攻击目标细胞。第一代CAR-T包含一个CD3ζ信号域。由于T细胞活化需要TCR-CD3和CD28两个信号通路的信号，因此第一代CART细胞治疗在过继转移后的疗效和持久性有限。未提高抗癌活性，设计了第二代CAR-T细胞。除外CD3ζ信号域外还包含一个共刺激域。两个最常用的胞内信号结构域是CD28和4-1BB(CD137)。FDA批注的axicabtagene ciloleucel和brexucabtagene autoleucel 均使用了CD28的结构域，两者都是针对CD19靶点的CAR-T。FDA批准的靶向CD19的lisocabtagene maraleucel和tisagenlecleucel，以及靶向B细胞成熟抗原(BCMA)的idecabtagene vicleucel均使用4-1BB的共刺激域。其他细胞内共刺激域如OX40、CD27、和诱导性T细胞共刺激域（COS）也在临床前研究中进行了测试，与CD28和4-1BB结构域的效果差不多。其中一些共刺激域可能对CAR-T细胞有更好的有益效果，有一项研究表明CD27共刺激结构域比CD28共刺激域在体内更能增强CAR-T的持久性。它们在CAR T细胞中的活性尚未在大型临床试验中得到验证。已经发现细胞内CD28和4-1BB结构域对CAR T细胞的分化和代谢有不同的影响。4-1BB和CD3ζ可联合诱导中枢记忆T细胞的分化和持续性，增加线粒体的生物合成，促进脂肪酸氧化和氧化代谢；CD28和CD3ζ结合诱导记忆细胞分化和糖酵解。为了利用不同性质的共刺激域并增强CAR T细胞的疗效，第三代CAR T治疗被设计在CD3ζ并联设置两个共刺激域。结合CD28和4-1BB可以使得CAR T细胞能靶向低亲和力的目标抗原，增强增殖能力，增强中央记忆细胞的分化，提高体内的抗肿瘤活性。一个包含可变数量共刺激域的CAR构建库测试时发现包含两个共刺激域的CAR T细胞。DAP10和CD27在体内取得最好的抗肿瘤活性。除外CAR的基本结构，生物工程的最新进展使进一步武装CAR免疫细胞成为可能，其可以增强抗肿瘤的功能并降低毒性。如CAR-T细胞上表达趋化因子受体，以促进趋化并向肿瘤微环境浸润；促炎性细胞因子的表达可以克服免疫抑制TME；敲除抑制性受体可以防止CAR-T细胞衰竭；双CAR-T细胞可以产生靶向两个抗原并克服抗原逃逸；自杀或抑制基因可以用来预防或减少毒性，包括靶向性、非肿瘤效应及细胞因子释放综合征。CAR-T治疗的现状到目前为止， FDA已经批准了五种CAR-T细胞。5个B细胞表面标记物， 4个靶向CD19，1个靶向B细胞成熟抗原(BCMA) (表1和图1)这五种药物均已被批准用于复发或难治性血液恶性肿瘤的治疗:B细胞来源的淋巴瘤、白血病和多发性骨髓瘤。第一个FDA批准的CAR-T疗法是Tisagenlecleucel，75例复发或难治性B细胞前体急性淋巴细胞白血病(ALL)患儿和年轻成人患者。在3个月内，总缓解率为81%，其中完全缓解(CR)为60%，不完全血液恢复(CRi)为21%。75例患者中55例(73%)出现3级或4级tisagenleckel相关不良事件。3级和4级细胞因子释放综合征(CRS)分别发生在21例和25%的患者中， 75例患者中有35例(47%)住进重症监护病房(ICU)进行治疗。基于该试验， CAR-T疗法于2017年8月30日获得FDA批准，用于治疗年龄≤25岁的B细胞前体ALL患者，且难治性或二次或以后复发。Tisagenlecleucel于2018年5月1日获批，用于治疗复发或难治的大B细胞淋巴瘤，包括弥漫大b细胞淋巴瘤(DLBCL)、高级别B细胞淋巴瘤和滤泡性淋巴瘤引起的DLBCL，基于多中心试验。在92例可评估的患者中，最佳的总缓解率为52%，其中CR为40%，部分缓解(PR)为12%。63%发生3级或4级不良事件，怀疑与tisagenlecucel有关。Axicabtagene ciloleucel(Yescarta™)于2017年10月18日成为FDA批准的第二种CAR-T疗法，用于治疗大B细胞淋巴瘤，包括DLBCL、原发性纵隔大B细胞淋巴瘤、高级别B细胞淋巴瘤和滤泡性淋巴瘤引起的DLBCL，经过至少两行系统治疗。一项有101名患者参加的多中心ZUMA-1试验显示， 18个月时客观缓解率(CR54%)为82%，总生存率为52%。约13%的患者发生3级或以上CRS。2021年3月5日， axicabtageneciloleucel也被批准用于复发或难治性滤泡性淋巴瘤，基于单臂、开放标签的ZAMA-5试验，经过两个或多个系列的全身治疗。91%的患者达到了缓解，约8%的患者出现了3级或3级以上的CRS。中位随访时间为14.5个月，在18个月时， 74%的患者持续缓解。