TWIST1

【导读】 化疗后的疾病复发是卵巢癌(OC)的一个主要临床挑战，但关于肿瘤表观基因组如何调节支持化疗耐药的转录程序，我们知之甚少。 9月28日，英国伯明翰大学研究学者在期刊《Communications Biology》上发表了题为“The chromatin landscape of high-grade serous ovarian cancer metastasis identifies regulatory drivers in post-chemotherapy residual tumour cells”的研究论文，本研究中，研究表明上皮肿瘤细胞显示出富含致癌转录因子MEIS和PBX基序的开放染色质区域。化疗后的微环境显示了深刻的肿瘤异质性，以及对染色质富集TP53、TP63、TWIST1和耐药通路激活转录因子结合基序的可及细胞的选择。OC化疗耐药肿瘤亚群在治疗前就已存在，并以应激相关基因表达为特征，在化疗后富集。核受体RORa, NR2F6和HNF4G被发现是这些细胞的候选转录驱动因子，而E2F2和E2F4结合位点的关闭表明治疗后的肿瘤具有低增殖能力。 因此，对卵巢癌细胞化疗后存活的基因调控图谱的描述揭示了潜在的化疗耐药核心转录调控因子，为改善临床结局提供了新的治疗靶点。 https://www-nature-com.libproxy1.nus.edu.sg/articles/s42003-024-06909-9#Sec8 背景知识 01 高级别浆液性卵巢癌(HGSOC)是最常见和最致命的卵巢癌亚型，每年影响全球23.9万名女性，5年生存率仅为25%。绝大多数(80%)患者被诊断为晚期FIGO III期或IV期疾病，并有转移进展的证据。患者常表现为广泛的腹膜腔播散，最常见的转移部位是网膜。 晚期HGSOC的治疗方案包括铂类化合物的化疗和减瘤手术。尽管大多数病例在初期有临床反应，但化学耐药性极为常见，70-95%的患者在两年内出现疾病复发。过去30年，人们对化学耐药的机制进行了深入研究，主要集中在耐药信号通路的扰乱和基因表达谱上。机制包括铂类化合物转运泵的失调、DNA损伤修复（DDR）通路和细胞死亡响应的紊乱，但对化疗治疗的耐药机制的数量和复杂性超过了更具靶向性的疗法。 上皮性肉瘤样癌（HGSOC）的体细胞突变谱非常复杂，存在极端的拷贝数变异，TP53突变的普遍性几乎达到100%，并且存在异常高的肿瘤异质性。对转移性卵巢癌的详细转录分析揭示了肿瘤、间质和浸润性免疫细胞群的细胞类型构成。研究表明，化疗可调节肿瘤微环境中的转录程序，与IL6相关的炎症网络和应激反应基因与不良治疗反应和加速疾病复发有关。此外，最近的一项纵向单细胞转录组研究鉴定并验证了与复发和生存期缩短相关的应激相关肿瘤细胞表达谱。 对化疗耐药的分子机制了解得较少的是，调控应激、DNA损伤响应或细胞死亡信号转导的转录程序的基因调节机制。事实上，作为单一疗法或与化疗联合使用的表观遗传疗法是克服耐药的一种潜在选择，目前正在进行临床评估。 研究发现肿瘤细胞中与压力相关的化疗耐药的转录调控因子 02 研究人员对19,122个上皮肿瘤细胞的染色质景观进行了更详细的分析。研究人员对分群子集的特征分析揭示了肿瘤子集内基因、峰值和位点活性的异质性。所有样本都显示出明显的EPCAM、LAPTM4B、KRT7、PAX8基因活性以及MEIS1位点富集，支持上皮细胞类型，但包括MUC16在内的其他肿瘤标志物在样本间的变化更大。在治疗前的细胞中，MEF2家族、TP53和TP63的选定位点显示出显著富集，而在治疗后的细胞中，TP53/63的富集更为明显，在40-60%的样本中可见。 化疗富集的与压力相关的肿瘤细胞的转录驱动因子 研究人员已经发现，腹膜转移灶内的HGSOC化疗耐药性受到一组可识别的与压力相关的基因标志物的促进，该标志物可在预先治疗的肿瘤细胞亚群中检测到，因此有必要在这些数据中检查肿瘤压力基因活性评分。与先前的研究结果一致，在化疗后，每细胞和每样本的肿瘤压力评分均显著增加，这表明可能存在对化疗耐药的与压力相关的肿瘤细胞的选择。值得注意的是，该队列中出现疾病复发的两名患者（post_F和post_G）也是肿瘤压力评分最高的患者。 为了探究驱动这种应激/化疗耐药肿瘤细胞状态的主要转录调控因子，研究人员识别出每个样本的chromVar motif分数与应激标志物分数的相关性。这一分析识别出与应激分数显著相关的结合位点活性，其中包括转录因子RORA、GATA、NR2F6和HNF4G。尤其是，与应激分数呈最强负相关性的结合位点包括E2F2和E2F4，它们是DNA复制和细胞周期的激活调节因子。这些结果表明，化疗耐药应激相关肿瘤细胞的增殖率较低，这与先前的研究结果一致，即慢周期肿瘤细胞具有增强的化疗逃逸能力。 此外，研究人员通过基因活性差异分析和结合位点富集分析确定了5114个在化疗前和化疗后肿瘤细胞中存在差异的基因以及286个富集的结合位点。CNA（拷贝数变异）轮廓揭示了未经治疗肿瘤细胞中的多种遗传学异常，尤其是染色体3、19和20的增益，而化疗后肿瘤细胞中观察到的CNA较少。为了突出标记出大部分对化疗敏感（化疗前）和对化疗耐药（化疗后）的肿瘤细胞的可能转录调节因子，研究人员接下来确定了在化疗后具有不同活性的基因和TF（转录因子）结合位点的交集。