RB1CC1

引言 DNA 修复和自噬是维持细胞生存的两个关键生物学过程。DNA修复负责修复DNA损伤，确保基因组稳定；而自噬则负责清除细胞内多余的、受损的、错误折叠或聚集的蛋白质和细胞器，维持细胞稳态。拓扑异构酶 I (TOP1) 在DNA复制和转录中起着至关重要的作用，它通过切断DNA形成超螺旋结构，释放扭转应力。然而，TOP1与DNA形成的共价键——TOP1cc是一种有害的DNA损伤，会导致基因组不稳定和细胞死亡。TOP1cc修复主要依赖于酪氨酸DNA磷酸二酯酶 1 (TDP1) 介导的切除修复或MRE11核酶介导的DNA切割和切除修复【1】。然而，TOP1cc的修复过程与蛋白质降解途径的关系尚不清楚。自噬因子在DNA复制叉附近富集，表明自噬可能在DNA损伤修复中发挥作用。TEX264是一种保守的蛋白质，既是自噬受体，也与TOP1cc修复有关【2】。然而，TEX264是否通过自噬介导TOP1cc修复，目前尚不清楚。 近日，来自英国牛津大学拉德克利夫医院的Kristijan Ramadan研究团队在Cell杂志上发表题为TEX264 drives selective autophagy of DNA lesions to promote DNA repair and cell survival的研究论文，该研究发现了TEX264介导的核吞噬作用在维持基因组稳定性和细胞存活中发挥关键作用。 首先通过免疫共沉淀和蛋白质组学分析，研究人员发现自噬相关蛋白（如Beclin-1、TEX264、CHMP7、ATG7、SNAP29）在DNA复制叉处富集，并且这种富集在CPT（诱导DNA复制压力的化合物）处理后被显著增强，这表明自噬可能在响应 DNA 复制压力时发挥作用。接着，研究人员使用LysoIP技术分离溶酶体，并通过质谱分析其蛋白质组成。结果表明，CPT 处理后，许多DNA复制和核蛋白（如DNA聚合酶、MCM复合物蛋白、核孔复合物）被运送到溶酶体，表明溶酶体可能直接参与 DNA 损伤的清除。 进一步，研究人员发现用CPT处理后，TOP1cc水平的恢复受到mTOR抑制剂Torin的促进，而自噬抑制剂ATG7的缺失则完全阻止了TOP1cc的修复，证明自噬是TOP1cc修复的关键途径。其他自噬相关蛋白，如syntaxin 17和RB1CC1，也参与了TOP1cc的降解和细胞对CPT的存活，说明自噬修复TOP1cc的过程是一个复杂的网络，涉及多个自噬相关蛋白。使用mCherry-TOP1-GFP报告系统证实了TOP1在低剂量CPT处理后进入溶酶体，表明 TOP1cc可以直接被溶酶体降解。 通过分析γ-H2AX 和53BP1的定位，研究人员发现低剂量CPT诱导的DNA损伤主要表现为复制压力，而不是DNA 双链断裂。此外，研究人员发现ATR抑制剂VE-822强烈抑制了TOP1cc的运送，而ATM抑制剂KU-55933没有影响，这表明ATR在响应DNA复制压力和促进 TOP1cc 降解中起着关键作用。自噬抑制剂ATG7和syntaxin 17的缺失加剧了低剂量 CPT 处理后蛋白质聚集物的形成，说明自噬在防止蛋白质聚集物形成中发挥作用。 最后，研究人员发现MRE11核酶的缺失强烈抑制了TOP1cc的运送，而MUS81和TDP1的缺失没有影响，表明MRE11核酶在将TOP1cc从核内运送到溶酶体中起着关键作用。使用 LysoIP-Seq技术分离溶酶体中的DNA片段，并通过测序分析其序列特征。结果表明，溶酶体中分离的DNA片段主要来自核内 DNA，且大部分来自内含子和着丝粒区域，表明溶酶体可以清除整个TOP1cc损伤，包括其蛋白质部分和相关的DNA片段。使用 TOP1cc 特异性抗体和LysoIP等技术证实了TOP1cc在低剂量CPT处理后在细胞质中的存在。这表明 TOP1cc可以从核内被运送到细胞质，并被溶酶体降解。 