基于一项单臂、开放标签的ZUMA-2试验， FDA于2020年7月24日批准了第三个靶向CD19的CAR-T疗法Brexucabta或难治性套细胞淋巴瘤。在这个多中心II期试验中，74名患者被纳入， Brexucabtageneautoleucel生产了71名患者，给药68名患者。总体而言缓解率为93%，缓解率为67%。12个月时，总生存率为83%。约15%的患者发生3级或以上CRS。Lisocabtagene maraleucel (Breyanzi™)是最近批准的针对复发或难治性大B细胞淋巴瘤的CD19靶向CAR-T治疗，经过两个或多个系列的系统治疗，包括未指定的大B细胞淋巴瘤(包括由惰性淋巴瘤引起的大B细胞淋巴瘤)、高级B细胞淋巴瘤、原发性纵隔大B细胞淋巴瘤和滤泡性淋巴瘤3b阶段。在这项多中心TRANSCEND试验中，有192名可评估患者参与，客观缓解率为73% (50×106、100×106和150 ×106给药方案分别为68、74和73%)，CR为53% ((50 ×106、100 ×106和150 ×106给药方案分别为60、52和51%)，中位缓解持续时间为17个月。3级或以上CRS发生在约2%的患者中。Idecabtagene vicleucel (Abecma®)是唯一的FDA-批准的CAR-T治疗不针对CD19。它针对多发性骨髓瘤(MM)细胞的BCMA靶点，并于2021年3月26日获得FDA批准，用于复发或难治性MM，经过4个或更多系列的系统治疗，包括免疫调节剂、蛋白酶体抑制剂和基于KarMMa研究的抗CD38单克隆抗体。在128名接受治疗的患者中，总有效率为73%(150×106、300×106和450×106给药方案分别为50、69和82%)，CR为33% (150×106、 300×106和450×106给药方案分别为25、29和39%)。约2%的患者中发生了3级或以上CRS。到目前为止，已经有超过700个恶性肿瘤的临床试验被注册。此外，CAR-T细胞疗法正在探索用于其他疾病，如自身免疫疾病和病毒感染)。表1 FDA近期批准的CAR-T治疗图1 FDA批准CAR-T治疗的时间线CAR-T细胞在癌症免疫治疗中的局限性许多因素导致了CAR-T治疗的失败，如患者的疾病进展、单采时T细胞数量不足、推迟的CAR-T生产、CAR-T细胞未满足回输剂量、固有的T细胞缺陷等。下面是与CAR-T细胞生产和治疗相关的因素。抗原选择尽管CAR-T治疗取得了巨大的成功，但仍存在一些明显的局限性。到目前为止，所有FDA批准的CAR疗法都以B细胞的标记物为靶点。CAR-T细胞治疗实体瘤落后于血液瘤的原因是多样的。缺乏癌症特异性的靶点是主要的障碍之一。尽管CD19靶向CAR T治疗会导致B细胞再生障碍，但静脉注射免疫球蛋白补充剂可以很容易地补偿大多数B细胞功能。实体瘤中很少存在这种不影响正常功能的特异性抗原。在实体肿瘤中，靶向肿瘤相关抗原的CAR-T细胞的临床试验，如被T细胞识别的黑色素瘤抗原1(MART1)和糖蛋白100(gp100)，表明确实发生非靶向肿瘤的副作用，有时不能轻易逆转。这种毒性可能发生在没有或只有最低的抗肿瘤活性的情况下，甚至当靶向被认为在健康成人组织中不表达的癌症睾丸抗原时，也可导致死亡。CAR-T细胞转移和浸润到肿瘤中的效率低下转移和渗透到肿瘤部位是静脉注射CAR-T细胞的要克服的下一个主要障碍。粘附分子异常表达的异常脉管系统降低CAR-T细胞附着的附着、迁移和浸润;密集的细胞外基质，包括癌症相关的成纤维细胞(CAFs)，为CAR-T细胞进入肿瘤部位创造了一个物理屏障;紊乱的细胞因子表达会优先吸引被抑制的免疫细胞。目前已经探索了各种策略来增加T细胞对肿瘤的浸润。比如CAR-T与另一种靶向CAFs的CAR-T治疗相结合，或将CAR-T细胞与细胞因子受体结合，结合到肿瘤中上调的细胞因子上。然而，这些策略有时是有代价的，因为这些目标通常存在于机体中。一项临床前研究表明，靶向CAFs的CAR-T细胞能够识别多能骨髓基质细胞，这导致小鼠产生恶病质和死亡，这些研究提醒人们不要在人类患者中使用这种策略。恶性的肿瘤微环境进入TME后，免疫抑制环境会抑制CAR-T细胞的功能。在某些癌症中尤其如此，如胰腺癌，细胞和基质成分都为癌症免疫治疗创造了不利的微环境。细胞成分如肿瘤相关的巨噬细胞(TAMs)，调节性T -细胞(Treg)，骨髓源性抑制细胞(MDSCs)和肿瘤相关的成纤维细胞(TAFs)可以直接抑制CAR-T功能，有助于免疫抑制细胞因子和代谢微环境抑制CAR-T细胞功能。血管内皮生长因子(VEGF)在肿瘤新生血管中起着至关重要的作用。最近发现VEGF几乎可以影响免疫系统的各个方面，导致抗肿瘤免疫的抑制。