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▲ 详细日程见文末 ▲摘要:伪狂犬病毒（PRV）是一种高度传染性疾病，可感染大多数哺乳动物，猪是唯一的天然宿主，给世界养猪业造成了巨大的经济损失。先天性免疫是宿主抵御病原体攻击的第一道防线，对于适应性免疫的正常建立至关重要。宿主会利用先天性免疫反应来抵御PRV的入侵，但PRV会利用各种策略来抑制先天性免疫反应，从而促进病毒的复制。目前，世界范围内用于预防猪感染PRV的减毒活疫苗，如Bartha K61。然而，越来越多的数据表明，这些疫苗并不能完全抵御自2011年底以来出现的PRV新变种。本文综述了PRV与宿主天然免疫之间的相互作用以及减毒活疫苗的研究现状，旨在促进新型、高效PRV疫苗的研制。关键词：伪狂犬病毒，先天免疫，免疫逃避，减毒活疫苗，重组疫苗。1背景PRV是导致伪狂犬病（PR）的病原体，也被称为奥杰斯基病（AD，Aujeszky’s disease）。PRV属于α-疱疹病毒亚家族，宿主范围很广，虽然猪是它的天然宿主，但包括人、猫、狗、山羊和牛在内的许多哺乳动物也可能感染。猪感染PRV可引起呼吸道、生殖和神经系统症状。处于不同生长阶段的猪会出现不同的症状。受PRV感染的新生仔猪会出现神经系统症状，死亡率高达 100%，而成年猪一般只表现出轻微的呼吸道症状，但会在神经系统中形成终生潜伏感染，这种潜伏感染可被重新激活，成为病毒的动态贮存库。PRV具有大约143kb 的双链DNA基因组，紧密排列，至少70个开放阅读框，并含有两个反向重复序列。几种 PRV 蛋白发挥调节宿主先天性免疫反应的功能，主要包括干扰素(IFN)系统、细胞凋亡和自噬，以促进病毒的产生。先天免疫对病毒感染反应迅速，但病原体清除和预防再感染的关键依赖于后天免疫系统，而高质量的先天免疫反应是建立后天免疫系统的先决条件。因此，了解 PRV 的先天免疫逃避机制对于疫苗的开发具有重要意义。自PRV流行以来，以 Bartha K61为代表的减毒活疫苗在预防和控制该病方面发挥了重要作用。然而，自2011年以来，中国出现了新的变异。Bartha K61对PRV变异株感染不能提供完全的保护作用。新的疫苗的开发是一个必要条件，一些学者认为，增强先天免疫能引起病毒的衰减。病毒先天免疫逃避的破坏可以减少病毒的毒力，同时建立强有力的免疫应答。本文综述了PRV先天性免疫逃避的多种策略，主要包括干扰素系统、自噬和细胞凋亡，以及PRV减毒活疫苗的研究进展。我们希望这篇综述能够为开发针对新型PRV变异体的疫苗提供一些思路。2PRV的先天免疫调节机制病毒感染诱导先天免疫应答，并通过模式识别受体 (PRR) 识别病原体相关分子模式 (PAMPs) 激活抗病毒先天免疫应答。据报道，宿主可以通过几种PRR识别PRV感染: Toll样受体2 (TLR2)，环磷酸鸟苷-磷酸腺苷合酶 (cGAS)，RIG-I样受体 (RLRs)，DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp) 盒多肽41 (DDX41) 和IFN调节因子的DNA依赖性激活剂。随后，特异性信号传导途径被激活以响应病原体感染而产生干扰素、促炎因子和趋化因子。我们总结了参与先天性免疫系统调控的PRV编码蛋白，重点是那些参与逃避 IFN 介导的免疫反应的蛋白（图1；表1）。图1 PRV通过编码多种蛋白质调节IFN介导的先天性免疫应答表1 PRV 因子与宿主的先天免疫系统相互作用2.1 IFN-I系统IFN-I 介导的先天性免疫应答是宿主抵抗病毒感染最有效的防御策略之一。然而，病毒在长期的进化过程中，已经发展出了各种各样的逃避宿主免疫的策略。PRV 通过几种策略调节宿主的先天性免疫反应。采用微阵列技术，用野生型 PRV 株感染细胞后，IFN-β 通常诱导的一部分基因表达下降。在病毒感染后，病毒 DNA 首先被细胞质 DNA 传感器 cGAS 识别，导致 cGAS 中的构象开关催化第二信使 cGAMP 的产生，然后 cGAMP 与位于内质网上的 STING 结合。它们转运到高尔基体，招募TANK-结合激酶1（TBK1）和IRF3/7，并使IRF3/7磷酸化，最后磷酸化的IRF3/7被转运到细胞核，激活编码IFN-I的基因转录。随后，JAK-STAT通路被IFN-I激活，启动数百个ISGs的转录，从而调节细胞因子。PRV 编码一系列蛋白质来规避 IFN-I 介导的先天免疫，其主要靶标是 cGAS-STING 信号通路和 IFN-I 信号通路（表 1）。STING是cGAS-STING 通路中的关键蛋白之一，一项可靠的研究表明，PRV UL13 招募 E3 连接酶 RING-finger 蛋白 5 (RNF5)，以促进 STING 的 K27-/K29 链接泛素化和降解。过氧化物酶1（PRDX1）通过与TBK1和IκB激酶ε（IKKε）相互作用来促进IFN诱导，Lv等人证实UL13能降解PRDX1，从而抑制IFN的产生，这取决于其激酶活性。研究表明，UL13 可通过泛素化和蛋白酶体介导的降解作用降解 IRF3。Bo等人通过筛选50种PRV蛋白发现UL13限制了ifn-β 转录。进一步的研究发现，UL13利用其激酶活性诱导IRF3磷酸化，从而减弱IRF3与其启动子的结合。gE和US3也以多种方式抑制IRF3活性。gE通过降解irf3的伴侣CREB结合蛋白 (CBP) 来抑制IFN的产生。US3抑制IRF3的活性，通过蛋白酶体途径机械降解IRF3。UL24通过降解irf7损害DNA传感途径。ifn-i介导的先天免疫反应是宿主抵抗病毒感染的最有效防御策略之一。然而，病毒已经开发了各种策略来逃避宿主免疫。在漫长的进化过程中。PRV以几种策略调节宿主先天免疫应答。当使用微阵列技术用野生型PRV株感染细胞时，通常由ifn-β 诱导的基因子集的表达降低。病毒感染后，病毒DNA首先被细胞质DNA传感器cGAS识别，导致cGAS中的构象转换以催化第二信使cGAMP的产生，然后cGAMP与位于内质网上的STING结合。JAK/STAT 信号通路在 IFN-I 介导的 ISG 产生中起重要作用。JAK/STAT 通路受 PRV 广泛调控。PRV 阻断了 JAK/STAT 信号通路重要节点 STAT1的磷酸化。几种病毒蛋白在这一过程中发挥积极作用，包括 EP0，US3，UL24，UL42和 UL50。EP0蛋白是通过抑制 IRF9的转录来拮抗天然宿主干扰素应答所必需的。Bcl-2相关转录因子1(Bclaf1)维持 STAT1和 STAT2磷酸化，并通过与 ISRE 和 STAT2直接相互作用来转录 ISG 来促进 ISGF3与 ISRE 的结合。US3通过蛋白酶体途径降解 Bclaf1抑制 ISG 的产生，促进 PRV 的免疫逃避。此外，UL42还干扰 ISGF3与 ISRE 的结合，其他一些研究发现 UL24抑制 ISG (包括 OASL，ISG20等)的转录。发现 UL50降解 IFN 受体以下调 IFN-α 免疫应答。Janus 激酶磷酸化并传导干扰素的抗病毒信号，最近发现 PRV 通过诱导蛋白酶体降解而降解 Janus 激酶。然而，其中涉及的机制仍不清楚。核因子-κB（NF-κB）在调节免疫、炎症反应、细胞增殖和存活方面起着至关重要的作用。NF-κB 的主要形式是由 p50 和 RelA 亚基组成的异源二聚体，它们以抑制活性的状态与 IκB 家族蛋白结合。当细胞受到应激、细胞因子或病原体入侵等各种刺激时，NF-κB 抑制蛋白 IκBα 被激活并与 NF-κB 分离，通过蛋白酶体途径降解，NF-κB 进一步转运到细胞核，激活各种基因的转录。细胞 NF-κB 信号通路受到 PRV 感染的严重影响。最近的研究发现，PRV编码蛋白UL13通过抑制RIG-I和MDA5的转录来调节NF-κB的活化，从而抑制RLR介导的IFN-β的产生，以逃避先天宿主免疫。此外，UL24 与 p65 相互作用，介导蛋白酶体途径中的 p65 降解，从而影响 NF-κB 的激活。总之，PRV 从多个方面调控 IFN 的功能，包括 IFN 的产生和 IFN 信号通路。病毒抑制 IFN 信号转导的能力与毒力之间存在密切的相关性。通过删除 STAT1/2 拮抗剂可以减弱麻疹病毒。一项重要研究发现，PRV 的糖蛋白 gE/gI 复合物能显著抑制浆细胞树突状细胞（pDCs）分泌 IFN。与野生型（WT）PRV 株相比，删除了 gE/gI 的 Bartha K61 减毒疫苗株通过 pDC 触发了更强的 IFN-I 反应。恢复甚至改善在野生型 PRV 感染中受损的 IFN 系统是一种很有前景的抗病毒策略。尽管 IFN 系统并不是病毒毒性的唯一决定因素，但它仍具有重要作用。PRV 的免疫逃逸因子在病毒感染中所起的关键作用为疫苗和抗病毒药物的开发提供了潜在的目标。2.1 细胞凋亡、自噬和坏死细胞凋亡是一种程序性细胞死亡，其特征是细胞膜起泡、染色质凝结和 DNA 断裂，同时保持膜的完整性，形成凋亡小泡。细胞凋亡是宿主抵抗病原体入侵的一种手段，它使受感染的细胞过早死亡，导致病毒增殖中止，并通过轻度释放抗原诱导特异性免疫。有报道称 PRV 诱导细胞凋亡。PRV 的 US3 和 gE 蛋白不仅能拮抗 IFN 系统，还能通过不同途径抑制细胞凋亡。研究表明，US3 可激活 PI3K/Akt 和 NF-κB 通路，从而抑制细胞凋亡；gE 可使细胞外信号调节激酶 1/2（ERK1/2）磷酸化，从而降解促凋亡蛋白Bim。DNA 损伤反应（DDR）对维持基因组完整性至关重要，它根据损伤程度导致 DNA 修复、细胞周期停滞和细胞凋亡。PRV 感染会造成宿主细胞的 DNA 损伤，导致细胞凋亡，最近的研究表明 PRV 与 DDR 之间存在更深入的对话。磷酸化的 H2AX 是 DDR 的标志，而 PRV 的 UL13 可与 H2AX 相互作用并磷酸化 H2AX，从而促进其复制。富亮氨酸 PPR 矩阵蛋白（LRPPRC）是一种多功能蛋白，也是第一个独立于 Caspase 蛋白之外的凋亡蛋白。最近，Xu 等人发现 PRV 的 UL16 蛋白与 LRPPRC 相互作用，减弱了 LRPPRC 对 NF-κB 的激活，而 NF-κB 是 PRV 复制的宿主限制因子。这些基因是开发新型减毒活疫苗时有望减弱 PRV 的靶标。自噬可用于修复细胞内成分，并在细胞饥饿时为细胞提供重要的能量和物质。越来越多的研究表明，自噬是免疫反应不可或缺的一部分。PRV 可诱导细胞自噬，通过经典的 Beclin-1-Atg7-Atg5 途径促进复制。Wnt/β-Catenin信号通路调节细胞增殖、分化和存活。最近的研究发现，PRV 感染会显著激活 Wnt/β-Catenin 信号通路，这可能会通过上调病毒诱导的自噬促进病毒增殖。