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本文为转化医学网原创，转载请注明出处 作者：Jerry 导读： 肿瘤异质性及其驱动因素影响肿瘤进展和癌症治疗。单细胞RNA测序用于研究肿瘤生态系统的异质性。 近日，浙江大学郭国骥、梁廷波等研究人员在权威期刊《Advanced Science》上发表了题为“Pan-Cancer Single-Nucleus Total RNA Sequencing Using snHH-Seq”的研究论文，本研究中， 研究人员开发了一种高通量、高灵敏度的方法snHH-seq，该方法将随机引物与液滴微流控平台的预索引策略相结合。 这种创新的方法允许从临床冷冻样品中检测单个细胞核中的总RNA。并且建立了一个强大的流水线，以促进全长RNA-seq数据的分析。snHH-seq应用于来自32例不同肿瘤类型患者的73万多个单核。泛癌症研究使其能够全面分析肿瘤转录组数据，包括表达水平、突变、剪接模式、克隆动态等。 https://onlinelibrary-wiley-com.libproxy1.nus.edu.sg/doi/10.1002/advs.202304755 研究背景 01 癌细胞及其驱动因素的异质性在肿瘤发生和恶性进展中起着重要作用，并对癌症治疗有重要影响。单细胞RNA测序(scRNA-seq)能够在单细胞水平上测量转录信息，从而准确地解决肿瘤异质性。 许多研究利用scRNA-seq来阐明肿瘤微环境的多样性，揭示治疗策略的机制，并据此提出新的分子标记和治疗靶点。 然而，scRNA-seq在处理临床肿瘤样本，特别是档案材料(如冷冻组织)方面具有独特的后勤和技术挑战。首先，临床肿瘤样本的scRNA-seq需要实施快速组织解离程序，目前大多数医院的常规病理实验室不存在这种程序。其次，大多数scRNA-seq方法使用oligo-dT引物来捕获和扩增聚腺苷化转录本，这一过程高度依赖于组织样品的质量。此外，寡聚dt捕获导致缺乏对许多生物过程很重要的非聚腺苷化转录本。第三，高通量scRNA-seq方法只能检测转录本3 '或5 '端的短片段，这限制了临床样本的突变和剪接分析，特别是对肿瘤。 为了克服这些挑战，研究人员开发了“高通量高灵敏度单核总RNA测序”(snHH-seq)，将随机引物和预索引策略结合在液滴微流控平台上。单核RNA-seq (snRNA-seq)减少了对样品收集和处理的要求。这也为纵向样本的分析铺平了道路。使用随机引物而不是oligo-dT引物捕获转录本，不仅可以拯救部分降解转录本的档案临床样本，而且具有更高的灵敏度(一个转录本有多个可捕获的位点)和更高的覆盖率(转录本的3 '和5 '端，非聚腺苷化转录本和聚腺苷化转录本)。该预索引策略应用于基于液滴和基于平板的方法，提供至少一个数量级的吞吐量增益，并促进临床样品的多路分析。 研究进展 02 为了能够评估大量临床冷冻样本，减少解离的批次，研究人员建立了snHH-seq，一个基于液滴的高通量、高灵敏度的单核总RNA测序平台。snHH-seq是一种结合随机RT引物和预索引策略优势的强大方法。 snHH-seq具有高通量和高灵敏度，为肿瘤图谱绘制和其他基因组研究提供了新的可能性。 接下来，研究人员使用snHH-seq分析冷冻临床肿瘤样本。研究人员分析了32例患者的735 722个细胞核，涵盖了中国发病率和死亡率最高的肿瘤类型，包括肺腺癌(LUAD)、肝细胞癌(HCC)、肝内胆管癌(ICC)、胶质瘤、结肠腺癌(COAD)、直肠腺癌(READ)、乳腺浸润性癌(BRCA)、食管癌(ESCA)和胃腺癌(STAD)。在单细胞癌症研究中，识别恶性细胞是至关重要的一步，因为它们构成了癌症样本的主要组成部分。为了在研究人员的数据集中识别细胞类型(恶性细胞和非恶性细胞)，研究人员使用了标记基因和推断拷贝数变异(CNV)的组合。