图1 TEX264驱动的选择性自噬促进DNA修复和细胞存活（Credit: Cell） 总之，这项研究证明了选择性自噬在DNA修复中的进化保守作用，并表明它对维持基因组稳定性和细胞存活至关重要。此外，该发现还表明，在治疗结直肠癌患者时， TEX264的表达水平与对伊立替康等TOP1抑制剂的化疗反应相关。 参考文献 1. Pommier, Y. (2006). Topoisomerase I inhibitors: camptothecins and beyond. Nat. Rev. Cancer 6, 789–802. https://doi-org.libproxy1.nus.edu.sg/10.1038/nrc1977.7. Stingele, J., Bellelli, R., and Boulton, S.J. (2017). Mechanisms of DNA–protein crosslink repair. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 18, 563–573. 2. Fielden, J., Wiseman, K., Torrecilla, I., Li, S., Hume, S., Chiang, S.-C., Ruggiano, A., Narayan Singh, A., Freire, R., Hassanieh, S., et al. (2020). TEX264 coordinates p97- and SPRTN-mediated resolution of topoisomerase 1-DNA adducts. Nat. Commun. 11, 1274. https://www-cell-com.libproxy1.nus.edu.sg/cell/fulltext/S0092-8674(24)00911-5 责编|探索君 排版|探索君 文章来源|“BioArt” End 往期精选 围观 一文读透细胞死亡(Cell Death) | 24年Cell重磅综述（长文收藏版） 热文 Cell | 是什么决定了细胞的大小？ 热文 Nature | 2024年值得关注的七项技术 热文 Nature | 自身免疫性疾病能被治愈吗？科学家们终于看到了希望 热文 CRISPR技术进化史 | 24年Cell综述

【导读】 高ALDH1A3表达胶质母细胞瘤（ALDH1A3 hi GBM）显示，术后放化疗的获益有限。在本研究中，团队发现ALDH1A3和PKM2之间的相互作用，增强了后者的四聚化，并促进了胶质母细胞瘤干细胞（GSCs）中的乳酸积累。ALDH1A3介导的PKM2四聚化，是改善ALDH1A3 hi GBM对放化疗反应的潜在治疗靶点。 2024年8月6日， 首都医科大学附属北京天坛医院张伟团队在期刊《Cell Metabolism》上发表了题为“Glycometabolic reprogramming-induced XRCC1 lactylation confers therapeutic resistance in ALDH1A3-overexpressing glioblastoma”的研究论文。本研究全面、系统地检验并确定了富ALDH1A3性GBM中PKM2激活和治疗耐药的机制。放射增敏剂和化学增敏剂D34-919，为ALDH1A3 hi GBM患者提供了一种新的治疗选择。 https://www-cell-com.libproxy1.nus.edu.sg/cell-metabolism/fulltext/S1550-4131(24)00282-1#%20 研究介绍 01 异柠檬酸脱氢酶（IDH）野生型（WT）胶质母细胞瘤（GBM）是成人中最常见且具有侵袭性的原发性恶性脑肿瘤，GBM的特点是复发率高、致死率高。GBM对目前的治疗不敏感，即使在大体全切除和积极的术后放化疗后也是如此，因此，GBM患者的预后仍然很暗淡。