自噬通路似乎被 PRV 利用，Sun等人的研究表明，PRV 对自噬的调控十分精妙，在感染早期诱导细胞自噬，这与病毒复制无关，随着病毒复制的进展，自噬水平下降。进一步的研究发现，US3 可激活 PI3-K/AKT 通路来抑制自噬。US3 对细胞自噬的抑制有利于细胞存活，并可能促进 PRV 的复制。Bcl2-associated athanogene 3（BAG3）参与调节细胞凋亡、发育、细胞骨架组织和自噬。BAG3 可抑制 PRV 复制，PRV 蛋白 UL56 与 BAG3 相互作用，并通过溶酶体途径降解 BAG3；但在 WT PRV感染中却观察不到这种现象。PRV的其他一些蛋白可能会拮抗UL56降解BAG3的活性，具体细节还有待进一步探讨，BAG3可能是生成稳定细胞系以生产高水平PRV减毒活疫苗的潜在靶标。坏死是一种不同于细胞凋亡的细胞死亡形式。在受体相互作用蛋白激酶 3（RIPK3）及其伴侣蛋白（RIPK1、TRIF、DAI 或其他）的帮助下，混合谱激酶结构域（MLKL）被激活，导致细胞破裂，释放出大量与损伤相关的分子，并引发炎症反应。PRV 以依赖 RIPK3 的方式导致细胞坏死，而抑制坏死会促进 PRV 复制。PRV 是否会阻断坏死尚不清楚，但其他一些疱疹病毒，如小鼠巨细胞病毒（MCMV）编码的 M45/vIRA 可阻断 RIPK3 的活性，同样，HSV-1 编码的核糖核苷酸还原酶大亚基（ICP6）可与人体细胞中的 RIPK3 相互作用，从而抑制坏死。这些信息表明，PRV 可能具有某种潜在的能力来抑制细胞坏死，从而促进其复制。细胞凋亡、自噬和坏死是细胞死亡的三种典型形式，随着时间的推移，这些形式的细胞死亡的独立性和相关性得到了越来越多的认识。当细胞受到刺激并相互转化时，可以同时诱导多种类型的细胞死亡。PRV 感染与宿主死亡率之间的关系是复杂的，PRV 与宿主之间的相互作用是研制抗 PRV 感染的新型疫苗和抗病毒药物的基础。3PRV变异体的基因组进化目前，许多欧美国家已宣布自己不再感染 PRV，中国已通过接种 Bartha K61疫苗有效地控制了 PRV 感染。自2011年以来，中国东部和北部的几个养猪场发生了 PRV 感染暴发，更令人担忧的是，这些受感染的猪已经接种了PRV疫苗。2011年以前，尽管不同的 PRV 分离株的生物学特性不同，但只有一种PRV血清型。他等人根据 PRV全长序列构建了最大似然树，结果表明目前的PRV分离株可分为基因型1和基因型2两个不同的分支。利用 gC 基因构建的最大进化枝可信度树证实了 PRV 分为进化枝1和进化枝2，同时表明这两个进化枝已经独立传播了几个世纪。最大似然树分别基于 gB 和 gD 构建，PRV 分为两个进化枝，毫无疑问，Bartha K61和2011年后的变异被分配到不同的进化枝。有趣的是，2011年以后，中国的 PRV 分离株主要是基因型2，这部分解释了为什么 Bartha K61疫苗(基因型1)不能提供对新型 PRV 变异体的完全保护。GB、 gC 和 gD 是主要的抗原基因，易发生突变，因此经常用于 PRV 系统发育分析。抗原基因的独立系统发育分析使得更容易理解疫苗和不同毒力株之间的关系。研究表明，PRV 变异体 gC 和 gD 的突变在逃避 Bartha K61诱导的免疫中起关键作用。天然突变和重组体促进 PRV 菌株多样性的变异。翟等人于2017-2019年间从中国东部的养猪场采集了 PRV 样本。根据 gC 基因，这些 PRVs 属于进化分支2。主要 PRV 糖蛋白 gB，gC，gD 和 gE 的测序分析显示分离物内氨基酸序列分歧最大，分别为4.0,0.7,0.3和1.1% 。与 Bartha K61疫苗株相比，这些分离株在几个蛋白位点有突变，特别是 S41G，R162H 和 S345L 在 gC 上的变化可以改变受体结合和/或糖基化，这可能导致变异 PRV 的出现。自然重组加速了病毒基因组的进化，生物信息学分析表明，在 PRV 基因组中经常发生包被和包被重组。Tan 等人发现了一种新的 HN2019 PRV 毒株，它来源于经典 PRV (如 Ea)和 HB-98疫苗毒株的重组。胡等人利用 Bartha K61对所有中国分离株进行重组预测，得到23个重组事件。Bo 等人发现 Bartha 菌株为重组 JSY13变体提供了部分基因。早期伪狂犬病病毒 SC 株是介于中国地方性病毒株和巴萨疫苗样病毒株之间的重组病毒株。这些报道表明，重组在中国 PRV 的演变中起着关键作用。Bartha K61是近半个世纪前引入中国的，长期免疫对 PRV 的突变和重组有很大的贡献。因此，PRV 的监测和进化分析对于 PR 疾病的预防和控制非常重要，而这些信息可以为 PRV 疫苗的开发和使用提供关键信息。4PRV活疫苗接种疫苗是预防传染病的最有效策略之一。根除 PRV 运动的成功主要归功于应用了优良的 PRV 疫苗。然而，传统的疫苗接种并不是一劳永逸的解决方案，人类与传染病的斗争仍在继续。PRV 变异体在中国的流行促使我们集中精力开发新的和更有效的疫苗来阻止 PRV 变异体大流行。减毒疫苗保留了病原体的大部分自然结构。尽管如此，它们在体内的复制能力和毒力降低，现在普遍认为减毒疫苗提供更好和更完整的免疫保护，特别是 T 细胞介导的免疫(图2)。减毒活疫苗是目前应用最为广泛和发展最为迅速的疫苗。本节总结了目前减毒活疫苗和基于病毒载体的活疫苗研制的进展和关键问题，并对新型活疫苗的研制提供了见解。图2 野生型伪狂犬病毒和减毒活疫苗可诱导体内产生后天免疫系统4.1减毒活疫苗大多数 PRV 疫苗是基于部分基因缺失的减毒活疫苗。PRV的美国区基因US3、 US和US8是主要的毒力基因，被认为是对PRV复制不重要的非核心基因。US2在大多数疱疹病毒中保守，通过调节ERK的定位间接调节MAPK的活性。另一项研究表明，缺失PRV us2基因会增加病毒滴度。US9是一种膜蛋白，在病毒传播过程中发挥着至关重要的作用疱疹病毒(包括 PRV)的顺式神经传输。UL23编码一个与PRV毒力相关的非结构蛋白 PK，几乎不具有免疫原性。目前这些基因常被用作PRV衰减剂。第一株PRV减毒活疫苗 Bartha K61株是最好的改良活疫苗之一。对巴沙 K61疫苗株进行了体外连续传代，获得了减毒特性。后来，研究人员在 Bartha K61的美国区域发现了许多缺失，包括 US8和 US9基因的完全缺失和 US7和 US2基因的部分缺失。随着 PRV 遗传学和分子生物学的进步，PRV 基因的作用还没有被恢复，更多的基因缺失的 PRV 疫苗正在通过各种技术被开发。基因工程技术，如同源重组、细菌人工染色体和 CRISPR/Cas9基因编辑系统，可以快速构建基因缺失的菌株，作为活的减毒性病毒候选菌株。这主要包括单基因缺失、双基因缺失、三基因缺失、四基因缺失和五基因缺失疫苗(表2)。表2 PRV减毒活疫苗概述尽管减毒活疫苗对PR的预防和控制具有重大意义，但一些研究人员对减毒活疫苗在易感动物中的安全性提出了质疑。减毒性病毒菌株rPRvtJ-delgE/gI对猪是无毒的，但对绵羊是致命的，这表明gE和gI的缺失可能不足以减弱。另一组基于PRVΔTK&gE-AH02株构建TK/gE双基因缺失疫苗，导致1日龄无PRV抗体仔猪死亡。基于PRVΔTK和gE-AH02的PK基因缺失导致PRV病毒进一步减弱，并且在接种没有 PRV 抗体的新生仔猪后没有观察到临床症状。最近的一项研究发现，基于gE/TK缺失菌株的 US3基因的进一步缺失在具有更高水平的中和抗体，细胞因子和组织驻留记忆T细胞(TRM)的小鼠中具有更好的免疫原性。值得注意的是 US3编码的PK蛋白，它广泛参与PRV的免疫逃逸，如第1.2节所述。因此US3基因可能成为活体减毒性病毒设计和开发的有希望的目标。越来越多的基于突变体的减毒PRV疫苗已经开发出来，但仍有一些问题需要进一步考虑。首先，减毒剂仅限于US2、 US3、 US7、 US8、 US9和UL23的单个或多个缺失，下一步需要进一步开发新的减毒相关基因; 其次，多基因缺失后的病毒生长特性很少受到关注，一些基因缺失可能会降低病毒滴度，影响减毒活疫苗的生产; 最后，该疫苗在除猪以外的动物中的安全性有待进一步研究，特别是在非人灵长类动物中。为了控制新的 PRV 变种，更新疫苗株以匹配循环株是最关键的。因此，必须继续监测现场菌株的变化，并据此构建新的候选疫苗。我们的一般概念是，疫苗的安全性与毒力相关基因缺失的数量呈正相关，但更多的基因缺失对疫苗株的免疫原性和产量有更大的影响。减弱病毒免疫逃避是构建减毒疫苗的一种策略。先前的研究显示，US3、 US8、 UL13、 UL16、 UL24、 UL42、 UL50和 EP0有助于 PRV 逃避宿主的先天免疫，因此这些基因具有构建减毒性病毒的潜力。免疫逃逸基因的引入可以降低 PRV 的毒力，提高其安全性。例如，Wang 等人构建的 PRV EP0缺失突变体对 IFN-α 介导的抗病毒免疫更敏感。另一个研究小组构建了一个 UL50缺失的 PRV 突变体，该突变体对 IFN-α 介导的病毒抑制类似敏感。尽管缺乏动物研究来验证这些基因降低毒力的能力，将 PRV 免疫逃逸基因导入目前的减毒活疫苗是一个有希望的策略来产生新的 PRV 活疫苗。4.2. 抗多种病原体的减毒重组PRV活疫苗猪至少受到40种病原体的威胁，其中包括16种病毒、15种细菌、8种寄生虫和1种原生动物。近年，猪只传染病如非洲猪瘟、口蹄疫、猪只繁殖与呼吸系统综合症、猪细小病毒和流感等已被广泛记录。针对每一次潜在的疫情爆发，采用适当的疫苗接种是最有效的方法，但现场存在许多混合感染。不同疫苗在短期培养周期内多次正确接种是很难实现的。异源抗原基因在病毒基因组中的插入和表达导致额外的免疫保护或增强的免疫效应是一个令人兴奋的研究课题。PRV 有一个很大的基因组，如前所述，一些基因的缺失使其减弱而不会显著影响其生长能力和免疫原性。几种基于伪狂犬病毒的载体疫苗已经研制成功。例如，共同表达流行性乙型脑炎病毒(JEV)的 PrM-E，经典猪瘟病毒(CSFVs)的 E2，口蹄疫病毒 p12A 和3C，PPV VP2，猪三角冠病毒(PDCoV)穗(S) ，PRRSV gP5和 M，ASFV 和SARS-CoV-2S 或 N 的 CP204L (p30) ，CP530R (pp62) ，E183L (p54) ，B646L (p72)和 EP402R (CD2v)基因。这些多价疫苗对许多疾病具有预防作用，但其在猪体内的安全性和有效性仍有待进一步研究。这些研究表明，基因缺失的减毒 PRV 病毒可以作为一种有前途的载体来开发针对两种或两种以上病原体的多价疫苗。分子佐剂通过多种机制调节免疫系统，从而提高疫苗的效力。