PAGR1

聚乙二醇化(PEGylation)作为目前应用较为广泛的药物赋形剂，可大幅增加前体药物的亲水性，降低肾小球滤过，延长体内停留时间；此外，PEG修饰的纳米载体可通过空间排斥作用提高胶束稳定性[1]。尽管自1973年以来，PEG就被FDA列为“公认安全”食品成分，但越来越多的研究报告称PEG对动物和人类具有免疫原性。抗PEG抗体对聚乙二醇化制剂的体内性能产生显著影响，其中在重复施用聚乙二醇化蛋白质和纳米载体制剂时广泛观察到加速血液清除的现象。抗PEG IgM与后续剂量的聚乙二醇化制剂之间的相互作用诱导补体激活，促进单核吞噬细胞系统(MPS)的识别和快速清除，同时引起过敏反应症状(HSR)；抗PEG IgG可直接与先天免疫细胞上的FcγR结合以诱导HSR (图1)[2, 3]。这些现象已在临床前和临床上得到不同程度的体现。由于抗PEG抗体产生的机制尚在研究中，临床上减少抗PEG抗体影响的方法主要依靠调整给药方案、应用辅助药物、PEG封端处理等。图1 抗PEG抗体的产生机制及其生物学效应从药剂学领域来看，根本途径是寻找一种具有相似理化性质和药代动力学优异但免疫反应不显著的相容性聚合物。作为亲水性聚合物，聚肌氨酸(Polysarcosine, PSAR)逐渐进入药物研发人员的视野。PSAR，即聚(N-甲基甘氨酸)，由肌氨酸(肌肉组织中的内源氨基酸)组成，类似于聚丙氨酸，具有高度水溶性；甲基取代的酰胺基团对蛋白质表现出有限亲和力，从而阻止血栓形成；氢键供体的缺失也赋予PSAR非免疫原性，因为氢键供体似乎对于与抗体发生反应至关重要；除链具有一定的刚性外，PSAR具有与PEG相似的聚合物特性，抑制体内巨噬细胞的摄取，延长制剂的血液循环时间；此外，PSAR对非特异性蛋白质吸附和细胞附着具有出色的抵抗力，它可以稳定血流中的纳米颗粒，并能在体内的癌症部位积聚[4-6]。PSAR目前多用于脂质纳米颗粒(LNP)、脂质体等领域，在抗体偶联药物(ADC)领域应用较少。基于ADC良好的临床应用前景及其有效载荷水溶性较差的限制因素，本文选取具有代表性的文章/专利重点介绍PSAR在ADC领域的应用。此方面具有代表性的企业包括MabLink、Novartis、Multitude Therapeutics (普众发现)等。  01  MabLink2023年10月18日，MabLink Bioscience宣布与礼来达成收购协议，成为其全资子公司。Mablink主要致力于开发ADC药物，其专有的亲水性药物连接技术PSARLink™能够设计具有高DAR值(DAR 8/16)的同质、血浆稳定的新一代ADC，同时保持优异的药理学特性和耐受性[7, 8]。针对ADC有效载荷疏水性问题，PSARlink™平台具有独特的“隐身”技术，通过在Linker上添加聚肌氨酸链构建创新型亲水性Linker，"掩盖"有效载荷的疏水性，使它们能在体内停留更长时间，从而促进对肿瘤细胞的杀伤作用、拓宽ADC治疗指数的潜力(图2A)。图2. PSARlink™平台技术及其应用PSARlink™平台最早应用于靶向于HER2 ADC的制备，以Trastuzumab (Tras)作为模式抗体进行概念验证实验(图2B)[9]。利用强亲水性的PSAR作为疏水性掩蔽实体，构建含有MMAE的树枝状的Linker-Payload，同时还含有β-葡萄糖醛酸酶响应性自降解单元，通过还原抗体链间二硫键制备具有良好理化和药理学特性的高负载(DAR8)均质ADC，经β-葡萄糖醛酸酶激活后在癌细胞内释放MMAE，发挥肿瘤杀伤作用。图3. ADC-PSAR的PK及其活性研究体内活性研究表明，ADC-PSAR12和ADC-PSAR0在BT-474乳腺癌模型中的抗肿瘤活性与其观察到的PK行为直接相关(图3B)。单剂量3 mg/kg的ADC-PSAR12能够明显抑制肿瘤生长，可引起肿瘤完全消退(4/5 CR)，而ADC-PSAR0则不能。在相同剂量下，T-DM1 (Kadcyla®)对肿瘤生长基本上没有抑制作用。在Sprague-Dawley大鼠中对其PK特性进行研究，探究Linker-payload的构效关系。受试ADC的暴露量随着PSAR长度的增加而增加，PSAR最多可达12个单体残基，进一步延伸PSAR对ADC的清除率几乎没有影响，ADC-PSAR0和ADC-PSAR12L (直链)显示出较差的PK特性(图3C)。在相同长度下，与PEG相比，PSAR能够更有效地提高清除率。上述ADC (2.5 mg/kg)的抗肿瘤活性在乳腺癌模型BT-474中进行活性研究，仅在具有低清除率的偶联物(ADC-PSAR12和ADC-PSAR18)中观察到肿瘤完全消退，就MMAE而言，12个单体的PSAR长度似乎是最优值(图3D)。尽管ADC-PSAR24具有出色的清除率，但其活性并不理想，可能是因为24个单体PSAR长度最终会产生过大和/或受阻偶联物，阻碍肿瘤渗透，干扰内化或β-葡萄糖醛酸酶消化过程，并最终导致观察到的抗肿瘤活性损失。具有较差(ADC-PSAR12L)或次优(ADC-PSAR6和ADC-PEG12)清除特性的ADC只能在测试剂量下抑制肿瘤生长(图3D)。这些结果证明在相同长度下，与PEG相比，PSAR能够更有效地提高ADC抗肿瘤活性(ADC-PSAR12与ADC-PEG12)。该部分内容所用的Linker-Payload囊括在专利WO2019081455[8]中。该专利使用逐步的树脂上亚单体方法获得具有特定链长的离散型单分散PSAR均聚物，较传统方法-由肌氨酸N-羧酸酐(NCA)或肌氨酸N-硫代羧酸酐(NTA)的缩合开环聚合反应-廉价、易于大规模生产、并能赋予终产物可接受的收率和优异的单体纯度并用于蛋白质偶联物技术，避免PSAR以多分散体形式在药物递送领域所面临的不必要的麻烦。此外，单分散PSAR均聚物为配体-药物-缀合物(LDC)提供改进的载药能力、药代动力学和治疗功效。图4. WO2019081455专利解析及其代表性LDCWO2019081455专利利用化学合成的方式构建多种直链型或支链型Linker-Payload，其中Payload涉及MMAE、SN38、PNU159682和依喜替康，PSAR链的长度不一，再以定点偶联的方式构建具有特定DAR值(8/16)的ADC (图4)。具体的体内实验实施例与上述文章一致，此处不再赘述。针对含有PNU159682的Linker-Payload构建靶向HER2的ADC，MabLink就其分支Linker未进行披露，仅知道该Linker是不可裂解的(图5)[7]。体外ELISA实验表明，含有两种不同Linker的ADC对HER2的结合活性不受Linker-Payload引入的影响，对HER2+ NCI-N87、SKBR3、MDA-MB-361、BT-474细胞系展现出良好的体外效力，Linker A的活性比Linker B高5-10倍。基于此，以Linker A构建的ADC (ADC-PNU-PSAR10-A)进行体内实验，结果表明ADC-PNU-PSAR10-A (1 mg/kg)可引起肿瘤完全消退，T-DM1 (Kadcyla®, 4 mg/kg)未能诱导肿瘤消退(图5B)。图5. PNU-159682不可裂解ADC的构建及其体内活性除了以T-DM1 (Kadcyla®)作为阳性对照进行抗肿瘤活性测试[9]，还以DS-8201a (Enhertu®)作为阳性对照进行活性测试(图6)[10]。针对拓扑异构酶I抑制剂Exatecan的疏水性，通过PSARlink™平台技术引入单分散PSAR，有效降低ADC的整体疏水性，ADC与未偶联抗体具有相同药代动力学特征。体内实验表明Tra-Exa-PSAR10在NCI-N87异种移植模型中表现出强大抗肿瘤活性(1 mg/kg)，优于DS-8201a；同时在100 mg/kg的剂量下在小鼠中具有良好的耐受性(图6B)。体外实验表明，这种基于Exatecan的ADC表现出比DS-8201a更高的旁观者杀伤作用，并在临床前HER2+乳腺癌和食管癌模型中克服了对T-DM1的耐药性，表明在异质性和耐药性肿瘤中具有潜在活性。总之，基于PSAR的疏水性掩蔽方法可以生成高DAR值的含Exatecan的ADC，其具有优异的理化性质、改善的药代动力学特征和有效的体内抗肿瘤活性。图6. 基于PSARlink™平台技术构建的Exatecan ADC的活性评估基于PSARLink™平台技术，MabLink目前共计开发出多款ADC产品，其中MBK-103[11]进展较快。MBK-103靶向叶酸受体α (FOLR1)，DAR=8，其由Fc减弱的人源化IgG1单克隆抗体、聚肌氨酸疏水性掩蔽实体、专有的二肽可裂解单元和Exatecan组成。MBK-103在人血浆中表现出优异的离体稳定性，可延长半衰期，与未缀合的单克隆抗体类似，可导致药物暴露增加，在十多个具有不同FOLR1表达的体内小鼠肿瘤模型中观察到有效的抗肿瘤功效，剂量低至1-3 mg/kg。