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新兴细胞和基因疗法（CGT）正在改变医学领域，为患者提供传统药物无法实现的针对性和个性化治疗。截至目前，针对血癌的CAR-T细胞疗法，针对血液系统疾病的基因工程造血干细胞以及治疗一系列罕见疾病的基因疗法，如遗传性视网膜营养不良症和脊髓性肌萎缩症 (SMA)已是市场上已经获批的产品。然而，进入下一阶段，还需要面临一些挑战。对于CGT来说，作为基本的安全性和有效性特征，通过控制活性剂量、时间和部位来精确调节治疗细胞或基因的活性水平至关重要。但目前，治疗性细胞的过度激活和基因治疗中的脱靶效应仍然是需要克服的重大障碍。当输注的CAR- T细胞过度激活时，CAR-T细胞活性可能导致细胞因子释放综合征 (CRS) 和神经毒性，而基因疗法可能会破坏非目标基因的功能或调节，从而导致严重不良反应。最近几年，合成生物学得到快速发展，正在提供新的解决方案来解决这些问题。新型Synthetic receptor（合成受体）平台已成为精确控制工程细胞功能的强大工具，用于微调治疗过程，例如通过识别和处理目标信号或生物标志物来调整剂量或生物活性分子的产生，合成生物学与治疗策略的融合可能会大大加速细胞和基因疗法向下一代的进化。2024年1月3日，国科大李伟团队在Nature子刊《Signal Transduction and Targeted Therapy》刊登了一篇综述文章，回顾了合成受体系统的当前知识，包括其特征和应用，以及设计和改进合成受体的策略，另外还讨论了开发和调整合成受体平台以编程新基因和细胞疗法的挑战。下面小编带大家一起了解一下这篇综述内容。合成受体概述对于功能性合成受体，至少有两个结构域：用于特异性结合的传感结构域（通常是单链可变片段scFv或纳米抗体），以及将传感信号转换为输出信号的执行器结构域。可以使用天然或人造结构来设计合成受体，通过重新连接细胞信号接受和传导的关系，赋予细胞特制的功能，图1总结了过去合成受体研究中关键发现的时间表。图1 过去三十年来合成受体的里程碑式研究成果近年来，模块化合成受体不断被设计和发展用于生物医学应用，如CAR 是一种合成受体，能够与靶细胞高度特异性地相互作用。另一种广泛使用的合成受体是合成Notch（synNotch），当靶向第二抗原时，能够有条件地驱动CAR的表达以及工程化T细胞中的额外信号（图2c）。此外，合成受体已被用来改造治疗细胞，这些细胞可以感知任意输入，例如小分子和疾病相关生物标志物，并在动物模型中分泌治疗分子以做出响应（图2d）。此外，具有紧凑尺寸的合成受体，如图2e所示的RASER（异常信号重新布线至效应器释放）可以通过AAV载体在靶向基因疗法中直接递送以治疗ErbB过度表达的癌症。图2 使用合成受体编程细胞和基因疗法除了生物医学应用外，合成受体已广泛应用于基础研究中，从而以受控和精确的方式研究细胞信号传导和行为的各个方面，包括细胞分化、迁移和形态发生。例如，研究人员已使用 synNotch 受体对工程细胞进行编程，使其响应近分泌信号传导而自组织成多细胞结构。同时，合成受体也可以作为合成正交形态原系统的一部分进行工程设计，以严格控制的方式对三维（3D）组织进行图案化（图2f）。多种类型的合成受体哺乳动物合成受体可以根据不同的分类标准进行分类，这里概述了根据四个不同原则分类的各种可用合成受体，并进一步讨论了它们的优势和局限性。1、细胞表面受体和细胞内受体根据结合配体的位置，合成受体可分为细胞表面受体（又称跨膜受体）和细胞内受体。细胞表面受体一般包括三种类型的跨膜受体（即酶联受体、G蛋白偶联受体和离子通道样受体），它们跨越质膜并将细胞外信号转换为细胞内信号。对于这一类别，每个合成受体包含一个胞外配体结合结构域、至少一个跨膜结构域和一个胞内效应结构域。