设计合适的分子佐剂来构建基于基因缺陷PRV的重组活疫苗是一个很有前景的方向。Zheng等人构建了表达PPV VP2蛋白和猪IL-6的重组PRV，显著增加了 PPV 特异性淋巴细胞的增殖。将Fms相关酪氨酸激酶3配体（Flt3L）插入到TK和gE缺陷的PRV中，构建重组HNX-TK-/gE--Flt3L，可显著促进树突状细胞的成熟和活化(DCs)。5结论PRV仍然是猪的主要传染源之一。此外，人类感染PRV的持续发生增加了 PRV 的风险水平。PRV利用多种策略逃避宿主先天免疫。先天性免疫逃逸基因的修饰或缺失是开发新型减毒活疫苗的一个有前途的策略。减毒性病毒活菌株也是研制新型多价疫苗的良好载体，可对抗病毒、细菌和支原体等两种或多种病原体，特别是与呼吸道有关的病原体。另外，合适的分子佐剂的插入可以大大提高疫苗的保护效率。尽管已有几种 PRV 疫苗应用于临床，但加快新型疫苗的研制是当前PRV变种和其他病原体流行的迫切需要。参考资料：Nie Z, Zhu S, Wu L, Sun R, Shu J, He Y, Feng H. Progress on innate immune evasion and live attenuated vaccine of pseudorabies virus. Front Microbiol. 2023 Mar 3;14:1138016. doi: 10.3389/fmicb.2023.1138016. PMID: 36937252; PMCID: PMC10020201.为了推动兽用生物制品行业交流，共同探讨该领域的最新研发进展、产业化现状及未来发展趋势，生物制品圈联合四叶草会展、乘风济海将于2024年4月17日-18日在南京共同举办“兽用生物制品研发和产业化大会”，系中国医药全产业链新资源大会（CBC大会）中的一个分领域专业会议。诚邀全国相关领域研究者共享学术盛会。名称：兽用生物制品研发和产业化大会时间：2024年4月17日-18日（周三-周四）地点：南京国际展览中心主办单位：生物制品圈、抗体圈、四叶草会展，乘风济海媒体支持：药时空、细胞基因研究圈报名方式：扫描下方二维码或点击文章最底部“阅读原文”→ 填写表格 → 报名成功组委会获得报名信息后，根据报名信息进行初筛，并进一步与报名者沟通确认，实现精准邀请（严格审核通过）。大会日程注：大会日程以会议现场为准。中国医药全产业链新资源大会（CBC大会）是一场将“政、产、学、研、用、管、投”各方精英围绕全产业链新资源展开的合作大会，将于2024年4月16日-18日在南京国际展览中心举办。大会将主打“全产业链新资源对接”，围绕投资、立项、临床前研发、临床研究、生产、供应链国产化、销售、MAH合作、国际品种合作、公司股权合作与并购全产业链，为中国医药同仁带来全新的资源与商机。大会下设的同期会议包括：宠物药品、食品、保健品新资源大会兽用生物制品研发和产业化大会透皮技术研发生产与注册开年分享会吸入制剂研发、生产与注册新机遇新进展分享会中国改良新药与缓控释制剂全产业链合作大会陆续更新中......识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

近年来，利用脂质纳米颗粒制剂的mRNA技术已成为一项开创性的技术，使得能迅速研发并接种数十亿剂新型冠状病毒病（COVID-19）疫苗。然而，避免mRNA药物和疫苗出现不可接受的毒性仍然是一项重要挑战。脂质纳米颗粒的结构组分、生产方法、给药途径以及由复合mRNA所产生的蛋白质可能存在着毒性问题。最近，美国波士顿东北大学的Mansoor M. Amiji团队在《Nature Reviews Drug Discovery》中发表了一篇综述文章“Strategies to reduce the risks of mRNA drug and vaccine toxicity”。该综述深入探讨了新型mRNA的潜在毒性问题以及在临床前开发过程中用于减少mRNA药物和疫苗潜在风险的方法和新兴策略。特别是关于mRNA和脂质纳米颗粒在细胞趋向性和组织分布方面可能导致的毒性，以及它们可能具有的致敏性。下面让我们一起学习这篇重要的文章。新年倍速开工 | 文末有送书福利1 引言mRNA 技术已被证明是一项颠覆性的生物医学技术，相比传统疫苗和药物开发具有许多优势，包括短制造时间和通过简单改变 mRNA 序列实现多种应用。但mRNA 在疫苗和药物临床应用中仍然相对较新，这带来了需要解决的重要安全问题。目前已有数十种应用 mRNA 技术的药物和疫苗处于晚期开发和临床试验阶段，涉及呼吸和潜伏病毒、罕见疾病、癌症、自身免疫疾病和许多其他人类健康状况。如何有效地减少与 mRNA 技术相关的潜在毒性风险是一个主要挑战。与生物制剂以及传统小分子药物的某些方面相似，将 mRNA 药物和疫苗应用到研究和开发流程中具有很强的相似性。这包括首先确定治疗领域的未满足需求，评估是否可以开发 mRNA 以满足这些需求。一旦确定了目标领域，就要进行 mRNA 药物和疫苗的早期开发，包括对适当部位的预临床药理学评估和验证预期能够提供临床益处的反应水平。毒理学评估可同时进行，或随后在先验临床动物模型中进行，以帮助预测人体暴露情景。虽然美国参议院通过了食品和药物管理局现代化法案 2.0，S.5002，未来可能更频繁地使用替代动物模型来评估毒性风险，但目前毒理学评估仍在相关动物模型中进行。在非临床阶段，毒理病理学评估了暴露于 mRNA 药物和疫苗的潜在人体风险。此外，非临床研究提供了足够持续时间和剂量暴露的毒理学资料，以支持这些试验性 mRNA 药物和疫苗进入临床试验阶段。与一些生物制剂一样，用于生成功能蛋白的 mRNA 可能导致毒性。此外，大多数 mRNA 药物和疫苗主要是通过含有许多缓冲和小分子脂质组分的脂质纳米颗粒（LNPs）进行传递，这些组分也可能引起毒性。当前 mRNA 药物和疫苗传递配方的复杂性增加了来自各种因素的毒性风险。除了一些单剂疫苗或基因编辑目的，mRNA 药物和疫苗可能需要重复剂量，这会带来额外的毒理学关注。专栏1 mRNA药物和疫苗的发展现状。核酸治疗为治疗DNA或RNA水平上的疾病的新型药物和疫苗设计带来了突破性的变革。mRNA平台具有利用细胞质中的细胞器将蛋白质翻译为蛋白质和酶替代疗法、抗病原体免疫、癌症免疫疗法和基因编辑的优势。FDA批准的针对2019年冠状病毒病（COVID-19）的mRNA疫苗是该平台快速、高效和安全预防病原体的出色示范。此外，mRNA为治疗由蛋白质或酶功能异常或缺失引起的疾病提供了有前景的平台。原位蛋白质表达使其能够有效运送到细胞亚细胞器，从而提高治疗效果。天然mRNA降解和蛋白质代谢率限制了它们的治疗效果的持续时间，但与DNA或传统蛋白质治疗相比，其疗效和持久性仍然更胜一筹。与基因治疗相比，mRNA活性不受核膜渗透性的阻碍，因此不会由于靶向添加到DNA片段中引发易位突变的风险。由于mRNA平台的多功能性，已经合成了许多不同的药物和疫苗候选物来治疗各种疾病和预防多种病原体。这些候选物通常与现有或新型的脂质纳米粒构建物结合，以增强疗效并避免不良反应。到2023年年中，有41种用于传染性疾病的mRNA疫苗和10种用于癌症免疫疗法的mRNA疫苗处于II期或更进一步的临床试验阶段，此外还有21种用于其他目的（例如蛋白质替代疗法）的mRNA制剂正在开发中。2 翻译mRNA治疗技术一旦鉴定出蛋白质靶点，可以通过体外转录（IVT）在无细胞环境中合成其mRNA序列：线性化的质粒DNA分子与核苷酸酶共在存在细菌噬菌体RNA聚合酶（其中T7是最常用的）的情况下结合；聚合酶然后识别DNA模板中的启动子区域，并在核苷酸存在下合成RNA转录本。然而，未经修饰的IVT mRNA存在免疫原性异常和细胞内递送效率低的问题。mRNA治疗的成功临床应用是由两个科学里程碑推动的：降低IVT mRNA的免疫原性和研发能够将其递送至细胞质的脂质纳米粒（LNPs）。图1：对未经修饰的IVT mRNA的先天免疫反应。a, TLR3的内体信号传导上调IL-1受体相关激酶M（IRAK-M）和肿瘤坏死因子（TNF），并激活核转录因子干扰素调节因子1（IRF1）和核因子κB（NF-κB）。b, TLR3的内体信号传导导致细胞内TNF水平增加。意外的双链RNA可以激活细胞质内的黑色素瘤分化相关蛋白5（MDA5），并导致细胞内干扰素-β（IFNβ）和细胞外IL-6水平增加。ER，内质网；IVT，体外转录。消除IVT mRNA的免疫原性消除IVT RNA的异常免疫原性对其临床推广来说是非常重要的。这一点由一项开创性的研究所发现：核苷酸甲基化和假尿苷的应用可以减轻IVT ssRNA的先天免疫识别。特别是，当树突状细胞暴露在假尿苷、N6-甲基腺苷、5-甲基胞苷或2-硫胞嘧啶合成的ssRNA中时，它们的TNF或IL-12分泌减少。此外，经修饰的ssRNA在稳定表达TLR3、TLR7或TLR8的HEK293细胞中不会激活它们，这些细胞产生的IL-8比未经修饰的ssRNA处理时要少。核苷酸修饰从那时起在开发免疫耐受性和有效的治疗性mRNA应用方面起到了关键作用。用于治疗应用的in vitro合成的mRNA通常进行双链RNA纯化，并进行某种核苷酸修饰。还应用了其他设计修改。在模板中编码3'端的poly(A)尾部添加了120-150个腺嘌呤，这有助于翻译的启动并增强mRNA链的稳定性。同样重要的是，修饰包括在第一个或第二个核苷酸的2'-O-甲基化核糖上形成5'端N7-甲基鸟苷三磷酸结构，这构成了一个标记IVT mRNA为“自身”的帽子，并阻止了干扰素诱导的四重蛋白重复区域1(IFIT1)的识别。事实上，核苷酸修饰和纯化技术一直在不断优化。例如，N1-甲基假尿苷(1mψ)在假尿苷上提供更好的转染效率，并进一步降低了免疫原性，纤维素纤维与RP-HPLC相比，使双链RNA杂质的含量降到了相当的水平。专栏2: 环状mRNA是线性mRNA的一种有前途的替代品环状mRNA（circRNA）是一种单链mRNA分子，其3'和5'端相连，最初发现于植物类病毒。自那时以来，已在哺乳动物细胞中检测到，并被推测具有各种功能。外源性circRNA触发强效的RIG-I反应，无论是否进行密码子优化、双链RNA纯化或5'帽子修改。通过使用允许各种RNA结合蛋白将其标记为“自身”的人类内含子以抑制体外转录合成的circRNA的免疫原性，以及通过N6-甲基腺苷核糖核酸修饰，实现了对其免疫原性的抑制。另外，已经证明未修饰的circRNA只要充分纯化脱除了线性RNA，就不具免疫原性。在同一研究中，展示了脂质纳米颗粒如何能够有效地将circRNA传递到小鼠的脂肪组织中，在那里的蛋白表达时间比线性mRNA更长。这一现象被归因于circRNA的出色稳定性，避免了由外切酶介导的3'-多聚腺苷酸尾部缩短引发的线性mRNA的主要降解途径。