此外，转化生长因子β（TGF-β）、IL-4、IL-10等也会使得T细胞功能障碍，促进免疫抑制细胞的浸润。许多策略已经存在并用在TME下促进CAR-T的治疗，例如将CAR T疗法与ICIs或其他免疫刺激疗法相结合，使CAR T细胞对免疫抑制细胞因子不敏感。抗原逃逸T细胞发挥抗癌活性，抗原丢失和下调是治疗失败的重要机制。尽管有很高的初始缓解率，但7~25%的患者接受靶向CD19的CAR-T治疗后， CD19表达减少的恶性肿瘤复发。靶向两种不同抗原的CAR-T构建或连续的CAR-T治疗正在积极地进行，以尽量减少抗原逃逸和下调。CAR-T细胞扩增和持久性不足除了靶向抗原的逃逸， CAR-T细胞扩张和体内持续存在被认为是长期缓解的关键。特别是那些需要长期治疗的恶性肿瘤，如ALL。对于其他恶性肿瘤，如非霍奇金淋巴瘤，短时间的强化化疗无需巩固和维持治疗就足以诱导缓解。在后一种情况下，尽管CAR-T细胞未被检测到， B细胞在抗cd19CAR-T治疗后恢复，但完全缓解持续存在。缺乏CAR- T细胞持久性可能与宿主对CAR-T细胞的抗转基因免疫反应有关。在这种情况下，基于氟达拉滨的淋巴消耗状态治疗可以减少抗转基因免疫反应，改善CAR-T细胞的扩张和持久性，并增强CAR- T细胞的疗效。更常见的是，CAR-T细胞扩增和持久性的缺乏是由直接与CAR-T细胞相关的因素引起的。人们设计和研究了各种策略来增强CAR-T细胞的扩展和持久性:CAR-T细胞构建、亲本T细胞选择、 T细胞培养条件、药物操作、修饰CAR-T基因表达和代谢、逆转T细胞衰竭、促进记忆表型发展等。关于CAR-T结构，大多数临床测试和FDA批准的CAR-T细胞产品含有CD3ζ一个共刺激域，通常是CD28或4-1BB。临床前研究和一些临床观察表明，共刺激结构域可以影响CAR-T细胞的表型和体内持续时间， 4-1BB结构域持续时间更长，为168天。而CD28为基础的CAR-T细胞治疗约持续30天。体外培养、激活和扩增不仅能引导T细胞转导CAR-T基因，扩大到产生足够的CAR-T细胞用于临床应用，而且对维持CAR-T功能和输注后的持久性也至关重要。体外培养导致T细胞终末分化，倾向于激活诱导细胞死亡(AICD)和衰竭，可影响体内扩张和持久性。优化培养条件可促进记忆型CAR-T细胞的发育和体内扩展和持久性。全身毒性CAR-T细胞治疗有很高的反应率，特别是在耐药或者难治的疾病中，但也与较高的副作用率相关。全身细胞因子毒性发生在急性期，当CAR-T细胞被激活并释放细胞因子作为CAR-T细胞与抗原结合的生理反应。所有有效的CAR-T治疗都观察到严重甚至致命的影响。对于大多数患者，它表现为与发热、低血压、缺氧和与高水平炎症细胞因子相关的多器官衰竭相关的CRS。一些患者也可发展为免疫效应细胞相关神经毒性综合征(ICANS)。ICANS具有明显的神经学表现，继发于脑脊液细胞因子水平升高和血脑屏障破坏，表现为失语症、精神状态改变、震颤、癫痫和头痛。各种方法已经被采用，其中一些已经转化为临床应用。糖皮质激素和抗白细胞介素-6 (IL-6)抗体西妥昔单抗是最常用的药物干预。其他几种方法正在积极探索以控制或改善全身细胞因子的毒性，如根据肿瘤负荷量身定制CAR-T细胞剂量，修改CAR-T构建，在CAR-T细胞中加入关闭开关或自杀基因。在CAR-T细胞治疗后，偶尔会发生噬血细胞性淋巴组织细胞增多症(HLH)/巨噬细胞活化综合征(MAS)。基于一项多中心调查，大约3.5%(7/201例)的患者接受CAR-T细胞治疗后发生HLH/MAS。主要临床表现为发热、肝脾肿大、肝功能异常、血细胞减少、高脂血症铁蛋白水平，高甘油三酯血症和低纤维蛋白原血症。有时表现与CRS相似。HLH/MAS有几种诊断标准以HLH2004为临床最常用。以皮质类固醇为基础的免疫抑制治疗是主要的治疗方法，但仍有较高的死亡率。CAR-T细胞治疗实体肿瘤的特殊考虑目前，超过70%的CAR-T细胞临床试验集中于血液恶性肿瘤，超过40%的CAR-T细胞治疗CD19，而不到30%的CAR-T细胞治疗实体肿瘤。CAR-T在实体肿瘤中的治疗遇到了上述所有的挑战。在设计实体肿瘤的CAR-T治疗时需要特别考虑。首先，靶抗原的选择至关重要。目标抗原列表和一些临床试验实例可以在之前的综述中找到，并正在扩大。在CAR-T治疗中，理想的目标抗原是那些仅表达在恶性细胞上的肿瘤特异性抗原。事实上，除了癌症新抗原和可能的表皮生长因子受体变异III(EGFRvIII)，几乎所有其他在实体肿瘤CAR-T治疗中使用的抗原都是由正常细胞共享的。在血液系统恶性肿瘤中靶向非癌症特异性抗原的主要优势是:1)在正常细胞被破坏的情况下存在挽救性补救，如图所示，免疫球蛋白补充靶向B细胞标记物的CAR-T治疗(CD19和BCMA);2)细胞更新快，有新的细胞来补充。