MRE11

乳酸化是最近发现的一种蛋白质翻译后修饰，最初通过表观遗传机制与基因转录调控有关。然而，它在肿瘤发生中的作用（无论是作为主要驱动因素还是次要调节因子）仍不确定。今天，小编要和大家分享一篇2024年10月发表在Cancer Cell上的综述，文章总结了目前对乳酸化的理解，强调了在病理生理相关条件下使用精确方法来操纵乳酸化水平的必要性。 乳酸化是一种新型蛋白质翻译后修饰，最早于2019年通过肽免疫沉淀与HPLC-MS/MS分析相结合被鉴定。这种修饰最早被发现与癌细胞和巨噬细胞中通过表观遗传调节对基因转录的调节有关。乳酸化的发现为理解Warburg效应的功能意义提供了一条新途径，因为乳酸是这种修饰的关键驱动因素。随后的研究表明，乳酸化发生在多种蛋白质上，包括组蛋白和非组蛋白，并且与不同的生理和病理背景有关。本文讨论了癌症乳酸化研究中当前的主要发现和未解决的问题，并进一步提出了潜在的策略来证实这种修饰的功能研究。 高乳酸水平驱动乳酸化 乳酸化发生在蛋白质的赖氨酸残基，包括组蛋白和非组蛋白。迄今为止，已在各种癌细胞中鉴定出1000多种乳酸化蛋白。乳酸化的主要驱动因素是乳酸，乳酸水平升高（在癌细胞中观察到的10至 30 mM）是乳酸化形成所必需的。这表明任何影响糖酵解的因素，特别是乳酸脱氢酶A（LDHA）的活性，都可以调节乳酸化水平。 然而，尽管乳酸浓度高，但发生乳酸化的蛋白质比例相对较低，在总靶蛋白库中观察到的乳酸化不到 ∼10%。这表明由于非经典酶活性，乳酸化可能发生效率低下。作为一种手性化合物，赖氨酸 L-乳酸化和 D-乳酸化均已被鉴定。然而，赖氨酸 L-乳酸化是体内的主要异构体 ，因为 D-乳酸化是由涉及乳酸谷胱甘肽的非酶促过程产生的，仅在乙二醛酶系统受损时观察到。 参与乳酸化的底物和酶 基于乳酸化与与组蛋白乙酰化的相似性，乳酸-CoA被认为是乳酸化的底物。 支持乳酸-CoA作为底物的证据包括两个关键观察结果： （1）乳酸-CoA水平与乳酸化呈正相关 （2）组蛋白乙酰转移酶p300在体外使用乳酸-CoA进行乳酸化修饰。 然而，乳酸辅酶 A 的酶源仍然未知（图1）。值得注意的是，癌细胞中乳酸-CoA的内源性水平极低，约为0.011 pmol/106个细胞，比哺乳动物细胞中的乙酸-CoA水平低约1,000倍。 丙氨酸-tRNA合成酶AARS1和AARS2充当乳酸传感器和乳酸转移酶，可使多种蛋白质（包括p53、YAP和线粒体蛋白质）乳酸化。然而，与乙酰转移酶不同，AARS1直接使用乳酸作为底物，而不是乳酸-CoA。乳酸与人AARS1结合的Kd 值范围为2-35 μM，而癌细胞中的乳酸浓度可以达到10-30 mM，因此AARS1很可能在体内介导乳酸化中起主要作用。一些脱乙酰酶，如HDAC1-3和SIRT1-3，具有去乳酸化活性。然而，这些酶的主要功能是脱乙酰化，它们并不是乳酸化所特有的。 图1. 参与乳酸化的酶和底物 乳酸化的生物学意义：基因转录和蛋白质功能 据报道的乳酸化功能可以根据修饰是发生在组蛋白还是非组蛋白中来大致分类。组蛋白乳酸化被认为通过表观遗传机制调节基因转录，然而目前还不清楚组蛋白乳酸化是否普遍抑制或增强基因表达。此外，虽然已经报道了组蛋白乳酸化的潜在writer和eraser，但相应的reader仍然未知。 非组蛋白乳酸化被认为可以增强或抑制这些蛋白质的功能。例如，AARS1感知乳酸并转位到细胞核中以乳酸化YAP，维持其核定位并促进YAP激活；AARS1 介导的p53乳酸化抑制其相分离、DNA结合和转录激活，从而促进肿瘤发生。乳酸化也通过促进癌症中的 DNA 修复与化疗耐药有关。例如，负责维持基因组稳定性的MRE11-RAD50-NBS1（MRN）复合物的关键组分MRE11和NBS1都能发生乳酸化，对于复合物的形成和随后的DNA修复至关重要。 图2. 