尽管与线性mRNA相比，circRNA具有更好的稳定性，潜在地具有改善的药代动力学，但在其在药物开发中广泛应用之前仍需克服一些障碍。简而言之，这些障碍涉及体外转录过程中的循环化产率，以及需要多种纯化技术以避免免疫原性。如何将mRNA传递到细胞中？将mRNA有效地传递到细胞质是实现高效的mRNA药物和疫苗的先决条件，但由于其体积和负电荷，带负电的长mRNA分子在磷脂双层上扩散非常缓慢。另一个障碍是mRNA在细胞内核糖核酸酶（RNases）以及血液中的核糖核酸酶的快速降解。这些挑战通过将mRNA与脂质结合形成脂质纳米颗粒（LNP）克服了，迄今为止，这是mRNA药物的主要传递载体。与裸露的mRNA传递相比，经脂质纳米颗粒（LNP-mRNA）配制的mRNA受到生物降解保护，具有改善的半衰期、增加的细胞摄取和蛋白翻译。制备LNP-mRNA颗粒是通过混合在乙醇中溶解的脂质和在低pH水溶液中溶解的mRNA分子的混乱混合实现的。通常，LNP配方中的脂质包括可电离（氨基）脂质、聚乙二醇化（PEG化）脂质、胆固醇和助剂脂质，这些脂质可能影响LNP的生物活性、生物降解性和结构稳定性。3 给药途径mRNA产品的给药途径取决于预期的应用（例如治疗和免疫）和疾病病理生理学。根据给药途径，需要调整诸如大小和脂质组成等制剂参数，以改善mRNA的生物药物学特性，包括特定的器官靶向性。到目前为止，肌肉内和肿瘤内注射在临床试验中占主导地位。肌肉内注射疫苗的开发尤其具有前景，因为只需少量抗原的产生就足以引发先天免疫反应，同时也可以启动细胞适应性免疫。的确，在临床试验中，大多数采用肌肉注射的LNP-mRNA制剂都是针对传染病的。为成功免疫需要免疫细胞拦截LNP-mRNA构造、抗原产生以及接入淋巴系统。LNP-mRNA颗粒的大小和表面特性会影响包埋作用（即颗粒被抗体和补体片段标记以被噬细胞摄取），从而影响抗原提呈细胞（如巨噬细胞）的摄取。事实上，mRNA基础的抗原产生使得任何跨膜结构域的自然呈现和多聚体复合物的形成成为可能，从而产生强大的T细胞反应。最近的研究揭示了肌肉注射mRNA疫苗（包括针对COVID-19的疫苗）后的关键免疫事件。总的来说，在肌肉注射LNP-mRNA构造后，树突状细胞、单核细胞和中性粒细胞会浸润注射部位，导致局部炎症。这种初始局部炎症是暂时的，与皮下注射相比较来说较轻，这可能是因为肌肉组织的血管化和淋巴引流更好。在浸润的免疫细胞中，中性粒细胞是最不有效率的mRNA产物转译细胞，因此充足的单核细胞和树突状细胞存在对于有效免疫是必要的。在BioNTech-Pfizer BNT162b2疫苗的案例中，激活的单核细胞、树突状细胞和巨噬细胞负责在小鼠的淋巴引流淋巴结中呈现抗原，但需要提到的是，不结合的LNP-mRNA也可以独立于内吞免疫细胞而扩散到淋巴引流淋巴结。CD4 T细胞激活为滤泡辅助T细胞支持芽囊中心的形成、B细胞的激活以及最终的浆细胞和记忆B细胞的产生。mRNA-1273和BNT162b2疫苗的编码蛋白质及mRNA构造在接种人的引流腋窝淋巴结中被检测到，持续时间长达第二剂疫苗接种后60天；此外，抗原特异性TFH细胞在增强免疫后6个月在循环中被检测到，这意味着在淋巴结或脾脏中持续芽囊中心的活动。尤其值得注意的是LNP-mRNA疫苗中的可电离脂质的兴奋作用。考虑到改良mRNA的免疫原性受到抑制，直到最近还不清楚哪种组分承担mRNA疫苗的兴奋作用。LNPs中的可电离脂质已被证明能够在小鼠中通过单次肌肉注射诱导IL-6、抗原特异性CD4 T+FH细胞的产生以及在芽囊中心中B细胞的分化。该研究表明，可电离脂质组分单独 （而非mRNA）通过刺激先天免疫系统在与RNA感知相关的TLR或RLR信号通路之外提供兴奋作用。相反，另一项研究表明，mRNA-1273和BNT162b2疫苗的mRNA成分确实通过与MDA5相互作用，产生I型干扰素，从而在小鼠中诱导强烈的CD8 T细胞产生。到目前为止，LNP-mRNA疫苗的兴奋作用和免疫原性似乎取决于脂质和核酸组分，而潜在的免疫刺激协同作用尚未被充分解决。肌肉内途径也是癌症免疫治疗的首选途径。mRNA基因的癌症免疫治疗被转化成肿瘤相关抗原或新抗原。肿瘤相关抗原是癌细胞中过度表达的蛋白质和酶，而新抗原是仅由癌细胞表达的蛋白质。治疗效果依赖于这些抗原的翻译和呈现，如果成功和充分，就会招募CD8和CD4 T细胞对携带它们的癌细胞进行攻击。一种这样的制剂正在进行I期剂量逐步升级研究，以评估其作为单药物免疫疗法对切除实体瘤或与pembrolizumab（一种抗PD1单克隆抗体）联合用于不可切除实体肿瘤的安全性（NCT03313778）。这里值得一提的是肿瘤内注射在癌症免疫疗法中也被使用。在一项I期研究中，输送的mRNA编码细胞因子IL-23和IL-36γ以及刺激OX40通路的抗肿瘤细胞因子在实体瘤微环境内增强患者的免疫应答（NCT03739931）。皮内注射和皮下注射是具有潜力的替代途径，在几个体外和体内研究中得到了证明。通过皮内途径输送后，表皮和真皮中的朗格汉斯细胞和树突状细胞可以有效地进行抗原呈递和免疫应答，用于疫苗接种对抗病原体或用于癌症免疫疗法。在体内，自我扩增的mRNA通过皮内给药在转染效率方面超越了电穿孔技术。在另一项研究中，单次皮内给药编码血管内皮生长因子C的mRNA-LNPs可以促进淋巴生长并在小鼠中缓解实验性淋巴水肿。最后，需要提到的是，皮下注射（即注射到真皮下的脂肪组织中）也可用于免疫目的，并已证明可以在小鼠黑色素瘤模型中诱导强烈的细胞毒性T细胞免疫应答。静脉注射是mRNA治疗的一种常见途径，但面临着一些挑战。静脉注射后，脂质纳米颗粒(LNP)-mRNA构建物主要分布在脾脏和肝脏。高的脾脏生物分布是由于LNP-mRNA的上包被作用，这促进了其被单核巨噬细胞（MPS）中的脾脏巨噬细胞摄取，同时也促使LNP-mRNA通过脾脏窦内窦血管的大的内皮间隙漂移。肝脏生物分布也很显著，同样是因为被驻留的巨噬细胞和组织渗出所促使的。但肝脏LNP-mRNA生物分布进一步被与肝细胞之间的配体-受体相互作用所增强。具体来说，LNP进入血液循环时形成的蛋白质和脂质层（生物分子外晶）富含载脂蛋白E（ApoE），ApoE是肝细胞上的低密度脂蛋白受体（LDLR）的天然配体。值得注意的是，其他外晶配体-细胞受体相互作用也已显示可促进肝脏中LNP-mRNA的摄取。虽然LDLR-ApoE相互作用不仅局限于肝脏，但它们在肝脏生理特点下更为便利：总血量的10-15%通过肝动脉和门静脉到达肝脏，其中60%在小容量窦内窦中。在那里，血流减慢减缓了纳米颗粒的输送速度，并使其与肝细胞和非实质细胞（如库普弗细胞、星状细胞和内皮细胞）发生接触和摄取。总之，肝脏生理学和生物分子外晶介导的LNP-mRNA颗粒细胞摄取使其在肝脏被被动靶向，而导致了肝脏以外的生物分布的减少。由于mRNA的短暂性，可能需要重复给药才能维持慢性酶替代治疗或需要定期产生抗体或细胞因子的治疗效果。尽管LNP-mRNA制剂可能会引起免疫反应，但大部分已发表的研究侧重于其治疗应用。如果无法避免或通过抗炎药物抑制先天免疫反应，那么挑战就是使其短暂、可耐受，并且足够稀疏，以避免慢性炎症。除了不良反应，重复给药的PEG化纳米药物制剂还存在另一个已被广泛研究的问题，即加速血浆清除（ABC）。ABC被描述为一种免疫反应，其假定机制涉及在第一剂剂量后产生与PEG成分相互作用的IgM。在随后的剂量中，抗PEG IgM介导的补体活化导致颗粒被MPS（主要是在肝脏中）大量吞噬。由于ABC，如脂质体类了阿霉素盐（DOXIL）的PEG化脂质制剂的重复给药导致了缩短的半衰期和明显的肝脏生物分布。最终，如果PEG组分与预期的应用和给药方案不匹配，那么LNP-mRNA制剂中的PEG组分可能会成为问题。口服给药是LNP-mRNA领域中不发达的一种途径，尽管它具有最高的患者依从性。口服给药的一个主要问题是胃相的酸性pH，会质子化可离子化脂质，并在胃肠道中过早释放mRNA内容，其中核酸酶会迅速降解。即使在胃相的低pH或胃肠道中的脂酶和酯酶存在下，如果可以保持结构完整性，LNP-mRNA颗粒的生物可及性也会受到覆盖在肠上皮细胞上的黏液糖蛋白层的限制。针对预临床毒性的评估旨在确定耐受性良好且高效的LNP-mRNA制剂。当观察到毒性时，会进行调查性的体内、体外和体外实验，以了解潜在机制，并在理想情况下改善正在开发的制剂设计。本节讨论了关于免疫病理反应以及肝脏或脾脏毒性的研究，这是mRNA基药物和疫苗在预临床开发中面临的主要安全问题。除非另有说明，我们只考虑了修改和/或经过dsRNA纯化的mRNA的研究。4 临床前毒性已终止的探索性mRNA药物和疫苗临床试验如表1所示。这些终止的原因各不相同，包括疗效低和药物候选品风险-效益概况的意料之外的变化。预临床安全评估旨在识别耐受性良好且有效的LNP-mRNA制剂。当观察到毒性时，研究人员通过体内、体外和体外实验来调查潜在机制，并在理想情况下改善正在开发的制剂设计。本节讨论了对LNP包裹IVT mRNA的免疫病理性和肝脾毒性的研究，这是基于mRNA的药物和疫苗的预临床发展中的主要安全问题。除非另有说明，本节只考虑经过修饰和/或双链RNA纯化的mRNA的研究。表1 已终止的mRNA药物和疫苗临床试验数据收集日期为2023年11月12日。涉及的研究机构包括：奥古斯特·皮·伊苏尼尔生物医学研究所、IrsiCaixa、比利时热带医学研究所、布鲁塞尔自由大学、Synapse bv、Asphalion、eTheRNA免疫疗法、CR2O、巴塞罗那克林尼克医院、Germans Trias i Pujol医院和布鲁塞尔大学医院。肝脏和脾脏毒性由于脂质体-载体mRNA在肝脏和脾脏中的显著生物分布，微观观察和肝脏、脾脏的组织病理学在临床前开发中是标准做法。急性药物性肝损伤常通过测量血浆中丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）和碱性磷酸酶（APT）水平来评估。可预期，大多数公开可获取的促进脂质体-载体mRNA治疗应用的研究仅报告了轻微的病理学发现。在一项这样的研究中，合成了编码人类甲基丙二酰辅酶A羧基转移酶（hMUT）的修饰mRNA，用于治疗甲基丙二酸血症/酸尿症（MMA，一种超罕见代谢紊乱）低表型小鼠模型。在最高静脉注射剂量的脂质体-载体mRNA制剂中，没有临床化学发现，但80%的小鼠出现与中央脾动脉旁边淋巴细胞轻微减少的情况。这种效应被归因于脂质体-载体，而不是hMUT mRNA或其表达，因为在携带增强型绿色荧光蛋白（EGFP）mRNA的脂质体-载体中也观察到了这种效应。另一项研究中，使用编码人类精氨酸酶的修饰mRNA治疗缺乏精氨酸酶的小鼠模型。尽管无生化或组织病理学发现，但接受单一防治剂配方的火萤鳞蛾荧光酶mRNA组肝脏切片的电子显微镜显示亚微米级脂滴。