此外，Exatecan独特的作用模式以及专有PSARLink™平台的独特特性使其在结直肠癌模型中也有一定的体内抗肿瘤效力，而微管蛋白抑制剂仅表现出有限的治疗效果。该ADC在食蟹猴中具有良好的耐受性，最高非严重毒性剂量(HNSTD)可达50 mg/kg，甚至重复给药也是如此。MKB-103于2023年第四季度提交IND，计划于2024年Q4进行I期临床试验。  02  Novartis 诺华针对包含亲水性基团的Linker-Payload的ADC制备专利目前共检索到两篇: WO2020236841[12]和WO2020236825[13]，两篇专利以同日(2020年5月19日)进行申请。其中WO2020236841主要以含有PEGylation、寡糖、PSAR、磷酸(酯)、多肽等修饰的Linker-Payload的构建为主，以PSAR修饰的Linker-Payload包含不同的长度及末端基团(图7A)，但在具体的实施例中所构建的靶向P-钙黏蛋白ADC中并未含有PSAR的修饰；专利WO2020236825主要涉及含MCL-1抑制剂的ADC的制备及应用，同WO2020236841类似，构建不同集团修饰的Linker-Payload (图7B)，同样在具体的实施例也未构建含有PSAR修饰的ADC。相信在不久的将来诺华将会公布含有PSAR修饰ADC的活性结果。 图7. WO2020236841、WO2020236825中PSAR修饰的Linker-Payload (部分)  03  普众发现(Multitude Therapeutics) 普众发现(Multitude Therapeutics)医药科技有限公司于2019年6月成立于上海和硅谷，该公司同时在开发CAR-T、双特异抗体(BsAbs)和ADC。该公司开发的MabArrayTM和T moiety平台技术用于ADC药物的开发，MabArrayTM用于发现新颖的细胞表面抗肿瘤靶点以构建First-in-Class ADC的抗体部分；T moiety则用于开发Linker-Payload，克服Exatecan因其过强的疏水性导致无法直接偶联抗体的困难，并赋予ADC更强的旁观者效应和肿瘤浸润能力。T moiety ADC技术平台是一种高亲水性自裂解Linker修饰技术，展现出更优的“疏水屏蔽效应”与稳定性，与现有的ADC相比大幅度提高ADC的治疗效果，延长药物作用时间，同时能够克服多重肿瘤耐药性，更重要的是毒副作用并没有增加，从而进一步提升现有ADC药物的治疗窗口。T moiety-Exatecan ADC的研究进展在Cancer Discovery杂志在线发表-“Antibody-exatecan conjugates with a novel self-immolative moiety overcome resistance in colon and lung cancer”，详尽揭示了DS-8201a (及其他DXd家族ADC)和TRODELVY的耐药机制，并且以此为基础进行新型的ADC的开发[14]。文章比较多个因素-亲水性修饰(PEG、PSAR)、多肽(VC、VA、GGFG)-对Linker-Payload的影响(图8)。对于T moiety而言，对其进行修饰处理-None、甲氨基甲基(T800)、PEG8 (T900)和PSAR (T1000)，以Tras作为模式抗体进行偶联，评估不同Linker-Payload的理化性质及活性。在聚集稳定性方面，相较于PEGylation修饰，PSAR10修饰的T1000/T1001所构建的ADC具有可忽略不计的聚集水平(尤指T1000)；同时，间甲基氨基甲基修饰的T800可构建出高DAR的均质ADC，其聚集程度也在可接受范围内；相比之下，T800和M800二者化学等效，但所构建形成的ADCs聚集程度相去甚远，该结果表明T-moiety可作为最佳修饰位点(图8C)。通过一系列筛选，表明T800-T1000的修饰比经典的PEGylation更有优势。图8. 不同T-moiety修饰的ADC构建及其稳定性评价文章中作者利用T1000偶联技术，进一步在多个成药靶点上（HER2, TROP2, HER3, CDH6）进行“头对头”的抗肿瘤活性药效实验，评估MTX-1000的体内抗肿瘤活性。药效学模型包含多种适应症(肺癌、结直肠癌、胰腺癌、肾癌等)、多种模型类型(细胞源性异种移植模型-CDX、人源肿瘤异种移植模型-PDX、同基因小鼠模型)、不同多药耐药(MDR)特征，同时针对所研究靶点的表达量高低以及癌症主要基因突变类型进行抗肿瘤活性评价(图9)。通过近乎全面的体内药效数据，充分证明通过T moiety技术构建的ADC相比现有的含DXd/SN-38的ADC具有更加优异的抗肿瘤活性和更宽广的适用性。图9. T moiety-Exatecan ADC抗肿瘤活性普众发现基于T moiety技术平台开发了三款ADC药物，其中AMT-707 (CUSP06)[15]信息批露较多，靶向钙粘蛋白-6 (CDH6)，DAR=8，CUSP06在体外对CDH6+癌细胞系表现出很强的抗增殖活性，利用CUSP06处理CDH6+ CDX模型(PA-1、OVCAR3和786-O)可引起肿瘤抑制。此外，CUSP06在CDH6Low/High PDX模型中表现出强大的抗肿瘤活性并能引起肿瘤消退。2022年6月8日，普众发现与昂阔医药(OnCusp)签署合作协议共同开发和商业化CUSP06[16]。根据许可协议条款，OnCusp获得在大中华区以外的全球范围内独家开发和商业化CUSP06的权利，普众发现将获得预付款、开发、注册和销售里程碑付款以及分级特许权使用费。CUSP06的临床前活性为CUSP06未来的临床开发提供了强有力的支持，该项目计划于2023年下半年进行I期临床试验，用于铂类难治性/耐药性晚期实体瘤(卵巢癌)患者，但目前尚未有信息进一步披露。目前，基于PSAR修饰的ADC还处于起步阶段。虽然该种修饰较PEGylation有更低的免疫原性，但可能会因给药频次、用药周期等产生抗PSAR抗体，应当对抗PSAR IgM和IgG的准确阳性率和水平进行检测与研究，更好地促进PSAR修饰在疾病治疗领域的应用。 主要参考文献 1. Yadav, D. and H.K. Dewangan, PEGYLATION: an important approach for novel drug delivery system. Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition, 2021. 32(2): p. 266-280.2. Zhang, P., et al., Anti-PEG antibodies in the clinic: Current issues and beyond PEGylation. J Control Release, 2016. 244(Pt B): p. 184-193.3. Fu, J., et al., Anti-PEG antibodies: Current situation and countermeasures. Nano Today, 2024. 55: p. 102163.4. Son, K., et al., Evasion of the accelerated blood clearance phenomenon by polysarcosine coating of liposomes. J Control Release, 2020. 322: p. 209-216.5. Zhang, Q., et al., PASylation improves pharmacokinetic of liposomes and attenuates anti-PEG IgM production: An alternative to PEGylation. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine, 2023. 47: p. 102622.6. Zhou, P., et al., Biodegradable Polysarcosine with Inserted Alanine Residues: Synthesis and Enzymolysis. Biomacromolecules, 2022. 23(4): p. 1757-1764.7. https://www.mablink.com/psarlink.8. Viricel, W., Ligand-drug-conjugate comprising a single molecular weight polysarcosine. 2019, Mablink Bioscience.9. Viricel, W., et al., Monodisperse polysarcosine-based highly-loaded antibody-drug conjugates. Chemical Science, 2019. 