这使得研究人员能够识别出在对化疗敏感和对化疗耐药的细胞中同时具有高基因活性和富集结合位点的TF（转录因子）。KLF15、MEF2B、NRF1和CUX2被确定为四个可能的化疗敏感性主调节因子，而另外37个转录因子被确定为在化疗耐药中具有潜在重要性的因子。 研究小结 03 总之，研究人员对转移性卵巢肿瘤细胞的染色质景观的分析揭示了相当大的异质性。化疗后的肿瘤细胞增加了染色质可及性，包括可被干性和耐药驱动因子(如TP63、TP53、TCF7和TWIST1)调节的区域。这些数据为转移性卵巢癌化疗后转录程序的基因调控机制提供了深刻的认识，并确定了一系列潜在的治疗靶点，以进一步探索对抗化疗耐药性和改善HGSOC患者的结局。 【参考资料】 https://www-nature-com.libproxy1.nus.edu.sg/articles/s42003-024-06909-9#Sec8 【关于投稿】 转化医学网（360zhyx.com）是转化医学核心门户，旨在推动基础研究、临床诊疗和产业的发展，核心内容涵盖组学、检验、免疫、肿瘤、心血管、糖尿病等。如您有最新的研究内容发表，欢迎联系我们进行免费报道（公众号菜单栏-在线客服联系），我们的理念：内容创造价值，转化铸就未来！ 转化医学网（360zhyx.com）发布的文章旨在介绍前沿医学研究进展，不能作为治疗方案使用；如需获得健康指导，请至正规医院就诊。 热门推荐活动 点击免费报名 🕓 上海｜11月15日-16日 ▶ 2024第一届中国类器官转化医学大会 点击对应文字 查看详情

文章解读+创新点拓展，为您带来科研新体验～ 导读 一项发表在Cell Research的前沿研究Single-cell RNA sequencing reveals the developmental program underlying proximal–distal patterning of the human lung at the embryonic stage，通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）与空间转录组技术的强强联合，为人类肺脏早期发育提供了前所未有的精细视图。本文将为您揭示这项技术如何帮助科学家们洞察肺部近端-远端模式形成的关键机制，并探讨其对临床实践的重大意义。 研究背景 肺脏发育是一个复杂的过程，涉及多种细胞类型的分化与互动。传统研究手段虽能提供部分信息，但在捕捉细胞层面动态变化方面显得力不从心。单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术的问世改变了这一局面，它使研究人员得以前所未有的精度观察细胞内部活动，尤其是那些在早期发育阶段发生的变化。 此外，空间转录组技术进一步增强了研究能力，它能够在保持细胞空间位置的同时分析其基因表达情况，这对于理解器官发育过程中细胞间的相互作用至关重要。 值得注意的是，此前对于早期发育阶段的数据相对匮乏，而本研究选取了从第4周到第8周的胚胎期乃至早期假腺期的人类样本进行单细胞测序分析。相比之下，已有较多研究关注于更晚发育阶段的单细胞测序。因此，本研究填补了这一领域的空白，提供了早期胚胎肺发育的重要数据支撑。 研究设计与结果 研究者使用了单细胞RNA测序技术对4-8周的人类胚胎肺组织进行分析，构建了一个包含超过16万个细胞的转录组图谱。通过这个图谱，研究者们不仅识别出了近端与远端上皮细胞之间明显的基因表达差异，而且还发现了多个调控近端-远端模式形成的转录因子，如THRB、EGR3、ETV1以及SOX6。 更重要的是，通过对早期胚胎基质细胞群的细致剖析，揭示了一个BDNF+的基质细胞群体，它们在近端-远端模式形成中扮演着重要角色，并具有空间特异性。 接着采用了空间转录组技术，对6周的肺组织切片进行了空间转录组学分析。将分子特征映射到了解剖尺度上，对细胞类型及其分子标志物在近端与远端上皮中的分布情况进行展示。 图1：主要的肺细胞类型出现在人类胚胎肺发育的开始 研究者选取了人类胚胎肺（4-8周）进行采样，涵盖了胚胎和早期假腺体阶段。通过单细胞转录组测序分析，鉴定了六种人类胚胎肺细胞类型：间质细胞、上皮祖细胞、神经嵴祖细胞、内皮祖细胞、原红细胞和巨噬细胞（图1b-d）。研究发现，在第4周时，所有六种细胞类型均已出现，表明肺器官发生始于复杂的细胞相互作用（图1e）。 图2：TFs调节早期上皮细胞的近端-远端模式 进一步分析发现，在4-8周，大多数近端（如基底细胞和纤毛细胞）和远端（如肺泡I型和II型细胞（AT1和AT2）祖细胞已经出现（图2a）。近端/远端祖细胞的异质性促使我们研究了转录因子的作用，这些转录因子是发育过程中细胞命运决定的主要驱动因素。研究表明，KLF5/SOX2调控近端细胞命运，而ETV5/SOX9则调控远端细胞命运（图2c）。 自第4周起，便观察到明显的近端-远端表达模式，直到第6周后SOX2hi/ETV5lo上皮细胞中远端因子显著下调，而SOX2和SOX9在这两个细胞群体中一直共表达（图2e-f），这表明近端特异性大约在第6周开始形成。由此得出结论，肺上皮细胞的近端-远端模式自第4周起就开始形成，并由不同的转录因子组合引导。 