除了CAR 之外， synNotch、SNIPR（合成膜内蛋白水解受体）、RASSL（仅由合成配体激活的受体）、Tango、MESA（模块化细胞外传感器），ChaCha、TCS（双组分系统）、嵌合细胞因子受体和GEMS（广义细胞外分子传感器）也属于细胞表面受体的范畴。细胞内受体可以位于细胞质或细胞核中，也可以锚定在细胞的细胞内膜上。Cal-Light（钙门控和光门控开关）、CHOMP、体内传感器、RASER（重新布线异常信号以释放效应器）、LOCKR（闭锁正交笼状蛋白）、COMET（可组合的哺乳动物转录元件）和POST（磷酸调节正交信号转导）属于细胞内受体的类别。值得注意的是，这里讨论的合成受体也可以称为合成蛋白开关。由于细胞内受体只能通过细胞内输入激活，因此其中许多受体被设计为由可以穿过质膜的化学分子诱导的开关。2、天然信号传导的受体与正交信号传导的受体激活的受体通过多个下游途径触发信号转导，顾名思义，根据驱动的下游途径（天然的或工程的），可以将合成受体分为基于天然信号传导的受体和基于正交信号传导的受体。基于天然信号的受体将内源信号通路重新连接到原始或定制的输出信号。此类合成受体包括 RASSL、CAR 、嵌合细胞因子受体、GEMS和GEAR。它们不可避免地会激活原有途径来驱动输出。其中，RASSL、CAR和嵌合细胞因子受体将内源性途径重定向到目的配体，从而执行所需的功能。虽然 GEMS 和 GEAR 通过内源通路生成新的定制输出，但它们可以同时导致内源转录网络的激活。另一方面，调节转录网络的能力是基于天然信号传导的受体比基于正交信号传导的受体具有独特的优势，允许执行自然和高度复杂的信号。如CAR是为了模仿TCR的功能，通过调节内源信号通路实现抗肿瘤活性，同时，CAR激活可以诱导额外的转基因（如激活的核因子）T细胞驱动的细胞因子表达，这是正交系统无法实现的。相比之下，基于正交信号传导的受体完全独立于内源信号传导途径。这归因于正交合成转录因子（syn-TF）或正交信号转导系统的使用，因为它们不能识别内源性调控元件并激活内源性信号级联。然而，一些syn-TF（如基于dCas9 的TF和基于TALE的TF）可以编程内源基因表达，而不需要额外的合成启动子。值得注意的是，最广泛使用的正交转录因子是非人源的（如酵母和细菌），因此在临床应用中具有很高的免疫原性风险。使用包含源自人TF的DNA结合结构域和激活结构域的人源化 syn-TF 将大大降低免疫原性风险，而这些融合的转录因子仍然能够激活内源性信号传导。3、可溶性配体结合受体和表面配体结合受体合成受体可以高特异性可溶性和表面结合的配体。根据配体的特性，相应的合成受体可分为可溶性配体结合受体和表面配体结合受体。多种配体呈可溶形式，包括大多数化学分子、激素、细胞因子、生长因子、细胞内可溶性蛋白和一些从膜蛋白上切下的肽（如癌胚抗原 CEA)。上面列出的可溶性分子可以诱导可溶性配体结合受体的活化，例如Tango、ChaCha、MESA、嵌合细胞因子受体、CHOMP、GEMS LOCKR、和POST。通过使用可以穿过质膜的化学分子，已经开发出了几种细胞内合成受体（如POST、CHOMP 和LOCKR）。同时，当受体的配体结合域位于质膜、细胞表面受体（如Tango、ChaCha、MESA 和 GEMS）之外时，它们也可以充当细胞外配体。对于肽/蛋白质配体，在大多数情况下，它们无法进入细胞，因此作用于细胞表面受体，随后触发下游细胞内信号级联反应。固定细胞质膜上的表面结合配体，可以反式激活相邻接收细胞上的细胞表面受体。CAR和synNotch是典型的表面配体感应受体，理论上不能被可溶性配体激活。可溶性配体结合受体通常通过配体诱导的二聚化来激活以触发下游信号传导，而表面配体结合受体需要配体-受体相互作用产生的机械力来激活下游信号传导。