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摘要：在自然和临床样本中检测病毒是研究和诊断中的一个复杂问题。存在不同的病毒分离和鉴定方法，包括PCR、CRISPR/Cas技术、NGS、免疫分析和基于细胞的检测。随着基因工程方法的发展，利用细胞培养的方法已成为有用且信息丰富的手段。分子生物学方法可以提高细胞培养对特定病毒的敏感性和特异性，并可用于生成报告基因细胞系。这些细胞系在病毒感染后表达特定的报告蛋白（例如，GFP、荧光素酶和CAT），可以在实验室环境中被检测。基因组编辑和合成生物学方法的发展为设计细胞培养中的病毒报告系统提供了新的视角。本综述旨在描述病毒学方法的一般情况以及目前存在的基于细胞的方法的开发实例。 1.引言 病毒是人类群体中许多疾病的病因，其中一些疾病可能导致流行病和大流行。为了防止这类事件，需要从患者和自然样本中快速检测出分离的病原体，以及研究分离物的属性。目前，有几种病毒检测方法。与PCR、CRISPR/Cas技术、NGS（下一代测序）、免疫分析和基于细胞的检测方法相关的检测方法（表1）。所有这些方法都有优点和局限性，必须用于解决特定问题，以便全面研究病毒。有些方法只允许检测病毒核酸或蛋白质，而其他方法允许检测活病毒颗粒，并且可以用来确定感染的剂量和时间以及生命周期的机制。最广泛使用的病毒检测方法是基于病毒基因组材料的扩增。除了基于PCR的检测外，还有基于扩增的其他方法（例如，SDA—链置换扩增，NASBA—基于核酸序列的扩增，3SR—自我维持序列复制，以及LAMP—环介导的等温扩增）。这些方法不仅可以在研究中应用，也可以在临床检测中应用。这些方法允许直接检测病毒DNA，但在病毒RNA的情况下，PCR之前必须进行反转录。基于PCR的方法由于扩增而足够敏感，允许检测样本中的少量分子。然而，一些作者指出，基于PCR的方法在检测某些病毒（如人类肠道病毒）方面的灵敏度低于基于细胞的方法。此外，使用基于PCR的方法可能与假阳性结果有关。此外，基于PCR的方法只允许检测病毒基因组而不是活病毒。然而，目前正在开发与下一代测序相关的改进病毒检测方法。这些方法主要被用来检测纯化和浓缩的病毒（即来自细胞培养），使用这种方法在临床样本中检测病毒的问题是病毒与宿主基因组的比例不足。为了解决这个问题，通过详细比较现代方法来纯化和富集临床材料中的病毒颗粒，设计了一种可以有效增加病毒基因组相对于宿主基因组数量的方法。这导致测序样品准备成本的降低以及随后生物信息学分析的改进。CRISPR-Dx病毒检测方法基于导向性内切酶：CRISPR相关蛋白（Cas）。这种方法使用Cas13家族的蛋白质，它们对RNA表现出“附带的”，非特异性的切割活性。考虑到这种效果，建立了一种名为SHERLOCK（特异性高灵敏度酶报告解锁）的方法。这种具有高灵敏度的核酸检测工具涉及病毒基因组材料的扩增和Cas13蛋白间接切割荧光标记的RNA探针，允许样本中病毒材料的定量。这种方法的灵敏度来自于即使是生物材料中微量的病毒核酸也经过重组酶聚合酶扩增（RPA），对于RNA病毒检测，还有一个额外的反转录步骤。然后使用DNA依赖性RNA聚合酶T7将放大的病毒DNA副本转换回RNA。此后，使用gRNA，Cas13蛋白识别病毒核苷酸序列，导致标记的核苷酸的附带切割，从而允许定量确定样本中的病毒含量。这个方向系统正在不断发展，以提高其灵敏度并改善登革热病毒或寨卡病毒（ZIKV）的检测。另一种流行的病毒检测方法是使用基于抗原的检测。这种方法既可以在研究中使用，也可以在临床诊断中使用。使用针对病毒的抗体的标准方法包括病毒中和试验、血凝抑制、补体固定和间接免疫荧光。这些方法仅用于诊断已知病毒，其衣壳结构已被研究。使用终点稀释分析评估病毒滴度是基于细胞培养上清的血凝试验。然而，正如观察到的流感病毒由于病毒基因组编码血凝素的序列中突变的快速积累导致氨基酸替代，使用这种方法研究病毒的抗原特性是复杂的。这种方法应用的一个问题是病毒在标准细胞系中的复制能力较差，例如MDCK细胞。也许这种检测将随着新敏感系的使用而得到改进。在这方面，使用基于检测病毒核蛋白的基于抗原的检测来改进病毒循环的监测将有助于测量临床样本中的病毒滴度。已经为IgG（免疫球蛋白G）和IgM（免疫球蛋白M）蛋白开发了这种技术，允许监测人群中的疾病。在与黄病毒相关的疾病的情况下，IgM通常在疾病表现后的几天内产生，并且通常可以在几个月内检测到。然而，在黄病毒感染的情况下，抗体的交叉反应是可能的。此外，IgG在IgM抗体发展后的几天内被检测到，并且可以检测到几个月。使用这种方法，已经提供了许多病毒的检测方法，例如ZIKV和戊型肝炎病毒。有一组使用细胞培养检测活病毒的方法。这些方法的斑点检测始于1950年。与细胞培养相关的病毒检测方法已经开发出来，并显示出巨大的潜力，因为它们提供了许多优点。使用这些方法，不仅可以确定病毒颗粒的存在，还可以表征病毒属性，这在开发新病毒引起的疾病的治疗方法时极为重要。此外，从细胞培养中获得的病毒颗粒可以通过电子显微镜进行研究，以检查病毒形态。所有使用细胞培养识别和研究病毒的方法可以分为两类。第一种方法利用病毒感染的细胞病变效应（CPE），这意味着细胞在病毒释放后死亡，可以在显微镜下检测和定量。然而，基于CPE的方法繁琐且灵敏度低，无法检测非细胞病变性病毒。可以使用不同的细胞系进行病毒检测，例如NSK、MDCK、UMNSAH/DF1、BS-C-1、Vero、A549、HEK293或HeLa细胞，它们可以作为培养和检测具有不同效率和特异性的病毒的基质。第二种方法与产生报告细胞系有关，其中特定细胞被修改以在病毒感染时产生报告蛋白。这种报告器的特性应该非常特定于病毒，以允许研究人员特别检测感兴趣的病毒。在病毒感染的情况下，病毒蛋白识别报告结构作为病毒基因组或具有特定切割位点的嵌合蛋白，从而产生可量化的信号，研究人员可以检测到。根据它们的基因组结构和生命周期，不同病毒的检测有不同的原理。一些RNA病毒的载体中的病毒结构的转激活可以通过病毒感染、蛋白质的切割和病毒蛋白酶释放报告器来发生，具有核复制周期的负链RNA病毒可以被minigenome模拟病毒检测。 总之，基于细胞的方法是当前可用的病毒检测和表征方法的重要类别之一。这些策略都有优缺点，这些在本节中进行了描述，但主要的区别特征是，基于细胞的方法可以用来分离和研究活的病毒颗粒；然而，在应用这些方法时存在一个问题，与细胞培养中的低敏感性（病毒进入细胞的能力）和许可性（病毒在细胞中复制的能力）有关。由于细胞系的这两个属性共同促进了细胞方法的发展，除非报告中提到了具体差异，否则它们通常可以统称为“灵敏度”。为了解决这个问题，正在开发新的方法。细胞系对特定病毒的敏感性取决于病毒附着在细胞膜受体上以及与细胞抗病毒反应相关的宿主基因。现代分子生物学方法已经允许开发遗传修饰的细胞，这些细胞增加了病毒的产生。本综述旨在描述一般的病毒学方法和今天使用的基于细胞的方法的具体发展示例。 2.CPE检测和敏感细胞系 为了提高活病毒颗粒研究方法的灵敏度，正在开发提高细胞培养灵敏度的技术。