10(14): p. 4048-4053.10. Conilh, L., et al., Exatecan Antibody Drug Conjugates Based on a Hydrophilic Polysarcosine Drug-Linker Platform. Pharmaceuticals, 2021. 14(3): p. 247.11. Viricel, W., et al., MBK-103, a potent novel conjugation platform-based antibody-drug conjugate, changing therapeutic options in folate receptor alpha positive cancer patients. Cancer Research, 2023. 83(7_Supplement): p. 1544-1544.12. Chen, Z., et al., Antibody drug conjugates having linkers comprising hydrophilic groups. 2020, Novartis AG.13. Burger, M.T., et al., Preparation of peptides and myeloid cell leukemia-1 inhibitor antibody-drug conjugates as antitumor agents. 2020, Novartis AG LES Laboratoires Servier.14. Weng, W., et al., Antibody-Exatecan Conjugates with a Novel Self-immolative Moiety Overcome Resistance in Colon and Lung Cancer. Cancer Discov, 2023. 13(4): p. 950-973.15. Lu, W., et al., CUSP06/AMT-707, a new CDH6-targeting antibody-drug conjugate, demonstrates potent antitumor activity in preclinical models. Cancer Research, 2023. 83(7_Supplement): p. 6320-6320.16. https://www.oncusptx.com/cn/html/companynews/61.html.识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

点击上方的 行舟Drug ▲ 添加关注基于生理学的药动学/生物药剂学模型在中药药动学研究中的应用进展来源《中草药》 2023年10月 第54卷 第20期作者田锁燕，贾国香，胡静雯，卢倩，苏布达，杨珅珅，李遇伯天津中医药大学中药学院摘要中药具有多成分、多靶点、代谢复杂、临床应用广泛的特点。中药药动学（pharmacokinetics，PK）是中药研究中的重大科学问题之一，在阐释中医中药的科学性、推进中药国际化、现代化中具有重要意义。基于生理学的药动学（physiologically based pharmacokinetics，PBPK）模型与基于生理学的生物药剂学（physiologically based biopharmaceutics，PBBM）模型针对中药及其复方，采用“自下而上”的方法预测药物的体外特性与体内血浆或不同组织中药物及其代谢物的药动学过程，为阐明中药药效物质基础、揭示中药有效性与安全性的科学内涵、中药新药研发与剂型改进等方面提供重要的参考信息。介绍PBPK/PBBM模型在中药药动学研究中的优势和应用，以期为中药现代化研究和临床合理用药等方面提供参考。关键词中药药动学；生理学的药动学；生物药剂学；药物相互作用；风险评估；剂型优化与开发_正文_近些年来，中药在埃博拉病毒、疟疾和新冠肺炎等众多疑难杂症的治疗中发挥了良好的作用，也正是因为中医药悠久的历史，使得中药在世界许多地区被广泛应用于临床治疗和药品保健等领域[1-3]。由于中药的化学成分多样、生物功能复杂、药效物质基础不明确[4]，众多研究者开展了广泛而深入的中药药动学研究，为中药中各成分的体内代谢过程研究做出了重要贡献。中药药动学是运用数学函数和定量描述方法，研究中药有效成分及组成，单方或复方在体内吸收、分布、代谢及排泄（absorption，distribution，metabolism，and excretion，ADME）过程及时-效和时-量关系[5]。其研究对阐明中药药效物质基础、中药代谢途径及其代谢产物的化学结构和中药药理作用机制等具有重要意义，为中药质量监测评估、新药开发以及给药途径提供科学参考[6-8]。然而，中药药动学的研究仍然存在许多需要解决的问题：（1）符合中药自身特征的技术方法和评价体系较少；（2）中药复方的药动学研究有待加强，有些中药的药动学研究还停留在动物实验层面，不能直接应用于人体[9]，亦或是由于实验数据太少，导致中药在体内的药物代谢参数不准确[10]；（3）基于药物代谢酶和转运体的中药体内过程调控机制和中西药相互作用机制有待深入研究；（4）中药PK-PD结合模型研究需要构建新思路和新方法；（5）中药健康风险评估需要重视。目前，美国食品药品监督管理局（food and drug administration，FDA）和欧洲药品管理局（European medicines agency，EMA）分别颁布了多项关于生理学的药动学(physiologically based pharmacokinetics，PBPK)平台规范及其研究的报告规范的指南，有助于提高PBPK研究质量[11-13]。PBPK模型的建立从临床实验数据出发，通过将药物信息和生理信息结合起来，对药物浓度-时间曲线进行先验模拟。对于中药的开发和研究，PBPK模型可以弥补传统研究方法的不足，在不同年龄阶段外推、种属间外推、体外到体内外推以及基于动物数据预测人体药动学等研究方向中具有独特优势，对创新药物的临床研究，降低研发成本具有重要的意义。1PBPK/生理学的生物药剂学(physiologically based biopharmaceutics，PBBM)模型概述及PBPK研究进展1.1 PBPK模型概述基于PBPK模型是一种整合了生理、生化和解剖等方面的知识，模拟机体循环系统血液流向，从整体的角度出发将机体各器官/组织相互联结，并遵循质量守衡原理建立的数学建模技术[14-15]。1937年，Theorell首次提出使用多隔室模型模拟药动学的想法，并在模型中纳入生理参数，至此，PBPK模型逐步发展起来[16]。与传统房室模型（表1）不同的是，PBPK模型是将每个相应的组织器官单独作为一个房室看待，房室间借助血液循环连接，将各个房室内药物复杂的ADME过程简单化，求得质量平衡微分方程，将数据导入专业的PBPK软件进行计算并验证，能真实反映出某一组织/器官内药物浓度的经时变化，以此呈现出药物在体内的分布情况[17-18]，同时允许估计最大血浆浓度、吸收动力学、分布动力学和药物消除。1.2 PBBM模型概述基于PBBM在药品质量监管领域的应用正在不断发展。PBBM和基于生理学的吸收模型（physiologically based absorption modeling，PBAM）原理相同，也称为PBPK吸收模型，涵盖生物药剂学的所有领域，在本文中以PBBM统称。PBBM是在GastroPlus™（Simulations Plus，Inc）中开发的一种有前途的工具，整合了吸收建模、生物预测溶出度测试和PBPK建模，用于预测体内吸收和指导制剂开发[19]。因此，可以使用最小的PBPK或全身PBPK模型，在PBBM中模拟系统药物处置过程，对不同制剂进行全面的生理药动学/药理学研究，量化PK和PD图谱。PBBM模型被用于多个研究领域，包括（1）溶出方法/检测标准；（2）粒径分布设置；（3）IVIVR；（4）风险评估；（5）特殊人群口服吸收；（6）生物药剂学分类系统（biopharmaceutics classification system，BCS）的分类依据；（7）胃pH的影响；（8）生物等效性评价等。FDA相关会议报告决定，一般性PBPK指南适用于PBBM模型[20]。1.3 PBPK模型研究概况PBPK结合体外至体内外推（In vitro-In vivo extrapolation，IVIVE）技术，预测药物的药动学特征和药物间相互作用（drug-drug interaction，DDI）的程度等[21-22]，已变得越来越普遍。众多研究者意识到其为人类发展所带来的无限价值，利用PBPK模型在包括但不限于以下几个方面。