考虑到所研究的癌症类型，研究人员使用带注释的非上皮细胞，如内皮细胞、基质细胞和巨噬细胞作为intercnv的参考，以推断每个患者的CNV特征。 为了进一步说明TME(肿瘤微环境)的异质性，研究人员收集了来自不同患者的内皮细胞、骨髓细胞和基质细胞，并进行了亚聚类分析。研究人员获得了15个肿瘤内皮细胞(TEC)亚簇，包括动脉TEC (C4、FBLN5和SULF1)、静脉TEC (C6、ACKR1)、淋巴TEC (C2、PROX1)、毛细血管TEC (C7、BTNL9和CD36)、外周血TEC (C9、PDGFRB)、尖端TEC (C3、COL4A1)、细胞周期TEC (C12、C2orf48和CIT)和免疫样TEC (C10、DOCK2和PTPRC)。Tip TEC (C3)和cell cycle TEC (C12)在多个肿瘤中富集。在泛癌髓系细胞中，研究人员观察到肿瘤和NAT之间共享和特异性的基因特征。此外，研究人员在乳腺肿瘤和NAT样本中观察到显著的异质性。C2和C5主要驻留在乳腺肿瘤中，表达抑癌基因，可能调控乳腺TME中硫酸肝素的表达;C13主要存在于乳腺NAT和高表达的LRP1B中，LRP1B是一种可能抑制肿瘤迁移和侵袭的肿瘤抑制因子。表达C8的TNXB主要存在于NAT中，对多种肿瘤有贡献，可能阻碍肿瘤细胞的侵袭和转移。 总的来说，研究人员对细胞区室的泛癌症分析揭示了肿瘤环境的共享和癌症限制特征。 使用snHH-seq进行泛癌分析 研究结论 03 总之，研究人员证明了高分辨率单细胞全长转录组测序在鉴定新的肿瘤生物标志物方面的价值，并为全长单细胞测序提供了详细的分析。研究人员的综合分析方法包括检查基因表达、体细胞突变、剪接模式和克隆行为。通过利用这些不同的观点，研究人员可以确定与癌症相关基因和细胞类型相关的特定变异。这个项目代表了研究人员理解癌症潜在遗传机制的能力的重大进步。最终，这些发现加深了研究人员对肿瘤生物学的理解，并为更有效的诊断和治疗方法铺平了道路。 参考资料： https://onlinelibrary-wiley-com.libproxy1.nus.edu.sg/doi/10.1002/advs.202304755 注：本文旨在介绍医学研究进展，不能作为治疗方案参考。如需获得健康指导，请至正规医院就诊。 热门·直播/活动 🕓 北京｜12月19日-20日 ▶第四届单细胞测序技术应用研讨会暨单细胞&空间组学研讨会（日程稍后公布） 点击对应文字 查看详情

Toll样受体(TLR)在触发先天性和适应性免疫反应中发挥着至关重要的作用。它们不仅启动先天免疫反应，而且还是先天免疫和适应性免疫之间的重要连接器。 Toll样受体(TLR)可分为十个，除了TLR10与其他不同，被认为是Toll样信号传导的免疫调节剂。特异性免疫可分为四类，涉及不同的TLR组合。BiomedicinesTH1免疫反应TH1免疫反应是对抗细胞内细菌、原生动物和真菌的宿主免疫反应，涉及的免疫细胞包括M1样巨噬细胞、产生IFN-γ的CD4+ T细胞、细胞毒性CD8+ T细胞和iNKT1等。Biomedicines涉及TH1免疫通路的自身免疫性疾病包括1型糖尿病、多发性硬化症、接触性皮炎和结核病等。关键TLR：TLR7、TLR8和TLR9这三者都位于巨噬细胞的内体区室中。TLR7、TLR8 和 TLR9对应的配体分别是单链RNA、细菌核糖体RNA和未甲基化的CpG DNA寡核苷酸。这些配体是在巨噬细胞吞噬溶酶体中细菌或原生动物的消化过程中产生的。TLR7、TLR8和TLR9主要的信号通路涉及IRF5和IRF7，它们上调IL-12和IFN-γ等下游靶标。TLR8信号转导激活IRF5，而TLR7/9信号转导激活IRF7。TLR7和TLR9首先激活MyD88复合物，包含TRAF3、TRAF6、IRAK4、IRAK1、IKKα、OPNi 和 DOCK2等等。其激活顺序为：TLR7通过激活MyD88从而首先激活IRAK1，再影响IKKα，使其触发转录因子IRF7。