因此，可溶性配体结合受体（例如嵌合细胞因子受体和GEMS）可以在长距离运输后由配体诱导激活，而表面配体结合受体（CAR和synNotch）只能以近分泌方式发挥作用。4、部分模块化受体和完全模块化受体根据合成受体是否完全由可重构组件组成，我们将其分为部分模块化受体和完全模块化受体。可以通过设计人工识别结构域同时保留天然信号转导域来构建部分模块化受体，或者保留天然识别结构域同时设计人工信号转导域。前者可以将内源信号通路重新连接到新配体（如 CAR、嵌合细胞因子受体和GEMS），而后者可以通过天然配体（如Tango、ChaCha和dCas-synR）激活替代通路。因此，前者可归类为天然信号传导的受体，后者可归类为正交信号传导的受体。完全模块化的合成受体，具有经过设计的识别域和信号转导域，包括 synNotch、SNIPRs、MESA和 LOCKR可以执行新功能，而不以正交方式破坏内源性途径。值得注意的是，用于完全模块化合成受体模块化组装的组件，可以源自天然存在的成分（synNotch、SNIPR 和MESA）或从头设计的成分（LOCKR）。合成受体工程在这里，将重点介绍四种单次跨膜合成受体的发展和迭代，即CAR（图3a）、synNotch（图4a）、MESA（图5a）和GEMS（图5b）。图3 嵌合抗原受体（CAR）的设计和工程化嵌合抗原受体 (CAR)CAR 是一类最著名的合成受体系统，目前，CAR已应用到T细胞、NK细胞和巨噬细胞等免疫细胞中。此外，包括不变自然杀伤T（iNKT）细胞、粘膜相关不变T（MAIT）细胞和γδT（γδT）细胞在内的先天T细胞也被认为是有前景的免疫效应细胞，这些细胞表现出内在的抗肿瘤微环境（TME）能力和移植物抗宿主病 ( GvHD )的风险最小。CAR主要由胞外结构域(ECD)、跨膜结构域(TMD)和胞内结构域(ICD)组成(3a )，其结构的模块化特点，极易于修改和重新设计。胞外域可分为信号肽 (SP) 和配体结合结构域 (LBD)，前者促使跨膜受体蛋白定位至质膜，后者则特异性识别抗原。LBD通常是抗体的scFv，通过柔性多肽连接子将抗体轻链和重链可变区连接起来。除了简单地scFv之外，CAR 还可以由两个不同的抗原识别结构域组成的双特异性抗体（也称为“串联CAR”）（图3c）。因此，串联CAR-T细胞可以识别单个癌细胞中表达的不同抗原（如Her2和IL-13和IL-13Rα2、CD19和CD20），从而减少肿瘤逃逸的可能性。除此之外，还有用于T细胞治疗的拆分、通用和可编程 (SUPRA) CAR 系统（图3c）。在该系统中，传统的 CAR 架构分为两个元素：（1）通过将 scFv 与亮氨酸拉链融合而形成的可溶性 zipFv；（2）通用zipCAR，包含细胞外同源亮氨酸拉链的剩余跨膜和细胞内结构域。通过添加不同的 zipFv 蛋白，表达 zipCAR 的独特 T 细胞可以重新靶向不同的肿瘤抗原。此外，SUPRA CAR 可以通过可溶性zipFv剂量微调T细胞，从而提高T细胞治疗的安全性和有效性。TMD 通常是跨越质膜的疏水性 α 螺旋，其功能是将CAR蛋白锚定到膜上。除了控制膜整合外，TMD 还调节 CAR 之间的关键相互作用，例如组装和激活。CAR中使用的TMD几乎全部源自天然T细胞蛋白，如CD8、CD28、CD4和CD3δ。另外也有学者从头设计TMD，调节CAR功能和CAR- T细胞活性，相对于常用的CD28 TMD减少了细胞因子释放。ICD充当传输激活信号的角色。大多数CAR的ICD都包含CD3δ衍生的信号传导部分，该部分具有三个基于免疫受体酪氨酸的激活基序 (ITAM)。从20世纪90年代衍生出来的第一代（1G）CAR到现在，CAR本身的结构一直在不断发展到第五代（5G）（图3b），旨在提高特异性并最大限度地减少脱靶毒性。1G CAR仅包含ITAM来提供激活信号传导，没有共刺激结构域。