最后，注射编码流感血凝素H3抗原的脂质体-载体mRNA制剂导致兔子的AST、ALT和C-反应蛋白水平增加。肝脏组织病理学发现包括局部脊下空泡化，炎症细胞和红细胞浸润，脾脏的细胞增生（淋巴细胞扩展）观察于生发中心。总之，静脉和肌肉注射脂质体-载体mRNA后可能出现肝脏或脾脏的致病性，并且似乎肝细胞对脂质组分的摄取能扰乱脂肪酸和脂质管理。免疫应答纳米药物引起的不良免疫反应包括疫苗接种后的反应原性、过敏反应、全身性补体免疫反应和细胞因子介导的反应等。部分基于mRNA的COVID-19疫苗接种后罕见的免疫不良反应机制正在逐渐明确。在临床前开发中，LNP-基于mRNA的治疗可能会受到这些反应的影响，从而降低其安全性和治疗效果。由于其固有的组成复杂性，确定特定LNP-mRNA复合物中哪个组分引起了不良的先天免疫反应，以及可能加剧这些反应的条件（剂量、给药途径、存在的炎症等），并非易事。在本节中，将根据测定的结果，即Toll样受体（TLR）激活和细胞因子分泌、炎性体激活和补体激活，讨论有关LNP制剂的IVT mRNA的免疫病理学的现有文献。LNP-mRNA的TLR激活和细胞因子分泌有迹象表明LNP-mRNA通过刺激TLR可能会导致细胞因子的产生（图2a）。在一项相关研究中，先用脂多糖（LPS）挑战小鼠，然后进行单次静脉注射LNP-mRNA后，小鼠血清中出现了IL-6、C-C趋化因子配体2（CCL2）和其他促炎细胞因子的水平升高，肝组织均匀化中出现C-X-C趋化因子配体2（CXCL2）。当小鼠接受空载脂质体时出现类似的免疫反应，这表明可离子化的阳离子脂质（Acuitas专有）是免疫刺激组分。在已经去除巨噬细胞的小鼠以及Tlr4-/-小鼠模型中，炎症表型消失。有趣的是，使用其他两种可离子化的阳离子脂质（DLin-MC3-DMA或C12-200）的mRNA配方也产生了类似的发现。这些结果引发了关于LNP-mRNA复合物的其他组分或其生物分子胞质膜可能刺激膜相关TLRs的问题，假设可离子脂质不会大量显示在颗粒的最外层。图2: 作为对LNP制剂修饰IVT mRNA的响应的细胞因子释放。a，先用脂多糖（LPS）挑战后，脂质纳米粒子中的mRNA（LNP-mRNA）引发Toll样受体4（TLR4）。随后可以在血清或组织匀浆样本中检测到C-C趋化因子配体2（CCL2）、C-X-C趋化因子配体2（CXCL2）和IL-6。b，干扰素-β（IFNβ）释放、LPS挑战或TLR4触发可以独立抑制转染效率。在某些情况下，转染效率下降归因于内体逃逸不良和蛋白激酶R（PKR）磷酸化（P），但这些事件的相对贡献尚不清楚。详细信息请参阅主要文本。ER，内质网。在一项独立研究中，外泌体TLR4和LNP-mRNA在小鼠巨噬细胞外体经LPS预处理后共定位，从外体验证了LNP-mRNA在存在预先炎症条件下通过TLR4触发先天免疫系统的假设（图2b）。在这些条件下，内体逃逸受到了影响，而TLR4下游的蛋白激酶R（PKR）的磷酸化至少部分地导致了细胞质mRNA翻译的减少。本研究中使用的阳离子可离解脂质是cKK-E12，与C12-200类似，也具有长烃链替代的嘧啶基团。尽管没有包括单独的LNP控制组，但与TLR4相关的这些发现指向了脂质介导的生物学效应。皮下注射离子性阳离子脂质基（专有于Acuitas）的LNP制剂、非编码多胞嘧啶mRNA产生了类似的，尽管是局部的炎症效应。单次注射导致了编码促炎性IL-1β、IL-6以及CXCL和CCL蛋白的基因上调。RNA测序（RNA-seq）和基因集富集分析指向了RLR和TLR刺激以及炎症小体激活。空的LNP控制组显示出相同的促炎表型，因此有人认为阳离子脂质可能触发了观察到的炎症反应。在类似实验中，使用离子性阳离子脂质的自增强荧光酶酶mRNA皮下注射在小鼠中引起了强烈的IFNβ产生。此外，荧光酶表达动力学似乎受到同时发生的炎症反应的限制，这表明后者可以严重影响基于mRNA的药物的治疗指数（图2b）。其他阳离子可离解脂质已被证明引起较轻微的先天免疫反应。重复静脉注射以LNP制剂编码因子IX的mRNA不会导致小鼠血浆中TNF或IFNγ水平升高。但是，其他炎症细胞因子，如CCL2、IL-6、CCL4、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）和趋化因子（如在激活时规则，正常T细胞表达和分泌）RANTES短暂增加。在一些研究中，促炎反应更明确地归因于mRNA。改良的EGFP mRNA经皮下电穿孔在小鼠注射部位周围引发了IFNβ产生，但不清楚mRNA是否经过双链RNA纯化。与阳离子脂质的暗示相矛盾的是，一项研究发现，在静脉注射基于C12-200的、LNP制剂的、经过碱基修饰的、乱序的小鼠Epo mRNA后，小鼠血清中出现了强烈的促炎细胞因子反应。IL-6、IL-5、CXCL2和CCL2等细胞因子比空的LNP控制组明显升高，尽管mRNA并不是经过双链RNA纯化的。总的来说，TLR激活和促炎细胞因子的释放作为LNP-mRNA对先天免疫系统的频繁影响，有时会引发强烈的不良反应并影响蛋白质翻译。离解脂质通过激活阳离子性T脂质-4是一种可能的初始事件，尽管精确的分子机制尚未被描述。其他因素也可能对所述的炎症效应的产生或加剧起到作用，这可能取决于有效荷载、剂量或给药途径。炎症小体激活炎症小体激活最近被确定为LNP-mRNA的一个明显的先天免疫系统效应（图3）。向炎性炎症情况发出信号，激活NF-κB以及NOD富含亮氨酸重复和含有蛋白质3（NLRP3）和前IL-1β的转录的经典路径，可能来自TLR激活。第二信号启动NLRP3小体的组装和激活。在一项体外研究中，NLRP3小体激活导致骨髓来源的巨噬细胞在DLin-MC3-DMA基础的LNP-mRNA的体外给药后，mRNA的转染效率降低LPS用于提供原始信号，但mRNA也可能通过TLR激活进行原始信号，因为不清楚是否经过修饰或纯化。溶酶体破裂伴随着LNP-mRNA的逃逸，释放损伤相关分子模式，被提出作为第二信号。然后从IL-1β的释放、剪切的气孔蛋白D和caspase 1的表达以及cathepsin B的成熟来推断NLRP3的激活。图3：LNP-mRNA激活炎症小体。利用脂多糖（LPS）或外周血单核细胞（PBMCs）未经先前挑战的巨噬细胞能激活核转录因子-κB（NF-κB），并诱导产生促炎性 IL-1 细胞因子，同时还会激活典型炎症小体激活途径中的其他分子。这些分子包括半胱氨酸蛋白酶 1、半胱氨酸蛋白酶 B、含有 CARD 结构的凋亡相关斑点样蛋白（ASC）斑点、N-气体磷脂酸 D（N-GSDMD）和线粒体反应性氧化物种（ROS）。LNP–mRNA 指的是被包埋在脂质纳米粒子中的 mRNA；GSDMD NT 指的是 gasdermin D 的 N-末端裂解产物；NLRP3 指的是 NOD-、LRR- 和 pirin 结构域含有蛋白 3；TLR4 指的是 Toll 样受体DLin-MC3-DMA或SM-102（Moderna COVID-19疫苗中的离子化阳离子脂质）被用来配制载有EGFP129的LNPs。当人体外周血单核细胞（PBMCs）用任一配方处理时，IL-1β释放急剧增加，同时其他促炎细胞因子也增加，如IL-6、CCL2、CCL4和TNF等。值得注意的是，空的基于SM-102的配方也引发强烈的IL-1β分泌，这表明这些脂质同时提供了促炎体激活的初级和次级信号。mRNA经过1mψ合成，带有低免疫原性5'端帽修饰，并经过纤维素处理纯化去除双链RNA杂质，因此被认为是免疫静默的。初级信号被建议起源于LNP-PRR相互作用，LNP诱导的损伤相关分子模式提供了次级信号。鉴于离子化脂质LNP-mRNA制剂激活Toll样受体并释放IL-1细胞因子的倾向，IL-1β的释放可能介导MYD88的磷酸化，从而提供自分泌或旁分泌的初级信号。补体激活和过敏反应血浆和细胞表面的补体蛋白构成了先天免疫系统的基本部分。补体激活，即一系列蛋白酶事件，支持寻找并清除被识别为致病的物质或颗粒。识别致病性是启动补体激活的事件，有三种途径：经典途径，由IgG或IgM的模式识别启动；备用途径，由补体蛋白C3中硫醚键的水解启动；最后，凝集素途径，由甘露糖结合凝集素和叶酸蛋白受体的多糖致病模式识别启动。生物制剂和核酸治疗的出现迅速将与补体激活相关的免疫毒理学调查提升为药物开发流程中的常规实践。为支持这些工作，补体组分敲除模型或补体耗竭血清是有用的工具，还有特定途径或诱导模型也已在文献中描述。LNP-mRNA制剂已被证明激活补体途径。在一项体内研究中，给恒河猴静脉注射翻译hEPO的LNP-mRNA后，血浆C3a和C5b-9水平轻微而可逆地升高.在另一项研究中，将翻译CD40L的LNP-mRNA孵育在活化血清中，也使C3b/c和可溶性C5b-9升高.补体激活并且与LNP完整性的丧失相关的抗PEG IgM是必需的。这些发现与先前关于由于免疫球蛋白的包被和补体激活而导致纳米药物制剂加速免疫细胞介导清除的报告相一致。补体激活也可能导致罕见的过敏反应。在接种BNT162b2或SM-102 COVID-19疫苗的第一剂后报告了少量过敏反应案例。受影响的患者C5a水平升高，但没有IgE，这表明肥大细胞脱颗粒（和过敏反应的发生）不需要先前致敏和抗原特异性IgE产生，就像真正的过敏反应一样。这些发现指向补体激活相关的假过敏（CARPA），通过这种方式，肥大细胞的脱颗粒不需要免疫球蛋白介导，无论是在补体激活还是肥大细胞脱颗粒水平上。迄今为止，尚不清楚哪种疫苗成分可能导致C5a的释放。可能是已有的抗PEG IgG或IgM触发了经典途径，引发CARPA; 另外，可能在脂质的内源化过程中激活了经典途径。过敏反应（HSRs）包括静脉注射药物后的不良免疫事件，包括纳米药物。HSR是罕见的，但有潜在的危险，因为它们可能表现为严重的过敏反应、心肌炎、喉咙肿胀、呼吸衰竭或血液动力学变化等症状。任何LNP-mRNA成分理论上都可能引起HSR，但历史数据显示，PEG化脂质目前是最可能导致反应的成分。当PEG部分结合到已敏感的肥大细胞表面的特异性IgE时，后者脱颗粒并在所谓的I型即时型HSR中引发过敏反应。与I型HSR相比，如上所述，CARPA是一种更严重的HSR类型，它源于肥大细胞的直接脱颗粒和类似过敏反应的症状。除CARPA和I型HSR外，还有更多类型的HSR（II-IV），在我们所知的公共领域中尚无LNP-mRNA特异性报告。5  LNP-mRNA毒性的知识盲点监管机构认识到纳米级含药物成分的材料在吸收、分布、代谢和排泄（ADME）剖面与其在分子、颗粒和制剂水平上的物理化学性质之间复杂的关系。LNP-mRNA制剂的毒性和免疫原性、毒力动力学似乎受到多种因素的困扰，其中包括粒子大小、可离子化脂质化学、PEG长度和表面密度，以及有效载荷的免疫原性（即使在修饰的IVT mRNA的情况下）。