图3：多种基质细胞类型表现出近端-远端空间异质性 除了内在的转录因子，由中胚层衍生的间充质细胞所形成的微环境对于肺上皮形态发生至关重要。为了进一步了解间质细胞的空间特性，特别是它们与上皮层的距离，研究者利用空间转录组测序技术，将分子特征映射到解剖尺度上（图3d）。通过该技术，研究者观察到在近端和远端上皮中分布的不同上皮亚型，包括SOX2hi/ETV5lo和SOX9hi/ETV5hi及其分子标记物（图3e-f）。 通过计算间质亚型与近端/远端上皮之间的空间距离（图3g），研究者发现CRABP1+基质细胞密集地包围着气管管腔，而COL9A2+上皮细胞则位于左、右支气管附近。相反，BDNF+上皮细胞主要分布在边界区域，暗示其在建立远端上皮微环境中的关键作用。气道 平滑肌细胞（ASMC）围绕上皮分布，而血管平滑肌细胞（VSMC）则分散，没有典型的模式。单分子荧光原位杂交（smiFISH）技术验证了COL9A2+细胞和ASMC的定位（图3h）。 值得注意的是，LIMS2被鉴定为新的ASMC标志物。这些结果揭示了间质亚型在空间上的特异性分布及其在胚胎肺器官发生过程中作为上皮形态发生微环境提供者的多样性作用。 图4：SC_BDNF+基质细胞为早期肺上皮细胞的发育提供信号 进一步的研究发现，BDNF+基质细胞亚型是上皮受体相关的间质来源配体（图4a）。这类细胞在胚胎第4周出现，并随肺发育逐渐减少（图4b）。BDNF+细胞的标志基因BDNF和FGF10在器官形成期间下调（图4c），显示出其在早期发育中的特殊作用。配体-受体分析表明，BDNF+间质亚型主要表达BDNF、FGF9/10、WNT2/2B等配体，这些配体的受体主要由上皮细胞表达，提示BDNF+间质细胞与上皮细胞之间存在特异性通信（图4d）。 smiFISH验证了这一结果（图4e）。此外，向肺上皮祖细胞类器官中添加BDNF可以改善其存活、生长和分支（图4g-h）。这些结果表明，SC_BDNF+间质细胞作为一种胚胎特异性亚型，在早期肺发育中对上皮分支形态发生具有重要作用。 图5：ASMC和VSMC的发展轨迹推断 为了进一步推断了ASMC和VSMC的分化调控程序，作者对SMC细胞进行了拟时序分析（图5a-b），在4周时就发现SMC向ASMC或VSMC分化的偏向性，早于之前研究解剖学的观察（6周时）。间充质细胞中的核心转录因子如MEIS2、SHOX2、TWIST1在SMC发育过程中逐渐下调，而SMC标记物ACTA2和TAGLN在两类SMC中均逐步上调，ASMC和VSMC各自的标记物MYH11和MEF2C也随着发育时序在各自亚型中上调（图5c）。 进一步研究还发现了一系列具有有高调控子活性和特定的转录模式的调控SMC向VSMC和ASMC分化的新型转录因子，如EBF1对VSMC，FOXF1对ASMC（图5d），并通过smiFISH验证了这一结果（图5e）。 此外，ASMC特异性表达IGF1、CXCL14、SSC5D和ENPP作为与上皮受体相互作用的配体（图5f）。这些发现揭示了ASMC在肺发育中的关键作用，表明表达这些配体的SMCs可以建立支持上皮发育的微环境，有助于改进体外肺器官模型的生成。 拓展延伸 单细胞RNA测序（scRNA-seq）和空间转录组技术在其他许多科研领域也有广泛的应用前景。下面我们将探讨这两种技术如何在不同的生物学研究中产生深远影响。 ●癌症研究 单细胞RNA测序技术能够帮助科学家们识别肿瘤微环境中的细胞异质性，这对于理解癌症的发生发展机制至关重要。通过分析肿瘤细胞及其周围非肿瘤细胞（如免疫细胞、成纤维细胞等）的基因表达谱，研究人员可以发现肿瘤细胞如何逃避免疫监视，以及它们是如何与周围的微环境相互作用以促进肿瘤生长。此外，空间转录组技术还能提供这些细胞在肿瘤组织中的精确位置信息，进一步揭示细胞间复杂的相互作用，从而为制定更有效的个性化治疗方案提供理论依据。 ●免疫学应用 免疫系统是一个复杂的网络，包含了多种多样的细胞类型。单细胞RNA测序技术使得研究人员能够详细分析免疫细胞的多样性，了解不同免疫细胞亚群的功能特性。例如，在病毒感染或自身免疫性疾病中，通过比较健康个体与患病个体的免疫细胞组成差异，可以发现新的免疫反应机制。空间转录组技术则有助于理解免疫细胞在感染部位的分布情况，这对于研究免疫应答的局部化效应具有重要意义。 ●神经科学应用 大脑是人体中最复杂的器官之一，其功能依赖于高度异质化的神经元和其他支持细胞的协调工作。单细胞RNA测序技术使神经科学家能够对不同类型的神经元进行分类，并研究它们之间的功能差异。特别是在发育神经生物学领域，这些技术帮助揭示了神经元如何从前体细胞分化而来，以及它们如何形成复杂的神经网络。空间转录组技术则允许研究者在保留细胞空间位置的情况下分析基因表达模式，这对于理解大脑发育过程中细胞排列规律及功能区划分具有不可替代的价值。 ●发育生物学应用 除了肺发育之外，单细胞RNA测序和空间转录组技术也被广泛应用于其他器官系统的发育研究中。例如，在心脏发育研究中，这些技术有助于鉴定参与心肌细胞分化和心脏形态发生的转录因子；在肝脏发育研究中，则可以用来追踪肝细胞的起源和成熟过程。通过整合这些数据，研究人员能够构建出更加完整的器官发育图谱，为理解各种发育缺陷提供新的线索。 ●再生医学应用 再生医学致力于通过细胞疗法或组织工程手段修复受损组织和器官。