为了研究病毒的生物学特性，例如决定它们宿主物种特异性和增殖率的因素，以及产生活病毒颗粒，需要允许病毒传播的细胞系。病毒的一个基本特性是其进入细胞并产生病毒后代的能力。病毒复制后是宿主细胞的形态和生化变化，最终导致细胞破坏。根据病毒种类，这些变化有几种形式，例如合胞体形成、细胞变圆或细胞溶解。这种可见的细胞变化通常称为细胞病变效应。基于这一特性，开发了许多病毒感染性测定方法（例如，组织培养感染剂量（TCID50）、半数致死剂量（LD50）、痘和斑点测定），以及其他生物/化学测定方法（例如，检测血吸附、血凝和总蛋白）和通过电子显微镜直接计数病毒颗粒。在病毒研究技术的发展中，胚鸡卵（ECE）方法是细胞基础病毒研究技术的替代品。对于一些病毒，ECE仍然经常用于病毒分离。尽管ECE可以支持各种流感病毒分离株的生长，但它们有几个限制，这些限制与胚胎中连续繁殖可能导致血凝素糖蛋白的改变有关，这导致产生与原始分离株不同的卵适应病毒。研究通过血凝试验比较这两种方法，比较不同的细胞系，并使用关于CPE和TCID50/mL的信息。注意到低致病性禽流感病毒在所有细胞系中的复制效率都低于胚胎。然而，作者强调，使用MDCK、CEK和CEF等细胞系可以节省时间和资源，因为它允许处理更多的样本量，尽管病毒复制效率较低，但可能仍然有益。现在，使用CPE作为主要工具之一的细胞方法也已经应用于其他类型的病毒。例如，这种方法被用来研究与天花病毒在系统发育上密切相关的马铃薯痘病毒。使用这种方法可以区分马铃薯痘病毒和密切相关的鼠疫和牛痘病毒，因为它们在细胞病变效应上的差异。此外，基于细胞的方法也被用来研究几种ZIKV分离株之间的差异。在这些研究中，Vero细胞系上的细胞病变效应被用来估计感染滴度，作为研究病毒株的一种方法。发现两种寨卡病毒分离株，NR-50244和NR-50241，可以有效感染HEK293细胞，这很快导致明显的CPE和细胞普遍溶解。现代方法不仅可以寻找特定的细胞系，还可以确定观察到的效应背后的机制，这与不同的细胞受体有关。因此，进行了系统研究ZIKV对各种细胞系的趋向性等研究。ZIKV已被证明对来自不同组织（如肌肉、胎盘和肝脏）的七种以上细胞系具有趋向性。广泛的趋向性可以通过潜在的ZIKV受体在各种器官中的广泛分布来解释。以前曾显示，在人类上皮细胞系中，这种病毒积极复制，导致IFN-β（干扰素β）的抗病毒效应。这些研究报告了一系列有用的细胞系，用于在病毒学实验室中培养ZIKV。从所有上述方法中，我们可以得出结论，基于CPE的策略在不同病毒的研究中广泛使用。然而，这些方法通常耗时，选择一种对特定类型的病毒敏感且理想选择性的细胞系并不总是容易的。此外，提高细胞培养的灵敏度对于开发使用报告器结构检测病毒颗粒的方法很重要，这将有助于改进基于细胞的技术。这个问题可以通过两种方式解决。可以增加细胞培养对特定感兴趣病毒的灵敏度，或者创建一种对所有病毒高度敏感的细胞系，以解决与检测来自患者样本的未知病毒代理有关的问题。这个话题仍然相关，因为有时需要使用几种标准细胞系来检测病毒。如果不使用病毒特异性细胞系，则应使用多个细胞系进行病毒检测。例如，在涉及从16个样本中分离呼吸道病毒的实验中，包括流感样本，3个样本仅在Mv1 Lu细胞中显示CPE；3个仅在MDCK细胞中显示CPE；其余样本在两个细胞系中都显示CPE。已经有许多增加细胞培养对某些病毒的敏感性和许可性的示例。获得的细胞系MDCK-SIAT1对人类流感病毒的敏感性高于对禽流感病毒的敏感性。增加参与细胞表面受体合成的酶表达的方法是有希望的，以创建对不同病毒敏感的细胞系。例如，目前还没有适当的系统来传播诺如病毒（HuNoV）。尽管如此，已知HuNoV与位于细胞膜中的组织血型抗原受体相互作用。这些受体的成熟是一个多阶段过程。然而，有证据表明特定的糖基转移酶等酶参与了这些途径。因此，这些酶的过度表达可能会增加细胞培养对诺如病毒的灵敏度。 在另一项与流感病毒有关的研究中，通过对人呼吸道跨膜蛋白酶（TMPRSS2或MSPL）的过度表达来修改MDCK细胞系。在没有胰蛋白酶的情况下，这些细胞支持了基于致病性禽流感病毒的三种重组疫苗的生长。以下作为示例的研究与细胞系对广泛dsDNA基因组病毒—单纯疱疹病毒（HSV）的增加许可性有关。最早生产的敏感细胞系之一用于HSV检测。为了细胞转染，产生了包含病毒反激活蛋白VP16（称为α-TIF或Vmw65）与Moloney白血病病毒的长末端重复（LTR）序列的构建物。VP16的产生使细胞对HSV更敏感，并增加了病毒产量200倍，这适用于CPE测定。为了创建用于病毒学研究的报告器细胞系，需要增加细胞对病毒的敏感性和病毒基因组在细胞中的复制率。解决了这个问题，就可以生成高分辨率的报告器细胞系，并增加疫苗株的生产。已经证明，使用RNA干扰，减少与免疫反应相关的哺乳动物细胞中某些基因的活性，可以增加EV71（脊髓灰质炎病毒和肠病毒71）的增长高达80倍。发现通过使用CRISPR基因编辑技术敲除EP300（组蛋白乙酰转移酶p300）和ZNF205（锌指蛋白205）等基因，可以增加病毒颗粒的产量。类似的研究描述了通过敲除单个Vero细胞宿主基因实现轮状病毒增长18倍的增加。通过敲除BST-2（骨髓基质抗原2）基因，阻断病毒从细胞中的释放，获得了有希望的结果。一些具有脂质包膜的病毒，如MHV68（小鼠γ疱疹病毒68）、猪流行性腹泻病毒、流感病毒和牛痘病毒的释放，在BST-2基因敲除的动物细胞系中显著增加。这项研究的结果显示，这种方法可以增加许多病毒的生产。许多病毒的复制与细胞破坏有关。例如，腺病毒科的成员通过p53非依赖机制启动细胞死亡。在这方面，增加细胞培养的灵敏度的一个有趣的方法是生成抗凋亡的细胞培养。凋亡是一个多组分机制，涉及半胱氨酸蛋白酶或AIF1（同种异体炎症因子1）在半胱氨酸蛋白酶非依赖途径中。敲除所有这些基因是必要的，以抑制这种机制。这个问题通过CRISPR/Cas9技术解决了，其中使用了几个sgRNA，导致这些基因从HEK293T细胞系中移除。进一步的分析表明，携带促凋亡蛋白的病毒颗粒比在标准细胞系中更有效地产生。可以得出结论，细胞培养后的病毒分离和CPE测定是生物样本中病毒鉴定最常用的方法，提高细胞培养灵敏度的现代方法非常有希望。然而，值得讨论的是这种方法目前存在的不足。基于CPE的斑点形成单位（PFUs）的定量是量化不同病毒水平的广泛方法，但这种方法是费力的；例如，大多数病毒家族需要长时间的复制（长达一周），细胞培养在特定条件下进行（湿度、介质的pH值）。此外，病毒的培养需要在处理病原体时采取某些安全预防措施。此外，大多数标准病毒检测协议包括在感染后几天的细胞固定免疫染色。此外，这种方法基于使用合适的细胞系和应用其他病毒检测方法，例如使用抗体检测病毒。由于样本中病毒颗粒计数通常很低，抗原检测抗体并不总是可用的，隔离和生产病毒颗粒需要多次尝试，并且需要开发对病毒感染具有增加灵敏度的细胞系。因此，这种方法不提供快速结果。此外，一些病毒（即拉沙病毒）显示出非常低的PFU值，因此CPE方法的应用无用。即使在广泛的细胞系中相对容易生长的病毒也可能耗时且昂贵。 3.