尽管1G CAR被证明能够在小鼠体内激活T细胞并控制肿瘤，但它们在随后的临床研究中未能实现抗肿瘤反应。原因可能是单独的CD3z不足以激活静息T淋巴细胞或触发最佳量细胞因子的产生。为了解决这些问题，2G CAR通过在1G CAR的基础上合并共刺激域（图3b），在肿瘤抗原刺激时能够发出第二个信号，这一改进实现了细胞因子产生、CAR-T细胞持久性和抗肿瘤功效的增强。3G CAR结合多个共刺激域进一步增强CAR-T细胞效力，尽管在体外和体内均已证明了包括延长持久性和增强抗肿瘤功效在内的潜在益处，但一些临床结果并未证明3G CAR-T细胞具有显著优势。由于现有数据是从相对较小的异质样本中获得的，因此得出结论还为时过早，需要进一步的大规模研究来充分评估其可行性。4G CAR是从2G CAR改造而来，可组成或诱导分泌细胞因子（如IL-10、IL-12、IL-7、IL-15、IL-18 和 IL-23），从而协同宿主免疫细胞增强肿瘤杀伤能力。然而，实际上，释放的细胞因子在进入循环后可能会发生全身副作用。在一项临床研究中，修改了肿瘤浸润淋巴细胞 (TIL)，使其在NFAT诱导启动子的作用下表达IL-12，从而治疗转移性黑色素瘤。结果观察到大多数患者会产生严重的毒性，这可能归因于分泌的IL-12。因此需要更多的临床试验数据来评估其安全性和有效性。与4G不同，5G CAR的免疫调节因子表达模块被新的共刺激结构域取代，该共刺激结构域可以激活CAR-T细胞内的特定信号传导途径。基于这一原理，多种方法不断涌现，如将 IL-2 受体β链（IL-2Rβ）添加到CAR中，被抗原激活后，IL-2Rβ结构域可以激活JAK激酶和STAT3/5 信号通路，这可以使CAR-T细胞以最小的毒性实现抗肿瘤效果和体内扩增。然而，它可能会增加CRS的风险，因此在转化研究中应当谨慎。然而，最大限度地减少CAR 免疫细胞的脱靶和脱肿瘤毒性仍然具有挑战性。在此背景下，下一代CAR的开发已经开始（图3c）。例如，双CAR或synNotch CAR的组合逻辑控制可以通过两种或更多种抗原的存在来增强肿瘤靶向特异性。另一方面，通过开关CAR进行的安全控制可以微调CAR 活性，而终止开关CAR可以管理CAR-T细胞的存在时间。这些都是未来提高CAR-T细胞免疫治疗安全性的策略。此外，目前正在研究的大多数 CAR-T 细胞都是通过将CAR构建体插入自体T细胞中，而不破坏内源性TCR基因。在这种情况下，可以避免引发GvHD的风险。然而，患者的身体状况和免疫细胞状态通常不稳定，为了促进同种异体“现成”CAR-T细胞移植，使用核酸内切酶敲除TCR α链(TRAC)，从而破坏TCR的表达，可以成功防止移植物抗宿主的风险。如利用CRISPR/Cas敲入使得CAR编码基因能够精确整合到外周T细胞的TRAC位点中，这不仅有利于同种异体 CAR-T 的细胞产生，而且还增强了T细胞效力。然而，最近的研究表明，内源性 TCR 在促进 CAR-T 细胞在动物模型和患者体内的持久性方面发挥着关键作用，这指出在肿瘤免疫治疗中平衡从 CAR-T 细胞中去除内源 TCR 的复杂影响至关重要。合成Notch受体 (synNotch) 对Notch受体的深入研究为Notch受体的分子机制提供了重要的见解。模块化和独立于天然配体的机械力触发信号传导等内在特征，使Notch受体非常适合模块化嵌合受体工程。可以利用这一点，将天然 Notch 受体的跨膜核心结构域（图4a）以及细胞传感结构域和细胞内执行结构域组合创建新的synNotch 受体系统。图4 合成Notch (synNotch) 受体的设计和工程化其中synNotch可以正交地发挥作用来控制细胞分化、空间模式和布尔决策，synNotch还可以感知肿瘤抗原，然后驱动CAR的表达（如上所述的synNotch CAR），这使得仅通过双抗原识别激活的AND门控T细胞的工程化成为可能。