单细胞RNA测序技术能够帮助鉴定具有再生潜能的干细胞群体，并揭示它们在特定生理或病理条件下的行为变化。空间转录组技术则有助于确定这些细胞在体内的确切位置，这对于指导细胞移植和组织重建具有实际意义。 临床应用与展望 从临床角度看，单细胞RNA测序与空间转录组技术通过精确定位基因表达变化，促进了肺疾病如先天性肺发育不良和慢性阻塞性肺病的深入理解，有望催生更精准的诊断与治疗方案。这两项技术不仅推进了基础科学研究，也为临床医学带来了革新机遇，预期未来将有更多基于这些技术的新疗法出现，改善患者的生活质量。 注：本文旨在介绍医学研究进展，不做治疗方案推荐。如有需要，请咨询专业临床医生。 参考文献： Cao S, Feng H, Yi H, Pan M, Lin L, Zhang YS, Feng Z, Liang W, Cai B, Li Q, Xiong Z, Shen Q, Ke M, Zhao X, Chen H, He Q, Min M, Cai Q, Liu H, Wang J, Pei D, Chen J, Ma Y. Single-cell RNA sequencing reveals the developmental program underlying proximal-distal patterning of the human lung at the embryonic stage. Cell Res. 2023 Jun;33(6):421-433. 点击下方「阅读原文」，前往梅斯官网查询更多实验技术服务支持~

点击上方的 行舟Drug ▲ 添加关注 单克隆抗体引起细胞因子释放综合征的机制及临床前评价进展 来源 《中国新药杂志》 2024年 第33卷第14期 作者 傅盈双，李双星，姜华，林志 国家药物安全评价监测中心药物非临床安全性评价研究北京市重点实验室/中国食品药品检定研究院 摘要 单克隆抗体药物(简称单抗药物)在癌症、免疫相关疾病等方面治疗前景广阔。随着临床前及临床研究数据的积累，人们对其免疫毒性的认识越来越深入。细胞因子释放综合征(cytokines release syndrome，CRS)是一种由多种因素诱导的免疫系统广泛激活的全身炎症反应，单抗药物可通过激活效应细胞或非效应细胞引起细胞因子释放，严重威胁患者的健康。临床前主要通过体外细胞因子释放实验(cytokine release assay，CRA)及体内试验综合评估单抗药物的安全性。虽然体内和体外实验的数据可以相互补充，但通常不能完全预测临床发生，临床前预测单抗药物引起CRS的风险仍是一个亟待解决的问题。本文将从CRS的发生机制、相关法规及临床前评价方法3个方面对单抗治疗产品诱发的CRS进行综述，以期为单抗治疗产品的临床前安全性评价策略提供新的思路。 关键词 细胞因子释放综合征; 单克隆抗体药物; 机制; 安全性评价; 细胞因子释放实验 _ 正文 _ 随着生物技术及精准医疗的发展，单克隆抗体药物(以下简称单抗药物)凭借其高特异性、结构均一、耐受性好且可进行大规模、可重复、安全可控的工业化生产等特点成为生物类药物治疗的热点，目前美国FDA已批准上百种抗体药物，包括鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体、全人源化抗体、抗体药物偶联物(antibody drug conjugates，ADC)等，在抗移植排斥、抗恶性肿瘤、代谢性疾病、哮喘等方面发挥重要作用[1-2]。然而单抗药物作为一种治疗性蛋白在应用过程中有诱发机体对自身或相关蛋白产生免疫反应或相关免疫事件的风险，如过敏反应、血清疾病、产生抗药抗体、肿瘤裂解综合征和细胞因子释放综合征(cytokines release syndrome，CRS)等。CRS是由多种因素诱发的T细胞、巨噬细胞、NK细胞等多种免疫细胞过度活化，以白介素(interleukin，IL)、干扰素(interferon，IFN)、趋化因子等炎症介质水平快速升高为特征，严重威胁生命的临床综合征，是免疫调节类药物常见的不良反应，常见于恶性肿瘤、感染性疾病、自身免疫性疾病、单基因疾病患者[3]。CRS的发作和持续时间因病因和治疗不同而有所差异，但几乎所有CRS患者都会发热，除发热以外临床还表现为乏力、头痛、恶心、呕吐、腹泻等，这些可能与患者体内免疫反应引起的细胞因子升高导致的组织损伤或急性期生理变化有关。CRS进展期，患者还可能出现低血压、低氧血症和呼吸困难、多器官衰竭(通常是肺部、肾脏、肝脏)甚至死亡。此外，由于患者体内呈高炎症反应状态、凝血功能障碍及血小板减少使其有自发性出血的高风险[4]。 CRS最早出现于CD3单克隆抗体(CD3 monoclonal antibody，OKT3)的应用中，当时未引起人们的重视。直到2006年在TGN1412抗体的Ⅰ期临床试验的试验组中6例健康男性志愿者在给药90min内炎症细胞因子水平快速升高，并相继出现肺损伤、多器官衰竭和凝血功能障碍，这一严重不良事件引起研究者及药品管理机构的重视，对单抗药物的使用更加谨慎，英国监管部门重新审查TGN1412的临床前研究数据，TGN1412的临床前评价体内试验以食蟹猴为实验对象，体外试验通过直接向人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)中加入可溶性抗体检测其安全性，然而无论是体内还是体外试验都没有提供任何证据表明在临床试验中给予人体时发生严重的不良反应[5]。 