报告器细胞系 为了使基于细胞培养的方法更简单、更具信息性和更方便，已经开发了报告器细胞系。报告器细胞系包括在病毒感染后产生报告蛋白的特定细胞。报告器应对感兴趣的病毒非常特定，以允许研究人员检测特定病毒。病毒感染后，病毒蛋白识别报告构建物作为病毒基因组或嵌合蛋白，并产生可检测的信号。报告器细胞系对病毒学研究和疫苗制造非常有用。尽管基于报告器的方法可能需要生长活病原体病毒，因此限于具有特定生物安全级别的实验室，但它们易于扩大规模，比标准病毒学方法劳动强度小，从而大大增加了传染性病毒的检测。这种方法导致了快速、客观的病毒定量研究，包括评估病毒滴度、抗病毒敏感性和中和滴度。使用报告器细胞系与传统基于活病毒的方法相比具有几个相当大的优势。首先，该方法比其他基于活病毒的方法更快。在这种方法中，不需要耗时的培养和免疫染色技术，结果可以在12-48小时内获得。另一个优势是报告器细胞系可以检测少量感染的细胞。例如，显示水痘-带状疱疹病毒荧光素酶活性的报告器细胞系可用于检测每个样本少于10个感染的细胞。报告构建物的关键特征是报告基因。荧光蛋白和酶如β-半乳糖苷酶或荧光素酶可以作为报告基因。值得注意的是，根据它们的基因组结构和生命周期，用于检测不同病毒家族的报告活性的研究中使用了各种元素。在宿主核中复制的负链RNA病毒（正黏病毒，丝状病毒）已使用称为minigenome的构建物进行检测。具有（+）RNA基因组的病毒（阿尔法病毒或丙型肝炎病毒）的报告系统也涉及可以被病毒蛋白识别的minigenome构建物。然而，这组病毒使用了不同的方法。一些具有RNA（+）基因组的病毒（黄病毒和小肠病毒）编码一个包含结构和非结构蛋白的大多肽。这个多肽通过宿主和病毒蛋白酶进一步加工成单个蛋白。当报告器在病毒蛋白酶切割肽的特定位点时被激活，可以检测到病毒感染。逆转录病毒和具有DNA基因组的病毒（疱疹病毒）可以通过带有病毒启动子调节的报告构建物的质粒稳定细胞转染来检测。报告盒的转录是由病毒进入启动的。下面，我们将考虑一些目前在病毒学中用于检测不同病毒家族的报告器细胞系的发展。这些研究可以为基于先前表征的属于同一类别的病毒的报告构建物组装方法的相似性，为新型病毒的检测系统的发展提供基础。 3.1.用于ssRNA(-)基因组病毒检测的报告器细胞系 3.1.1.正黏病毒科，流感病毒 流感A和B是广泛传播的病毒，负责人类年度流行病，并与巨大的经济损失有关。流感根据其神经氨酸酶和血凝素类型分为不同的亚型和株。在生物样本中准确和快速地检测这些病毒对于病毒感染诊断和疫苗制造至关重要。报告器细胞系概念首次应用于流感病毒。几年后，李等人为流感A和B病毒开发了报告盒。流感病毒激活的报告器细胞系技术用于研究包括生成一个可以在病毒复制响应中产生任何信号的报告系统。流感A和B病毒的基因组分为八个片段。在感染期间，病毒聚合酶复合体的蛋白和NP核蛋白参与产生RNA(+)链和病毒基因组复制。为了激活这些过程，需要顺式作用元素，这些元素是非翻译的保守区域，在基因组流感病毒RNA序列的末端（50 -和30 -UTR）。用于细胞中的流感病毒A的报告构建物包含位于NP基因组片段的50 -和30 -UTR之间的荧光素酶或GFP（绿色荧光蛋白）编码区域。该构建物克隆到质粒DNA（pDNA）中，并由聚合酶I启动子和终止子元件驱动，生成RNA在50 -或30 -末端没有额外的核苷酸。线性化的pDNA整合到宿主细胞基因组中（图1）。这个构建物在感染期间模仿病毒基因组片段，报告基因表达是使用病毒聚合酶复合体实现的。通过类似方法生成了流感B病毒的报告系统。从HEK293T、BHK-21和MDCK细胞中获得了报告器细胞系。使用一组呼吸道病毒，评估了报告蛋白的激活特异性。特异性诱导很高，流感A和B病毒之间有轻微的交叉激活。尽管在报告器细胞系和MDCK细胞中确定的TCID50相似，但报告器细胞系在获得结果的时间减少（从六天到两天）、增强的客观性和减少繁琐的实验程序方面有明显的优势。这些报告器细胞系已成功用于抗体中和和抗病毒敏感性实验。 图1. 用于ssRNA（-）基因组病毒检测的分子报告器系统。报告器系统的原理基于不带有帽子和polyA尾的mRNA的产生。这样的RNA模仿病毒基因组。核糖酶水解RNA或RNA聚合酶I启动子。这个转录物模仿（-）病毒RNA，允许它使用病毒蛋白进行复制。报告蛋白的转录发生在以这种方式获得的（+）RNA上。3.1.2.丝状病毒科，埃博拉病毒 埃博拉病毒是一种丝状病毒，它在中非广泛传播，并在西非和欧洲出现。埃博拉病毒感染以急性发热为特征，死亡率约为50%。如前所述，分子方法非常有用，但结果不允许检测感染性病毒。这使得评估特定病毒分离株的致病性并预测对埃博拉病毒研究非常重要的爆发变得困难。标准基于细胞的方法在埃博拉病毒研究中也存在限制，包括在获得结果之前的14天期限。所有这些特征是开发报告器细胞系的关键先决条件。基于负义minigenome的埃博拉病毒检测的报告器细胞系得到了发展，该minigenome由细胞RNA聚合酶II转录的组成型巨细胞病毒（CMV）启动子调控（图1）。添加锤头核糖酶（对应于核糖酶A的一些修改）使mRNA模仿埃博拉病毒基因组。因此，目标转录物没有帽子或聚腺苷酸化。因此，组装了一个由以下顺序排列的功能组件组成的嵌合minigenome：最小病毒启动子、埃博拉病毒RNA的50-UTR、绿色荧光蛋白序列和病毒RNA的30-UTR。该构建物两侧是两个核糖酶。构建的盒式结构通过PiggiBac转座子整合到VERO-E6细胞系基因组中。minigenome的转录由病毒复制复合体介导，产生报告蛋白。该系统对不同种类的埃博拉病毒有效，不与密切相关的马尔堡病毒发生交叉反应。将这种基于细胞的方法与用于病毒定量的免疫荧光测定法进行比较，表明它们具有相同的效率。此外，测试了临床样本，该测定法在报告细胞中产生了阳性结果。 3.2.用于ssRNA(+)基因组病毒检测的报告器细胞系 3.2.1.甲病毒科，阿尔法病毒 阿尔法病毒亚科包括辛德比斯病毒，它会导致人类严重发热。病毒的非分段基因组由两个功能区域组成。多聚蛋白的直接翻译，随后被病毒蛋白酶进一步加工，从ssRNA(+)的第一部分开始。这些蛋白对晚期蛋白的转录和病毒基因组的复制是必需的。晚期或结构蛋白由ssRNA(-)转录的亚基因组RNA编码。辛德比斯病毒基因组的cDNA克隆是报告器细胞系发展的第一步。报告构建物基于辛德比斯病毒亚基因组RNA的cDNA。报告盒在Rous肉瘤病毒长末端重复（LTR）启动子的控制下，克隆到质粒中，可以在细胞中恒定表达。这个转录物模仿ssRNA(+)，由晚期启动子和萤火虫荧光素酶ORF组成，两侧是病毒顺式作用元素（图2）。当细胞被病毒感染时，产生识别顺式元素的非结构病毒蛋白，合成ssRNA(-)。这个RNA是合成亚基因组RNA的模板。这些过程模仿病毒生命周期阶段。荧光素酶的翻译从人工亚基因组RNA的晚期启动子开始。表达这个报告盒的质粒转移到BHK细胞中，并获得了对G418有抵抗力的稳定转化体。在辛德比斯病毒复制水平高的情况下，报告蛋白活性在长达4小时的时间内被检测到。此外，应注意，荧光素酶测定与CPE测定等效且同样敏感。