乳酸化促进肿瘤发生和化疗耐药的机制总结 明确乳酸化生物学功能面临的挑战 乳酸化的特异性和效率较低 首先，蛋白质乳酸化比例较低，使得很难区分乳酸化是起主要调节作用还是仅仅是其他代谢过程的次要结果。其次，目前尚不清楚乳酸化和去乳酸化是由少数特定酶还是更广泛的酶介导。第三，用于研究乳酸化的分析可能无法准确反映体内环境的条件，例如，一些研究中使用的乳酸-CoA浓度远高于细胞中通常发现的浓度，这可能会扭曲结果并导致高估乳酸化在细胞过程中的作用。 缺乏操纵乳酸化的特异性工具 研究乳酸化的常用方法及其局限性如下： （1）赖氨酸残基上乳基化位点点突变可能会改变蛋白质的内在特性并消除同一位点的其他PTM，尤其是乙酰化； （2）乳酸补充或LDHA抑制，可广泛影响乳酸化以外的细胞过程，例如氧化还原平衡和免疫逃避/抑制； （3）抑制糖酵解的上游调节因子，这可能导致比LDHA 抑制更广泛的副作用； （4）具有吡咯赖氨酰-tRNA合成酶的正交翻译系统，这是位点特异性乳酸化的强大工具，其局限性是乳酸化水平无法精确控制，无法反映真实的病理生理条件。 图3. 乳酸化功能研究的注意事项 验证乳酸化真实功能的研究策略 为了阐明乳酸化的真正功能，开发能够在病理生理条件下精确和特异性地专门操纵乳酸化水平的不同方法至关重要。 （1）具有吡咯赖氨酰-tRNA 合成酶的诱导型正交翻译系统以剂量依赖性方式选择性提高乳酸化水平。 （2）使用AARS1变体的敲入模型特异性抑制乳酸化形成。 小结 尽管乳酸化具有潜在的重要性，但证明其与特定表型之间存在因果关系的明确证据仍有待进一步阐明。因此，开发能够精确、特异性地操纵病理生理条件下乳酸化水平的方法将更清楚地了解乳酸化在癌症中的作用。

引言 DNA 修复和自噬是维持细胞生存的两个关键生物学过程。DNA修复负责修复DNA损伤，确保基因组稳定；而自噬则负责清除细胞内多余的、受损的、错误折叠或聚集的蛋白质和细胞器，维持细胞稳态。拓扑异构酶 I (TOP1) 在DNA复制和转录中起着至关重要的作用，它通过切断DNA形成超螺旋结构，释放扭转应力。然而，TOP1与DNA形成的共价键——TOP1cc是一种有害的DNA损伤，会导致基因组不稳定和细胞死亡。TOP1cc修复主要依赖于酪氨酸DNA磷酸二酯酶 1 (TDP1) 介导的切除修复或MRE11核酶介导的DNA切割和切除修复【1】。然而，TOP1cc的修复过程与蛋白质降解途径的关系尚不清楚。自噬因子在DNA复制叉附近富集，表明自噬可能在DNA损伤修复中发挥作用。TEX264是一种保守的蛋白质，既是自噬受体，也与TOP1cc修复有关【2】。然而，TEX264是否通过自噬介导TOP1cc修复，目前尚不清楚。 近日，来自英国牛津大学拉德克利夫医院的Kristijan Ramadan研究团队在Cell杂志上发表题为TEX264 drives selective autophagy of DNA lesions to promote DNA repair and cell survival的研究论文，该研究发现了TEX264介导的核吞噬作用在维持基因组稳定性和细胞存活中发挥关键作用。 首先通过免疫共沉淀和蛋白质组学分析，研究人员发现自噬相关蛋白（如Beclin-1、TEX264、CHMP7、ATG7、SNAP29）在DNA复制叉处富集，并且这种富集在CPT（诱导DNA复制压力的化合物）处理后被显著增强，这表明自噬可能在响应 DNA 复制压力时发挥作用。接着，研究人员使用LysoIP技术分离溶酶体，并通过质谱分析其蛋白质组成。结果表明，CPT 处理后，许多DNA复制和核蛋白（如DNA聚合酶、MCM复合物蛋白、核孔复合物）被运送到溶酶体，表明溶酶体可能直接参与 DNA 损伤的清除。 进一步，研究人员发现用CPT处理后，TOP1cc水平的恢复受到mTOR抑制剂Torin的促进，而自噬抑制剂ATG7的缺失则完全阻止了TOP1cc的修复，证明自噬是TOP1cc修复的关键途径。