此外，多个单抗药物在临床应用中也表现出不同程度的CRS。利妥昔单抗靶向人B细胞表面CD20抗原，极好地改变了弥散性大B细胞淋巴瘤的治疗现状，但在上市初多例患者在输注利妥昔单抗后出现高热、恶心、呕吐、低血压、呼吸困难等症状，炎症细胞因子IL-6和TNF-α显著升高，部分患者IFN-γ也有明显升高[6]。MBS301是一种岩藻糖全敲除的人源化双特异性人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor-2，HER-2)抗体，用于治疗HER-2阳性乳腺癌和胃癌。患者接受输注治疗，数分钟后出现胸闷、血氧降低等症状，炎性细胞因子水平升高[7]。阿仑单抗(靶向CD52)、巴利昔单抗(拮抗IL-2R)、西妥昔单抗(抗表皮生长因子)等也会引起全身炎症反应[8]。除单抗药物以外，多种生物制品也能引起CRS，如CAR-T细胞产品在多项临床试验中CRS发生率普遍较高[9]。部分细胞毒类化学药或免疫调节化学药应用于临床中也会引起CRS，如阿糖胞苷、奥沙利铂、来那度胺等[10]。 因此，如何准确预测单抗药物引起CRS的风险是其临床前安全性评价中亟待解决的关键问题。深入了解单抗药物引起CRS的发病机制，将有助于探索开发临床前与人体药效学、毒理学、药动学更相近的体内试验模型及体外试验系统，从而预测毒性，为临床试验给药剂量及预防治疗措施提供科学依据。本文将对法规管理、细胞因子释放的发生机制、临床前安全性评价的体外及体内模型等研究进展做一综述。 1 细胞因子释放的发生机制 1.1 发生机制 单抗药物引起CRS的风险及严重程度与抗体的亲和力、抗原特性、抗体表位、Fc段与FcR受体的结合程度等均有关系。单抗药物可通过激活效应细胞或非效应细胞从而引发全身炎症反应。单抗药物主要通过3种方式激活效应细胞: ①抗体通过其Fab段与效应细胞表面的靶抗原结合激活效应细胞，引起细胞因子释放。②抗体通过与IgG抗体结合发生交联，使效应细胞表面的靶抗原交联，从而激活效应细胞，释放细胞因子。③抗体通过其Fc段与非效应细胞表面的FcR结合发生抗体交联，使效应细胞表面的靶抗原发生聚集，从而引起效应细胞活化释放细胞因子。除了激活效应细胞释放细胞因子外，单抗药物还可通过与效应细胞表面的靶抗原结合从而使抗体发生聚集，其Fc段与非效应细胞的FcR结合增加引起非效应细胞活化，释放细胞因子[11]。单抗药物可能通过一种或多种机制引起细胞因子释放，如TGN1412可能通过与CD28共刺激受体结合直接激活T细胞或通过抗体Fc段与FcR结合2种机制诱导细胞因子释放[12]。 1.2 参与细胞 CRS的发生发展涉及多种细胞，如T细胞、B细胞、巨噬细胞、NK细胞等。T细胞是机体适应性免疫的重要参与者，可分化成不同细胞亚群。CRS期间患者体内往往呈现Ⅰ型辅助型T细胞(T helper cell1，Th1)炎症反应状态，Th1可分泌IL-2，IFN-γ与细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic lymphocyte，CTL)协同进行细胞免疫，IFN-γ是致敏静息巨噬细胞的重要信号，在CAR-T细胞产品引起的CRS中，CART细胞释放IFN-γ激活巨噬细胞，从而导致细胞因子释放[13]。靶向T细胞的单抗药物也可能引起T细胞活化增殖，从而导致大量细胞因子释放，如TGN1412与效应记忆T细胞表面抗原CD28结合从而引起T细胞活化，短时间内引起患者IL-2，IFN-γ大量释放。B细胞通常与CRS无直接相关，但单抗药物靶向B细胞引起免疫系统活化可能引起细胞因子释放增多，如利妥昔单抗靶向B细胞表面CD20抗原，趋化因子募集单核细胞、补体，通过补体依赖的细胞毒作用、抗体依赖细胞的细胞毒作用杀伤靶细胞，靶细胞裂解后会释放大量细胞因子，从而引起CRS[14]。NK细胞是人体先天免疫细胞的核心细胞，在抗肿瘤、抗感染等方面发挥重要作用，且NK细胞与T细胞不同，无需致敏，可直接非特异性地杀伤肿瘤细胞。NK细胞也可分泌IFN-γ，促进巨噬细胞活化。阿仑单抗是一种抗CD52的人源化抗体，通过与NK细胞表面的CD16结合发生交联从而激活NK细胞引起细胞因子释放[15]。巨噬细胞可由单核细胞分化而来，通过吞噬病原体、细胞碎片等或抗原呈递在机体发挥重要作用，在CAR-T细胞治疗产品引起的CRS中发挥重要作用。 1.3 细胞因子 CRS的发生发展涉及数百种细胞因子包括IFN，IL和趋化因子等，诱发CRS的因素不同、时期不同，参与细胞因子的种类及水平也有所差异。IL-2，IFN-γ一般在CRS早期增长迅速，IL-10，IL-12等细胞因子水平发生改变的时间一般较晚。研究发现IL-2，IL-6，IL-10，TNF-α，IFN-γ是CRS的关键因子。 1.3.1 IL-6 IL-6是CRS炎症反应的重要介质之一，其水平变化与疾病的病理生理变化密切相关，在免疫和炎症反应中具有重要作用，也是CRS患者严重程度和预后指标的生物标志物。在CAR-T细胞治疗产品引起的CRS中，IL-6基因表达水平显著升高。