IRF7也可以被IRAK1磷酸化。TLR8则通过激活MyD88首先激活TAK1，再影响IKKβ。TAK1还可以激活下游分子JNK。当IKKβ易位到细胞核中时，它会触发转录因子IRF5。IRF5和IRF7的协同作用以产生IL-12，从而引发TH1反应，上调IFN-γ。TH2免疫反应TH2免疫反应是应对寄生虫的免疫反应，分为TH2a和TH2b。TH2a涉及炎性嗜酸性粒细胞、产生IL-4/5的CD4 T 细胞、具有类胰蛋白酶活性(MCt)的肥大细胞、iNKT2细胞和IgG4 B细胞。BiomedicinesTh2b则涉及嗜碱性粒细胞、产生IL-13/4的CD4 T细胞、具有类胰蛋白酶/糜酶活性的肥大细胞(MCtc)、iNKT2 细胞和产生IgE的B细胞。BiomedicinesTH2免疫与1型IgE相关的过敏性疾病密切有关，如哮喘、过敏性鼻炎和特应性皮炎等。关键TLR：TLR1、TLR2和TLR6TLR2和TLR6在嗜碱性粒细胞或肥大细胞等APC的表面上表达。TLR2可以在细胞表面与TLR6或TLR1形成异二聚体，共同识别三酰基脂蛋白，从而触发MAL接头分子，其激活MyD88非依赖性通路，产生IL-4，触发TH2免疫反应。TLR2-TLR6异二聚体则激活下游PI3K和AKT通路。TLR2激活导致TPL2(MAP3K8)被激活，继而通过IKK2介导激活NFκB通路。TPL2还激活MEK1/2和ERK1/2信号转导，从而触发TH2免疫通路。除了IL-4之外，依赖TLR6而上调的IL-25和依赖TLR1/TLR6的IL-33也是驱动TH2免疫反应的关键细胞因子。Th22免疫反应Th22免疫代表宿主针对细胞外细菌、原生动物和真菌的免疫反应。涉及中性粒细胞N1、分泌IL-22的Th细胞、iNKT17细胞和IgG2 B细胞。BiomedicinesTH22主导的免疫通路与3型免疫复合物超敏反应有关，包括阿瑟氏反应和类风湿性关节炎等疾病。关键TLR：TLR2、TLR4和TLR5与TH22免疫通路相关的主要TLR是TLR2、TLR4和TLR5，在中性粒细胞、树突状细胞和单核细胞/巨噬细胞的表面表达。TLR2同型二聚糖可识别革兰氏阳性细菌细胞壁中的肽聚糖和脂磷壁酸，同时还与真菌细胞壁中的β-葡聚糖相互作用。TLR4则负责识别革兰氏阴性菌细胞壁中的 LPS 内毒素。此外，TLR5可识别在运动细菌中发现的鞭毛蛋白。TLR4 信号转导触发MyD88、IRAK1和IRAK4组成的复合物。IRAK4激活IRAK1导致IRAK1自磷酸化及其与MyD88复合物的解离。随后，IRAK1 与泛素结合酶UBC13和UEV1A结合，促进TRAF63/TAK6复合物的泛素化。IRAK1的激活也会诱导TAK1和TRAF6激活，诱导下游NFκB易位到细胞核中，从而触发炎症基因的表达，上调IL-1、IL-6和TNF-α。此外，TAK1激活也导致转录因子AP1依赖于MAPK的激活。Thαβ免疫反应THαβ免疫是宿主针对病毒和朊病毒等传染性分子的免疫反应，涉及NK1细胞、分泌IL-10的CD4 T细胞、iNKT10细胞、CD8 T细胞和IgG1 B细胞。BiomedicinesTHαβ 免疫与2型抗体依赖性细胞毒性超敏反应有关。涉及THαβ免疫通路的自身免疫性疾病包括Graves病、重症肌无力和系统性红斑狼疮等。关键TLR：TLR3、TLR7和TLR9TLR3、TLR7和TLR9主要在浆细胞样树突状细胞的内体区室中表达，内体区室为病毒和 TLR 之间的相互作用提供了理想的环境。TLR3可识别病毒复制过程中产生的dsRNA，而TLR7可检测该阶段也存在的ssRNA。TLR9则可识别在细菌和病毒基因组中未甲基化的CpG DNA。涉及TLR3、TLR7和TLR9的信号通路汇聚在IRF3和IRF7上，启动下游1型IFN信号通路，从而启动THαβ免疫应答。