1.3.1 特殊人群安全用药问题外推得到儿童、妊娠妇女及病理状态下（如肝、肾功能不全）药物在体内的过程和给药方案[23-26]，如Guo等[27]开发并验证了成年患者奥马利珠单抗的PBPK模型，外推到儿童患者，成功预测到患有中度至重度过敏性哮喘的2~6岁儿童的临床用药剂量。1.3.2 药物多成分相互作用研究通过考察对代谢酶和转运体的竞争性抑制，研究药物-药物相互作用（DDI）[28-30]，Lien等[31]建立PBPK模型，研究特格拉赞与CYP3A4抑制剂和诱导剂的DDI。1.3.3 仿制药和药物新制剂研发研究者可通过修改不同化合物或制剂的相应参数来获得不同药物制剂体内ADME过程[32-35]，研发临床疗效佳、生物利用度高的仿制药和药物新剂型。1.3.4 环境风险物健康风险评估已有研究[36-39]成功利用PBPK模型预测到环境中污染物的健康风险值，为人类健康和环境治理提供了参考。上述研究证明PBPK是药物体内过程研究中的一大亮点，同时为新药研发和临床患者合理安全用药研究奠定了基础。随着计算机行业的快速发展，国内外许多公司开发出不同的机制性吸收软件，包括开放软件（acslX、SAAM II、ADAPT5和Berkeley Madonna等）和用户界面友好的常用专业软件（GastroPlusTM、Simcyp®-Simulator、PK-Sim®），3个专业软件分别囊括了基础模块、PBPK模块、ACAT、ADAM模块以及儿科模块[40-41]，为PBPK/PBBM建模和模拟做出了巨大贡献，很大程度上减少了科研成本、动物实验及临床实验受试者人数。文章内容由凡默谷小编查阅文献选取，排版与编辑为原创。如转载，请尊重劳动成果，注明【来源：凡默谷公众号】。2PBPK/PBBM模型在中药药动学中的应用目前，随着中药现代化的不断推进，PBPK模型利用其自身优势克服了传统房室模型的不足，在中药体内ADME与风险评估、中药-药物相互作用、中药在特殊人群的给药方案调整、中药整体CMM BCS分类属性研究等领域发挥了极为重要的作用（图1）。例如，吴桐[42]利用PBPK模型不仅预测到雷公藤甲素（triptolide，TP）存在体内肝毒性风险和药物相互作用反应，同时观测到中度肝损伤患者体内TP血浆暴露量明显升高。图1 PBPK 建模过程及其在中药PK 中的应用Fig. 1 PBPK modeling process and its application in TCM PK2.1 中药健康风险评估近些年，随着有关中药不良反应的报道逐渐增多，人们对中药的安全使用意识逐渐提高。但是，由于中药成分复杂多样并且有些毒性成分也能发挥临床治疗效果，因此，我国中药风险效益评估仍在初步研究阶段，尚未形成完整的理论体系[43-44]。根据美国与欧盟颁布的一系列以非动物实验作为评价药物安全性指标的政策[45]，得出PBPK模型可以预测中药成分在器官组织中的暴露量，提高中药安全性评价和限量标准的科学性和准确性[46]。药物性肝损伤（drug-inducedliver injury，DILI）是临床实践中观察到的最常见不良反应之一[47]，重症DILI表现为急性肝功能衰竭甚至死亡[48]。PBPK模型可以预测肝脏组织浓度，并与体外测定的氧化应激、线粒体损伤、胆汁酸淤积和先天免疫反应的激活等肝损伤机制整合（图2），模拟中药所致肝损伤[49-52]。Li等[53]利用PBPK建模预测口服苦参碱、氧化苦参碱、雷公藤甲素和大黄素4种中药活性成分的最大安全剂量。模拟结果与后续的临床试验结果相近。Liu等[54]采用体外毒性和计算机反向剂量测定的综合方法，研究16种蒽醌及其衍生物的潜在人体肝脏毒性。PBPK模拟证实了患者服用香豆素及其代谢物不足以引起肝毒性的发生[55]。综上，利用PBPK模型进行正向或反向剂量测定有助于人类对中药的风险评估，避免肝毒性等不良事件的发生。2.2 中药活性成分与药物相互作用研究中药及其复方制剂具有复杂多样的活性成分，极易影响部分中药或化学药的药动学行为，从而发生相互作用[56]。研究发现，中药复杂成分可以改变体内细胞色素P450酶和转运蛋白的活性[57]，间接影响CYP酶和P-gp底物药或抑制剂的代谢和清除[58]，从而无法达到临床预期治疗效果甚至引发不良反应。目前，各监管机构对（drug-drug interaction，DDI）体外和临床研究的相关指南不断完善与更新。国家药监局审评中心（center for drug evaluation，CDE）于2021年发布适用于化学药品、中药、天然药物等最新版《药物相互作用研究技术指导原则》，此方案指导了经真实的临床试验或人体数据验证过的PBPK模型对不同机制引起的药物相互作用进行评价，同时支持剂量选择和外推，将有助于减少药物开发过程中的不确定性，提高研发效率[59]。PBPK模型严谨科学的预测能力为其在中药配伍及中药-药物相互作用的机制和结果研究中发挥了极其重要的作用，通过模拟获得中药对代谢酶和转运体的诱导或抑制作用，定量预测相互作用的程度，将为中药的临床剂量预测和调整以及安全使用拓宽前景。2.2.1 预测中药与CYP450酶介导的药物相互作用中药与药物代谢酶相互作用大多呈现抑制作用，易引起药物不良反应。采用PBPK建模评估方法简化了中草药产品的安全性评估，并最终促进了临床肿瘤药物的安全使用。Jeffry等[60]建立并验证了贯叶金丝桃素的PBPK模型，预测圣约翰草与CYP底物药物相互作用的程度。模拟结果表明，圣约翰草提取物显著降低了经口给药后咪达唑仑的全身暴露量，而对服用伊马替尼患者的全身暴露量未产生影响。之后，他们以相同的思路建立黄连碱和小檗碱的PBPK模型，预测白茅根提取物与伊马替尼和博舒替尼在CYP3A酶存在时相互作用的程度。建议临床上调整博舒替尼的剂量，以保证药物疗效和安全性[61]。Tanveer等[62]使用PBPK模型评估不同CYP2C9基因型中水飞蓟宾A和氯沙坦相互作用的可能性和程度。预测结果可知，在CYP2C9*1/*2基因型个体中，水飞蓟宾与氯沙坦联合给药导致中度药动学相互作用。He等[63]开发并验证了五味子醇A和五味子醇B的PBPK模型，以预测CYP3A5表达者或非表达者中五味子醇A和五味子醇B联合给药后他克莫司暴露量的变化。结果表明，多次口服五味子醇B会导致CYP3A5表达者和非表达者他克莫司的体内暴露分别增加26%和57%，相互作用较强。2.2.2 预测中药与转运蛋白介导的药物相互作用中药活性成分会对转运蛋白的功能和表达产生影响，当与化学药物联用或与中药配伍时，有的能增强或降低原有药效，有的能抑制或消除毒副作用，有的则能产生或增强毒副反应[64]。例如，Liu等[65]采用SPIP模型探讨浙贝母和附子的不相容机制。结果显示，浙贝母对P-gp的功能和表达均有抑制作用，而附子中的苯甲酰新乌头原碱是P-gp的底物。紫杉醇是P-gp底物药，也是OATP1B1和OATP1B3的体外底物，而酮康唑与维拉帕米是P-gp抑制剂。Mailys等[66]通过建立紫杉醇静脉给药PBPK模型，预测癌症患者合用紫杉醇与酮康唑或维拉帕米发生HDI的程度以及导致中性粒细胞减少的发生率。预测结果可知，紫杉醇与酮康唑或维拉帕米合并使用的情况下，预计39%和26%的人群将发生重度中性粒细胞减少症，2种抑制剂均可导致紫杉醇的AUC比值增加。如果使用酮康唑或其他强抑制剂，建议在给药紫杉醇后至少12h给药，以降低毒性风险。2.3 中药活性成分在特殊人群中的药动学研究特殊人群的机体功能和其他生理机能会影响药物在体内的过程，代谢酶与转运体的功能和表达与健康成年人存在差异，更容易产生相互作用和肝损伤等不良反应，所以其临床治疗方案的选择需尤为谨慎。CDE于2023年发布了《生理药动学模型在儿科人群药物研发中应用的技术指导原则》，其中明确提到PBPK模型通过对人体PK的预测，可为临床试验设计提供依据，如剂量选择、药物组织分布和儿科剂型开发等[67]。因此，在研究药物在特殊人群体内吸收机制时，PBPK模型提供了一个虚拟的模拟平台，通过纳入与年龄、疾病相关的生理参数，模拟健康人与特殊人群体内药物暴露量，为其剂量药动学预测和精确治疗提供更加严谨的参考信息[68]。Li等[69]通过PK-Sim软件，建立了广金钱草总黄酮的标志性成分夏佛塔苷的人体PBPK模型，考察包括老年人（71~80岁）和慢性肾功能受损患者在内的特殊人群PK特征。预测结果显示，慢性肾脏病患者中夏佛托苷的血浆浓度比健康成年人要高得多，老年人口服TFDS后暴露量差异不大。因此，对于重度肾损害患者，建议减少临床用药剂量。陈琳[70]应用SimCypTM软件构建了欧前胡素、异欧前胡素的大鼠和人体PBPK模型，预测严重吸烟人群血浆药动学和HDI潜能，为服用含有补骨脂素中药的吸烟人群提供安全有效的用药指南。李会娟[71]基于PBPK模型联合PA-1细胞，对补骨脂的胚胎毒性进行定性定量研究。此方法为建立符合中医药特点的中药胚胎毒性筛查体系奠定基础，为妊娠期应用中药的安全性研究搭建良好的平台。