IL-6可由免疫细胞和非免疫细胞产生，如巨噬细胞和T细胞、B细胞和内皮细胞等。IL-6具有多效性，能够促进T细胞向CTL，TH17细胞亚型分化，发挥抗肿瘤作用。急性炎症时期，IL-6作为肝细胞刺激剂能够诱导肝脏中各细胞产生C反应蛋白(C-reactive protein，CRP)、血小板生成素、补体成分、血清淀粉样蛋白A等急性蛋白，并减少白蛋白的产生，与CRS发热、乏力、头痛、肌痛等临床表现密切相关。IL-6可上调内皮细胞补体5a受体表达，增加对过敏毒素C5a的反应性或通过诱导血管内生长因子产生增加，从而使血管渗透性增加导致间质水肿，最终导致组织损伤。IL-6与可溶性IL-6R复合物还可促进内皮细胞产生IL-6，IL-8和单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)、促进细胞间黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1)表达，募集白细胞。此外，IL-6还可促进血小板释放及纤维蛋白原产生或通过上调单核细胞中的组织因子招募纤溶酶原激活物抑制物-1，促进凝血级联反应激活，引起凝血功能障碍导致弥散性血管内凝血[16-17]。 1.3.2 IL-2 IL-2主要由CD+4Th1细胞产生，树突状细胞、肥大细胞及NKT细胞也可分泌少量IL-2。最初被认为是T细胞生长因子，随着研究的深入，学者发现IL-2还可以提高NK细胞溶解活性，促进B细胞分泌抗体，调节T细胞分化，维持Treg细胞稳态增殖[18-19]。与其他单抗药物不同，TGN1412单抗引起CRS的主要特征是IL-2水平显著升高和淋巴细胞增殖增加。 1.3.3 IL-10 IL-10是一种具有高效抗炎特性的细胞因子，几乎所有的白细胞亚群都可分泌，其中，巨噬细胞和调节性T细胞是主要来源。非白细胞亚群如上皮细胞、角质形成细胞等也可以表达IL-10[20]。IL-10可以抑制T细胞和巨噬细胞中IL，TNF-α和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulo-cyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)等促炎因子的表达，抑制巨噬细胞和树突状细胞的MHCⅠ类分子表达从而降低抗原呈递功能。除了人们熟知的抗炎作用，IL-10还具有免疫刺激作用，IL-10可促进CD+8T细胞及NK细胞的细胞毒性[21-22]。研究表明，发生CRS的患者血清中IL-10显著升高，与CRS严重程度相关[23]。 1.3.4 IFN-γ IFN-γ主要由NK细胞、NKT细胞、巨噬细胞在免疫反应的早期阶段产生，Th1细胞和CTL也可分泌产生IFN-γ[24]，IFN-γ是一种具有抗病毒、抗肿瘤、免疫调节功能的多效性功能因子，可刺激巨噬细胞向M1促炎表型极化，增强NO的产生及趋化因子、促炎因子TNF-α的表达。IFN-γ还可促进幼稚T细胞向效应CD+8T细胞分化，CD+4T细胞向Th1亚群分化。IFN-γ是CRS中重要的炎症因子，也是CRS早期分泌迅速增加的因子之一。 1.3.5 TNF-α TNF-α是炎症反应的主要调节因子，在细胞凋亡、免疫调节方面也起着核心作用，主要由T细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞产生，患者体内TNF-α水平往往在CRS早期迅速升高[25-26]。此外，IFN-γ还可与TNF-α协同激活JAK/STAT1/IRF1通路，诱导NO产生并驱动半胱天冬酶-8、死亡域蛋白(Fas-associated death domain protein，FADD)介导的炎症细胞死亡，导致组织损伤[27]，与CRS临床表现密切相关。 文章内容由凡默谷小编查阅文献选取，排版与编辑为原创。如转载，请尊重劳动成果，注明【来源：凡默谷公众号】。 2 指导原则及相关法规 1997年，ICH基于各国针对生物技术药物的安全性评价发布的指导原则和考虑要点制定了ICH S6[28]，提出了生物技术药物临床前安全性评价的基本原则，对相关种属选择、年龄、生理状态、给药方式、剂量、途径和方案等方面提出要求，但ICH S6是一份总纲性文件，并未对单抗药物的临床前CRS风险评价提供具体依据。ICH S8[29]对人用药物免疫毒性研究试验方法提供指导，虽然ICH S8指导原则将生物技术药物和其他生物制品排除在外，但许多原则及试验策略也适用于单抗药物。 2007年，国家药品监督管理局药品审评中心(CDE)发布了《治疗用生物制品非临床安全性技术审评一般原则》[30]对治疗用生物制品非临床安全性评价的一般原则、药理毒理实验的内容提供指导，其中该指导原则指出许多治疗用生物制品具有免疫调节作用，建议在临床前常规动物重复给药实验中重点关注免疫抑制剂免疫刺激反应。