胶质母细胞瘤干细胞（GSCs）的存在，显著增加了治疗耐药性以及肿瘤复发。最近的研究表明，GSCs产生并吸收大量的碳水化合物和脂质，作为生长的基石和燃料的来源。因此，鉴于其独特的代谢模式，研究的重点已转向开发针对GSC的代谢疗法。 增强的醛脱氢酶（ALDH）活性是维持癌症干性、恶性进展和治疗耐药性的关键因素。之前的研究表明，ALDH1A3的高表达，是GBM重要的独立不良预后因素。随后的研究证实，ALDH1A3作为维持ALDH活性最普遍的亚型，在GBM对基于替莫唑胺（TMZ）的治疗的耐药性中起关键作用。另一项研究表明，ALDH1A3的高表达导致肿瘤细胞中的糖酵解代谢增加，最终导致GBM的放疗耐药性。然而，ALDH1A3过表达上调肿瘤细胞中的糖酵解代谢，并诱导GBM患者对放化疗的耐药性，而其机制尚不清楚。 乳酸化不仅代表了一种在表观遗传基因调控中起关键作用的蛋白质翻译后修饰的新形式，而且还在糖酵解代谢与各种生物过程中的细胞功能调控之间，起着直接联系作用。随后，大量研究揭示了组蛋白乳酸化在转录调控、代谢调控、肿瘤恶性进展和其他生物学过程中的作用。近年来，非组蛋白乳酸化的发现，进一步揭示了其在调节许多酶活性和信号通路中的重要作用。对乳酸化的新兴研究，强调了其在各种生物过程中作为核心细胞功能调节剂和癌症治疗靶点的潜在作用。 在本研究中，团队发现ALDH1A3与丙酮酸激酶M同工酶2（PKM2）相互作用，以增加后者的四聚化，从而诱导GSC中的细胞内乳酸积累。乳酸化诱导的X射线交叉互补蛋白1（XRCC1）表面电荷的电，中和增强了其与输入蛋白α的亲和力，从而导致XRCC1更大的核易位，并最终增强了DNA修复活性，这将使这些细胞对放射治疗产生抵抗力。此外，团队还发现了一种小分子化合物，该化合物可以破坏ALDH1A3和PKM2之间的相互作用，从而增强GSCs在体内和体外的放化疗敏感性，而不会产生明显的副作用。这些发现阐明了ALDH1A3过表达介导糖酵解和放化疗耐药性的机制，并且它们允许鉴定高表达ALDH1A3 GBM患者放化疗的潜在小分子增敏剂 （ALDH1A3 hi GBM）。 研究进展 02 D34-919增强放化疗敏感性，抑制小鼠颅内异种移植肿瘤的生长 团队建立了GBM的3组颅内异种移植模型，包括I.组，肿瘤体积、生存率和体重监测；II.组，代谢通量分析；第三组，组织病理学染色。每组根据不同的处理，由8个亚组组成。团队发现，D34-919 + TMZ、D34-919 +放疗或D34-919 + TMZ +放疗的联合治疗，与相应的非联合治疗亚组相比，小鼠的肿瘤生长显著减少，总生存时间延长，三联治疗导致肿瘤完全消除（或至少低于检测限）和100%存活超过70天。D34-919联合治疗抑制了肿瘤生长，而没有伴随体重损失或任何组织和器官损伤。 与载体治疗相比，D34-919治疗与颅内肿瘤中PK酶活性的显著降低程度，和较低的乳酸浓度相关。同样，注射 D- 后1.5 小时13C6-葡萄糖进入小鼠尾静脉，团队发现产生的乳酸（与载体治疗组相比，D34-919治疗组颅内肿瘤中的C标记乳酸）显著降低。此外，D34-919在小鼠体内的处理在4小时后，在颅内肿瘤中显示出峰值积累，24小时时水平恢复到基线。 D34-919联合放化疗，可有效改善GBM，并延长异种移植模型的生存期 D34-919增加体内胶质母细胞瘤类器官和脑肿瘤的放化疗敏感性 GBM类器官是最新、最先进的体外肿瘤模型之一，可用于药物疗效评价。因此，团队使用来自12名病理诊断为GBM的患者的手术切除肿瘤样本（根据WHO中枢神经系统肿瘤分类第五版，WHO CNS5）来构建GBM类器官模型。团队使用这些类器官模型，来确定D34-919是否可以增强这些临床相关模型对放化疗的敏感性。团队用D34-919作为单一疗法，TMZ +放射作为单一疗法，或将这三者一起作为三联疗法，治疗此类类器官3天。