2.4 中药整体CMMBCS分类属性研究中药活性成分大多为BCS-Ⅲ类或Ⅳ类药物，不能完全被人体吸收入血，导致口服生物利用度低，PBPK模型可以预测出剂量数、吸收数及溶出数等参数[72]，进而完善BCS分类属性，揭示中药肠吸收的特征与行为。中药溶解性、渗透性是PBPK建模的核心参数之一，一方面，通过体外实验获得的中药BCS数据，可更进一步校验PBPK建模的默认参数，从而更准确地对中药人体吸收进行预测[73]。另一方面，PBPK模型也可以预测出剂量数、吸收数及溶出数等关键指标参数[74]，以进一步完善中药BCS分类。Liu等[75]以葛根芩连复方中的黄芩素为研究对象，基于大鼠、比格犬和健康人的PBPK模型及CMM BCS理念，研究黄芩素BCS属性分类。结果显示黄芩素为BCS-II类，与体外溶出速率结果一致。通过PBPK模型异速增长方程预测了槲皮素、大豆苷元、芒柄花素等体内有效渗透系数和吸收分数[76]。尹秀文[77]通过GastroPlus软件建立并验证小檗碱大鼠吸收PBPK模型，预测小檗碱在大鼠体内的吸收系数和CMMBCS属性分类。以上案例充分证明PBPK模型结合体内外实验方法是研究中药CMMBCS分类及预测人体吸收的良好工具，为中药成分的体内吸收研究方面提供数据基础及科学理论参考。2.5 中药剂型优化及开发美国FDA在药品开发早期就鼓励对PBPK技术的开发，尤其对于溶出是限速步骤的产品[78]。对于成分复杂或者不便于使用常规PK等效方法进行评估的中药制剂，基于生物药剂学的PBPK建模可将药物体内吸收、临床表现、药物关键质量参数和体外评估方法等联系起来[79]，进行生物等效性预测（图3），帮助建立体外-体内联系，辅助制剂优化和新剂型开发，制定以患者为中心的临床制剂质量标准。为了研究中药单体雷公藤红素及其纳米制剂在大鼠体内的药动学行为以及肝毒性，石忠波[80]成功利用雷公藤红素及纳米制剂的大鼠全身PBPK模型，预测血浆及各组织雷公藤红素的C-t关系，获取相关药动学参数。发现雷公藤红素在肝脏中分布最多，有蓄积现象。与雷公藤红素比较，其纳米制剂腹腔注射后生物利用度提高、肝毒性降低，其他药动学行为亦有所改善。Wang等[81]用GastroPlus软件建立3种姜黄素口服制剂PBBM模型，评估姜黄素在肠道吸收动力学参数。PBBM模型预测值与大鼠体内药动学实测值基本一致，表明其模拟中药制剂体内吸收结果可靠。此外，Gao等[82]以高疏水性药物穿心莲内酯作为模型药物，用PK-Sim软件分别建立大鼠口服纯穿心莲内酯、穿心莲内酯滴丸和穿心莲内酯环糊精三元复合制剂的PBBM模型，预测3种制剂的PK参数，并通过细胞和动物实验进行验证，辅助临床成功研制出穿心莲内酯环糊精三元复合制剂。综上所述，基于生理学的建模技术已经成为促进中药复方配方设计的有力工具，相比于传统药动学模型，其能够更加准确的预测出不同制剂的体内吸收过程，为中药制剂优化和新剂型开发提供科学指南。3结语与展望近些年来改进的机制性生理模型由于综合了口服药物吸收的多重过程及影响因素，拥有更好的模拟和预测能力，与Caco-2细胞模型及在体肠灌流模型的预测结果具有良好的相关性。PBPK模型在探索中药复方配伍的科学内涵、中药-药物相互作用、体内体外相关性和指导临床合理安全用药等方面具有极大的优势，同时可为药物说明书中特殊人群用法用量的撰写提供依据，加快了中药新药的研发历程。美国FDA等权威监管机构已经意识到PBPK模型的重要性，将其列入了新药注册的审查环节[83-84]。PBBM模型由于近年来在支撑药品质量标准制定领域使用的增加，人们对这一PBPK模型分支的兴趣渐长，在生理相关性溶出方法基础上构建的PBBM模型的模式，不仅可以帮助预测中药的体内吸收情况，还可以为中药复方生物豁免提供依据。相信未来这类技术在中药标准化中的使用会越来越普及和规范化。在以上应用实例中，中西药相互作用研究占比较大。临床工作中，中西药联用现象也十分普遍，并且取得了突出成绩。然而，PBPK模型预测中西药相互作用仍面临不少挑战，一方面，由于中药成分复杂、种属差异等因素，使得模型预测结果无法得到保证，目前将PBPK建模用于代谢酶和转运体参与的体内HDI研究并不多[85-86]；另一方面，中西药相互作用研究缺乏整体的定量评价体系和因果关系，无法从根源解决联合用药带来的安全问题。相信随着科学技术的发展与新的体外和体内数据的出现，PBPK等机制性生理模型在中药-药物相互作用研究中将会得到更多的开发和使用，为临床安全用药提供科学有用的参考指南，为中西药联用的增效减毒研究开启新篇章。此外，以上方法用于中药生物药剂学分类规律的研究对解释低生物利用度、高生物学效应的中药药效物质与作用机制的研究具有指导意义，从而促进中药复方剂型优化和开发。PBPK模型作为一种机制性模型，其预测结果的准确性依赖于当前科学认知水平和数据的可靠性。目前，对人类PBPK建模的研究尚处于积累阶段，系统参数来源少、参数准确性无法保证、模型验证缺少严谨性和计算复杂等难题，使得其无法在中药研究中被广泛使用。但随着各学科间的相互渗透、相互影响和更多科研工作者不懈的努力，PBPK在中药标准化研究中的应用会越来越广泛和深入。参考文献详见《中草药》 2023年10月 第54卷 第20期文章信息源于公众号凡默谷，登载该文章目的为更广泛的传递行业信息，不代表赞同其观点或对其真实性负责。文章版权归原作者及原出处所有，文章内容仅供参考。本网拥有对此声明的最终解释权，若无意侵犯版权，请联系小编删除。学如逆水行舟，不进则退；心似平原走马，易放难收。行舟Drug每日更新 欢迎订阅+医药大数据|行业动态|政策解读

G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptors, GPCR)，也被称为七次跨膜受体，是真核生物中最大的细胞表面受体家族[1]。GPCR是最成功的治疗靶点之一，占已批准药物的近35%。  01  GPCR是ADC新晋靶点集中在临床前阶段人体中约有800个GPCR，根据氨基酸序列相似性将它们分为六大类：A类-视紫红质样受体，B类-分泌素受体家族，C类-代谢型谷氨酸受体，D类-真菌交配信息素受体，E类-环腺苷酸受体，F类-卷曲受体[2]。在人体中只发现其中四类-A、B、C和F类。靶向GPCR的药物主要包括小分子、天然产物、多肽、抗体等，其中小分子类药物占比大于90%，抗体类药物占比不足2%[4]。因为针对GPCR的抗体筛选困难。除了GPCR本身蛋白体外表达困难、GPCR蛋白胞外区较小之外，其核心功能区域在物种间非常保守，常规的免疫方式难以获得针对功能区域的抗体应答。但随着晶体学、抗体筛选等方面取得的重大进展，包括抗体类药物在内的生物制剂数量正在逐年攀升[5]。目前，有3种FDA批准的靶向GPCR或其相关配体的单克隆抗体用于非肿瘤适应证：抗CCR4单抗（mogamulizumab）、抗降钙素基因相关肽（CGRP）1型受体单克隆抗体（erenumab）和抗CGRP单抗（eptinezumab）。截至2019年的数据，估计至少有146个GPCR靶向的mAb处于发现阶段，另有45个处于临床试验阶段，目前估计更多。随着基于GPCR抗体的疗法不断扩大并进入市场，获批药物的形式可能会超越mAb，包括bsAb、纳米抗体、ADC等。毫无疑问，GPCR也开始成为ADC的新晋靶点，开始扩展ADC的应用前景。表1：目前有7款在临床和临床前阶段的GPCR ADC表2：靶向GPCR的ADC安全性研究   02  CXCR4CXCR4属于A类GPCR，其在细胞迁移、增殖、造血和组织再生方面发挥重要功能。由于其在许多血液癌和实体瘤类型中高表达，因此CXCR4成为有吸引力的肿瘤治疗靶点[6]。第一个靶向CXCR4的ADC由美国斯克利普斯研究所（Scripps Research Institute）Peter G. Schultz教授组开发，研究其对CXCR4+转移性肿瘤的治疗效果[7]。使用不可裂解的亲水性Linker-Payload (MMAF-PEG4-ONH2)与非天然氨基酸对乙酰基苯丙氨酸(p-acetylphenylalanine, pAcF)进行位点特异性偶联成肟生成高亲和力的抗CXCR4 ADC (IgGX-MMAF)，DAR=2 (图2A)。MMAF含有末端羧基，细胞渗透性极小，几乎无旁观者效应，可降低对非复制造血干细胞的脱靶细胞毒性。利用高表达CXCR4的人骨肉瘤细胞系(SJSA-1-met)评估体外疗效，经IgGX-MMAF处理后，SJSA-1-met细胞活力显著降低(IC50=0.08 nM)，而CXCR4 mAb处理没有明显抑制效果(图2B)；同时，IgGX-MMAF对CXCR4阴性细胞无抑制效果。体内功效研究表明，使用CXCR4 mAb或IgGX-MMAF进行肺部肿瘤治疗，IgGX-MMAF在第8天时几乎无法检测到肿瘤，而CXCR4 mAb治疗的肿瘤与对照组相当(图2C)。目前，尚未报告该ADC的后续疗效或安全性研究。 