激活后，TLR3直接触发TRIF-IRF3信号通路，TLR7和TLR9激活IRAK1-IRF7信号通路。TRIF-IRF3信号通路触发涉及TRAF3、TBK1和IKKε的级联反应。另一方面，TLR7和TLR9激活MyD88通路，通过IRAK1进一步激活IKKα，在细胞核激活转录因子IRF7。IRF3和IRF7均能激活IFN-α和IFN-β的产生，从而启动THαβ免疫应答。此外，IL-27和IL-10也是驱动细胞因子之一。小结TLR不仅可以通过拮抗剂来治疗自身免疫性疾病，在其他领域也有应用。例如TLR激动剂可用于触发宿主对癌症的免疫反应，诱导癌细胞凋亡，从而作为肿瘤治疗的辅助药物。在疫苗开发中，配方里增加TLR激动剂也可以加强疫苗对致病原的效力。参考文献：1.Chu, Y.-T.; Liao, M.-T.; Tsai, K.-W.; Lu, K.-C.; Hu, W.-C. Interplay of Chemokines Receptors, Toll-like Receptors, and Host Immunological Pathways. Biomedicines 2023, 11, 2384. https://doi-org.libproxy1.nus.edu.sg/10.3390/biomedicines110923842.Jang YH, Choi JK, et al.House Dust Mite Increases pro-Th2 Cytokines IL-25 and IL-33 via the Activation of TLR1/6 Signaling. J Invest Dermatol. 2017 Nov;137(11):2354-2361. doi: 10.1016/j.jid.2017.03.042.

近日，在AACR2023上，Vincerx Pharma展示了一款治疗淋巴瘤的CXCR5-ADC产品VIP924的临床前数据。CXCR5属于趋化因子家族，是GPCR靶点的其中一种。其家族成员中，全球仅有CXCR4有一款拮抗剂产品上市(plerixafor)。靶点本身的机制CXCR5本身在B细胞和滤泡辅助T细胞上显著表达。在肿瘤、自免和慢性炎症中，CXCR5主要通过CXCL13-CXCR5轴来进行信号传递。Biochimica et Biophysica Acta(BBA) - Reviews on Cancer促瘤：在肿瘤中，CXCL13-XCXR5能通过双重途径促进肿瘤进展和发生。▷ 直接作用。CXCR5作为G蛋白偶联受体，结合GDP，激活PI3K，通过诱导Raf/MEK/ERK途径、整合素β3粘附激酶(FAK)/Src-paxillin和DOCK2/Rac/JNK途径来调节肿瘤细胞侵袭、生长和迁移。▷ 通过TME免疫细胞影响免疫监视。趋化因子的基础作用即包括将免疫抑制细胞募集到肿瘤微环境中。▷ CXCL13-CXCR5轴通过诱导IL-10协助恶性肿瘤细胞逃避T效应细胞免疫。▷ CXCL13-CXCR5还参与MDSC和Treg细胞的募集，促进肿瘤细胞存活、血管生成和侵袭。抑瘤：▷ CXCL13将CXCR5 B细胞和CXCR5 Tfh细胞募集到肿瘤部位，从而形成肿瘤TLO，促进有效的抗原呈递、细胞活化和分化，启动和维持局部和全身抗肿瘤T细胞和B细胞反应。▷ CXCR5的存在与否则可能会影响CD8+ CTL的抗肿瘤活性。与CXCR5-CD8+ T细胞相比，CXCR5+CD8+ T细胞在不同肿瘤类型中的增殖能力、颗粒酶B生成、肿瘤坏死因子α和干扰素γ表达均增强，从而引起更有效的杀瘤作用。其转录与表征和未耗尽的效应记忆CD8+ T细胞一致，定位到B细胞滤泡，表明其功能特征类似于CD4+ T滤泡辅助细胞。▷ 此外，CXCL13-CXCR5轴还可以与免疫检查点连接，以增强抗肿瘤作用。▷ 在淋巴细胞血液瘤中，CXCL13-CXCR5轴介导B细胞和Tfh细胞的归巢，有利于淋巴组织的构建。