然而，在感染后26小时检测到荧光素酶活性时，没有观察到CPE。尽管辛德比斯病毒不被认为是严重的人类病原体，其他与阿尔法病毒更密切相关的病毒（东部/西部马脑炎病毒）和更远亲的病毒（风疹病毒）是重要的病原体，并且对于检测这些病原体，开发特定和准确的技术非常感兴趣。报告系统方案基于这些病毒从亚基因组(+)RNA合成结构蛋白作为病毒复制产物的能力。在第一阶段，细胞中会产生模仿病毒(+)RNA的mRNA。在感染期间，(+)RNA被病毒蛋白识别并复制形成(-)RNA副本。在下一步中，这个(-)RNA作为亚基因组(+)RNA转录的模板链；晚期启动子被病毒蛋白激活，可以合成报告蛋白。 图 2. 针对具有亚基因组RNA检测的正义单链RNA病毒的分子报告系统。 3.2.2.甲病毒科，风疹病毒 风疹是一种严重的传染性病毒感染。尽管这种病毒引起的疾病在儿童和成人中大多是轻微的，但在怀孕期间，它可能导致死产或胎儿畸形。因此，当怀疑感染风疹时，需要准确诊断。目前，风疹病原体的诊断基于血清学方法和逆转录PCR（RT-PCR）和基于PCR的方法。然而，由于风疹病毒在细胞培养中没有明显的细胞病变效应，因此在细胞培养中分离活病毒进行进一步研究是一种非常费力的方法。因此，这种病毒的检测方法基于风疹病毒和肠道病毒（例如，柯萨奇病毒，回声病毒的成员）的共感染10天，有明显的CPE。当这些病毒共同培养时，由于风疹病毒诱导的干扰素的产生，细胞病变效应和肠道病毒的复制会减少，这表明宿主细胞中存在这种病原体。已经开发了一种具有特定报告器的风疹病毒细胞系，以便于使用基于细胞的方法进行研究，而无需添加辅助病毒。与其他甲病毒一样，风疹病毒基因组由ssRNA(+)组成，分为两部分。第一部分编码病毒RNA复制所需的早期蛋白，第二部分编码病毒粒子的结构蛋白。报告构建物基于基因工程亚基因组RNA（图2）。这个RNA在非结构蛋白领域有一个600 bp的缺失，以防止在没有野生型病毒的情况下合成报告器。结构蛋白区域被完全替换为报告蛋白（氯霉素乙酰转移酶（CAT）或绿色荧光蛋白（GFP））。ssRNA(-)转录成亚基因组RNA已经在体外合成，并通过转染到VERO细胞系。报告蛋白表达仅在对特定病毒感染有反应时发生。这种方法已经证明对实验室株和临床样本中的病毒都敏感。 3.2.3.黄病毒科，丙型肝炎病毒 丙型肝炎病毒（HCV）引起严重的急性或慢性肝损伤。HCV感染发展为慢性肝炎，与肝细胞癌高度相关。估计有7100万人患有慢性丙型肝炎病毒感染。丙型肝炎在临床样本中使用基于PCR和免疫学方法进行检测，提供足够的诊断精度。然而，为了研究活病毒的性质，需要基于持续细胞系的方法。由于丙型肝炎病毒在标准细胞培养中难以复制，因此开发了基于基因工程构建物和细胞系的各种方法，模拟不同的病毒生命周期阶段。其中一种方法是通过细胞系中的报告盒来响应病毒进入和感染。此外，有必要为HCV研究和抗病毒药物开发研究开发一种新的基于细胞的方法。许多基于HCV的报告系统基于特定的病毒蛋白酶活性。病毒基因组是一个翻译成多聚蛋白的序列。为了处理成熟的病毒蛋白，多聚蛋白被病毒和细胞蛋白酶切割。下面提供了为丙型肝炎病毒开发的双报告系统的描述。由人巨细胞病毒（CMV）启动子驱动的报告构建物由绿色荧光蛋白（GFP）组成，与分泌型碱性磷酸酶（SEAP）通过HCV NS3/4A蛋白酶的NS4A/B连接位点相连。将开发的报告系统传递到肝癌Huh-7细胞和来自Huh-7细胞的Ava5细胞中，使用慢病毒转导。几周后，选择稳定转化体。在病毒感染期间，病毒表达HCV NS3/4A蛋白酶，并将报告蛋白分开，这些蛋白被检测到（图3）。通过荧光检测、磷酸酶活性分析和西方印迹分析确认了这两种蛋白的存在。在其他研究中，SEAP基因被荧光素酶基因替换。 图3. 用于带有基因组多聚蛋白检测的ssRNA(+)基因组病毒的分子报告器系统。报告器系统基于特定病毒蛋白酶在处理原始病毒多聚蛋白以产生最终蛋白中的蛋白酶切割。报告蛋白在病毒蛋白酶的切割位点与病毒蛋白结合，并在感染后释放。 另一种基于细胞的报告器方法涉及构建一个模仿病毒基因组的minigenome，该基因组被NS5B RNA依赖性RNA聚合酶(RdRP)识别，这是抗病毒治疗的共同靶标。报告构建物受CMV启动子控制。报告系统模仿病毒ssRNA(-)，由带有IRES序列的50病毒UTR、30病毒UTR和由核糖酶用于从宿主细胞合成的mRNA切割的反义方向的荧光素酶组成（图4）。在HCV感染期间，NS5B RNA聚合酶识别minigenome构建物中的未加工区域并合成ssRNA(+)，以IRES依赖的方式翻译成荧光素酶蛋白。该系统已转移到BHK-21和Ava5细胞中，并用于评估RdRp活性和研究RdRp抑制剂的有效性。因此，HCV报告细胞系可以成为研究HCV性质和寻找HCV治疗新化合物的有用工具。 图4. 模仿用于丙型肝炎病毒(HCV)检测的基因组的分子报告器系统。携带报告构建物所有元素的mRNA转录后，末端片段被核糖酶自我掐断。这样的mRNA模仿(-)RNA病毒基因组。病毒蛋白在感染期间识别此RNA并复制它。在(+)RNA链上，有一个用于报告蛋白合成的内部核糖体进入位点。 3.2.4.黄病毒科，黄病毒 登革病毒(DENV)和寨卡病毒ZIKV是人类病原体，能够引起大规模爆发。登革病毒感染的机制尚未完全了解。研究ZIKV和DENV感染对细胞过程的影响是必要的，以预测疾病的严重程度并开发针对性和有效的治疗方法。对这些感染的实验室研究存在与其他病毒家族相似的限制。通常使用免疫分析或基于扩增的方法检测DENV感染的细胞反应。例如，已经开发了一种用于感染细胞培养中DENV的免疫染色程序。然而，由于DENV蛋白不在细胞表面暴露，因此需要前固定和渗透细胞以准确检测病毒感染；因此，这种方法不允许观察活细胞中的感染。同样，识别细胞中ZIKV感染的基本方法依赖于带有固定和渗透的免疫染色程序。使用基于扩增的方法和测序的限制与其他病毒相同，不允许我们使用活病毒进行研究。为了实时观察DENV感染，开发了一种基于病毒蛋白酶活性的报告构建物的Vero细胞系。报告系统与丙型肝炎病毒的蛋白酶诱导报告盒高度相似（图3）；然而，报告蛋白通过NS3病毒丝氨酸蛋白酶识别位点与病毒蛋白NS4B的部分连接。所得到的细胞系被四种DENV血清型感染。检测到GFP表达，从而相应地检测到病毒感染的开始。因此，可以使用此报告器在不破坏细胞的情况下检测DENV感染。然而，这种方法存在一个问题：报告细胞系中编码的NS4B片段据报道会影响细胞功能（例如，抑制I型IFN信号）。已经使用了类似的方法来研究ZIKV感染。病毒NS4B蛋白编码序列和病毒蛋白酶切割位点与绿色荧光蛋白在组成型启动子的控制下克隆在同一开放阅读框中。肝细胞癌（Huh7细胞系）和腺癌细胞（A549细胞系）通过表达报告器的慢病毒颗粒进行转导。在生产寨卡病毒的感染细胞中，病毒蛋白酶NS2B和NS3与其切割位点相互作用，可以使用荧光显微镜检测GFP的表达。所描述的报告系统可以检测ZIKV的非洲和亚洲株，但相同的构建物不会被DENV激活。这个系统对ZIKV感染的研究非常重要。 3.2.5.