目前，国内仅有CDE于2021年颁布的《药物免疫原性研究技术指导原则》[31]中针对CRS的非临床研究策略及基本考察参数提出了明确的要求，对于免疫调节类药物的临床前评价需要整合体内毒性实验及体外实验中细胞因子释放数据，除了在常规动物体内进行细胞因子相关检测外，还需遵循“case by case原则”进行细胞因子释放试验(cytokine release assay，CRA)，根据抗体作用的机制选择合适的实验系统如人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)、全血、内皮细胞、肿瘤细胞、纤维细胞等，通过固相法或液相法加入抗体孵育一定时间后进行细胞因子检测，具体检测的细胞因子种类需考虑抗体预期引起细胞因子释放的机制。而《药物免疫原性研究技术指导原则》未对体外细胞因子释放试验提出统一的标准及具体技术细节，还需根据药物的特性制定试验方法。 2014年，美国FDA发布治疗性蛋白制品免疫原性评估(Immunogenicity Assessment for Therapeutic Protein Products)[32]提出对治疗性蛋白产品介导细胞激活的能力进行体外评估，如在全血或PBMC体系中检测细胞增殖、细胞因子释放。该指导原则还指出传统用于毒理学试验的动物如大鼠、小鼠、犬、食蟹猴很少显示除淋巴细胞活化、细胞因子释放相关的明显毒性，但在常规毒理学试验中可检测与淋巴细胞活化、细胞因子释放相关的标志物，这有助于预测药物临床诱发细胞因子释放的风险。体外试验应考虑细胞受体交联的影响。 欧洲EMA于2017年发布的生物技术衍生治疗性蛋白免疫原性评估(Immunogenicity Assessment Of Biotechnology-Derived Therapeutic Proteins)[33]概述了治疗性蛋白免疫原性的影响因素、临床后果、评估策略及风险管理计划，指出治疗性蛋白可能引起严重的输注反应，延迟型超敏反应或与内源性成分发生交叉结合，但该指导原则并没有对细胞因子释放试验提出明确要求。 3 临床前评价 3.1 体外试验 根据药物免疫原性研究技术指导原则，具有免疫调节能力的药物的临床前评价需要综合考虑体内和体外试验，由于种属差异，动物模型可能无法模拟药物引起人体免疫系统激发的过程，预测药物引起CRS的风险，体外CRA试验是在充分考虑药物靶点和作用机制的基础上，在体外评估候选药物诱发细胞因子释放的风险，是临床前安全性评价的重要组成部分。当体内试验结果为阴性时，体外试验阳性结果可以提示潜在的安全风险，为临床研究方案制定提供参考。国际生命科学研究所-健康与环境科学研究所免疫毒理学技术委员会(ILSI-HESIITC)开展了CRS风险评估及CRA试验方法的研究，概述了制药企业和合同研究组织关于CRA试验的不同方法，对试验体系、检测指标等方面提出建议[34-35]。 3.1.1 试验体系 CRA方法的选择应该基于细胞因子释放的机制进行，并根据靶向/非靶向、单抗Fc效应功能对可能的作用机制进行预测。目前CRA常选择的试验系统主要为人PBMC、人全血、预孵高密度PBMC、PBMC与内皮细胞共培养。如果单抗药物直接靶向T细胞可能引起细胞因子释放，可以选择PBMC进行试验。但PBMC具有一定的限制性，如在分离阶段细胞可能会发生活化或细胞活力下降; 不同供体来源的PBMC差异大，造成试验系统的不稳定性及不易重复性; 且PBMC无法包含所有参与CRS的细胞类型，与体内CRS过程存在差异。如果Fc与FcRs结合可能引起细胞因子释放，应在包含表达FcRs的细胞中进行体外试验，如全血细胞，还可添加补体等成分。相较于PBMC，全血细胞状态更稳定且细胞种类较多，但个体差异仍存在。特殊情况下，靶抗原仅在疾病状态(如肿瘤细胞或自发致病性细胞)下表达或者细胞因子释放机制涉及全血或PBMC中不存在的细胞类型，则需考虑以肿瘤细胞、内皮细胞、成纤维细胞或原代细胞等为试验系统。PBMC与内皮细胞共培养体系能够模拟细胞在血管中的相互作用、血管渗漏发生等病理反应，但由于成熟的内皮细胞只存在于血管内壁，无法从健康志愿者身上获得，常用人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell，HUVEC)或血液生长内皮细胞(blood outgrowth endothelial cell，BOEC)，相比较HUVEC，BOEC可与PBMC来源于同一供体，避免了由于供体不同引起的局限性。有研究构建了三维仿生血管实验台，以PBMC、粒细胞、内皮细胞、自体去血小板血浆为试验系统，结果显示TGN1412、OKT3、阿仑单抗、曲妥珠单抗的细胞因子释放谱与体内CRS更相似，而且此试验系统接近生理环境，可能反映多种单抗药物通过不同机制诱导CRS的潜力[36]。 3.1.2 试验方法及检测时间 目前体外CRA常采用固定化抗体法和加入可溶性抗体法。相比于可溶性分析法，固定化抗体由于抗体的Fc段固定在培养板表面，抗体发生交联。对于大多数单抗药物而言，抗体固定化后更易导致细胞激活，进而导致细胞因子释放，其灵敏度更高，但由于固定化的特殊性，这也可能导致假阳性结果。可溶性抗体试验由于抗体游离，与PBMC交联不足，无法保证抗体全部与细胞结合，这也导致了实际结合的抗体浓度与加入的抗体浓度不一致，因此相比较固定化抗体而言其引起细胞因子释放的强度更弱、灵敏度较低，但与人体血液环境更接近，可模拟出体内抗体与细胞结合的过程，从而预测细胞因子的释放[37]。