图2. IgGX-MMAF ADC的构建及其体内外活性评价除上述研究外，该课题组还开发了另一款靶向CXCR4的ADC的药物[8]。利用自身前期研究成果牛抗体(BLV1H12)[9]中超长的重链CDR3移植到Trastuzumab中，替换Trastuzumab CDR3H中的原始Trp99-Met107环肽，得到人源化抗体HLCX (图3A)[9]。经流式检测发现HLCX对CXCR4的选择性和亲和力并未受到太大影响；同时，HLCX也具有较高内化效率。利用随机偶联的方式经两步反应引入含有不同Linker (可切割/不可切割)的淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(Lck)抑制剂-Dasatinib (图3B)，DAR≈3，由此产生的ADC可抑制T细胞受体(TCR)介导的T细胞活化和细胞因子表达，EC50较低，且对细胞活力的影响极小(图3C)。该ADC的成功构建可能会带来一类新型的选择性免疫抑制药物，其安全性得到提高，并将ADC策略扩展到肿瘤学以外的适应症，用于激酶抑制剂的靶向递送。 图3. 含Dasatinib ADC的构建及其对细胞因子分泌的影响辉瑞(Pfizer)科研人员为改善治疗指数降低靶向CXCR4 ADC的脱靶毒性，筛选了含有不同Linker、Payload、DAR、mAb亲和力和Fc形式的ADC[10]。经实验评价，Payload选择Aur0131，其对肿瘤细胞具有细胞毒性作用，但对外周血单核细胞(PBMC)没有毒性。候选ADC在NHL、ALL、MM和AML等癌细胞异种移植模型中进行活性测试，数据表明活性较优的ADC由较低亲和力的mAb组成，其Fc介导的效应功能也相应降低。ADC 713通过mAbs上的赖氨酸残基与不可裂解的Linker-Payload进行随机偶联而构建(AmPEG6C2-Aur0131; DAR=4，图4A)。针对CXCR4 mAb耐药的MOLP-8 MM细胞异种移植模型，ADC 713 (0.15 mg/kg)可导致肿瘤消退并显著延长生存期(图4B)。此外，该ADC也可提高化疗药吉西他滨在CXCR4+患者来源的非小细胞肺癌异种移植模型中的疗效(图4C)。目前，该款ADC仍处在临床前研究。 图4. ADC 713偶联位点、Linker-Payload及其活性评价  03  CXCR5CXCR5是趋化因子CXCL13的受体，在大多数B细胞恶性肿瘤中表达，包括弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、滤泡性淋巴瘤(FL)和慢性淋巴细胞白血病(CLL)[11]。对复发性DLBCL患者肿瘤活检的评估表明，CXCR5染色仍然很高，这表明它可能是探索非霍奇金淋巴瘤(NHL)治疗的相关靶点。BAY-924是由拜耳(Bayer)研发的一款新型首创ADC，由纺锤体驱动蛋白抑制剂(Kinesin Spindle Protein inhibitor, KSPi)与人源化抗CXCR5 IgG1抗体组成[12]。值得注意的是，研究人员对ADC的结构进行针对性优化，使其代谢模式与KSPi作用模式相匹配，并能够最大程度地提高肿瘤细胞内的有效载荷。SPR显示该抗体与CXCR5具有高亲和力(2.5 nM)，通过流式细胞术测量不同CXCR5+淋巴瘤细胞系中ADC的亲和力为0.8-10 nM。在体外实验中，BAY 924在不同CXCR5表达水平的肿瘤细胞系中具有高选择性和抗增殖活性(<0.03-2 nM; IC50)。在包括CXCR5+ MCL REC-1细胞在内的多种细胞系中观察到Ab的有效内化和溶酶体共定位。在体内实验中，BAY-924在多种CXCR5+淋巴瘤模型中具有高度活性；与肝脏、脾脏和肾脏等器官相比，肿瘤中的Payload有特定的积累，血浆中几乎检测不到。在大尺寸肿瘤(～500 mm3) REC-1模型中，以10 mg/kg、Q7D静脉注射2次BAY-924后可观察到持久的肿瘤消退。在恶性ABC DLBCL模型OCI-LY1中，单次注射10 mg/kg BAY-924可诱导10/10小鼠完全缓解(直至治疗后第95天)。在此模型中，头对头比较显示，BAY-924与利妥昔单抗、苯达莫司汀、来那度胺相比具有更优异的活性。鉴于其独特的结构，使得BAY-924具有高稳定性；同时HSPi可被困在肿瘤细胞内而不会发生细胞渗透性游离，预计BAY-924将显示出良好的安全性。总体而言，这些结果支持BAY-924作为治疗CXCR5+非霍奇金淋巴瘤的创新方法的进一步开发。  04  LGR5LGR5属于A类GPCR，活化经典Wnt/β-catenin信号传导[13]并介导细胞间粘附[14]。LGR5在许多胃肠道(GI)癌症中高表达，正常组织低表达，并标记肿瘤起始癌症干细胞(CSC)，使其成为有利的治疗靶点。UTHealth分子医学研究所的研究人员开发了靶向LGR5的ADC，该ADC由大鼠-人嵌合LGR5 mAb与MMAE偶联组成[15]。利用两种不同Linker (MC-VC-PAB vs MP)进行ADC构建，二者均与链间半胱氨酸残基偶联(DAR=4，图5A)，并显示能够以高亲和力特异性结合LGR5、内化并转运至溶酶体，与母体mAb相当。在LGR5高表达的LoVo (结直肠)和AGS (胃癌)癌细胞中，具有可裂解Linker的ADC比具有不可裂解Linker的ADC表现出11倍的效力(IC50分别为2–4.5 nM与47–51nM)，因此含可裂解Linker的ADC被选为体内研究的先导药物(图5B)，且该ADC对LGR5阴性癌细胞系没有影响，证明其靶标特异性。 在LoVo CRC异种移植模型中，含可裂解Linker的ADC治疗可导致肿瘤消除，并且没有观察到脱靶毒性(图5C)。 图5. 靶向LGR5 ADC的构建及其活性测试尽管尚未报道该ADC的进一步开发情况，但该组研究人员于2021年开发了靶向LGR5及其相关受体LGR4和LGR6的肽体药物偶联物(peptibody drug conjugate, PDC)[16]。该肽体包含RSPO4的弗林蛋白酶结构域，结合LGR4-6，但不增强Wnt信号传导，与抗体Fc区融合。利用微生物转谷氨酰胺酶进行位点特异性的偶联，引入含有可裂解(VC) Linker的MMAE或Duocarmycin SA (DMSA) (图6A)。在LGR4/5高LoVo细胞中，两种PDC的效力比抗LGR5-MMAE ADC强约3倍(图6B)，LoVo异种移植模型中的PDC治疗导致肿瘤显著消退并延长生存期(图6C)。该类PDC进一步的体内功效和耐受性研究尚未有报道。 图6. 肽体药物偶联物的构建示意图及其活性评价Genentech报道了两款抗LGR5 ADC，一款是通过链间半胱氨酸将蛋白酶可切割的MC-VC-PAB-MMAE与人源化LGR5 mAb偶联所得，DAR=3.5；另一款是通过重链上工程化的半胱氨酸将可酸水解的NMS818与人源化LGR5 mAb偶联所得，DAR=2[17] (图7A)。NMS818中含有PNU159682，其是一种插入DNA的蒽环类药物，可抑制拓扑异构酶II。MMAE在分裂细胞中表现出高效力，而PNU15982在亚纳摩尔浓度下表现出更高的效力，并在非分裂细胞中表现出细胞杀伤作用。这表明抗LGR5-NMS818可能具有更广泛的细胞杀伤范围，但也可能会增加正常组织毒性。该两款ADC在LGR5高表达D5124原代人胰腺癌异种移植模型中表现出相似的效力，导致肿瘤停滞或消退；裸抗和同种型对照抗体对肿瘤生长均没有显著影响，对照组ADC可导致肿瘤有一定程度的消退，但与靶向LGR5的ADC相比效果要差得多(图7B)。抗LGR5-NMS818显示出严重的肠道和肝脏毒性，而抗LGR5-MMAE治疗的小鼠则没有这种毒性，表明Linker-Payload的选择对于ADC耐受性至关重要。在APCmin/+; KRASLSL-G12D/+; Villin-Cre基因工程小鼠肠道肿瘤发生模型中进一步评估抗LGR5-MMAE的活性，长期治疗可显著提高生存率并缩小肿瘤体积(图7C)；然而，与对照组相比，肿瘤总数没有变化。这与MMAE已被证明对胃肠道肿瘤相对无效有关。因此研究其他Linker-Payload组合将会更有意义。与其他小组的研究相结合，这些发现展现出靶向LGR5治疗不同类型癌症的潜力。 图7.不同载荷ADC的活性评价  05  FZD7FZD7是一种Frizzled家族GPCR (F类)，可介导经典的β-catenin和非经典c-Jun激酶依赖性Wnt信号通路[18]。FZD7在卵巢癌中高表达，表达量与患者的中位生存期密切相关[19]，这表明它可能是ADC开发的一个极有吸引力的靶点。加州大学圣地亚哥分校(UCSD)的研究人员开发了一款抗FZD7的ADC-Septuximab vedotin，由嵌合人-小鼠FZD7 mAb通过可裂解MC-VC-PABC-MMAE偶联，DAR=4 (图8A)。