小核糖核酸病毒科，肠病毒 肠病毒是包括许多种类病毒的属，如柯萨奇A和B病毒、回声病毒（肠病毒A和B）、脊髓灰质炎病毒（肠病毒C）和肠病毒68或72。这些病毒是人类病毒病原体中最普遍的。肠病毒是许多严重人类疾病的原因，如无菌性脑膜炎、脑炎、心肌炎、心包炎和手足口病(HFMD)。水环境被肠病毒污染是肠病毒传播的主要原因，因为这种病毒在水中非常稳定，并且感染剂量低。肠病毒感染的大规模爆发使得有必要开发一个快速可靠的病毒监测系统。 传统的肠病毒检测和定量方法基于细胞培养中CPE的观察。然而，这种类型的测定非常费力，不能产生快速结果；因此，它不适用于常规应用。依赖逆转录PCR的分子方法对于检测病毒基因组等价物来说更加快速和准确。这种方法的限制在于它被认为是对病毒传染性能力的间接评估。 基于细胞的报告系统的发展代表了快速实验程序和揭示病毒性质及病毒感染细节的研究之间的折衷。肠病毒以及其他带有ssRNA(+)基因组的病毒产生特定蛋白酶，这些蛋白酶对成熟病毒蛋白的处理是必需的。其中之一是高度选择性和高效性的蛋白酶2A(2Apro)。因此，肠病毒的报告构建物基于使用这种蛋白酶特异性切割融合蛋白（图3）。该系统通过荧光共振能量转移(FRET)使用受体荧光蛋白EYFP(增强型黄色荧光蛋白)和供体ECFP(增强型青色荧光蛋白)之间的相互作用，它们由包含2Apro切割位点的短肽序列连接。编码供体和受体蛋白的盒式结构由组成型真核启动子驱动，克隆到表达质粒中。BGMK细胞转染了构建的表达报告系统的质粒，并获得了对G418有抵抗力的稳定转化体。在肠病毒感染期间，2Apro被表达并切割了其自身的特定位点。此后，两种荧光蛋白之间的相互作用被破坏，导致ECFP荧光强度增加。因此，可以在感染后大约7.5小时内检测到少量的病毒病原体。 所得到的报告细胞系对三种肠病毒感染显示ECFP荧光，并且不被不产生2Apro的甲型肝炎病毒(HAV)激活。据推测，这样的报告系统可以用于研究基于抗蛋白酶活性的抗病毒药物的开发。 3.3.用于逆转录病毒检测的报告细胞系 Retroviridae，慢病毒 慢病毒属的主要传染性病原体是牛免疫缺陷病毒（BIV）和人类免疫缺陷病毒（HIV）。HIV会导致获得性免疫缺陷综合征（AIDS）。AIDS会导致免疫系统逐渐功能障碍，并引发严重的感染和多器官功能障碍。BIV是一种与HIV在关键遗传和结构特征上相似的慢病毒。此外，BIV还是感染牛免疫系统功能障碍相关病理过程的原因。 确定病毒库中感染性颗粒的数量对于研究病毒生命周期阶段、开发病毒药物疗法以及在病毒基因组中寻找突变至关重要。可以从病毒的终点稀释中确定HIV库的定量滴度，但这些检测对于大量样本来说非常费力。因此，进行了专注于报告细胞系开发的研究。 在HIV研究中，细胞对HIV的敏感性是由细胞表面存在CD4（分化群4）受体所赋予的。第一条HIV报告细胞系是在20世纪80年代末开发的，基于转染的淋巴细胞系中的转录激活。CAT报告基因在HIV-1的LTR启动子的控制下克隆，并且可以被HIV Tat转录激活因子诱导（图5）。这些报告细胞被HIV激活，并且在较小程度上被人类T细胞白血病病毒4型和猴免疫缺陷病毒（SIV）激活。报告细胞系没有被马传染性贫血病毒、人类T细胞白血病病毒1型和2型，或单纯疱疹病毒1（HSV1）激活。另一种携带β-半乳糖苷酶基因的细胞系，作为HIV检测的报告基因，依赖于HeLa细胞。同样的方法被用来从人胶质母细胞瘤和猕猴乳腺肿瘤中产生HIV报告细胞系。此后，由HIV LTR驱动的GFP被用来生成改良的HeLa CD4细胞，用于检测HIV-1感染。 图5. 用于逆转录病毒和双链DNA基因组病毒检测的分子报告器系统。在未感染的细胞中，病毒启动子没有mRNA合成。当细胞感染发生后，病毒蛋白存在下开始转录和翻译报告蛋白。 然而，基于HIV LTR的报告系统有一些缺点。首先，这种系统在没有Tat的情况下表现出一定的基础表达水平。第二，它可能被细胞转录因子、细胞因子、增殖素甚至病毒包膜蛋白非特异性激活。有人提出，通过使用另一种调控蛋白Rev作为转录激活因子，可以解决这些问题。产生了一个新的含有GFP的构建物。使用荧光蛋白报告系统的优点在于其简单性，以及使用广泛可用的仪器检测和感染活细胞的能力。虽然GFP荧光信号在甲醛固定下是稳定的，但它也可以在未固定的活细胞中轻易检测到。GFP检测可以使用常规荧光显微镜和荧光素滤光片组合进行。此外，表达GFP报告蛋白的活细胞可以通过常规流式细胞术进行计数和排序。 基于RT-PCR的BIV检测方法已经推出。虽然这种病毒检测方法敏感且快速，但不能用于评估感染性病毒滴度，这是该方法的一个相当大的局限性。因此，采用了与HIV相同的方法来生产BIV的报告细胞系。报告细胞系基于可以被BIV感染的牛、犬和兔组织培养。CAT基因被用作报告基因，由BIV的LTR启动子驱动。在可检测到CAT基因基础表达的牛和犬细胞系中，细胞因子在LTR表达中起作用。然而，感染导致表达增加（50至80倍）。牛白血病病毒或牛合胞体病毒仅导致表达增加2至3倍。在BIV报告细胞系的进一步开发中，研究人员转而使用GFP作为报告基因，仍然由BIV LTR驱动。所得到的细胞系作为与BIV非常密切相关的病毒Jembrana病病毒的报告线发挥作用，但不是牛泡沫病毒的报告器。 目前正在使用基于细胞系的方法研究的另一种逆转录病毒是猿泡沫病毒（SFV）。基于BHK-21细胞构建了SFV的报告细胞系。获得了由SFV LTR驱动的β-半乳糖苷酶基因的报告细胞系。在这项研究中，使用了几种SFV菌株作为实验室适应菌株，并且还使用了来自两只黑猩猩、两只大猩猩和一只猕猴的血液中的天然菌株。在感染自体菌株后72小时内启动报告基因表达。另一种SFV菌株获得了相同的结果。细胞被证明是量化不同菌株的有效工具。作者表明，不同SFV菌株的复制速率在不同细胞中是不同的。 3.4.双链DNA基因组病毒 3.4.1.疱疹病毒科，单纯疱疹病毒 HSV-1型和2型感染在全球普遍存在。由疱疹病毒感染引起的发病率是一个重要问题。HSV感染可以引起一系列疾病，并改变感染者的免疫状态。此外，免疫功能低下的患者（AIDS患者、器官移植受者、白血病患者）的HSV感染会导致严重疾病。尽管HSV在哺乳动物细胞培养中繁殖良好，但由于必须对感染细胞进行免疫染色以识别抗原，因此病毒感染的检测是一个繁琐的过程，以便进行准确诊断。使用这种方法，在大多数情况下，可以在24至48小时内获得结果。在1990年代初开发了一种报告细胞系，允许更快地检测这种病毒。双链DNA病毒的报告系统与逆转录病毒的报告构建物类似（图5）。在这个盒式结构中，大肠杆菌LacZ基因被用作报告基因，克隆在HSV ICP6（HSV核糖核苷酸还原酶大亚基）启动子的控制下，进入一个表达真核载体。然后，使用设计好的报告构建物和携带新霉素抗性基因的质粒转化BHK细胞。为了获得稳定的报告细胞系，BHK细胞在含有选择性抗生素的培养基中培养。这种涉及病毒启动子的报告系统的便利性在于，HSV ICP6启动子在未感染的细胞中没有被激活，HSV的激活非常具体；因此，在同一培养物中容易区分感染和未感染的细胞。