另外，synNotch使CAR-T细胞能够产生特定的治疗反应，如以非常精确和局部的方式分泌细胞因子和抗体。与传统CAR 的激活驱动 T 细胞产生天然细胞因子谱相比，synNotch可以自定义控制细胞因子的表达。synNotch 受体与 CAR的更强大组合正在兴起，以实现精确有效的癌症杀伤，这让synNotch成为应用于癌症免疫治疗的另一种具有潜力的合成受体系统。尽管在实际的生物医学应用方面仍然存在挑战和局限性，但研究人员正在努力找出可能的解决方案。如天然Notch受体具有反式和顺式相互作用模式共存的固有特征，因此，当同源配体与受体存在于同一表面（顺式）时，由于顺式抑制，无法实现激活。为了避免顺式抑制，采用“flippase-out”策略在flippase重组酶转基因果蝇中实现 synNotch 及其配体的互斥表达。另外，synNotch 受体激活通常需要高水平的配体，这对于其他合成受体系统也很常见。而最近的一项研究报告了 synNotch 的改进版本esNotch，通过添加天然Notch衍生的细胞内疏水序列，使得配体激活水平降低了14.6倍（图4b）。此外，还有人修改了synNotch系统，形成合成膜内蛋白水解受体 (SNIPR)（图4b），实现了配体水平降低并增强了配体诱导的信号。同时，SNIPR可以通过人源化模块实现完全人源化，最大限度地降低免疫原性风险。还有人通过用化学诱导二聚化（CID）结构域取代传统的蛋白质特异性识别结构域，在synNotch的基础上衍生出正交化学激活细胞表面受体（OCAR）系统（图4b）。在小分子的诱导下，细胞上的工程化OCAR 可以形成异二聚体，并通过释放 synTF 来触发信号激活。当OCAR系统与传统的synNotch在同一细胞上共表达时，OCAR的一部分将通过卷曲螺旋相互作用被 synNotch 受体隔离，从而使OCAR无法被诱导剂激活。当synNotch受体被相应细胞激活时，OCAR可以恢复其对诱导剂的反应性，从而通过添加诱导剂进一步增强synNotch信号传导。由于其作用机制，OCAR 系统表现出内在的关闭开关，在出现毒性或故障时可用作安全开关（图4b）。模块化细胞外传感器架构 (MESA)与synNotch受体一样，模块化细胞外传感器架构（MESA）受体也利用synTF的蛋白水解释放，其易位到细胞核并启动转录激活以执行正交信号而不中断内源信号通路（图5a）。但与需要表面配体诱导机械力的 synNotch 受体不同，31 MESA 受体通过可溶性配体触发的受体异二聚化发出信号，执行随后的蛋白水解切割。图5 模块化细胞外传感器架构（MESA）和通用细胞外分子传感器（GEMS）的设计和工程每个MESA受体包含两种不同的单次跨膜蛋白，因为它们的胞内结构域是不同的（图5a），MESA 受体还包含三个模块结构域，通过 synTF 释放将细胞外配体结合输入转导为细胞内转录输出。通过设计细胞外传感器结构域，MESA受体可以重定向到新的配体。然而，MESA架构的也需要高水平的配体独立激活，这可能是由于运输期间或细胞表面上的瞬时受体二聚化所致，而TMD 优化可以降低配体激活水平并提高输出目的信号（图5c）。另外，在一项研究中，利用计算设计，使用 split-TEVp 系统进行 MESA 优化（图5c），也实现了低配体水平和高倍数诱导。同时，有报道设计了一种类似的基于 dCas9 的合成受体系统，称为“dCas9-synR”（图5c），该系统能够将天然输入信号与自定义的输出响应程序的直接激活相偶联。广义细胞外分子传感器（GEMS）对EpoR结构和信号传导机制的深入研究，刺激了基于EpoR支架的嵌合细胞因子受体的发展。这些嵌合细胞因子受体（如SD1D2g-1A）含有细胞外scFv、细胞外EpoR D1D2以及TMD结构域，和细胞因子受体的细胞内结构域（如gp130和EpoR）（图5d）。