与FZD7敲除(KO)的(OVCAR3和MA-148 FZD7-KO; IC50=25–60 nM)卵巢癌细胞系相比，Septuximab vedotin在FZD7+ (MA-148和PA-1; IC50=5 nM)中的效力增强。使用表达荧光素酶的MA-148、PA-1和MA-148 FZD7-KO异种移植模型测试其体内活性，MA-148和PA-1肿瘤能够得到明显消退，而在MA-148 FZD7-KO中未观察到显著的肿瘤生长抑制(图8B)。由于Septuximab vedotin特异性结合人FZD7，因此使用CRISPR-Cas9对小鼠进行工程改造，将Fzd7上的mAb表位从小鼠序列转换为人序列(Fzd7hF7/hF7)，未观察到对小肠隐窝/绒毛结构的明显毒性或损伤。此外，该ADC避免了全局Wnt抑制相关的脱靶效应。这些初步结果使该ADC在PDX和免疫活性模型中的进一步测试合理化，以评估其临床潜力。 图8. Septuximab vedotin模式图及其体外活性测试  06  CTR降钙素受体(CTR)属于B类GPCR，广泛表达于成人组织中，尤其是骨骼中。CTR在恶性神经胶质瘤和神经胶质瘤干细胞的致死性脑肿瘤胶质母细胞瘤的活检中广泛表达。墨尔本大学和莫纳什大学的研究人员开发了一款靶向CTR的ADC，该ADC由mAb2C4抗体通过赖氨酸末端ε-氨基与可裂解Linker-Payload (OSu-Glu-VC-PAB-MMAE)偶联组成，DAR=7[20]。此外，还利用SPDP linker构建了含有Dianthin-30[His6]或Gelonin的抗体偶联物。使用高度CTR阳性神经胶质瘤SB2b和JK2细胞以及U87MG GBM细胞评估抗CTR-MMAE活性，在SO1861 (一种促进溶酶体逃逸的三萜糖苷)存在情况下，抗CTR-MMAE的效力增加10倍(EC50=25.1 vs. 2.5 nM，表1)。关于此款ADC的体内研究和未来开发均未有报道。表1. 免疫毒素与ADC在SB2b、U87MG和JK2细胞系中的活性比较  07  GPR56GPR56是粘附类GPCR家族的成员，在大脑发育、免疫调节、HSC生成和肿瘤发生中具有重要功能。GPR56在多种肿瘤类型中高表达，包括结直肠癌、乳腺癌、肝癌、胰腺癌、肺癌和卵巢癌等[21]。GRP56的缺失可以抑制结直肠肿瘤的生长并使癌细胞对标准化疗敏感。GPR56在肿瘤发生中的潜在作用以及在各种肿瘤类型中的高表达为靶向GPR56 ADC的开发提供了理论依据。UTHealth分子医学研究所的科研人员基于已有10C7 mAb开发靶向GPR56的ADC[22]。10C7以高亲和力与GPR56的胞外结构域结合，并增强下游Src-Fak信号传导，被用于治疗CRC，特别是微卫星稳定亚型(MSS)[23]。为了确定最佳的ADC有效负载，研究人员筛选了一系列细胞毒素，探究其在CRC细胞中的效力。根据实验结果，选择含有可裂解Linker (VC)的DNA烷化剂DMSA与10C7通过链间半胱氨酸残基偶联，DAR=3.54 (图9A)。在具有不同GPR56表达水平的CRC细胞系中测试发现，在GPR56高表达CRC细胞系(SW620、SW403和HT-29；IC50=3.7–29.4 nM)中观察到有效的细胞毒性，而对GPR56阴性CRC细胞系没有影响；对照ADC没有诱导显著的抑制活性，表明该杀伤机制是GPR56依赖性(图9B)。同时，10C7 ADC在转移性直肠癌的GPR56+患者来源的肿瘤类器官(PDO)模型中进行活性研究，结果表明与对照ADC的抑制活性相比，10C7 ADC几乎可以完全杀死肿瘤细胞(图9C)。此外，10C7 ADC在MSS CRC细胞异种移植模型中显示出显著的抗肿瘤功效(图9D)。在免疫功能正常的小鼠中进行的初步安全性研究并未显示任何明显的毒性迹象，但由于小鼠和人之间10C7结合表位的序列差异，靶标介导的毒性可能被低估。 图9.GPR56 (10C7) ADC的构建及其体内外活性评价  08  CCR2CCR2在肿瘤浸润性骨髓细胞(包括肿瘤相关巨噬细胞)表达，并通过限制 CD8+ T细胞浸润来促进免疫逃逸。TAK-500[24]是一款免疫刺激抗体偶联物(Immune-stimulating antibody conjugate, ISAC)，由三部分组成：基于TAK-676的STING激动剂作为Payload (目前正在进行Ⅰ期临床评估[NCT04420884、NCT04879849])、IgG1抗CCR2抗体和一个自降解的含有马来酰亚胺的蛋白酶可切割的多肽Linker。TAK-500具有三种可能的作用机制：激活IFN反应、将抑制性肿瘤内CCR2+细胞重编程为炎症表型，以及阻断抑制性肿瘤相关巨噬细胞募集。因此，TAK-500有潜力克服CPI耐药性，用于难治性和免疫排除或荒芜的肿瘤(Immunologically excluded or deserted tumors)治疗。目前，TAK-500已进入Ⅰ期临床试验(NCT05070247, Recruiting)[25]，联合或不联合Pembrolizumab用于患有特定局部晚期或转移性实体瘤的成人患者的治疗。  09  CCR7CCR7属于A类GPCR，在肿瘤细胞迁移、转移和免疫细胞招募中发挥重要作用。CCR7在许多癌症类型中高表达，并与较差的预后相关，使其成为癌症治疗中极具吸引力的靶点。诺华(Novartis)开发了一款靶向CCR7的ADC-JBH492，用于治疗CLL和NHL[26]。JBH492由IgG1抗体组成，通过可裂解Linker与Ravtansine (DM4)偶联(细节暂未批露)。体外研究表明，与正常免疫细胞相比，JBH492优先结合CCR7高表达的肿瘤细胞，并通过DM4介导的细胞毒性和抑制配体诱导的CCR7信号传导发挥作用。在弥漫性大B细胞淋巴瘤PDX模型中JBH492实现部分或完全逆转，在非人类灵长类动物中没有明显的毒性或循环免疫细胞群的变化。JBH492单药疗法目前正在进行I期临床试验(NCT04240704, Recruiting)，用于治疗复发/难治性CLL和NHL患者，同时评估其安全性。  10 GPR20GPR20是一种在胃肠道间质瘤(GIST)中过表达的A类GPCR孤儿受体，大多数成人GIST是由原癌基因受体酪氨酸激酶(KIT)或血小板衍生生长因子受体α (PDGFRA)的激活突变驱动的。目前，唯一批准的GIST疗法是酪氨酸激酶抑制剂(TKI)，但肿瘤经常在KIT中产生继发性耐药突变，亟需更有效的治疗方案来克服这种耐药性。第一三共(Daiichi Sankyo)开发了DS-6157a，将GPR20 mAb通过高度稳定的组织蛋白酶可裂解的Gly-Gly-Phe-Gly (GGFG)四肽Linker与Deruxtecan (DXd)偶联，DAR=8 (图10A)[27]。在过表达重组GPR20 (GIST-T1/GPR20)的GIST-T1细胞和GPR20-NCI-N87胃癌细胞中DS-6157a仅在GIST-T1/GPR20细胞中表现出活性(IC50=156 ng/mL)，证明其对GPR20的特异性(图10B)。在GIST-T1异种移植模型中，使用DS-6157a治疗的两种模型中均观察到显著的TGI；值得注意的是，在GIST-T1异种移植模型中，DS-6157a导致肿瘤消退在治疗终止后持续8周；GPR20 mAb和对照ADC均不影响肿瘤生长，表明TGI依赖于GPR20和DXd (图10C)。重要的是，无论KIT突变状态如何，DS-6157a都能阻止PDX肿瘤生长，而TKI治疗的疗效因获得性或内在耐药性而变化(图10D)。 图10. DS-6157a的构建、活性测试及其克服耐药性的试验安全性研究显示DS-6157a对猴子的毒性极小或轻微，最高非严重毒性剂量为30 mg/kg (人体等效剂量=9.6 mg/kg)，以上数据支持DS-6157a进入临床试验(起始剂量=1.6 mg/kg)。评估DS-6157a单药疗法的安全性、有效性和药代动力学的I期临床试验于2020年5月开始(NCT04276415)。不幸的是，几乎所有患者都经历了轻度至重度治疗引起的和相关的不良事件，其中出现一例治疗相关性死亡(肝功能衰竭)，因此该临床试验被第一三共终止。  11  GPRC5DGPRC5D属于是GPCR孤儿受体，在原代多发性骨髓瘤细胞表面高表达，在正常组织的表达仅限于免疫赦免性的毛囊区域。GPRC5D的过表达与多发性骨髓瘤患者的不良预后和肿瘤负荷有关，这种关联使其成为治疗多发性骨髓瘤的潜在候选靶点。国内礼新医药利用其自有专利技术平台-LX-ADC™-开发了一种新型抗GPRC5D ADC：LM-305[28]，由抗GPRC5D单克隆抗体、蛋白酶可降解Linker和MMAE组成。体外研究表明，LM-305以高亲和力与GPRC5D过表达细胞系和GPRC5D内源表达的MM细胞结合，并呈剂量依赖性。它可以被GPRC5D表达细胞有效内化，并进一步在溶酶体中裂解。当与MM肿瘤细胞(NCI-H929和MM.1R)共培养时，LM-305显示出有效的细胞毒性，IC50值范围为0.1-0.3 nM。