使用免疫荧光染色，团队发现D34-919作为单一疗法或与TMZ和辐射联合使用，可显著降低乳酸化XRCC1-K247水平，而TMZ +辐射没有影响。团队还可视化了γ-H2AX水平和裂解的caspase-3水平，发现从单一疗法到双重疗法再到三联疗法，两者的水平都逐渐升高。相比之下，从单一疗法到三联疗法，Ki-67的水平逐渐降低。团队对颅内异种移植模型进行了类似的分析，并发现了类似的结果。 D34-919联合疗法在患者来源的GBM类器官模型中，有效缩小肿瘤负荷 研究结论 03 本研究表明，用糖酵解抑制剂2-DG对GSC进行预处理，导致它们对放化疗的敏感性与ALDH1A3表达无关。ALDH1A3的过表达，可能通过糖酵解代谢途径，影响了GSCs的治疗敏感性。随后，团队进行了一项广泛的研究，以了解ALDH1A3促进糖酵解代谢的内在机制。 ALDH1A3在促进多种癌症的糖酵解代谢方面，发挥着重要作用。ALDH1A3在糖酵解代谢中的调控机制，被认为是通过经典和非经典途径介导的。先前的研究表明，间充质GSCs中ALDH1A3和ACSS1的增加，可能有助于糖酵解代谢的激活，可能是通过改变乙酰辅酶A合成。然而，本研究的结果，未能支持上述机制。此外，ALDH1A3表达的上调，更有可能增加乙酰辅酶A的产生，而乙酰辅酶A反过来会抑制，而不是激活糖酵解代谢。因此，需要更多的证据，来支持经典通路的参与。 RNA-seq分析结果显示，ALDH1A3编辑细胞中糖酵解酶的表达，没有显著变化；这进一步否定了非经典通路参与糖酵解代谢调节的可能性。相反，团队发现ALDH1A3与多种蛋白质相互作用，包括PKM2。PKM2是糖酵解中的关键酶。ALDH1A3和PKM2 间的蛋白质相互作用，增强了后者的四聚化。GSCs中糖酵解代谢的增强，可能是由于四聚化PKM的强催化活性。ALDH1A3诱导的PKM2激活，导致乳酸的显著细胞内积累，但其他糖酵解和TCA循环相关代谢物没有显著变化。综上所述，本研究报告了一种促进代谢重编程的新机制和代谢酶非经典功能的调节途径。 研究由于糖代谢重编程导致的治疗耐药机制，仍然是癌症研究中一个日益突出的话题。团队的研究结果首次表明XRCC1-K247乳酸化在GSCs中增加，同时在GSC中细胞内乳酸积累。XRCC1作为连接DNA修复酶的支架蛋白，在内源性和外源性DNA修复中，起着至关重要的作用。具有灭活XRCC1的肿瘤细胞，对DNA损伤更敏感。XRCC1的乳酸化，使其从带负电荷转变为电中性，这增加了其对核转运蛋白输入蛋白α的结合亲和力。XRCC的核输入，最终导致GBM细胞中DNA损伤修复增强。重要的是，在GBM的临床样本中，检测到XRCC1-K247乳酸化。上述结果表明， XRCC1-K247乳酸化， 可能是GBM术后放疗和化疗敏感性的准确预测因子，而不仅仅是XRCC1表达。 ALDH1A3诱导的PKM2激活是GBM治疗耐药的基本原因。D34-919的作用，与已知的PKM2抑制剂不同，可能不会影响正常细胞的代谢功能。长期腹腔注射D34-919治疗后，小鼠大脑及重要器官均未见副作用。此外， D34-919在预防颅内肿瘤治疗耐药方面， 显示出更强的作用。这些效应可能归因于错综复杂的体内肿瘤微环境或体外和体内培养条件之间的差异。 肿瘤类器官模型以其卓越的肿瘤组织学概括能力、肿瘤的内在特征及其微环境而闻名，在肿瘤研究中具有巨大的潜力。D34-919在GBM类器官模型中的作用，与颅内肿瘤模型相似。然而，XRCC1-K247的乳酸化在辐射组和TMZ处理组中，均呈下降趋势。造成这种结果的原因，可能是放疗和化疗改变了肿瘤细胞的代谢平衡或线粒体稳定性，从而间接改变XRCC1-K247的乳酸化。尽管与D34-919处理相比，这些变化很小，但它们是稳定的，值得进一步探索。同样重要的是，与颅内肿瘤模型相比，D34-919在增强GBM类器官模型放化疗方面的稳定性，相对较差。类器官模型之间的差异被放大，可能是由于GBM类器官模型之间，存在广泛的遗传差异。 