有研究通过风干或湿涂将TGN1412固定在聚丙烯或聚苯乙烯96孔板上，加入PBMC或全血孵育一定时间，通过Elisa检测TNF，IL-6，IL-8，结果表明PBMC相较于全血对TGN1412更敏感，且风干包被抗体比湿法包被抗体刺激释放细胞因子效果更显著[38]。除了细胞体系及试验方法的考虑，细胞因子检测时间也是试验的重要关注点之一，不同时间参与的细胞因子不同，选择合适的时间窗进行分析从而减少假阴性的风险。 3.1.3 体外试验检测指标及相关考虑 目前检测免疫治疗产品引起CRS的最佳分析方法仍存在争议。不同的单抗药物引起的CRS机制不同，其诱导细胞因子的风险也不同，具有细胞毒性效应器功能的单抗药物或具有激动剂效应的抗体有更高的细胞因子诱导风险，检测的细胞因子种类、时间取决于药物的作用机制，而且不同检测平台的细胞因子绝对水平有差异，无法绝对说明阳性结果。除检测细胞因子外，还可以通过CCK-8法、细胞计数、流式CFSE染色进行细胞增殖检测以及通过流式进行细胞亚型检测及比例检测。此外，除了进行人源细胞的体外试验，还可以考虑在动物细胞上进行体外试验并进行比较，通过人源细胞及动物细胞的体外结果差异可以了解人体相关的免疫药理学是否能在毒理试验所选择的动物种属中表现出来，也可以判断该动物是否无法预测部分人体的潜在免疫毒性。 3.2 体内模型 ICH S6提出生物制品临床前安全评价应选择动物种属，由于许多生物制品的生物学活性与种属和组织特异性相关，通常无法在常用种属中进行标准的毒性试验，所以应选择能表达相应受体或抗原决定簇可产生药理学活性且与人体组织具有类似的组织交叉反应性的相关种属动物。ICH S6(R1)建议采用体外分析、功能活性评价、组织交叉反应等多种方法进行确定相关种属。经研究发现，TAN1412临床前体内研究与临床研究出现显著不同的原因是TGN1412选择食蟹猴进行临床前评估，经研究TGN1412临床前和临床研究差异大的原因主要是幼年食蟹猴和成年人T细胞表面抗原不同，幼年食蟹猴缺乏记忆型T细胞，且食蟹猴的效应记忆型CD+4T细胞不表达CD28抗原，而人的效应记忆T细胞表达CD28抗原，而效应记忆T细胞是TGN1412的主要效应细胞[39]。当无相关种属时，应考虑使用表达人源受体的相关转基因动物或使用同源蛋白。由于单抗药物等治疗蛋白通常与啮齿类动物的结合较少，因此临床前安全性评价通常在非人灵长类动物上进行药效学、药动学及安全性研究评价。而特殊情况下，部分单抗药物可在啮齿类动物大鼠、小鼠或转基因小鼠上进行临床前研究。通过向免疫缺陷鼠移植人类免疫细胞重建免疫系统获得的人源化小鼠模型可以提供与人体免疫系统更相近的环境，在单抗药物的临床前评价中有良好的应用前景。研究者基于NSG小鼠构建PBMC人源化NSG小鼠、PBMC人源化NSG-MHC-DKO及人源化NSG-SGM3，通过静脉注射OKT3，ANC28，KEYTRUDA，ATG和TGN1412类似物，以PBS作为阴性对照，通过流式检测细胞因子释放，结果显示几种PBMC人源化小鼠模型均能快速、灵敏地反应单抗药物诱发的CRS[40]。 4 结语 单抗药物极大地改变了肿瘤治疗及自身免疫疾病的治疗前景。但随着单抗药物的应用和临床实践经验的积累，与其相关的免疫原性和免疫毒性问题也逐渐得到研究者的重视。免疫原性和免疫毒性不仅影响其药效和安全性，也给企业和药监部门带来挑战。TGN1412临床前安全性评价失败的案例也说明了构建用于单抗类生物药临床前评价模型的迫切需求。目前单抗药物治疗产品的体内模型主要以啮齿类动物及非人灵长类为主，但由于单抗的高度特异性及种属差异性，单抗药物与啮齿类动物、非人灵长类动物往往无法有效结合发挥作用，与单抗药物在人体内的与抗原结合、信号转导等有较大差异，无法准确预测其药效及毒性。虽然基于动物的免疫毒性研究由于种属差异对预测临床试验中人体免疫毒性具有缺陷性，但是有助于非临床研究中药物安全性或有效性数据的解释与整体分析。体外CRA试验是进行单抗药物临床前安全性评价的重要方法，不同单抗药物引起CRS的机制不同，因此体外试验的细胞体系、试验方法、检测细胞因子种类及时间也有所差异，不同检测平台的检测结果也不同，因此无法得到绝对结果。对单抗药物等治疗性蛋白需要进行体内试验及体外试验从而综合评估候选药物诱发CRS的潜在风险。双抗及多抗药物也是近年来的新药研发热点之一，全球共有13种双抗药物获批上市，在肿瘤治疗及遗传性疾病中表现出较好疗效，这类药物在进行体外CRA试验时需考虑双抗/多抗药物的机制确定CRA试验条件，如靶向Gp100(葡萄膜黑色素瘤细胞)/CD3(T细胞)的双抗药物tebentafusp，CRA试验需加入葡萄膜黑色素瘤细胞，以尽可能模拟人体内真实反应。目前尚无标准精确的体外试验平台对所有抗体进行准确评估，因此我们需要开发和验证在人源血液、细胞、组织上进行单抗药物的体外安全性试验，并综合体外及体内试验数据确定和尽量减少潜在的不良反应，为临床试验剂量选择、风险评估策略提供科学依据。 参考文献 详见《中国新药杂志》 2024年 第33卷第14期 文章信息源于公众号凡默谷，登载该文章目的为更广泛的传递行业信息，不代表赞同其观点或对其真实性负责。文章版权归原作者及原出处所有，文章内容仅供参考。本网拥有对此声明的最终解释权，若无意侵犯版权，请联系小编删除。 学如逆水行舟，不进则退； 心似平原走马，易放难收。 行舟Drug 每日更新 欢迎订阅+ 医药大数据|行业动态|政策解读