这些嵌合细胞因子受体可以由配体依赖性开/关调节，并模仿天然细胞因子受体系统的功能。在此原型基础上，对GEMS系统进行了合理的设计和工程化。GEMS受体包含源自具有F93A突变的促红细胞生成素受体(EpoR)的标准跨膜支架(图5b)，消除了促红细胞生成素的敏感性。细胞外识别结构域可以进行模块化替换，以响应各种细胞外可溶性配体。胞内结构域采用各种信号传导域将输入重新分配到不同的内源性途径（如JAK/STAT、PI3K/Akt、PLCG和MAPK/ERK）。在最近的报告中，GEMS 平台已发展成为通用工程激活调节剂 (GEAR)和模块化双特异性细胞外受体 (AMBER)。GEAR系统通过DNA结合模块将内源信号诱导的synTF核转位和基于dCas9的基因表达结合起来（图5e），由不同受体（包括 GEMS 受体）激活的各种途径（如NFAT、NFκ、MAPK或 SMAD）可以整合到工程化的GEAR中。AMBER系统是一种基于 DARPin 和 GEMS 的可编程接收器（图5e），它继承了这两个系统的特性和优点。因此，AMBER可以被设计和精炼，以模块化和可预测的方式与新的可溶性配体结合。为了概念验证，GEMS及其衍生物已应用于体外和体内工程设计细胞以进行疾病治疗（图2d ）。结论和观点合成受体的设计和工程取得了巨大进步，合成受体系统的不断进化加速了其生物医学应用和临床转化。作为最成功的案例，CAR 走在了最前沿，已有6种CAR-T细胞疗法获得FDA批准，还有很多正在进行临床研究（ClinicalTrials.gov）。此外，包括CAR-NK和CAR-M在内的其他CAR工程细胞也在转化研究中得到广泛研究。展望未来，该领域的一个重要目标是揭示设计原理，以指导具有所需特性和功能的合成受体的合理设计。越来越多的报告利用计算设计策略来工程和改进合成受体系统，如CAR、MESA 和从头蛋白质开关。其中，从头设计的蛋白质已被纳入合成受体工程中。预计未来可以通过从头设计策略或生成语言模型来设计各种有价值的合成受体。选择功能性合成受体系统，并将其与免疫细胞整合，可能会突破合成受体应用的界限并开发新的细胞疗法（图6）。值得注意的是，不同合成受体系统的组合可以表现出协同效应并进一步增强其性能，研究表明synNotch CAR-T细胞通过组合抗原识别显著增强其安全性和抗肿瘤效果或超低的抗原密度识别。随着工程干细胞疗法的出现，合成受体也可用于工程化iPSC衍生的细胞产品（图6b, c），有可能用于通过程序化通信增强其与宿主微环境的生存和植入能力（图6b）。然而，由于存在一些关于干细胞治疗的预防性数据和批评态度，未来的试验需要进一步研究干细胞治疗本身的安全性和有效性。同时，在临床前和临床研究中也需要谨慎解决对遗传物质（如转基因免疫原性）和引入的遗传修饰的安全性的担忧。图6 合成受体的潜在治疗应用不断扩大此外，合成受体还可以对体内基因疗法进行编程，从而提高安全性和有效性（图6d）。体内基因治疗的一种有前途的方法是利用腺相关病毒（AAV）系统将治疗性遗传物质递送到人体中。尽管 AAV 作为新型基因疗法越来越多地用于临床试验，但其有限的包装容量（约4.7kb）阻碍了上述大多数合成受体的装载。为了满足临床需求，需要设计或筛选尺寸紧凑的合成受体递送载体，如当下火热的LNP。此外，具有最小免疫原性的人源化合成受体对于推进基因治疗以及工程细胞治疗也至关重要。总之，具有所需功能的模块化合成受体已被设计并应用于治疗应用。与此同时，技术进步不断促进和加速合成受体系统的开发和进化，未来预计合成受体生物学会快速发展，并不断为程序化基因疗法和工程细胞疗法提高新的方向，而这是现有方法无法实现的。原文链接https://www-nature-com.libproxy1.nus.edu.sg/articles/s41392-023-01680-5#Sec14/