参考资料： 1.Louis D.N.Perry A.Wesseling P.Brat D.J.Cree I.A.Figarella-Branger D.Hawkins C.Ng H.K.Pfister S.M.Reifenberger G.et al. The 2021 WHO classification of tumors of the central nervous system: a summary. Neuro Oncol. 2021; 23: 1231-1251 【关于投稿】 转化医学网（360zhyx.com）是转化医学核心门户，旨在推动基础研究、临床诊疗和产业的发展，核心内容涵盖组学、检验、免疫、肿瘤、心血管、糖尿病等。如您有最新的研究内容发表，欢迎联系我们进行免费报道（公众号菜单栏-在线客服联系），我们的理念：内容创造价值，转化铸就未来！ 转化医学网（360zhyx.com）发布的文章旨在介绍前沿医学研究进展，不能作为治疗方案使用；如需获得健康指导，请至正规医院就诊。 热门·直播/活动 🕓 线上｜08月15日 19:00-20:30 ▶ “脑类器官前沿：揭秘遗传机制，重塑神经退行性疾病研究未来”线上研讨会欢迎您的参与！ 🕓 北京｜09月20日-21日 ▶ 第五届单细胞技术应用研讨会暨空间组学前沿研讨会欢迎您的参与！ 🕓 上海｜11月15日-16日 ▶ 2024第一届中国类器官转化医学大会欢迎您的参与！ 点击对应文字 查看详情

导读 “自噬”是细胞的一个自我消化的过程，简单来说，自噬就像是细胞内的“清洁工”，负责清理不再需要或功能异常的“垃圾”。 日本学者大隅良典是这一领域的先驱，凭借自噬相关的研究，他斩获了2016年诺贝尔生理或医学奖。 出生在日本的大隅良典从小就对化学颇感兴趣，20世纪90年代，大隅良典从面包酵母中找到了与自噬有关的关键基因，自那以后，他开启了自噬研究之路，并将这项研究带到了人类细胞之中。 以下是大隅良典的自述。 早年经历与影响 1945年，也就是第二次世界大战结束前半年，我出生在日本福冈。我的父亲叫大雄，是九州大学采矿工程教授；母亲叫诗名。 当时，日本普遍贫穷，甚至经常食不果腹。我是一个体弱多病的孩子，再加上营养不良导致身体更为孱弱。我出生后，母亲患上了肺结核，在床上与病魔抗争了很长时间。我仍然记得她患上脊柱结核后打石膏的样子。 幸运的是，那时夏威夷的一位友人向我父母寄来了新研发的抗生素，正是这及时的援助让我的母亲得以康复。虽然当时的我对这些药物的具体意义并不完全理解，但“链霉素”、“青霉素”等名词却在我心中留下了深深的烙印。大约在我8岁那年，母亲终于能够重拾正常的生活。与此同时，比我大12岁的哥哥大助顺利考入东京大学文学系，他在我上小学时已经是个大学生了。在父亲、两位姐姐礼子和文子，以及众多亲友的支持下，我顺利度过了那段充满挑战的日子。倘若那时我能遇到一位出类拔萃的医生，或许我会走上医学的道路。然而，我心中始终燃烧着成为科学家的梦想，这梦想在父母的期望中得到了鼓舞。 我在一个充满自然气息的环境中成长，我的家四周环绕着稻田、溪流、山丘和大海。我的童年时光大多在户外度过，捕捉鱼类、采摘野果。在小学期间，我对昆虫的收集产生了浓厚的兴趣，花费大量的时间去寻找各种奇特的昆虫标本。夜晚，我会仰望星空，尝试记住每一颗星星和星座的名字。然而，这些兴趣并未得到专业的培养，最终只成为了我童年时期的美好回忆，而非终身热爱的追求。每当哥哥从东京大学放假回家，他总会带回一些书籍，其中不乏精心挑选的科学类读物。这些书籍大大拓宽了我对学校之外世界的认知。尽管我体质较弱，既无运动天赋，也不擅长文学，但我仍然努力在学校取得优异的成绩。 图1. 1951年在福冈拍摄的全家福（父母、哥哥和两个姐姐）。 在高中期间，我加入了化学俱乐部，我们会在其中混合各种化学物质，并喜欢观察它们之间的反应。我清楚地记得琼脂中“列桑格现象”（Liesegang phenomenon）的美，但当时我并不知道如何分析它。