因此，在血液系统恶性肿瘤的靶内，肿瘤外的副作用通常是可控的。相反，在实体肿瘤中靶向肿瘤相关抗原(TAAs)通常与更显著的副作用相关，因为通常难以修复实体器官中正常细胞的肿瘤外损伤。已经设计了几种策略来解决实体肿瘤和血液病中肿瘤特异性抗原的缺乏。一种是将主要和共刺激信号域分成两种不同的CARs。因此，除非靶细胞同时表达靶抗原，否则这些分裂细胞和CAR-T细胞不会被强烈激活。一个类似的分裂和方法是合成Notch(synNotch)受体系统，在该系统中，第一个目标抗原的结合触发CAR的表达， CAR的表达可以被附近表达第二个目标的细胞激活并杀死。另一种方法被称为非方法，如在分裂、通用和可编程（SUPRA）CAR系统中所见，在该系统中，CAR可以与TAA结合并激活CAR T细胞，但第二种抗原（通常是在正常细胞上表达的抗原）的存在可以竞争CARTAA结合，并阻止CART细胞激活。一些其他的方法也被探索过，比如微调CAR亲和力，以实现靶抗原过度表达的癌症细胞而非低抗原表达的正常细胞激活CAR T细胞，靶向癌症细胞中异常糖基化，并使用靶向癌症新抗原的T细胞受体。在实体肿瘤的CAR-T治疗中，抗原异质性也是一个需要考虑的关键因素。在FDA批准的CAR-T疗法中，靶向抗原CD19和BCMA是在恶性细胞的干细胞中表达的发育性生物标记物。在实体肿瘤中，这种发育性抗原/生物标志物与正常细胞共享，因此，针对这些抗原可能导致严重的靶向性、非肿瘤毒性。对于非发育性生物标志物，异质性表达在癌细胞中很常见。为了克服靶抗原的异质性，人们提出了双特异性或多特异性CAR，其中一个CAR可以识别多个靶抗原。另一种方法是将几个靶向不同抗原的CARs导入相同的T细胞中。在这两种方法中，靶向性和非肿瘤性都是一个主要问题，因为很少有肿瘤特异性抗原存在。CAR-T细胞浸润肿瘤和保留细胞毒性是实体肿瘤的主要障碍。在CAR-T细胞直接与靶细胞接触的白血病或淋巴细胞在淋巴器官中正常流动和积聚免疫反应的淋巴瘤中，这两个障碍就不那么重要了。目前正在探索几种增强CAR-T细胞在实体肿瘤中的活性的方法。一种方法是增强CAR-T功能，并添加分子武装这些细胞以增强抗肿瘤活性。例如，用趋化因子受体武装CAR-T细胞可以通过上调目标趋化因子来增强T细胞向肿瘤的浸润。TGF-β 是TME抗癌免疫的主要负调控因子。在CAR T细胞中敲除TGF-β 可以增强其抗癌活性。然而，一种更常见的方法是将CAR-T细胞与另一种药物结合，以克服障碍并提高疗效。有人提出了一种基于药理学的抗癌药物排名，这可能会指导免疫疗法联合的发展。CAR NK细胞解决与CAR T治疗相关的未满足需求NK细胞是先天免疫系统的一组细胞毒性淋巴细胞，可以对非自身细胞产生快速反应。与识别MHC上呈递的抗原的T细胞不同，NK细胞可以在没有MHC的情况下直接识别靶细胞。事实上，MHC与NK细胞上的杀伤细胞免疫球蛋白样受体（KIR）结合，抑制NK细胞的功能。此外，与可以释放炎症细胞因子并导致CRS和神经毒性的CAR T细胞的参与和激活不同，NK细胞具有不同的细胞因子谱。因此，目前正在积极探索NK细胞作为过继细胞治疗的替代方法(表2)。表2 CAR T，NK和巨噬细胞的比较CAR-NK细胞相对于CAR-T细胞的一个主要优势是免疫细胞的来源。由于同种异体反应性和移植物抗宿主病(GVHD)， CAR-T治疗需要使用自体T细胞。由于这些患者通常在接受CAR-T治疗之前接受了大量治疗，他们中的许多人在外周血中T细胞计数较低。因此，获因此，采集足够的自体T细胞会显著延迟治疗，有时不可能采集足够的细胞用于CAR T制备。在一项研究中，22.5%(16/71)的患者使用低于目标的CD3+ T细胞的自体淋巴细胞来生产CAR-T细胞。冗长而繁琐的CAR-T制造过程使得更多的患者要么不适合治疗，要么在参与治疗过程后出现疾病进展。例如，在导致FDA批准的ALL的tisagenlecucel的I期试验中， 83名患者中只有54名患者接受了CAR-T细胞输注， 9名患者在治疗前病情进展或死亡， 15名患者接受了其他治疗。由于NK细胞不通过MHC途径激活，并且降低了异源反应的风险， CAR-NK细胞的制造不需要自体NK细胞。它可以使用现有的NK92细胞系、脐带血和诱导多能干细胞(iPSCs)。事实上，有5项临床试验使用NK-92细胞系在人类患者身上进行。在一项使用脐带血开发的HLA-不匹配CAR-NK疗法的试验中，11例患者中没有一例出现GVHD。因此，CAR-NK治疗的一个主要优势是，“现货的”准备使用的CAR-NK细胞可以通过批量生产生产，并在任何时候注入患者。CAR-NK治疗相对于CAR-T治疗的第二个主要优势在CRS和神经毒性。CAR-T细胞激活导致大量炎症细胞因子的释放，导致CRS和神经毒性。