最重要的是，给药途径的酶学和生化特征以及组织处理LNP代谢副产品的能力也可能是决定LNP-mRNA药物和疫苗安全剖面的因素之一。脂质及其代谢物的毒理学可离子化脂质脂质及其代谢物可以是参与能量代谢和免疫的信号分子，因此，新型可离子化脂质不仅应该在转染效率方面进行测试，还应该进行审查，以排除与其特定生化性质相关的潜在毒性。在上面的“TLR激活和细胞因子分泌”部分，我们描述了一些可离子化阳离子脂质似乎参与PATTERN识别受体（PRRs）的情况。其他不良结果也需要被排除。例如，单不饱和脂肪酸可能对避免铁死亡有保护作用，但它们对脱饱和的敏感性（例如，通过FADS2）和产生潜在有害的不饱和脂肪酸的调查仍在进行中。此外，细胞内酯化脂肪酸的积累可能导致脂质过氧化，除非过氧化产物在代谢上得到处理，否则可能导致病理性。最后，脂肪酸可能通过过氧化物酶体增殖物活化受体（PPARs）直接刺激炎症途径。以与用于核酸传递相等的脂质浓度测试空的LNPs（没有核酸）可能有助于确定哪些毒性可能来自可离子脂质。一个这样的研究表明，当以高剂量静脉给药时，携带可离子脂质YSK13的空LNPs可以提高血浆ALT和AST。这些变化被归因于肝嗜中性粒细胞浸润，因为库普弗细胞没有被牵涉到肝损伤。重要的是，空LNPs产生与携带小干扰RNA（siRNA）的LNPs相同的效应，表明载体本身就能够引起肝毒性。尽管其他参数也可能驱动毒性（例如剂量、给药途径等），但是测试空的LNPs将脂质生物相容性问题与可归因于mRNA或其翻译产物的毒性分离出来。PEG化脂质PEG化抑制了MPS的捕获LNP-mRNA，增加了其半衰期，并且增加了其到其他组织的渗出的机会。PEG-脂质摩尔比也影响LNPs的大小，以及其生物分布剖面。尽管如此，PEG的ADME调节能力和毒力动力学之间的平衡仍在审查中，一些报告提出了有关其长期安全性的担忧。其他复杂之处包括LNP-siRNA复合物的细胞摄取问题导致的低转染效率，或者改变细胞内吞噬途径对于脂质-DNA粒子的治疗转化的必要性。当可能需要重复给药时，PEG化已经被成功转化为产品，如COVID疫苗，PEG化脂质可以通过所有途径给药，包括口服。特定case的LNPs包括磷脂酰胆碱（PC），显示在小鼠脾脏中具有升高PC特异性的天然抗PC IgM和B-1a细胞被证明会激活B2细胞产生抗PEG IgM（图4）。这个研究提供了LNP-mRNA没有先前暴露于PEG时加速血液清除（ABC）效应的一个合理解释，以及有时观察到的血清蛋白表达下降。同样重要的是，它提出了B-1a细胞如何在控制细菌和病毒生长时，可以在LNP-mRNA中与先天和适应性免疫反应之间搭桥。ABC的另一个提出的机制是由于过去暴露于PEG的抗PEG IgM（可能和IgG）抗体，可以使PEG化的制剂被包衣作用，并介导其迅速MPS清除从系统循环中，主要通过库普弗细胞摄取。总的来说，PEG的几种物理化学性质（例如长度、结构、末端基团）及其在LNP-mRNA复合物中的结合（例如PEG-脂质摩尔比、亲水性锚定基团、脱落速率）可能影响其免疫原性。因此，带有PEG化脂质的LNP-mRNA药物和疫苗的临床前发展应该伴随着严格的免疫毒理学评估。图4：PEG化LNP-mRNA在脾脏中引起适应性免疫反应。天然的抗磷酸胆碱（PC）IgM抗体通过脾脏中的树突状细胞促进了脂质纳米颗粒（LNP-mRNA）中的mRNA的包覆作用。在这里，聚乙二醇（PEG）表位被呈递给B2细胞，激活并产生抗PEG的IgM抗体。新兴的额外成分传统的脂质纳米颗粒（LNP）由可电离脂质、胆固醇、辅助磷脂和PEG化脂质以不同的摩尔比例组成。最近，为了调节LNP-mRNA制剂的生物分布和改善细胞转染效果，研究人员探索了额外的成分。值得注意的例子包括添加第五种永久带电（阴离子或阳离子）脂质、鞘磷脂或胆固醇衍生物。增加1,2-二油酸-3-三甲基氨丙（DOTAP）的摩尔比例（该物质带有带正电的季铵基团）会改变DLin-MC3-DMA基础的LNP制剂化的荧光酶mRNA的蛋白表达，使其在静脉注射到小鼠后转移到肺部。永久性阴离子脂质的加入也改变了LNP-mRNA制剂的生物分布。某些阳离子脂质可以触发PRRs，具有促炎性，它们的毒性一直困扰着脂质体在临床转化中的应用。因此，在LNP中高摩尔百分比的添加应该伴随着严格的免疫毒理学筛查。胆固醇类似物（例如β-谷甾醇）和胆固醇氧化产物已用于改善LNP-mRNA在体外的转染效率167，并分别改善了mRNA在肝内皮细胞中的传递。为了预防重复给药和改善细胞热带性，有必要排除脂毒性或细胞代谢紊乱，类似于观察到的胆固醇及其氧化产物的情况。为了对LNP-mRNA的药代力学和药效学特性进行微调，LNP-mRNA工程的复杂性可能会增加。因此，安全评估应该预先考虑到尺寸、化学性质和相关生物转化（例如生物分子冕）的改变可能产生的不良影响。研究界似乎对LNP-mRNA的某些毒性方面忽视了（专栏3）。专栏3 LNP-mRNA 毒性研究的不足之处细胞外 LNP-mRNA 的毒力动力学体外实验表明，仅有 1-2% 的脂质纳米颗粒（LNP）介导的核酸传递成功地实现了细胞转染。然而，剩下的 98% 的致病潜力尚未被深入研究。已知，非特异性免疫反应可能会被非特异性释放的 mRNA 或 LNP 介导的 Toll 样受体 4 (TLR4) 刺激所触发，但还可能有其他值得关注的原因。纳米颗粒既可以直接引发补体级联反应，也可以通过免疫球蛋白在表面吸附引发补体级联反应。在血液中，这会增加颗粒的包覆和清除，但 LNP-mRNA 引发的补体激活对特定器官的毒理影响尚不清楚。这一知识空白尤为重要，因为 LNP-mRNA 制剂具有增加的肝脏生物分布，而肝细胞和非实质细胞配备有补体受体。事实上，已经发现 C5a 的释放和与 C5R1 的结合与人类肝脏中的趋化、促纤维化和促炎信号相关，这可能严重影响了 mRNA 药物的耐受性。LNP-mRNA 的细胞外解离是另一个后果大多未知的事件。除了聚乙二醇（PEG）脱落（仅涉及表面结合的脂质）之外，LNP-mRNA 还容易通过生物分子冕的形成而完全解离263。此外，研究表明，具有酯键的脂质容易受到细胞外内皮和脂蛋白脂酶的作用。当游离氨基在极性头基中的可离子化脂质发生 N 氧化时（例如来自内源性胺氧化酶），可能会产生有毒的醛类。颗粒状 LNP-mRNA 的毒性迄今为止，已有两种基于脂质纳米颗粒 (LNP) 的 mRNA 疫苗获得了 FDA 的紧急授权，用于临床使用。然而，这些可离子化脂质不一定适用于其他 LNP-mRNA 药物或疫苗。这是因为每种 mRNA 载体的独特性质（长度、带负电的磷酸基团）会影响 LNP-mRNA 复合物的自组装。其最终结构还受生物环境的影响，因为生物分子冕的形成会导致内部重组和组成重排。因此，LNP-mRNA 颗粒的生物物理特性可能会影响其药效学特征：颗粒曲率和表面化学的微小变化已被证明会影响颗粒的生物分子冕的组成，以及它们在体内的免疫球蛋白介导的补体活化、包覆和细胞瘤性。在体外测试中，LNP-mRNA 颗粒的生物物理特性可能决定它们对细胞的沉积和细胞结合亲和力，就像其他胶体稳定纳米颗粒的情况一样。总体而言，在评估其毒性和药效学时，LNP-mRNA 的颗粒性质和生物物理特性必须考虑在内，尤其是在药物开发领域中，这些参数通常不考虑小分子药物的开发。6 目前避免 LNP-mRNA 风险的方法目前已经以前所未有的速度发表了展示 mRNA 平台药物潜力的临床前研究。通过各种手段可以寻求新型 mRNA 治疗药物的安全性和耐受性。例如，用于皮内给药的微针可以节约剂量，保护 mRNA 免受核糖核酸酶的影响，并最小化局部和全身的不良反应。在两项相关研究中，装载 mRNA 的聚合物可溶性微针或装载裸 mRNA 或 LNP-mRNA 的中空微针分别在离体或体内模型中高效诱导了疫苗应用的免疫原性。最近，聚糖胱氨酸（一种重复 N-取代甘氨酸单体的聚合物）作为一种有前途的聚乙二醇 (PEG) 替代品崭露头角，它可以削减与 PEG 化脂质相关的某些不良免疫反应。在一项专利申请中，聚糖胱氨酸-脂质共轭物能与 RNA 形成精确控制尺寸和表面特性的纳米颗粒，包括各种末端基团以调整电荷。事实上，聚糖胱氨酸-脂质共轭物已被证明能有效与 mEPO 或荧光酶 mRNA 结合，并实现蛋白表达水平与 PEG化 LNP-mRNA 配方相当。至关重要的是，聚糖胱氨酸配方在体外表现出更好的安全性，减少了体内炎症原性或肝毒性。病理条件的生理特异性也可以利用来改善 LNP-mRNA 配方的 ADME 特性。在一项相关研究中，假设 LNP-mRNA 在再灌注时可因其显著的内皮微小穿透孔（类似于增强渗透和潴留效应）而分布到缺血心脏组织。事实上，实验结果表明，静脉注射的转译为 Cre 的 LNP-mRNA 在 Cre 报告小鼠心肌梗死区域内增加了对心脏成纤维细胞、心肌细胞和巨噬细胞的靶向。基于同样的前提，另一项研究表明，通过转译成细胞周期调节因子（如丙酮酸激酶肌肌亚基肌肌酶2）等 mRNA 治疗剂可以促进心肌梗死缓解和心脏再生。其他风险回避实践包括系统合成和筛选可离子化脂质、联合疗法、最小化非靶效应以及环状 mRNA 的开发。脂质库和定量结构活性关系可离子化脂质对 LNP-mRNA 配方的治疗效果至关重要：其头基的低 pKa 促进了在内体中 LNP-mRNA 结构的解离，其烃尾的立体化使 mRNA 能够释放到细胞质。通过组合化学合成新型脂质可以相对快速地进行筛选，以确定领先候选者的转染效率和体外毒性，甚至进行定量结构-活性关系研究。多轮优化已提高了 LNP 封装的 mRNA 的转染效率。然而，意想不到的毒性和低代谢物清除要求改善安全性和耐受性配置文件。最近的两个例子显示了理性设计方法如何改善 LNP-mRNA 配方的 PK 和药效学：正交实验设计被用于识别在小鼠羊膜液中具有最佳体外稳定性的 LNP-mRNA 配方；而分子动力学则被应用于描述具有正方酰胺离子化脂质的 LNP-mRNA 颗粒如何改善非人类灵长类动物血清中的靶向蛋白表达。联合治疗通过与其他药物或佐剂联合给药，可以提高mRNA药物和疫苗的治疗效果，从而降低相关风险。在多个早期临床试验中，mRNA与免疫检查点调节剂或细胞因子联合给药，以增强抗肿瘤作用。最近，Moderna的mRNA-4157（编码突变KRAS的肿瘤相关抗原）与pembrolizumab（一种PD1的免疫检查点抑制剂单克隆抗体）联合给药的II期临床试验（NCT03897881）结果显示，与单药治疗相比，在III期或IV期黑色素瘤患者中，复发或死亡显著减少。在预临床阶段，注射编码IL-12、IL-27和GM-CSF的LNP-mRNA与裸IL27 mRNA的联合给药相较于单独使用LNP-mRNA，在小鼠黑色素瘤模型中对抑制肿瘤生长具有十倍的协同效应。