其他自噬相关蛋白，如syntaxin 17和RB1CC1，也参与了TOP1cc的降解和细胞对CPT的存活，说明自噬修复TOP1cc的过程是一个复杂的网络，涉及多个自噬相关蛋白。使用mCherry-TOP1-GFP报告系统证实了TOP1在低剂量CPT处理后进入溶酶体，表明 TOP1cc可以直接被溶酶体降解。 通过分析γ-H2AX 和53BP1的定位，研究人员发现低剂量CPT诱导的DNA损伤主要表现为复制压力，而不是DNA 双链断裂。此外，研究人员发现ATR抑制剂VE-822强烈抑制了TOP1cc的运送，而ATM抑制剂KU-55933没有影响，这表明ATR在响应DNA复制压力和促进 TOP1cc 降解中起着关键作用。自噬抑制剂ATG7和syntaxin 17的缺失加剧了低剂量 CPT 处理后蛋白质聚集物的形成，说明自噬在防止蛋白质聚集物形成中发挥作用。 最后，研究人员发现MRE11核酶的缺失强烈抑制了TOP1cc的运送，而MUS81和TDP1的缺失没有影响，表明MRE11核酶在将TOP1cc从核内运送到溶酶体中起着关键作用。使用 LysoIP-Seq技术分离溶酶体中的DNA片段，并通过测序分析其序列特征。结果表明，溶酶体中分离的DNA片段主要来自核内 DNA，且大部分来自内含子和着丝粒区域，表明溶酶体可以清除整个TOP1cc损伤，包括其蛋白质部分和相关的DNA片段。使用 TOP1cc 特异性抗体和LysoIP等技术证实了TOP1cc在低剂量CPT处理后在细胞质中的存在。这表明 TOP1cc可以从核内被运送到细胞质，并被溶酶体降解。 图1 TEX264驱动的选择性自噬促进DNA修复和细胞存活（Credit: Cell） 总之，这项研究证明了选择性自噬在DNA修复中的进化保守作用，并表明它对维持基因组稳定性和细胞存活至关重要。此外，该发现还表明，在治疗结直肠癌患者时， TEX264的表达水平与对伊立替康等TOP1抑制剂的化疗反应相关。 参考文献 1. Pommier, Y. (2006). Topoisomerase I inhibitors: camptothecins and beyond. Nat. Rev. Cancer 6, 789–802. https://doi-org.libproxy1.nus.edu.sg/10.1038/nrc1977.7. Stingele, J., Bellelli, R., and Boulton, S.J. (2017). Mechanisms of DNA–protein crosslink repair. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 18, 563–573. 2. Fielden, J., Wiseman, K., Torrecilla, I., Li, S., Hume, S., Chiang, S.-C., Ruggiano, A., Narayan Singh, A., Freire, R., Hassanieh, S., et al. (2020). TEX264 coordinates p97- and SPRTN-mediated resolution of topoisomerase 1-DNA adducts. Nat. Commun. 11, 1274. https://www-cell-com.libproxy1.nus.edu.sg/cell/fulltext/S0092-8674(24)00911-5 责编|探索君 排版|探索君 文章来源|“BioArt” End 往期精选 围观 一文读透细胞死亡(Cell Death) | 24年Cell重磅综述（长文收藏版） 热文 Cell | 是什么决定了细胞的大小？ 热文 Nature | 2024年值得关注的七项技术 热文 Nature | 自身免疫性疾病能被治愈吗？科学家们终于看到了希望 热文 CRISPR技术进化史 | 24年Cell综述