在使用tisagenlecucel治疗ALL的I期试验中，85%(45/53)的患者发生了3级或以上毒性的CRS，26%(14/53)的患者发生了3级或以上毒性， 41.5%的患者发生了3级或以上神经毒性。其他CAR-T治疗也观察到类似的毒性。在11例使用来自脐带血的HLA未配对的 anti-CD19 CARNK细胞治疗的患者中，没有一例出现CRS或神经毒性。CAR-T和NK细胞之间这两种毒性的差异可能是由于细胞激活时释放的细胞因子的差异。CAR-T细胞的活化导致炎症细胞因子的释放，如肿瘤坏死因子α，IL-1β，IL-2和IL-6等，而接受CAR-NK治疗的患者这些炎症细胞因子并没有增加。CAR-NK细胞释放不同类型的细胞因子，如粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。第三，除了CAR途径外， NK细胞还有多种靶向和消灭癌细胞的机制(图2)。NK细胞是抗体依赖的细胞介导的细胞毒性的关键媒介，NK细胞表达的CD16能够识别IgG结合在肿瘤细胞上的Fc部分并杀死癌细胞。此外， NK细胞可以激活，通过接触和/或脱离癌细胞在细胞表面激活和抑制杀伤igg样受体(KIRs)。激活型和抑制性KIRs分别通过ITAMs(免疫受体酪氨酸基激活基序)和ITIMs(免疫受体酪氨酸基抑制基序)传递信号。应激细胞和癌细胞下调MHCI类表达并脱离抑制性KIRs，或上调应激诱导的分子，如MICA/MICB (MHCI类链相关蛋白A/B)，激活KIRs，使得NK细胞的激活以杀死目标细胞。第四， NK细胞的寿命有限。NK细胞的平均寿命约为2周。这意味着，在靶向非肿瘤毒性发生的情况下，它可以随着CAR的消失而自我限制。然而，这也创造了一把双刃剑，反复输注CAR-NK细胞可能需要延长缓解期。CAR结构的比较到目前为止，大多数CAR-NK细胞研究使用的CAR-T细胞使用的相同的CAR-T细胞结构，具有与第一代CAR-T细胞相同的细胞内CD3ζ域，或CD3ζ加一个共刺激域4-1BB，与第二代CAR-T细胞使用的一样(图1)。添加4-1BB共刺激域显著改善NK细胞激活，细胞毒性和细胞因子的产生，如干扰素-γ 和粒细胞-巨噬细胞集中性刺激因子。由于NK细胞有自己相互关连的激活和抑制受体来控制NK细胞的激活和细胞毒性，因此有人提出，利用NK细胞特异性的细胞内信号域，如适配器分子DAP10或含ITAM的信号域，如DAP12和2B4，可以提高细胞毒性。2B4属于信号淋巴细胞活化分子(SLAM)家族受体，通过SLAM相关蛋白(SAP)在NK细胞中转导活化信号。2B4与CD48结合在靶细胞上诱导NK细胞活化，增加细胞毒性和干扰素-γ产生。与含有4-1BB-CD3ζ 的CAR-NK细胞相比，含有2B4- CD3ζ的CAR-NK细胞具有更好的细胞毒性、干扰素γ的产生和体内抗肿瘤功效。为了进一步优化NK细胞CAR-T的构建，Li等人将一个CAR-T细胞构建与九个不同的CAR-NK细胞进行了比较，这些细胞包含四个不同的跨膜结构域和不同的细胞内信号域，并靶向相同的间皮素抗原。CAR-NK细胞包含NKG2D跨膜结构域， 2B4共刺激结构域和CD3ζ 信号域，表现出强烈的抗原特异性细胞毒性。CAR-NK细胞由携带该构建物的人iPSC发展而来，具有典型的NK细胞表型，具有显著的抗肿瘤活性，并延长了在体内的生存时间。CAR-NK细胞治疗的现状到目前为止，至少有24个CAR-NK细胞的临床试验已经计划或正在进行中。恶性肿瘤、靶抗原和临床试验信息见表3和补充信息1。这些临床试验均处于I/II期试验阶段。使用“嵌合”和“NK”这两个关键词， PubMed仅确定了一项临床试验(表4)。Liu等人发表了一项针对cd19阳性淋巴类肿瘤的CAR-NK细胞I期临床试验。在这个试验中，一个类似的CAR-T细胞结构被用来建立CAR-NK细胞与抗cd19单链抗体抗原结合的细胞外域和CD3ζ 作为细胞内信号域。此外， CAR-NK细胞表达白细胞介素-15以增强CAR-NK细胞在体内的扩张，而rimiducid诱导的caspase-9作为一种安全措施，在发生严重不良事件时可触发CAR-NK细胞凋亡。11名b淋巴恶性肿瘤患者被纳入试验。这些患者在入组前接受了四种治疗线的中位数。CAR-NK细胞来自部分HLA匹配的脐带血标本(前9例患者)或没有考虑HLA匹配的脐带血标本。11例患者均未出现CRS、神经毒性、噬血细胞性淋巴组织细胞增多症或移植物抗宿主病。在这些患者中没有观察到炎症细胞因子的增加。11例患者中有8例(73%)获得客观缓解，包括7例CRs(3例CLL和4例淋巴瘤)， 1例CLL Richter's转化患者的高级别淋巴瘤完全缓解。