例如在在DLBCL中，CXCR5CD4 T细胞通过STAT3和STAT1的磷酸化促进肿瘤细胞的存活和增殖，并分泌IL-10。作为靶点，靶向CXCL13的研究似乎相对更多些。Vincerx数据结构：VIP924由CXCR5单抗、legumain-可裂解linker和驱动蛋白纺锤体蛋白KSPi抑制剂组成。机制：在细胞内，VIP924在溶酶体内被legumain裂解，细胞毒性有效载荷在细胞浆内释放。当细胞分裂时，KSPi与其靶蛋白结合并抑制有效的纺锤体形成。KSPi上的细胞捕集器修饰是用于阻止KSPi扩散出细胞。据称与其他B细胞结合抗体相比，VIP924中的CXCR5抗体显示出出色的细胞内化能力，但未展示具体数据。与CD19、CD22、CD70和CD79b作为抗体靶点的KSPi-ADC对比，CXCR5在不同淋巴瘤中的细胞毒性水平：可以看到，在GC-DLBCL中较为突出但不如CD70，在BurkL中相对碾压，但是B-NHL、一般DLBCL和MCL中细胞毒性都不是较优的选择。安全性数据：剂量递增数据：对CXCR5高表达的LY2214动物模型随机给予VIP924 10 mg/kg第1、5天，第10、15、20天给予4 mg/kg VIP924，每周1次，共3周。两个治疗组都显示出主要的抗肿瘤活性。10mg/kg组和4mg/kg组的TGI分别为87%和91%(P<0.0001)。其中，在HBL-1异种移植瘤模型中，一次应用10mg/kg VIP924导致三只小鼠中有两只完全反应，没有留下可测量的肿瘤。小结Vincerx之前是做小分子抑制剂和小分子偶联药物的。进展最快的产品是CDK9抑制剂。ADC，一个热门但是又非常挑战创新技术的话题。对于一些药企来说，能够上这艘船也意味着更广阔的的应用领域。具体地对于Vincerx而言，能将偶联技术扩展到更热门的领域是管线拓展的一个可行方向。单看这一款产品，CXCR5的靶向性是足够的，但是CXCR家族这么久以来没有成药也是有显著的机制原因在，从理论上而言，ADC的结构能让其摆脱CXCR5复杂体内机制的困扰，不失为对此类有效但复杂的靶点的探索方式。选择这么难的靶点，不知道Vincerx是否有什么独家心得。目前从这次海报披露的数据来看，适应症的竞争不算小，同时，也没有显示对CXCR5抗体有什么进行工程化处理的考虑。不过两个剂量组的肿瘤抑制率(TGI)都很高，即使对于非最优靶点的适应症，也表现出了优秀的肿瘤杀伤能力。Vincerx探索ADC，感觉也像是一点行业的缩影，对这个赛道现在是“又爱又恨”。参考资料：1.https://investors.vincerx.com/static-files/87a84746-dd73-4502-b779-a3c74329e4402.Binhan Wang, Manni Wang,et al.CXCL13-CXCR5 axis: Regulation in inflammatory diseases and cancer,Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Reviews on Cancer,Volume 1877, Issue 5,2022,188799,ISSN 0304-419X,https://doi-org.libproxy1.nus.edu.sg/10.1016/j.bbcan.2022.188799.3.https://www.biospace.com/article/releases/vincerx-pharma-presents-preclinical-data-on-vip924-a-first-in-class-antibody-drug-conjugate-adc-at-the-2023-american-association-for-cancer-research-aacr-annual-meeting-/?s=86