使用所描述的报告系统，通过β-半乳糖苷酶活性在接种后几小时内（最多6小时）发生感染检测。使用这种报告细胞系进行病毒检测的有效性与在病毒学研究中使用的标凈基于细胞的方法相当，例如斑点分析。两种类型的HSV都激活了所开发的报告盒，而其他Herpesviridae成员（人巨细胞病毒（HCMV）、带状疱疹病毒（VZV））的非特异性激活则没有发生。因此，指示细胞系可以为在细胞培养中快速观察HSV感染提供有用的方法。 3.4.2.疱疹病毒科，γ-疱疹病毒 最重要的γ-疱疹病毒种类之一是与卡波西肉瘤相关的疱疹病毒（KSHV或人疱疹病毒8（HHV8））。这种病毒可以引起卡波西肉瘤，这是一种经常在AIDS患者中发展的癌症。通过基于细胞的方法研究病毒生命周期特征的一个障碍与病毒在大多数细胞系中难以培养的事实有关。因此，使用诸如确定病毒滴度这样的标准方法具有挑战性。因此，报告细胞系的开发基于至少在低水平上允许的细胞（HEK293T细胞、永生化内皮细胞、一些癌细胞系等。）。如前所述，基于PCR或基于ELISA的基因组等价物测量的分子生物学方法不能反映病毒的传染性能力。 用于指示细胞系开发的方法是使用以下方法。HH8基因组编码主要调节剂Rta，它激活一系列宿主和病毒启动子，并调节病毒生命周期中裂解程序的激活。Rta调节的启动子之一是多聚腺苷酸化核（PAN）RNA的细胞启动子。这个启动子片段可以被野生型病毒激活，并且lacZ基因被克隆到报告质粒中。然后，稳定转染HEK293T细胞。研究表明，HHV8病毒感染激活了报告盒，并且β-半乳糖苷酶活性水平是病毒剂量依赖性的。 3.4.3.疱疹病毒科，水痘-带状疱疹病毒 水痘-带状疱疹病毒（VZV）是水痘的原因，可能由于初次感染或感染细胞中病毒的再激活而出现严重并发症。可用的、快速的、针对性强的方法允许检测VZV是耗时和费力的，这使得开发针对性的病毒治疗和耐药菌株鉴定变得复杂。 基于病毒启动子特异性激活的VZV报告细胞系已经开发出来。测试了几个VZV启动子序列，最好的序列被证明是ORF9启动子，因为它具有特异性、强烈的激活。荧光素酶基因位于ORF9启动子的下游。质粒组装后，MeWo细胞和BSC40细胞被转染，并使用G418筛选稳定转化体。所获得的细胞克隆之一被用于进一步研究，因为它在对VZV的反应中显示出高荧光素酶活性，并且在没有VZV的情况下背景活性水平低。此外，在感染细胞和未感染细胞与报告盒共培养的情况下，报告器被激活。为了检测非特异性报告器再激活，细胞系被HCMV、人疱疹病毒6（Z29）和人疱疹病毒7（SB）感染。在所有这些情况下，都没有发现荧光素酶活性。然而，HSV1感染的指示细胞激活了荧光素酶活性，与VZV感染后24小时观察到的水平相似。然而，HSV1感染的细胞在感染后48小时表现出强烈的细胞病变效应；因此，荧光素酶活性降低，这使得区分HSV1感染和VZV感染变得可行。 4.结论  病毒检测方法包括一系列分子和细胞方法。基于细胞的方法在病毒学研究中占有相当大的部分。任何用于病毒检测的细胞系都必须具有灵敏度特征，这指的是易感性和许可性。通常，灵敏度是细胞被少量病毒独立于物种感染的能力。在实验室中，可以通过敲除细胞抗病毒反应基因或通过简单地在实验室收藏的不同培养物中选择敏感细胞系来实现许可性。易感性是细胞系被特定病毒种类感染的属性。在实验室中，可以通过增加病毒结合细胞受体的表达来增加易感性。改善这两个属性可以使细胞系成为病毒分离和研究的便捷工具。传统上，病毒感染的研究是基于CPE的基础上进行的，但这种方法并不适用于每种病毒，在这种情况下需要额外的耗时研究。这个问题已经通过使用携带分子传感器系统的细胞系来解决，这些系统允许通过存在容易检测的报告蛋白来检测感染性病毒代理。这种方法可以用于定量研究，作为CPE方法的更快的类似物。通过整合分子技术来提高分子报告器构建的灵敏度，可以实现病毒学中基于细胞方法的优化。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

关注并星标CPHI制药在线 Adaptimmune Therapeutics的T细胞受体疗法（T cell receptor therapy，TCR）Tecelra（afamitresgene autoleucel，afami-cel）日前获得FDA的加速批准，成为了医药开发历史上值得关注的里程碑事件。 Tecelra针对的适应症滑膜肉瘤是一种发生在人体软组织中的罕见癌症。Tecelra的里程碑成就表现在：1）T细胞受体疗法针对肿瘤学的成功；2）免疫疗法针罕见肉瘤（实体瘤）疾病；3）对于CAR-T攻克实体瘤提供重要指导作用。 1、T细胞受体疗法 下一代免疫疗法对抗肿瘤学的技术平台包括：自然杀伤细胞、肿瘤疫苗和肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）等，如今这个行列又加入了T细胞受体疗法（T cell receptor ，TCR疗法）。 TCR在某些方面与已经呈现“大行其道”态势的CAR-T疗法具有类似性和关联性。但是CAR-T仍在上下求索的实体瘤却已经成为了TCR的阶下之囚。TCR的获批，证明了这种技术有可能聚集并侵入难以治疗的癌症，包括实体瘤。这给与了CAR-T开发者极大的希望，它们未来可以显著扩大对免疫疗法有反应的患者群体。 免疫疗法利用免疫系统的力量来攻击癌细胞，TCR则专门增强免疫系统中的T 细胞。T细胞利用其表面受体检测它们遇到的物质是身体的一部分还是外来病原体，但癌细胞可能躲过这样的检测。针对这种问题，研究人员试图找到帮助T细胞受体识别癌细胞表面的蛋白质片段（抗原）的方法。如果受体识别出这些片段，那么T细胞就会将其目标识别为癌症并触发免疫反应。 TCR 比CAR-T更进一步，可以通过结合那些也存在于细胞表面的蛋白质片段来识别细胞内癌症蛋白质，从而为它们提供更多的分子作为靶向。与CAR-T靶向的表面分子相比，这些抗原更有可能是癌细胞独有的，这就意味着TCR疗法脱靶的风险更小。除此之外，相对于CAR-T来说，TCR被耗竭的可能性就较低，这就为它们直捣癌细胞黄龙提供了便利，比CAR-T发起更系统性的免疫攻击。科学家们并不完全了解这种现象背后的机制，但认为与细胞外部的蛋白质片段很少有关。 癌症免疫疗法的领袖一直在探索TCR疗法，包括CAR-T先驱Kite（被吉利德收购）和Juno（被Celgene收购）。然而在Tecelra获批之前，这些TCR努力都没有获得修成正果。 2、Tecelra针对实体瘤获得成功 Adaptimmune在一系列癌症中进行了临床试验，包括卵巢癌、头颈癌和肉瘤，最终在16年的努力之后针对滑膜肉瘤获得成功，得到了FDA的加速批准，并且成为Adaptimmune的获批资产。Tecelra也是十多年来滑膜肉瘤的第一个新疗法。 与CAR-T一样，TCR每种治疗方法都是个性化的，需要从患者身体中提取T细胞，并对其进行工程设计，使其表达所需的受体，然后重新输注入患者体内，这同样是一个复杂的制造过程，并意味着高昂的标签价格。一次性疗法Tecelra 的标价为 72.7万美元。