由于我希望成为一名化学家，因此选择了以化学见长的东京大学就读。 然而，化学课程却并没有激发我的兴趣，我经历了一段不确定的时期，甚至为我的未来感到苦恼。幸运的是，当时分子生物学领域刚刚兴起，于是我决定专攻这一领域。本科毕业后我加入了今堀和男（Kazutomo Imahori）的实验室，他是当时日本少数几个拥有分子生物学实验室的科学家之一。 今堀和男的研究领域是物理化学，用于评估蛋白质与核酸之间的相互作用。在前田昭（Akio Maeda）的指导下，我开始研究核糖体亚基在蛋白质合成中的作用。尽管我无法得出特别有趣的结果，但我在今堀实验室的时光令人兴奋，因为我们参与了快速发展领域的工作，我第一次体验到了实验工作的乐趣。这段经历还让我对细胞内蛋白质合成的连续性有了深刻的认识。    图2. 1967年高中化学俱乐部。 在我研究生学习期间，大学学生抗议活动非常多，而东京大学在这一时期正处于社会辩论和社会变革的中心。我在这段时间里意识到，我们必须关注社会发展和社会的方向，为了参加讨论和示威活动，我也因此无法完全专注于实验室工作。 从攻读博士学位第二年开始，我决定转到京都大学，前田昭此时已经是副教授，他加入了新成立的生物物理系。京都大学提供了一个非常自由的环境，我在化学系生物化学实验室中遇到了一群才华横溢的新学生和朋友。在研究过程中，我对大肠杆菌素E3产生了兴趣，它能够穿过细菌细胞膜并立即抑制蛋白质合成。这一时期，我对生物膜的兴趣不断增长。 一年后的1971年，我与中泽麻里子（Mariko Nakazawa）结婚，她在我之后两年加入了今堀实验室。我们结婚后在京都度过了非常令人难忘的一年。然而不久后，中泽麻里子意外地怀孕了，她也因此返回了东京。为了支持我们的新家庭，她成功申请加入了新成立的三菱生命科学研究所。我也回到东京，选择跟随今堀和男，此时他已经转到了东京大学的农学院，我在那之后勉强完成了论文，获得了博士学位。    图3.（a）今堀和男和（b）安良浩二。 当时，要获得一个良好的学术职位并不容易。由于细胞生物学领域刚刚开始兴起，今堀和男建议我前往洛克菲勒大学的G. M. 埃德尔曼（G. M. Edelman）实验室工作。当时，今堀和男以前的学生伊原一朗（Ichiro Yahara）在那里表现很好，也因此我很快就获得了一个岗位。这是我第一次离开日本，而且与我之前的工作领域大不相同，所以我一度非常迷茫。我的妻子在获知后决定离开研究所，和我一起去纽约。幸运的是，中泽麻里子很快在同一所大学的诺顿·辛德（Norton Zinder）实验室找到了一个研究职位。 最初，我研究的是淋巴细胞的丝裂原，但埃德尔曼决定将实验室的重点转向小鼠发育，于是我参与了建立体外小鼠受精系统的工作。我之前只处理过大肠杆菌，因此我每天都会为如何用少量卵子捕捉早期发育过程而苦恼。不久之后，迈克·贾兹温斯基（Mike Jazwinski）从亚瑟·科尔伯格（Arthur Kornberg）的实验室转到我们的实验室。受哈特韦尔（Hartwell）发现cdc突变体的启发，我们开始了一个项目，旨在揭示酵母中DNA复制起始的机制，我加入了这个项目。我们原计划使用密度梯度离心法在这个项目中使用分离的细胞核，但很难获得未受损的细胞核。我注意到试管顶部有一层白色物质，当我出于好奇在显微镜下观察这层物质时，我意识到我们还在分离高度纯化的液泡。这给我留下了深刻的印象，并是我走向今天这个位置的众多偶然环节之一。    图4. 大隅良典和中泽麻里子于1971年和2015年。 1977年秋天，东京大学理学院的安良浩二（Yasuhiro Anraku）教授邀请我回到日本担任他的实验室的助理教授，尽管我刚开始研究酵母DNA复制起始的工作，但还是决定尽快回到日本。1977年12月，我带着当时即将满6岁的儿子回到了日本，而中泽麻里子则和我们在纽约刚出生的第二个儿子一起多待了几个月，以完成她在辛德实验室的工作。 