CAR-NK细胞可以持续至少12个月。表3 CAR NK细胞的临床试验表4 一期靶向CD19的CAR NK的临床试验总结CAR-NK细胞的局限性虽然CAR-NK细胞治疗比CAR-T细胞治疗的优势是显而易见的，正如上面讨论的，显著的局限性也存在。几乎所有与CAR-T治疗相关的限制也适用于CAR-NK细胞，从目标抗原选择，抗原异质性， CAR-T设计，制造到输注后挑战，如NK细胞迁移到肿瘤部位，敌对的肿瘤微环境。目前正在进行积极的研究，以改善CAR-NK的制造和储存，特别是“现成的”CAR-NK细胞，优化CAR-NK的结构，以增加CAR-NK渗透到肿瘤中，并保持免疫抑制TME的细胞毒性，并最大限度地减少靶向性和非肿瘤毒性。此外， NK细胞的半衰期较短(< 10天)，这是CAR-NK治疗中的一把双刃剑。这在发生严重毒性的情况下具有优势，但也产生了一个挑战，可能需要反复给药，以实现持久的反应。重新编程CAR-NK细胞，使其具有记忆细胞特性，并在体内长期存活，以进行持续的免疫监测和预防癌症复发是目前一个积极探索的领域。此外，与T细胞相似， NK细胞在细胞表面同时具有活化和抑制KIRs。有核细胞上普遍表达的MHC分子可抑制NK细胞功能。CAR-巨噬细胞来解决与CAR-T和CAR-NK治疗相关的未被满足的需求CAR-T治疗已经在血液系统恶性肿瘤中取得了很高的成功，但它还没有在实体肿瘤中取得成果，即使具有很强的临床前研究。血液病和实体恶性肿瘤之间存在着一些明显的区别。例如，在B细胞恶性肿瘤中观察到的CD19在实体肿瘤中存在罕见的靶抗原。这种显著的差异也可能是继发于血液肿瘤和实体肿瘤之间潜在的生理差异。当考虑癌症免疫周期时， CAR-T细胞绕过了该周期的前三个步骤:癌症抗原释放和呈现， T细胞启动和激活。然而， CAR-T细胞的有效性仍然受抗癌免疫的最后四个步骤的控制，即T细胞转移(步骤4)和渗透(步骤5)到肿瘤，识别(步骤6)和杀死肿瘤(步骤7)。如上所述，这四个步骤为T细胞创造了巨大的障碍。例如，许多实体瘤是免疫“冷”瘤，免疫细胞很少渗入TME。由于TME具有免疫抑制作用，即使在那些有显著免疫细胞浸润的癌症中，免疫细胞也不能消灭癌细胞。尽管CAR-NK细胞相对于CAR-T细胞有一些优势，但与CAR-T细胞相关的大多数障碍也适用于CAR-NK细胞。NK细胞通常不是TME中主要的免疫细胞群。武装CAR-NK细胞可以解决一些障碍。例如，在CAR-NK细胞中加入IL-15可以显著增强CAR-NK细胞在体内的扩张和持久性，提高小鼠模型的抗肿瘤活性和总生存期。由于迄今为止只有一项I期临床试验报道，尚不清楚用细胞因子武装CAR-NK细胞是否可以推广到其他恶性肿瘤。NK细胞一旦进入肿瘤部位，具有免疫抑制作用的TME可以抑制NK细胞的功能。由于与CAR-T和CAR-NK细胞治疗相关的障碍，最近CAR-巨噬细胞已经成为一种替代疗法。CAR巨噬细胞和CAR-T细胞有许多共同的特点和障碍，如特异性抗原的需求，抗原逃逸和下调，以及全身细胞因子的毒性。然而， CAR巨噬细胞在实体肿瘤的其他两个主要障碍上比CAR-T细胞具有独特的优势:免疫细胞贩运和渗透到TME，以及免疫抑制TME(表2)。由于免疫细胞向TME转运和浸润，巨噬细胞在许多肿瘤中大量存在，而T细胞浸润较差。新鲜冷冻肿瘤切片显示，巨噬细胞在许多癌症类型中占肿瘤浸润细胞的大多数，在黑素瘤、肾细胞癌和结直肠癌中高达50%。TME巨噬细胞的浸润是继发于肿瘤部位分泌的许多细胞因子。缺氧诱导肿瘤细胞和间质产生细胞因子，如CCL2 (C-C motif chemokine ligand 2)、 CXCL12 (CX-C motif chemokine ligand 12)、 CSF1 (ColonyStimulating Factor 1)和VEGF招募巨噬细胞。一旦被募集到缺氧的TME中，这些可溶性因子的受体就会被下调，从而将巨噬细胞锁定在TME中。此外，巨噬细胞可以直接感知缺氧状态及其代谢产物，如低pH，并迁移到TME中。TME的另一个特点是免疫抑制微环境，这对T细胞来说是一个主要障碍，而对巨噬细胞来说则不是。由于这种环境，渗透到肿瘤部位的T细胞往往发展衰竭表型，有时不能被免疫检查点抑制剂逆转。巨噬细胞的情况可能并非如此。巨噬细胞大致分为两大类，经典活化的促炎M1巨噬细胞和交替活化的抗炎M2巨噬细胞。TAMs，尤其是M2 TAMs，被广泛认为是TME的中枢免疫抑制细胞群之一。甚至M2巨噬细胞虽然抑制了其他免疫细胞的功能，但仍具有吞噬功能。事实上， M2巨噬细胞比M1巨噬细胞具有更高的吞噬能力。此外，巨噬细胞具有较高程度的表型可塑性，可以对环境刺激作出反应，改变表型。CAR巨噬细胞中的CAR结构CAR -T细胞中的CAR-巨噬细胞具有与CAR-T细胞相同的结构，具有细胞外抗原结合域、铰链区、跨膜域和细胞内域(图1)。