Tecelra也因此创造了美国所有癌症细胞疗法中最昂贵的单剂量标价纪录。Adaptimmune认为，身披细胞疗法和孤儿药两项属性，Tecelra价格可谓合理。Adaptimmune需要四到六周的时间才能为每位患者定制治疗。分析师预测，Tecelra峰值销售额将超过1.7亿美元。 肉瘤是一种罕见的癌症，据估计，美国每年有 1000 至 1300 人被诊断出患有滑膜肉瘤。这种癌症经常在人们 20 到40岁之间发作。滑膜肉瘤目前主要通过手术、放疗和化疗进行治疗。一旦癌症扩散（常见于肺部），通常将无法治愈。虽然近年来科学家们在用免疫疗法治疗不同的癌症方面取得了长足的进步，但将它们应用于肉瘤却一直是横亘在人们面前的艰巨挑战。肉瘤是骨骼和软组织的肿瘤，滑膜肉瘤尤其被认为是“免疫惰性”的，这意味着没有很多免疫细胞在这些肿瘤部位周围存在，导致了此类肿瘤细胞可以“有恃无恐”地增长。“检查点抑制剂并没有对这种肿瘤细胞产生有效的影响。 TCR为扭转这一困局提供了希望。肿瘤细胞的一些蛋白质片段能够反映出细胞内的一些蛋白质。TCR的机制是获取患者自身的T细胞，并赋予它们识别这些蛋白质片段（抗原）的能力，作为癌症标志物，然后将细胞递送至肿瘤部位。在Tecelra的关键试验招募了已经接受过至少一种化疗的患者，大约43%接受治疗的患者看到了反应，反应持续时间中位数约为6个月，他们的肿瘤缩小。这比在后期治疗中使用的化学疗法的反应率要高得多，而且afami-cel也显示出更长的反应持久性。 入组患者肿瘤细胞高度表达MAGE-A4蛋白。Adaptimmune表示，大约30%的滑膜肉瘤患者符合此项要求，意味着每年可接受400名患者。美国癌症协会估计，今年美国将有13590人被诊断出患有软组织癌，使其成为最罕见的肿瘤类型之一。根据估算，这些肿瘤中约有 5% 至 10% 是滑膜肉瘤，这些肉瘤具有侵袭性。Adaptimmune的 数据显示，转移性疾病患者的中位五年生存率约为 20%。 Adaptimmune获得的是FDA的加速批准，这意味着他们必须在正在进行的上市后验证性研究中确认这些益处，以最终获得全面批准。Adaptimmune预计将在明年提交这些结果。无论如何，Tecelra的获批标志着细胞治疗领域又向前迈进了一步。此前FDA已经批准了六种针对癌症的CAR-T疗法，并在今年首次批准了另一种TIC (肿瘤浸润淋巴细胞) 免疫细胞疗法Amtagvi，针对黑色素瘤。Adaptimmune将Tecelra视为在其软组织癌领域开展更大业务战略的第一步。第二种疗法lete-cel可能会在明年提交给监管机构，用于治疗两种类型的肉瘤。Adaptimmune估计，这两种疗法加起来可以在美国的年销售额达到4亿美元的峰值。 除了已获得批准的滑膜肉瘤之外，Tecelra还针对一系列肿瘤进行研究，包括尿路上皮癌（膀胱）、黑色素瘤、卵巢癌、非小细胞肺癌 （NSCLC）、食管、胃、滑膜肉瘤、粘液样/圆细胞脂肪肉瘤 （MRCLS）、头颈部癌等。 同CAR-T疗法一样，Tecelra也带有一个黑框警告。接受 Tecelra 治疗的患者可能会出现细胞因子释放综合征 （CRS），这是一种危险的侵袭性免疫系统反应，包括可能危及生命的反应。在临床试验期间，在给药Tecelra后观察到CRS。 3、TCR疗法对于CAR-T的影响 TCR 寻找细胞内靶标，而不仅仅是细胞表面的靶标。从理论上讲，这一特征应该帮助他们达到CAR-T难以治疗的实体瘤。Tecelra的批准证明了这一点，标志着工程细胞疗法首次被FDA批准用于实体瘤。（Iovance Biotherapeutics最近批准的黑色素瘤疗法Amtagvi不依赖于与Tecelra相同的基因工程）。 图1. 针对血癌和实体瘤的CAR-T研究数量逐年走势图（左），以及血癌和实体瘤CAR-T疗法数量最多的五类适应症（右）。（图片来源：Citeline, IQVIA） 虽然CAR-T疗法在获批数量上远远领先于TCR，但一直在努力寻求实体瘤方面的突破。获得FDA批准的CAT-T均针对血液癌，包括如B细胞淋巴细胞白血病和B细胞非霍奇金淋巴瘤。 CAR-T疗法在实体瘤领域受挫的原因主要体现在以下三个方面： ·靶向肿瘤抗原和肿瘤异质性：虽然血癌中存在靶点异质性，但这些疾病更常倾向于表达单个标志物（B细胞标志物CD19）。实体瘤更常具有肿瘤相关抗原（tumor-associated antigen， TAA），在肿瘤本身上高度表达，但在正常组织中也有较低水平的表达。此外，实体瘤在肿瘤类型（原发性与转移性）和患有相同癌症的患者之间表现出TAA异质性。因此设计出一款在实体瘤中靶向理想靶抗原的CAR-T细胞非常困难。 ·肿瘤浸润：确定理想的靶抗原是第一部分，一旦找到靶抗原，CAR-T细胞必须成功到达所需位点并浸润肿瘤。CAR-T细胞用于全身给药治疗血液系统恶性肿瘤，因此很容易接触到靶点。相比之下，实体瘤CAR-T疗法必须克服几个阻碍CAR-T细胞穿透和归巢的障碍，例如肿瘤基质和异常脉管系统。 ·肿瘤微环境 （TME）：一旦CAR-T细胞侵入内皮屏障，它必须继续存活并在险恶的肿瘤微环境中持续存在。TME给CAR-T治疗带来了无数障碍，包括由抑制性细胞类型和髓源性抑制细胞组成的肿瘤基质等。此外，成人实体瘤和儿童实体瘤之间 TME 的组成存在差异，在开发治疗方法时可能需要特别考虑。 虽然TCR疗法与CAR-T存在一些区别，但双方之间无疑存在关联性。在血液癌方面取得了重要突破之后，CAR-T疗法明显转攻实体瘤，从历史上看，超过 70% 的CAR-T试验都是针对血液癌症的，然而，越来越多的 CAR-T 试验针对实体瘤。2023 年试验开始数量的CAR-T中有44%针对实体瘤，高于 2019 年的 26%（图1）。CAR-T在实体瘤研究中仅占比20%，但针对实体瘤的 CAR-T 越来越多地涉及难以治疗的癌症，包括胃癌和胰腺癌。 Tecelra的成功无疑会为CAR-T的实体瘤研究提供宝贵的借鉴和思路，相信针对实体瘤的CAR-T疗法批准即将到来。 Ref.        Fidler, B. First-of-its-kind cell therapy approved by FDA for rare soft tissue cancer. Biopharma Dive. 02. 08. 2024. Joseph, A. Seeking to unleash immunotherapies on solid tumors, biotech homes in on cell receptors. STAT. 09. 07. 2018. Joseph, A. FDA approves innovative T cell immunotherapy for rare soft-tissue cancer. STAT. 02. 08. 2024. Global Oncology Trends 2024. Outlook to 2028. IQVIA. May 2024. Guzman, G. et al. CAR-T Therapies in Solid Tumors: Opportunities and Challenges. Curr Oncol Rep. 2023 May; 25(5):479-489. doi: 10.1007/s11912-023-01380-x. END 【智药研习社直播预告】 来源：CPHI制药在线 声明：本文仅代表作者观点，并不代表制药在线立场。本网站内容仅出于传递更多信息之目的。如需转载，请务必注明文章来源和作者。 投稿邮箱：Kelly.Xiao@imsinoexpo.com ▼更多制药资讯，请关注CPHI制药在线▼ 点击阅读原文，进入智药研习社~