另一个例子是，在小鼠淋巴结中表达编码黏蛋白1（三阴性乳腺癌肿瘤中过度表达的细胞表面相关的跨膜糖蛋白）的LNP-mRNA，激活肿瘤特异性T细胞。与抗细胞毒T淋巴细胞相关蛋白4（CTLA4）单克隆抗体静脉联合给药，可以进一步促进细胞毒性T淋巴细胞的活化，抑制肿瘤生长的效果比单独使用LNP-mRNA治疗更好。免疫抑制剂的使用对于化疗是常见的做法，也可以作为核酸治疗的重要组成部分。在一个概念验证研究中，地塞米松（dex）与酰基或烷基团共价结合，并装入载有编码萤火虫荧光酶的IVT mRNA的LNP中。在小鼠经剂量匹配静脉给药后，dex-LNP-mRNA配方在体外没有急性细胞毒性，且明显低于单独使用LNP-mRNA的细胞因子产生水平。在转甲状腺素淀粉样蛋白病患者中，在注射LNP启用的CRISPR-Cas9基因编辑疗法配方前，给予糖皮质激素和抗组织胺药物，以减轻可能的系统性先天免疫反应。其他小分子药物也被发现在减轻与脂质相关的不良免疫原性方面具有有效作用，例如Janus激酶抑制剂和推测的抗氧化剂埃达罗韦。减少离靶效应的方法为了降低mRNA治疗药物开发中的离靶效应风险，可以通过特异性抑制细胞中的mRNA表达或改善LNP-mRNA的器官特异性摄取来实现。前一种策略利用内源性microRNA（miRNAs），这些短的非编码RNA分子可以自然地抑制mRNA的翻译，从而以细胞和疾病特异性的方式调节基因表达。将miR结合位点整合到IVT mRNA的3'非翻译区域中可以减少在miR丰度高的细胞中的翻译。miR-122在健康肝细胞中丰富，而在肝细胞癌细胞中不丰富。与miR-122结合可以抑制IVT mRNA对促凋亡或有毒蛋白的翻译，从而减少基于mRNA的抗癌治疗的离靶效应。在体外实验证明，将翻译Rift Valley热病毒S段基因上的非结构蛋白的mRNA注入miR-122阳性的肝细胞系中，诱导了p53凋亡，而在miR-122阴性的细胞系中没有诱导凋亡。在带有高人类肝细胞移植的小鼠上，注射包含编码促凋亡PUMA序列或翻转caspase 6的IVT mRNA时，可以抑制肝脏毒性，同时损伤肿瘤细胞。然而，肝脏经静脉注射后的被动靶向仅对蛋白质和酶替代治疗有益，而LNP-mRNA的肝外靶向仍然是一个挑战。最近的LNP-mRNA工程进展为除肝脏外的器官靶向和肝脏内细胞附着的改进提供了希望。降低肝脏生物分布和控制非实质细胞分布有望在肝脏中减少离靶效应，而肝脏目前承受着LNP-mRNA毒性动力学的主要负担。在一个显著的例子中，永久带电的脂质（阳离子或阴离子）被添加到新型或临床相关的LNP（例如DLin-MC3-DMA）中，以摄取生物分布的摩尔比例和带电依赖方式来控制。通过测试三种不同的阳离子或阴离子脂质，发现了明确的摩尔比例阈值，可以用于预先和可预测地控制肺、脾或肝脏的生物分布。具体而言，荧光素酶蛋白表达可以逐渐从肝脏转移到脾脏，然后独特地呈现在肺脏中。同时还证明，离子化脂质的存在对于成功的mRNA翻译是必要的。对3种治疗蛋白（hEPO、IL-10和mKL）的LNP-mRNA制剂的体内毒性评估未显示出对检测的器官的组织病理学改变或血清细胞因子水平的增加。最近的一项研究利用鸡蛋鞘磷脂（ESM，N-（十六烷酰）-神经鞘-4-烯-1-磷酯胆碱）来调节LNP-mRNA的生物分布。ESM是一种天然存在且生物相容的脂质，被添加到基于DLin-MC3-DMA的LNP制剂的荧光素酶mRNA中。在小鼠体内静脉注射后，这些纳米颗粒表现出延长的循环时间，从而实现了改进的肝外生物分布。通过化学工程调控脂质，可以调节LNP包装的siRNA在肝脏内细胞上的摄取。离子性脂质的pKa被证明可以预测性地将摄取从肝细胞转移至肝窦内皮细胞。同一研究提供了证据，显示离子性脂质酰链和极性头基之间的酯键在溶酶体中结构解离前被不同程度地酶解。具体而言，本研究中使用的PEG化LNP对肝窦内皮细胞表面的内皮和脂蛋白脂酶敏感，但对肝细胞上的肝酯酶不敏感。7 在LNP-mRNA制剂的开发中降低风险的模型在新药和疫苗的临床前开发中，风险管理对于安全过渡到临床试验并实现有利的治疗指标至关重要。传统上，动物模型被用于获得广泛的毒理学和药理学数据，但它们存在许多限制（例如成本、周转时间）和生物伦理问题。体外和体外模型以及能够研究LNP-mRNA与细胞和组织的纳米生物相互作用的仪器，通过提供更多的机制研究空间来补充动物模型。因此，在临床前开发的早期失败可以成为改进更安全的LNP-mRNA药物和疫苗并避免冗余的体内研究的机会。动物模型的限制在LNP-mRNA药物和疫苗的临床前阶段，降低风险意味着筛选和评估可能缩小治疗指标并可能导致临床试验失败的毒性。传统上，动物模型被用于筛选具有足够治疗功效和可接受不良效应的药物候选物，并优先进行临床转化。这些模型可以测试系统和局部毒性，并确定这些反应如何依赖于性别、年龄、剂量方案和给药途径等参数。此外，还可以在药物给予前、中、后收集临床生物标志、行为表现、组织病理学和组学数据。基因编辑和基因表达技术的最新进展，如CRISPR-Cas9和siRNA，结合高效的人类基因组测序，有助于产生模拟许多人类疾病方面的小鼠模型，以测试新药的疗效和安全性。例如，MMUT的外显子3缺失被认为编码人甲基丙二酰辅酶A转移酶（hMUT）上的配体结合腔，产生了一种严重的多元酸甲烷酸尿症（MMA）小鼠模型。注射静脉LNP-mRNA编码hMUT证明了mRNA治疗这种代谢紊乱的安全性和高效性。大鼠和非人灵长类动物也被用于mRNA安全性和耐受性研究。mRNA编码hEPO被制成LNPs并以静脉注射给予这两种物种。毒理学发现与过量的hEPO水平和LNP驱动的炎症效应有关。在上述研究中，没有主要的物种间差异，但在临床前开发中应考虑物种相关变异。动物研究可以为药物候选物转化到临床试验生成大量可操作的数据。然而，人类和动物生理学上未考虑到的差异可能会影响安全性和疗效数据的可预测性，尤其是对于多组分、纳米颗粒制剂。非常恰当的一个例子是，IL-1通路在RNA疫苗相关的内源性信号中起着关键作用，但在小鼠和人类之间的功能不同：小鼠白细胞对RNA疫苗的反应中，抗炎性IL-1ra的上调程度高于IL-1α，这保护了小鼠免受细胞因子诱导的毒性影响。另一项研究提出了一种方法来考虑这种差异，通过同时在具有人性化、灵长类或野生型肝脏的小鼠中筛选多个LNP-mRNA制剂，每个制剂携带一个不同的DNA条形码。所有制剂都编码了一个细胞表面表达的热带骆驼单源抗体，可以通过荧光追踪。抗体与DNA条形码的共定位和来自肝细胞的RNA测序转录组数据的整合有助于在非人类灵长类动物或人类肝细胞中识别安全、高效的LNP载体以进行mRNA转换。然而，物种间生理差异是系统性的，所以代谢和免疫网络的相互作用可能会影响药物的耐受性。在鼠和人代谢网络的重叠模型可以考虑已知的物种差异（例如鼠类对维生素C的新生合成）；这种计算方法被用来计算产生药物代谢物的相对偏好，与可用的药理学数据相一致。在临床前开发中整合这样的计算方法可以支持对动物研究中收集的生物标志数据的有意义解释。高级体外和体外模型体外和体外试验被用来验证药物候选物的药理活性，并根据它们对细胞毒性和影响细胞存活性的情况进行改进。除相对易于使用和成本较低外，基于人体细胞的体外和体外试验需要用于评估毒性问题，因为人类基因组和免疫系统与其他动物存在差异。例如，基于脂质体纳米粒子的Cas9 mRNA传递面临着一些障碍，包括细胞特异性和潜在的有害的非靶效应。不同物种之间的基因序列差异可能使动物模型与靶向和非靶向的遗传毒性无关。种属间的固有和适应性免疫反应也很难在不同物种之间协调一致。例如，只有人类B细胞和浆细胞样树突状细胞表达TLR9，而在小鼠中，大多数其他树突状细胞和巨噬细胞都表达TLR9。因此，在综合毒理学筛选的背景下，利用和改进体外和体外人体系统至关重要。通过使用诱导多能干细胞（iPSC）器官样体、球体和微流控技术等技术的出现，提高了体外研究所能获得的生理学相关性和数据的多样性。事实上，现在可以通过体外模拟出高度转录组和功能的相似性，从而追踪观察到的药物毒性的分子途径。微流体芯片器官模型技术和干细胞来源的器官样体能够准确地再现各种组织的机械和空间属性，使其能够精确地在分子和表型水平上再现器官（病理）生理学。这些技术可以被利用于开发安全高效的mRNA治疗方法。最后，体外模型正在逐步变得更高通量，而机器学习算法可以利用组学和其他类型的数据（例如成像）来识别具有最佳药效动力学、预测其疗效并预测其毒性的药物结构。这些优势在最近的立法中得到了体现，即“包括基于细胞的方法和计算机模型在内的替代动物实验”，可以用于药物进入临床试验。伴随着动物使用的伦理问题、动物短缺以及FDA最近做出接受体外数据以支持新药（IND）申请的决定，有充分的理由使用和发展生理学相关的体外模型进行临床前开发风险评估。iPSC来源的器官样结构iPSC（诱导多能干细胞）是经过重编程以遵循替代分化途径的去分化的体细胞。iPSCs可以被引导形成各种类型的细胞（如肝细胞、心肌细胞、肠上皮细胞和组织驻留巨噬细胞等）并已被用于为患者特定的体外疾病建模和定制药物开发提供接近无限的细胞库。与原代细胞相比，iPSC的主要优势在于它们能够自组装成微观的三维结构，被称为器官样结构。iPSC来源的器官样结构可以呈现实质细胞和非实质细胞，并复制物种、病人和器官特异的转录组、代谢组、组织学和表型特征。现在有关于模拟人类器官甚至器官特异性疾病（如肝细胞胆管癌或模拟囊性纤维化病理生理学的肺泡）的人类器官样结构的报道。器官样结构的检测本质上比二维细胞培养更复杂，但微加工、生物打印和机器人技术的进展可以帮助加速相关工作流。尽管iPSC来源的器官样结构是一项相对新的技术，但它们越来越多地被纳入探索性药物开发流程中，因为预计它们将提供更灵敏和准确的毒理学和药理学数据，从而有助于推动可行的药物候选品进入临床试验。在撰写本文时，已经使用iPSC来源的人类肝细胞进行了LNP-mRNA产品在临床前开发中的转染优化。尽管如此，iPSC器官样结构尚未用于mRNA药物和疫苗的开发。这可能是由于缺乏血管化和LNP-RNA无法渗透整个器官样结构体积，从而限制了转染到外部几层细胞。基于微流控的方法可以为足够薄的组织切片提供连续的氧气和药物灌注，但目前尚不清楚单独的连续灌流是否足以实现LNP-mRNA在整个器官样结构体积中的扩散。这些问题可以通过多个iPSC的组合来克服，以发展出允许生理相关器官样结构灌流的微血管，类似于一项工作中引入了iPSCs来在人类肠道器官样结构内形成肠道神经系统。芯片上的器官改进的微加工技术和组织工程的进展使得制造能够在微观生长培养基填充的各种结构通道中维持细胞培养的装置（芯片）成为可能。在这些芯片中，细胞可以相互作用，同时嵌入在细胞外基质中形成三维组织（器官）。