体内肿瘤异种移植模型表明，LM-305治疗可对荷瘤小鼠的肿瘤生长产生剂量依赖性抑制；同时，LM-305在GPRC5D高表达MM CDX模型中以3mg/kg 的剂量表现出完全缓解(CR)。此外，LM-305 在动物研究中表现出良好的安全性。基于以上可喜的数据，2023年5月12日，礼新医药已与阿斯利康就临床前阶段的LM-305项目达成全球独家授权协议。根据协议条款，阿斯利康将获得LM-305的研究、开发和商业化的独家全球许可[29]。礼新医药将有资格获得包括首付款在内共计5500万美元的近期付款，以及最高达5.45亿美元的潜在开发和商业里程碑付款，外加全球净销售额的分级特许权使用费。此次授权(Licence-Out)，又是我国本土创新药企昂首挺胸进入全球化“深海”的典范。目前，LM-305已经入Ⅰ/Ⅱ临床试验(NCT05647512; Not yet recruiting)，用于复发性或难治性多发性骨髓瘤(RRMM)和其他浆细胞疾病的治疗，期待能够有好的临床试验结果。  12  US28US28 (四种人巨细胞病毒编码的病毒GPCR之一)已在多种肿瘤中检测到，包括神经胶质瘤、结直肠癌和前列腺癌等；US28可激活致癌信号通路，并在胶质母细胞瘤等肿瘤的进展中发挥肿瘤调节作用[30]。Vrije Universiteit Amsterdam和Utrecht University的科研人员开发了一种靶向US28的纳米抗体偶联物(VUN100-PS)，利用已有的US28-Nb[31]通过其C端未配对的半胱氨酸与水溶性光敏剂Mal-IRDye700DX偶联获得，不影响Nb的结合亲和力(图11)[32]。该偶联物可选择性杀死2D培养物以及3D球体中表达US28的胶质母细胞瘤细胞。这些数据表明靶向GPCR纳米抗体在光动力疗法(Photodynamic therapy, PDT)领域的潜力。 图11. 纳米抗体光动力疗法选择性杀死表达病毒GPCR的胶质母细胞瘤细胞  13  多款靶向GPCR的ADC被暂停除上述处于临床前/临床试验的ADC外，还有多款靶向GPCR的ADC终止研究或出于无进展状态(表2)[33, 34]。表2. 临床试验终止或无进展的ADC药物ADC是增长最快的癌症治疗药物之一，已证明其具有良好的抗肿瘤功效，并已获得FDA批准用于治疗多种实体瘤和血液恶性肿瘤。目前生物制药行业和学术界正在为改善癌症治疗做出广泛努力，有理由推断，针对GPCR的ADC数量在未来几年将继续增加，GPCR超家族将会成为ADC开发的热门靶点。免责声明：本文仅作信息交流之目的，文中观点不代表个人立场，亦不代表个人支持或反对文中观点。本文并非治疗方案推荐。如需获得治疗方案指导，请前往正规医院就诊。刍荛之作，若有纰漏/不足，欢迎各位批评指正(dyc21@mails.tsinghua.edu.cn)，谢谢！ 主要参考文献 1. Hauser, A.S., et al., Trends in GPCR drug discovery: new agents, targets and indications. Nat Rev Drug Discov, 2017. 16(12): p. 829-842.2. Congreve, M., et al., Impact of GPCR Structures on Drug Discovery. Cell, 2020. 181(1): p. 81-91.3. Hutchings, C.J., et al., Opportunities for therapeutic antibodies directed at G-protein-coupled receptors. Nat Rev Drug Discov, 2017. 16(9): p. 787-810.4. https://gpcrdb.org.5. Yang, D., et al., G protein-coupled receptors: structure-and function-based drug discovery. Signal transduction and targeted therapy, 2021. 6(1): p. 7.6. Buck, A.K., et al., CXCR4-targeted theranostics in oncology. Eur J Nucl Med Mol Imaging, 2022. 49(12): p. 4133-4144.7. Kularatne, S.A., et al., A CXCR4-targeted site-specific antibody-drug conjugate. Angew Chem Int Ed Engl, 2014. 53(44): p. 11863-7.8. Wang, R.E., et al., An immunosuppressive antibody-drug conjugate. J Am Chem Soc, 2015. 137(9): p. 3229-32.9. Liu, T., et al., Rational design of CXCR4 specific antibodies with elongated CDRs. J Am Chem Soc, 2014. 136(30): p. 10557-60.10. Costa, M.J., et al., Optimal design, anti-tumour efficacy and tolerability of anti-CXCR4 antibody drug conjugates. Scientific Reports, 2019. 9(1).11. Wang, B., et al., CXCL13-CXCR5 axis: Regulation in inflammatory diseases and cancer. Biochim Biophys Acta Rev Cancer, 2022. 1877(5): p. 188799.12. Johannes, S., et al., Preclinical characterization of BAY-924, a first in class ADC targeting CXCR5-positive B-cell malignancies, with a KSP inhibitor as novel payload. Cancer Research, 2019. 79(13_Supplement): p. 4825-4825.13. Park, S., et al., Unlike LGR4, LGR5 potentiates Wnt–β-catenin signaling without sequestering E3 ligases. Science signaling, 2020. 13(660): p. eaaz4051.14. Carmon, K.S., et al., LGR5 receptor promotes cell–cell adhesion in stem cells and colon cancer cells via the IQGAP1–Rac1 pathway. Journal of Biological Chemistry, 2017. 292(36): p. 14989-15001.15. Gong, X., et al., LGR5-Targeted Antibody-Drug Conjugate Eradicates Gastrointestinal Tumors and Prevents Recurrence. Mol Cancer Ther, 2016. 15(7): p. 1580-90.16. Cui, J., et al., Drug Conjugates of Antagonistic R-Spondin 4 Mutant for Simultaneous Targeting of Leucine-Rich Repeat-Containing G Protein-Coupled Receptors 4/5/6 for Cancer Treatment. J Med Chem, 2021. 64(17): p. 12572-12581.17. Junttila, M.R., et al., Targeting LGR5+ cells with an antibody-drug conjugate for the treatment of colon cancer. Sci Transl Med, 2015. 7(314): p. 314ra186.18. Zeng, C.M., Z. 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