它们在细胞内信号域上有所不同。CAR-T巨噬细胞可以直接使用CD3ζ 胞内区域，就像CAR-T细胞使用的那样，CAR-T细胞包含基于免疫受体酪氨酸的激活基模(ITAMs]。在CAR-T细胞中， ITAMs在CAR结合时被Src家族激酶磷酸化，与串联的SH2 (tSH2)激酶ZAP70结合，并激活CAR-T细胞发挥细胞杀伤作用。巨噬细胞不表达ZAP70。它们表达另一种含有tSH2结构域的激酶Syk，可以结合CD3ζ并在巨噬细胞中转导吞噬信号。除了CD3ζ，其他含有itam的细胞内结构域，如Fc受体的γ亚基(FcRγ )和多个表皮生长因子样结构域蛋白10(Megf10)，也被使用，并可诱导类似CD3ζ 的吞噬作用。FcRγ 转化巨噬细胞中抗体依赖细胞吞噬(ADCP)的典型信号转导。Megf10在巨噬细胞吞噬凋亡细胞中发挥着重要作用。与第二代和第三代CAR-T细胞相似，一个额外的信号域增强了吞噬作用。含有CD3结构域而没有共刺激结构域的CAR-T细胞，正如第一代CAR-T细胞所见，其体内活性有限。因此，所有FDA批准的CAR-T产品都包含一个共刺激的细胞内结构域，要么是CD28，要么是4-1 BB(表1)。在CAR-巨噬细胞中也观察到类似的结果。此前有报道称，磷脂肌醇3-激酶(PI3K)信号通路对大颗粒吞噬作用十分重要。CD19 PI3K招募域与CAR -FcRγ 的串联融合使目标全细胞的吞噬能力增加了三倍。CAR-巨噬细胞的现状到目前为止， CAR-巨噬细胞研究主要处于临床前阶段，一项I期试验正在进行中，该试验使用自体CAR-巨噬细胞靶向HER2过表达的实体肿瘤(表5)。Morrissey等人系统分析了可用于构建靶向CAR-巨噬细胞的CD19-和CD22-的胞内结构域。CAR-巨噬细胞含有任何含有ITAM的细胞内结构域，CD3ζ，FcRγ或Megf10，具有相当的吞噬效率，而含有Bai1和MerTK细胞内结构域的CAR-巨噬细胞不能结合到目标珠。大多数CAR-巨噬细胞只内在化目标细胞的碎片，类似于trogocytosis或啃噬活细胞的现象。全细胞吞噬少见。阻断“don’t eat me”信号CD47或CAR的抗体含有FcRγ-PI3Kk招募域，增强了整个细胞的吞噬作用，但在孵育4-8小时后，仍只有不到10%的巨噬细胞包含整个细胞。Klichinsky等人报道了CD3ζ-based anti-HER2 CAR-巨噬细胞的产生和表征。在本研究中，一个复制无能腺病毒载体被用来高效和可复制地将CAR传递到巨噬细胞。腺病毒感染诱导CAR-巨噬细胞M1分化，并使TME向促炎状态倾斜，而不是与大多数肿瘤相关的抗炎M2状态。此外，腺病毒转导的CAR-巨噬细胞作为专业的抗原呈递细胞，除了靶向抗原外，可以交叉呈递肿瘤来源的抗原，从而更有效地激活T细胞。与这些体外发现一致，这些CAR-巨噬细胞显著延长了携带肿瘤植入物的小鼠的生存时间，并减少了肺转移。L.Zhang等人报道的一项研究通过诱导多能干细胞(iPSCs)来源的CAR-巨噬细胞解决了生物工程巨噬细胞用于癌症免疫治疗的低效问题。在本研究中，利用非整合的episomal载体编码重编程因子来诱导iPSC克隆。然后含有CD86和FcRγ 细胞内结构域的CAR被转导到iPSC诱导的巨噬细胞中。这些iPSC衍生的CAR-iMACs巨噬细胞(CARiMACs)具有M2表型。然而，在与目标细胞相遇时，这些CARiMACs可以吞噬目标癌细胞，并向促炎M1状态倾斜。体内研究表明， CARiMACs可以扩展、持久并发挥其抗肿瘤活性。W.Zhang等人利用CAR-巨噬细胞来解决细胞外基质(ECM)引起的肿瘤免疫细胞浸润不足。ECM为T细胞渗透到肿瘤部位并发挥其抗癌免疫功能创造了一个物理屏障。CAR-T细胞靶向癌症相关的成纤维细胞或基质降解酶，肝素酶，可以促进免疫细胞浸润和增强抗癌免疫。在Zhang的CAR-巨噬细胞中，靶向HER2的scFv是结合到铰链区域和CD147跨膜和细胞内结构域，生成CAR-147巨噬细胞。CD147通过基质金属蛋白酶（MMPs)的表达对ECM重构至关重要。由于CD147不转导吞噬信号， CAR-巨噬细胞与靶细胞的结合显著上调了某些MMPs的表达，但不影响其他巨噬细胞功能，如吞噬、活性氧(ROS)的产生和炎症细胞因子的分泌。与体外实验结果一致， CAR-147巨噬细胞上调少量MMPs的表达，显著降低肿瘤中胶原含量，诱导CD3+ T细胞浸润，抑制肿瘤生长。Niu等人报道了一项使用CAR-巨噬细胞靶向表达ccr7的免疫抑制细胞进行癌症免疫治疗的研究。这个组以前发现脂滴高-(LDhi)免疫抑制细胞表达cc趋化因子受体7(CCR7)，在肿瘤组织中积累，抑制抗癌免疫。