▎药明康德内容团队编辑   一百多年前，著名生理学家Otto Warburg医生与同事最早观察到，肿瘤细胞有特殊的能量获取方式。即使在氧气充足的条件下，它们也更喜欢通过糖酵解途径代谢葡萄糖，而不像正常细胞那样选择更有效率的线粒体氧化磷酸化。这一现象被称为Warburg效应，Warburg医生也因此获得了1931年的诺贝尔生理学或医学奖。 由于这种特殊的代谢机制，肿瘤对葡萄糖的消耗速度很大，导致糖酵解的代谢产物——乳酸在肿瘤内大量积累，造就了酸性环境。此前曾有研究发现，乳酸是癌细胞的重要“帮凶”，通过促进特定蛋白的乳酸化，影响DNA损伤修复，帮助癌细胞躲避化疗药物。 图片来源：123RF 在一篇近日发表于权威学术期刊《自然》的研究论文中，中山大学附属第七医院（深圳）何裕隆教授、张常华教授团队联合中山大学孙逸仙纪念医院、英国癌症研究院合作发现，乳酸通过增强NBS1蛋白的乳酸化修饰，对于肿瘤的DNA损伤修复和化疗耐药起到了关键作用。基于这一发现，研究团队找到了一款“老药”司替戊醇（stiripentol），可以通过抑制乳酸的产生，逆转肿瘤对化疗药物的抵抗，为癌症治疗提供了一种新策略。 为了确认乳酸对于肿瘤抵抗化疗的影响，研究团队首先通过蛋白质组学和代谢组学分析了一组新辅助化疗胃癌肿瘤组织样本。相比对化疗敏感的肿瘤，耐药肿瘤组织中的乳酸水平显著上升。而来自动物模型和类器官模型的实验也进一步证实，乳酸会降低化疗的抗肿瘤效果，促进荷瘤小鼠的化疗耐药。 进一步分析发现，乳酸显著增强了DNA同源重组修复（HRR）。肿瘤细胞在经受化疗造成DNA损伤后，乳酸能快速修复受损的DNA，从而降低治疗效果，导致耐药发生。 ▲乳酸增强肿瘤细胞DNA修复和肿瘤化疗耐药（图片来源：参考资料[1]） 那么，乳酸是如何起作用的呢？实验发现，乳酸化修饰在化疗耐药肿瘤细胞系及化疗耐药患者肿瘤组织样本中显著上调。因此，研究团队随后使用4D-无标记乳酸化修饰蛋白质组学分析，筛选出了乳酸化修饰调控的一个关键底物蛋白：NBS1。 NBS1的全称是奈梅亨断裂综合征蛋白1（Nijmegen breakage syndrome protein 1）。先前的研究发现，编码该蛋白的基因发生突变可导致一种以染色质不稳定为特征的Nijmegen断裂综合征，主要表现为生长迟缓、智力障碍、免疫缺陷、细胞周期检查点缺失、癌症风险增加以及对电离辐射敏感等。而正常情况下，NBS1蛋白可与MRE11和RAD50蛋白形成一个复合物，即MRE11-RAD50-NBS1（MRN），在DNA复制和DNA双链断裂的修复等过程中起重要作用，主要包括DNA双链断裂部位的识别和启动HRR。 此次研究中，乳酸化修饰质谱提示NBS1蛋白存在乳酸化修饰，且NBS1蛋白乳酸化修饰在耐药的肿瘤细胞系中显著上调，乳酸可进一步增强NBS1蛋白的乳酸化修饰。 通过一系列生化实验，研究团队详细揭示了NBS1乳酸化修饰的动态调控机制。作者关键鉴定并验证出，NBS1蛋白上的乳酸化修饰位点位于第388位赖氨酸（K388），而与NBS1蛋白存在直接相互作用的乙酰基转移酶TIP60蛋白，正是NBS1的乳酸化酶，导致NBS1蛋白的乳酸化修饰。相反，组蛋白去乙酰化酶HDAC3被确定为NBS1的去乳酸化酶，通过与NBS1的相互作用去除乳酸化修饰，抑制其乳酸化水平。随后的基因编辑和体外实验证实了上述发现。 ▲乳酸诱导NBS1 K388乳酸化，TIP60介导NBS1 K388乳酸化（图片来源：参考资料[1]） 研究表明，K388乳酸化对于NBS1在DNA损伤修复中的功能至关重要。