Syntis Bio emerged from stealth on Tuesday with ambitions to mimic the effectiveness of weight-loss surgery with a once-daily oral therapy. The company – which counts mRNA pioneer Robert Langer as one of its co-founders – is hoping to exploit the small intestine’s unique biology to not only combat obesity, but a range of rare metabolic diseases.“While GLP-1 drugs have delivered new hope and unprecedented efficacy, there is significant demand for additional treatment options given ongoing issues with accessibility, cost, side effects and long-term maintenance,” noted co-founder Rahul Dhanda, the start-up's chief executive. The biotech is using the fact that the small intestine serves as the nexus for metabolic control, digestion and drug absorption. Its lead programme, SYNT-101, is designed to mimic the effects of gastric bypass surgery by transiently blocking nutrient absorption in the upper part of the small intestine. Syntis explained that this diverts nutrients to the lower small intestine, where absorption is more controlled, and stimulates a full cascade of satiety hormones such as GLP-1 and peptide YY. IND filing in 2025A formulation of SYNT-101 – which is powered by the company’s SYNT oral therapeutic technology – is currently in human testing, with full data due by the end of 2024. Findings from the study are expected to support an IND application with the FDA next year."What began as research to enhance the bioavailability of oral paediatric therapies quickly shifted to a vastly larger scale as we recognised that SYNT’s elegantly simple chemistry could help solve many global health challenges," remarked Langer. The technology uses mussel-inspired polymer chemistry to deliver a polydopamine coating to catalase-rich tissues, like the small intestine, which lasts for 24 hours before being naturally cleared from the body.Key to many disorders"The small intestine is the key to treating a broad spectrum of disorders,” Langer noted, with the SYNT platform also able to install and sustain gut-restricted enzymes in the small bowel, enhance the oral bioavailability of drugs, and target new tissues throughout the body. Earlier this year, Syntis acquired a portfolio of engineered enzymes from Codexis, including SYNT-202 for homocystinuria and SYNT-203 for maple syrup urine disease. The company is now working on next-generation formulations of the oral drugs and expects to submit an IND for one of them to the FDA next year.Syntis is backed by Safar Partners, BOLD Capital Partners, Touchdown Ventures, Colorcon Ventures and Portal Innovations, and raised $15.5 million in seed financing in 2023.For related analysis, see Vital Signs: Updating the oral obesity efficacy landscape – can they compete with injectables?