安良浩二实验室以其在E. coli中的转运蛋白和呼吸机制方面的工作而闻名，但安良浩二允许我开始一个关于酵母的项目。回想起来，我真的很感激安良浩二给我的这个机会。 我最终决定不去研究质膜，而是液泡的膜，这是一种细胞器。当时，液泡被认为是细胞的“垃圾场”，因此很少有科学家对它感兴趣，但我在植物学系的位置以及毗邻马益泽正志（Masashi Tazawa）实验室的位置使我相信液泡是一个被低估的、迷人的细胞器。我相信许多酵母研究人员都认为这是一个奇怪的项目选择。    很快，我开发了一种从高度纯化的液泡中分离液泡膜囊泡的程序。虽然液泡占细胞体积的大约四分之一，但我只能获得少量液泡膜，但这足以证明液泡膜上氨基酸和钙的主动转运。此外，我们是第一个展示新型质子泵V型ATP酶的团队，它为液泡转运提供了驱动力，这些工作是与已故的嘉数嘉美和日本田内悦子合作的成果。此后，V型ATP酶的结构和功能研究成为了一个活跃的研究领域，一直持续到今天。 搬到小田原并发现自噬 在对液泡膜进行了10年的研究之后，我获得了东京大学文理学院（小田原校区）的副教授职位，并建立了自己的实验室——只有我一个人。 我的实验室设备非常简陋，只有一台摇床、一个培养箱、一个分光光度计、一台基础光学显微镜和几个其他仪器。我意识到这是一个开始全新课题的难得机会，于是在我们部门的第一次会议上宣布我将研究液泡的溶解功能。然而，我并没有精心策划的策略来研究这个问题。 由于液泡是一个包含多种溶解酶的酸性区室，我推测这个细胞器将发挥与哺乳动物溶酶体类似的作用。将可能有害的降解过程隔离在膜区室中是有生物学意义的，但当时我知道，如果这是真的，那么需要降解的物质必须穿过液泡膜，这表明这需要细胞生物学的方法，并不容易解决。那时候，我关于蛋白质降解的研究源于对液泡的研究，那一年我43岁。 图5. 东京大学实验室的首批成员 溶酶体是克里斯蒂安·德迪夫（Christian de Duve）于1955年发现的，不久后，洛克菲勒大学的研究人员通过电子显微镜观察到溶酶体接收来自细胞外和细胞质的物质。德迪夫用希腊语“self-eating”一词来描述这种现象，意为“自我吞噬”。虽然像格伦·莫蒂莫尔（Glenn Mortimore）和佩尔·塞格伦（Per Seglen），对自噬的调节和复杂的膜动力学进行了深入的分析，但当我加入这一领域时，问题比答案多得多。哺乳动物细胞中溶酶体和膜动力学的复杂性阻碍了自噬机制的揭示。德迪夫的实验室与埃德尔曼的实验室在同一座大楼里，虽然我有来自他实验室的朋友，但我从未有机会在洛克菲勒大学与这位伟大的科学家见面。 今天的光学显微镜，包括荧光显微镜，都是先进的仪器，但在那个时代，光学显微镜的功率有限，很难获得关于细胞内的信息，特别是在对于微小的酵母细胞研究的时候。然而，可以在相差显微镜下清晰地观察到酵母液泡。液泡内部有点像低蛋白浓度的盐溶液，因此我知道由于折射率的不同，很容易检测到液泡内的结构。之后我每天都会在显微镜下观察液泡，我想我可能在这些年里比任何人都更长时间地观察酵母细胞！ 首先，我寻找了一种条件，使酵母能够分解自己的蛋白质，并确定了孢子形成是最佳候选。这种从营养生长细胞到通过减数分裂产生四个孢子的戏剧性变化是由氮的环境耗竭引起的。由于氮是蛋白质的主要成分，我推测这种剧烈的细胞重塑所需的蛋白质合成必须依赖于细胞自身蛋白质的周转。因此，我密切观察了孢子形成过程中的液泡形态，但没有观察到任何明显的变化。    有一天，我突然设想，如果我使用一种缺乏液泡蛋白酶的细胞，那么被输送到液泡中进行降解的结构将保留在这个细胞器中，并可能可见。幸运的是，伊丽莎白·琼斯（Elizabeth Jones）已经构建了缺乏液泡蛋白酶的菌株，并且作为酵母社区共享精神的典范，将它们存放在了加州大学伯克利分校的酵母遗传种质中心，因此我立即请求将它们送到我的实验室。当它们到达时，我使它们处于氮饥饿状态并在显微镜下观察。我观察到液泡内有小的球形结构在剧烈移动。