此外，微流控通道可以提供高度可控的细胞灌流，柔性基底可以提供机械刺激。将器官特异的人类原代细胞植入适当生化环境和机械刺激下生长的芯片中，已经实现了呈现其相应器官的表型、生物功能和转录组特征的组织的体外重建。许多基于芯片的器官和组织模型已经在文献中提出，包括肝脏、心脏、肠道、胎盘、肾脏、肺部和淋巴器官的芯片模型。这项技术已被誉为药物开发中的有用工具。例如，使用模拟实体肿瘤血管的肿瘤-血管芯片研究了小分子药物对肿瘤的渗透性，重现了实体肿瘤的内皮细胞间隙的渗漏和致密的细胞外基质。其在降低风险方面的潜力也已经在多项肝脏-芯片药物毒性研究中得到确认。最近的一项研究恰当地证明了由肝细胞和非实质细胞（库普弗细胞、星状细胞和窦oidal内皮细胞）组成的肝-芯片能够产生特定于药物的生物标志物和代谢产物，并重现药物诱导的细胞死亡。值得注意的是，更为细致的肝脏变化也可以重现，例如甲氨蝶呤诱导的脂肪积累。值得注意的是，尽管mRNA药物自然地靶向于肝脏或者该平台对纳米粒毒性的测试，但在已发表的领域中，尚无mRNA药物的药理学或毒理学研究。与每项技术一样，总有改进的空间。例如，人类原代细胞对于生理相关性是必要的，但也会引入研究器官的遗传背景的供体间变异度。另一方面，在从单层内皮细胞迁移到体外排列的三维组织中，足够的灌流是难以实现的。朝着这个方向，已经提出了在微流控芯片上呈现血管化乳腺肿瘤的蓝图。最后，循环的外周血单核细胞（PBMCs）将在研究纳米颗粒药物的反应原性时引入一个非常需要的生理复杂性层面，但目前只成功地嵌入了组织特异性驻留巨噬细胞或静止淋巴细胞。8 结语疫苗的快速设计对于生物治疗领域来说是一个转折点。尽管 mRNA 疗法已经研发了几十年，BioNTech-Pfizer和Moderna成功开发的COVID-19疫苗展示了该平台的效率。因此，曾经衰退的纳米医学领域焕发了新的活力。从学术界来看，出版物数量不断增加，学术界对RNA生物学的兴趣也日益高涨。与此同时，制药行业正在将更多资源用于开发治疗罕见疾病、多种癌症和感染的mRNA药物。可以说，该技术在药物开发领域的成功应用在很大程度上取决于其安全性。在一项I期临床试验中，静脉注射腺病毒载体后引发致命全身性炎症的案例是一个悲剧，使整个基因治疗领域的进展停滞了十多年。这提醒人们，对任何特定的mRNA药物安全性的严重担忧可能会影响整个平台。正如本综述所概述的那样，减轻mRNA药物和疫苗的风险是复杂的。LNP封装的IVT mRNA是一个多组分的实体，其生物活性可能超过组分的总和。LNP-mRNA制剂的药效学和潜在毒性与它们的颗粒性质、脂质化学和mRNA翻译产物密切相关。重要的是，单独调整一个参数（例如脂质化学）而不考虑其他参数（例如LNP-mRNA大小）构成了一个巨大的工程挑战。在安全应用中可能存在一些障碍。例如，生物技术公司正在转向内部和受专利保护的电离性脂质合成，这可能会延迟原本可以促进该技术安全应用的研究工作。此外，LNP-mRNA制剂的复杂性要求在临床前研发过程中采用多学科方法，包括纳米粒子表征、生物化学、药理学和组织工程学。不可避免地，依靠多种技术可能会导致误差传播和测量结果的不确定性。预临床阶段对组成复杂的mRNA药物和疫苗进行筛选的方法应超越小分子药物开发中的应用。首先，需要开发出更能复现人类生理和病理的药理学模型。理想情况下，需要咨询基于人工智能的药效学模型和毒基因组网络，以更好地解释数据。特别值得注意的是单细胞技术，它极大地扩展了体外和体外细胞对药物反应异质性的信息量。为了实现安全和有效的LNP-mRNA开发，一项研究展示了结合下一代测序、DNA条形码和单细胞RNA测序的方法，用于确定哪种特定的脂质化LNP-mRNA组成物在体内优先靶向特定的肝细胞亚类型。由于不同的LNP-mRNA模态可能共享相同的组分（例如电离性脂质），单细胞技术为促进具有所需药效学特性的LNP-mRNA制剂，并确定不良反应是否特异于组织或免疫系统提供了机会。可以实施早期的纠正工程，并减少动物使用。开发基于mRNA的药物和疫苗的安全性要求采用多学科方法，包括先进的体外毒性筛选方法、早期发现风险的组学数据集以及密切监测不断变化的LNP和mRNA工程领域。尽管复杂，成功降低风险是降低药物候选品流失率和避免成本的关键，并对新兴的mRNA疗法领域具有投资价值。参考文献Bitounis, D., Jacquinet, E., Rogers, M.A. et al. Strategies to reduce the risks of mRNA drug and vaccine toxicity. Nat Rev Drug Discov (2024). http://doi-org.ypl.ilibs.cn/10.1038/s41573-023-00859-3识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

病毒性传染病严重危害人类生存和健康，宿主免疫监测系统通过模式识别受体（PRRs）检测病毒核酸。RIG-I（RNA传感器RIG-I）样受体（RLRs）是负责快速识别病毒RNA的细胞质RNA解旋酶。在细胞质中识别病毒衍生的RNA后，RIG-I和MDA5与关键的衔接分子MAVS（线粒体抗病毒信号蛋白）相互作用，传递病毒信号。MAVS随后在线粒体上迅速形成朊病毒样聚集体，以触发下游TBK1和IRF3的激活，从而进一步诱导I型干扰素（IFN）和干扰素刺激基因（ISG）的产生。RIG-I和MDA5的适度表达和激活对于诱导抗病毒先天免疫反应和促进IFN-β分泌至关重要。然而，不受抑制的RIG-I和MDA5的表达可能通过诱导RLR诱导的信号过度激活而导致自身炎症和自身免疫性疾病。因此，RLR信号传导的严格调控对于确保在没有有害免疫病理学的情况下成功消除病毒至关重要。运输所需的内体分选复合物（ESCRT）系统能够捕获泛素化的蛋白质，并将其分选到晚期内体的管腔内小泡中。这些小泡成熟为多泡体/MVBs，最终与溶酶体融合促使蛋白质降解。然而，ESCRT系统在RLRs降解中的作用目前尚不清楚。近日，山东大学基础医学院高成江教授团队在Autophagy在线发表题为 LTN1 promotes RLR degradation to inhibit immune response to RNA virus through the ESCRT pathway 的研究成果，揭示了RIG-I和MDA5降解的新机制，并确定了LTN1在负调控RLR介导的抗病毒先天免疫中的作用，这可能为干预病毒感染提供新的靶点。病毒感染机体的大量复制会触发核糖体相关蛋白质量控制（ribosome-associated quality control，RQC）系统活化，导致宿主蛋白质合成稳态失衡，但RQC系统在抗病毒免疫反应中的功能和调控机制并不清楚，因此作者首先验证了RQC系统核心组分LTN1的抗病毒功能。作者构建了LTN1条件敲除小鼠，通过体外培养腹腔巨噬细胞、骨髓来源的巨噬细胞，用5’PPP-RNA、SeV、EMCV等分别刺激，发现LTN1敲除的巨噬细胞表达I型干扰素的能力增强；LTN1缺失后，VSV病毒的复制受到抑制。通过免疫印迹实验发现RLR信号通路中IRF3和TBK1的磷酸化在敲除LTN1的细胞中明显升高，这表明敲除LTN1促进了RLRs信号通路的激活进而促进了I型干扰素的产生。作者进一步研究了LTN1在体内抗病毒反应中的生理意义。相比于野生型小鼠，作者发现在LTN1敲除小鼠血清中VSV病毒诱导的IFNB的分泌明显升高，小鼠的脾脏、肝脏和肺中，Ifnb1的表达上调，VSV病毒的复制和滴度的明显降低，VSV感染后观察到严重的肺损伤相比于野生型小鼠明显减轻，死亡率下降。这些发现表明LTN1缺陷小鼠比野生型小鼠更能抵抗RNA病毒感染。为了揭示LTN1抑制RLR介导的免疫的分子机制，作者通过qRT-PCR，免疫共沉淀，免疫荧光等实验技术明确LTN1的靶点为RIG-I及MDA5，并促进两者降解。RQC系统关键组分NEMF、TCF25可与LTN1形成复合物帮助有缺陷或异常的多肽降解。因此作者分别构建了NEMF、TCF25 293T敲除细胞系，研究发现敲除NEMF或TCF25，LTN1仍就促进的RIG-I和MDA5蛋白降解。这提示LTN1可能独立于RQC系统发挥新功能。作者进一步研究发现，LTN1与RIG-I及MDA5在内体上存在共定位，ESCRT-0包括HGS和STAM，它们对于将泛素化的物质分选到内体中至关重要。作者在细胞中敲低或者敲除HGS和STAM组分，LTN1不再促进的RIG-I和MDA5蛋白降解。这些数据表明LTN1通过ESCRT系统介导RIG-I和MDA5的降解。LTN1是一种参与核糖体异常新生链泛素化修饰的E3泛素连接酶，同时ESCRT系统也主要降解泛素化的蛋白。因此，作者接下来探究了LTN1介导的RIG-I和MDA5的降解是否通过蛋白泛素化发生。通过免疫共沉淀实验，作者发现LTN1 明显增加了RIG-I和MDA5的K63链接的泛素化水平，但是LTN1缺失RING结构域或酶活位点突变后仍然可以增加RIG-I和MDA5的泛素化水平，这些数据表明，LTN1独立于其E3酶活性促进RIG-I和MDA5的多泛素化。因此作者假设LTN1可能招募其他E3连接酶进行K63连接的多泛素化。通过对LTN1相互作用蛋白的质谱分析，作者发现E3泛素连接酶TRIM27是LTN1潜在的候选结合蛋白。进一步通过重组蛋白体外结合实验显示TRIM27不能直接与RIG-I和MDA5相互作用，LTN1促进了TRIM27与RIG-I和MDA5的相互作用。体外泛素化实验表明LTN1招募E3泛素连接酶TRIM27促进了RIG-I和MDA5的泛素化。在这项研究中，作者发现LTN1可以增加RIG-I和MDA5的K63连接的多泛素化。这种K63连接的多泛素化通过ESCRT依赖性途径促进RIG-I和MDA5蛋白的分选和降解。进一步的通过质谱发现LTN1通过招募E3泛素连接酶TRIM27介导了RIG-I和MDA5的K63连接的多泛素化。LTN1敲除能够促进小鼠对RNA病毒感染的先天抗病毒免疫反应。因此，该工作揭示了RIG-I和MDA5降解的新机制，并确定了LTN1在负调控RLR介导的抗病毒先天免疫中的作用，这可能为病毒感染的干预提供新的靶点。山东大学基础医学院博士研究生秦菲、蔡宝珊为本文共同第一作者，山东大学高成江教授、刘冰玉教授为共同通讯作者。原文链接：https://www-tandfonline-com.libproxy1.nus.edu.sg/doi/full/10.1080/15548627.2023.2291939识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。