因为K388乳酸化修饰改变了NBS1蛋白构象，使之能够更有效地招募和组装MRN复合体，并促进HRR蛋白在DNA双链断裂部位募集，导致放化疗抵抗。 确认了乳酸如何影响肿瘤对化疗的反应外，另一方面研究团队还确认了肿瘤细胞内的乳酸来源。既往研究表明，肿瘤细胞中的乳酸主要有两个来源：一是细胞内产生，由肿瘤细胞中的乳酸脱氢酶（LDHA）产生乳酸；而是摄取自细胞外，由定位于肿瘤细胞膜的单羧基转运蛋白MCT1将肿瘤微环境中的乳酸摄取进入细胞内。 而在此次研究中，作者发现肿瘤耐药细胞中的乳酸主要通过LDHA在细胞内代谢产生。对于NBS1乳酸化修饰促进DNA损伤修复及化疗抵抗，导致临床预后不良，LDHA是这一过程的关键酶。 ▲Warburg效应介导的肿瘤耐药机制机制示意图（图片来源：参考资料[1]） 根据上述新发现的分子机制，研究团队提出了抗癌疗法的一种新思路：靶向LDHA抑制乳酸产生，降低NBS1的乳酸化修饰水平，从而破坏肿瘤细胞的DNA修复机制，最终逆转肿瘤化疗抵抗。 令人兴奋的是，一种已被欧洲药品管理局批准用于治疗癫痫的药物，司替戊醇（stiripentol），是已有深入研究的一种LDHA抑制剂。 研究团队测试后发现，司替戊醇可阻断胃癌细胞乳酸的产生，抑制NBS1 K388的乳酸化修饰，从而降低DNA修复效率并克服肿瘤放化疗耐药性。在肿瘤患者来源的类器官和异种移植模型中，司替戊醇与化疗药物顺铂或放疗联合使用，表现出高度协同效应，削弱肿瘤细胞的DNA修复能力并提高放化疗的效果，显著抑制肿瘤生长并延长小鼠的生存期。 ▲司替戊醇克服肿瘤的放化疗耐药、新辅助化疗耐药肿瘤中LDHA和NBS1 K388乳酸化水平升高（图片来源：参考资料[1]） 这些发现不仅揭示了乳酸在肿瘤代谢中的重要角色，定义了乳酸化作为抗肿瘤耐药的新靶点，更为临床治疗提供了新的方向，首次发现了可阻断DNA损伤修复的靶向药物司替戊醇。 尤其值得关注的是，作为已在临床上广泛应用的一种老药，司替戊醇的安全性和药效已得到验证，这意味着将司替戊醇用于肿瘤耐药的临床研究有望迅速得到应用。研究团队透露，目前已经申请了司替戊醇的肿瘤治疗专利，并启动了相关临床研究，招募患者进行临床试验：司替戊醇联合免疫靶向化疗用于常规治疗无效的腹膜转移癌患者单臂前瞻性2期临床试验（注册号：ChicTR2400083649）。如果试验成功，这将为癌症治疗带来革命性的变化，极大地提高放化疗的成功率，造福广大肿瘤耐药患者。 张常华教授、尹东教授、Axel Behrens教授、何裕隆教授是本文的共同通讯作者，陈恒星博士、李贇博士、李华福博士是共同第一作者。本研究得到了以下项目的资助：国家重点研发计划、国家自然科学基金，中国博士后科学基金，中国国家博士后创新人才支持计划，广东省科技厅广东省消化系统肿瘤重点实验室，深圳市“三名工程”，深圳市重点学科建设基金，深圳市可持续发展项目，深圳基础研究项目，以及粤港澳联合研究计划。 参考资料： [1] Hengxing Chen et al., NBS1 lactylation is required for efficient DNA repair and chemotherapy resistance. Nature (2024) Doi: https://doi-org.libproxy1.nus.edu.sg/10.1038/s41586-024-07620-9 本文来自药明康德内容微信团队，欢迎转发到朋友圈，谢绝转载到其他平台。如有开设白名单需求，请在“学术经纬”公众号主页回复“转载”获取转载须知。其他合作需求，请联系wuxi_media@wuxiapptec.com。 免责声明：药明康德内容团队专注介绍全球生物医药健康研究进展。本文仅作信息交流之目的，文中观点不代表药明康德立场，亦不代表药明康德支持或反对文中观点。本文也不是治疗方案推荐。如需获得治疗方案指导，请前往正规医院就诊。