因此， CAR巨噬细胞被设计表达CCR7自然配体CCL19 (C-C Motif Chemokine ligand19)作为细胞外结构域，以靶向表达CCR7的免疫抑制细胞。为了开发一个最佳的CAR结构，我们使用并比较了以下细胞内结构域:TLR2, TLR4, TLR6,MerTK，或经典的CAR- t激活域，4-1BBCD3ζ。含有MerTK或CAR-m(MerTK)的CAR-巨噬细胞在体外具有最强的吞噬和细胞杀伤活性。由于CCR7也在毛囊和肠绒毛中表达，当使用大剂量CAR-M(MerTK)时，观察到靶向非肿瘤毒性。低剂量时，能诱导CD3+T细胞向肿瘤浸润，增加促炎细胞因子的产生，抑制肿瘤生长，延长总生存期，减少转移，且毒性小。表5 近期CAR-巨噬细胞研究CAR-巨噬细胞的临床发展现状进展到目前为止，只有一项CAR-巨噬细胞的I期临床试验(Clinicaltrials.gov标识号:NCT04660929)。如上文所述，本临床试验是基于Klichinsky等人开发的CAR-巨噬细胞。本试验使用嵌合腺病毒载体Ad5f35修饰的CAR-巨噬细胞，并携带靶向HER2的单链抗体。腺病毒感染诱导巨噬细胞分化为促炎性M1样表型。该临床试验于2021年2月开始。到目前为止，还没有报告结果。第二项CAR-巨噬细胞研究也被注册(Clinicaltrials.gov标号:NCT05007379)。这是不是临床试验。本研究是一项观察性研究，目的是确定CAR-巨噬细胞在来自100名患者的患者源性类器官中的抗肿瘤活性。CAR-巨噬细胞的局限性CAR-巨噬细胞仍处于初期阶段，仅启动了一项临床试验，尚无结果报道。因此，许多限制还有待揭示。类似于CAR-T和NK细胞，CAR-巨噬细胞将需要经过7个步骤沿着癌症免疫周期来实现细胞毒性作用。巨大的努力正在优化CAR-巨噬细胞的结构，制造，储存，肿瘤浸润，和保留细胞毒性在TME。重复给药可能需要维持足够的CAR-巨噬细胞水平，以进行积极的癌症监测。使用巨噬细胞进行ACT治疗的一个主要优点是它有向肿瘤迁移和浸润的倾向。随着促炎型M1和抗免疫型M2表型间分化的可塑性，巨噬细胞向肿瘤的高浸润和向M2表型分化可促进肿瘤的生长和转移。M1表型的分化和保留正在研究中。结论综上所述， ACT联合CAR-T治疗已取得了较好的疗效迄今为止， FDA批准的5种CAR-T疗法在血液系统恶性肿瘤方面取得了巨大进展。实体肿瘤的CAR-T治疗由于缺乏癌症特异性抗原、 CAR-T细胞迁移到肿瘤部位的效率低、免疫抑制TME等原因而滞后。CAR-NK细胞也被研究并转化为临床试验。CAR-NK细胞有几个优点。有限的NK细胞寿命意味着更低的靶向/非肿瘤毒性风险;NK细胞释放的不同细胞因子谱降低了细胞因子释放综合征和神经毒性的风险；和降低的异源反应性的风险，允许使用NK细胞系生成现成的异源CAR-NK细胞。巨噬细胞是TME主要的浸润细胞之一。即使是免疫抑制的M2巨噬细胞也具有很强的吞噬活性。最近， CAR-巨噬细胞正在被探索作为一种替代方法的ACT。一项针对HER2表达实体肿瘤的CAR-巨噬细胞的临床试验正在进行中，临床前研究已经显示出有希望的抗肿瘤活性。未来的CAR-巨噬细胞治疗仍然需要克服CAR-T治疗遇到的一些其他障碍。由于肿瘤相关的巨噬细胞是TME的主要细胞类型和主要的免疫调节因子，因此开发CAR是一个主要的研究方向巨噬细胞不仅是一种吞噬机制，更重要的是，它是一种抗原呈递剂、TME修饰剂和免疫刺激剂，以促进抗肿瘤免疫。由生物制品圈&抗体圈主办的“2023生物制品工艺发展大会”将于9月22-23日在上海举办，本次大会将主要聚焦生物制品前沿技术、CMC、生产、工艺等热点话题进行探讨交流，涉及人用疫苗、兽用疫苗、抗体药、细胞治疗、基因治疗等生物制品领域。届时将邀请生物制品领域经验权威的专家进行报告，欢迎各界同仁参会学习交流。1.会议名称：2023生物制品工艺发展大会2.会议时间：2023年9月22-23日（周五、周六）3.会议地点：上海（酒店定向通知）4.主办单位：生物制品圈、抗体圈5.媒体支持：药时空、药创客、细胞基因研究圈6.报名方式及费用：扫描识别下方二维码进行报名登记。转发分享福利：生物医药研发企业、科研院校和监管机构人员，前100位报名人员转发分享至朋友圈本通知可免费参会（不含餐饮）报名后，加微信13585867695发截图给工作人员即可。组委会获得报名信息后，根据报名信息进行初筛，并进一步与报名者沟通确认，实现精准邀请，最终有机会进入大会微信群（严格审核通过）。各类商务合作咨询：13585867695（同微信）大会日程识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。