这些结构在氮饥饿开始后30分钟内出现，并在几小时内完全填充了液泡。在这个原本平静的酵母细胞中，这种明显的表型真的打动了我，我清晰地记得盯着显微镜看了好几个小时，甚至于无法移开视线。这些结构在野生型细胞中会立即降解，这就是为什么它们从未被正确记录的原因。 我很幸运有两个原因：首先，液泡内的结构，我们现在称之为自噬体，足够大，可以在显微镜下看到； 其次，自噬体通过布朗运动产生的强烈运动使得它们在液泡中的积累很容易被注意到，即使使用基础光学显微镜也是如此。这一现象的发现决定了我职业生涯的剩余部分。 我决定立即通过电子显微镜确定这一现象的原因，并寻求了美寿巴（Misuzu Baba）以及大须美佐子（Masako Osumi）的帮助。他们拍摄的图像美得令人惊叹，为酵母自噬的特征性膜现象提供了确凿的证据。这些图像显示，自噬体与细胞质具有相同的核糖体密度，以及各种细胞质结构和细胞器，这表明自噬是一个非选择性的降解过程。这些实验为我们提供了当前对与自噬相关的膜动力学的理解。虽然液泡比哺乳动物的溶酶体大得多，但我们观察到的整个过程在拓扑结构上与哺乳动物细胞中的巨自噬相同，证实了酵母可以作为研究自噬的模式生物。    酵母作为模式生物最吸引人的特点是其遗传可操作性，这使它在解析复杂的生物现象方面具有巨大的优势。对我影响很大的两个重要例子是李·哈特韦尔（Lee Hartwell）的cdc突变体鉴定及其在细胞周期中的作用，以及兰迪·谢克曼的sec突变体分离及其在膜转运中的作用。 由于我们对参与自噬的基因和蛋白质一无所知，因此第一步是分离出自噬缺陷突变体。但是当时，我们监测自噬的唯一方法就是观察液泡内自噬体的积累。我第一位硕士生塚田美纪（Miki Tsukada）在我们工作的这个阶段发挥了核心作用。她取出了数千个诱变细胞，分别使它们处于饥饿状态，然后检查液泡内是否存在缺少自噬体的突变体。这种方法使我们发现了第一个自噬突变菌株，我们将其命名为apg1。在这个菌株中无法诱导蛋白质降解，这使我们确信自噬体确实是饥饿期间负责降解的。正如我们所预料的，我们还发现，纯合二倍体突变体不能产生孢子。然而，在营养丰富的条件下，apg1菌株与野生型细胞之间并没有观察到差异，液泡功能或分泌也没有明显的缺陷。 很快我们就发现，与野生型细胞相比，apg1细胞在氮饥饿期间迅速失去活力。我们假设这一表型是由自噬缺陷引起的，因此我们接下来进行了一项初步的活力评估筛选。通过分离活力降低的菌株，然后检查这些菌株在自噬方面的形态缺陷，我们能够在一次筛选中鉴定出大约100个自噬缺陷菌株。进一步的遗传分析表明，这些菌株中有14个是互补组。根据我们目前对自噬的理解，这一筛选非常有效。我们最初预测这些突变体将在自噬过程的不同阶段表现出缺陷，但令人惊讶的是，它们都对自噬体的形成至关重要，这是自噬过程中最重要的一步。    接下来，我们着手克隆并鉴定筛选中观察到的突变表型所涉及的基因。塚田首先成功克隆了APG1基因，这使我们了解到该基因编码一种蛋白激酶。然而，我们还发现，剩余的基因编码对自噬至关重要的未表征蛋白质，但在营养丰富条件下对生长不是必需的。因此，我们无法推断出它们的功能，并经历了一段无法发表我们激动人心的发现的困难时期。尽管我们取得了快速的进展，但自噬基因仍然逃脱了全世界酵母遗传综合分析中其他研究人员的关注。我怀疑这是因为研究人员对必需基因感兴趣，这些基因通常被定义为在营养丰富培养基中无法存活的基因。此时，武田信司也开发了一种自噬活性的定量测定方法，即至今仍广泛使用的Pho8Li60测定法。这些发展共同为我们后续的自噬分子机制研究奠定了基础。 这就是我在东京大学那个小实验室里开始自噬研究的经历。从发现自噬到开始表征Atg基因，整个过程在八年内在驹场（日本东京都目黑区的一个町）完成。 国家基础生物学研究所 下一个阶段开始于1996年。 当时我被选为位于冈崎的国家基础生物学研究所（NIBB）的教授。该机构为基础生物学提供了非常有利的环境，我选择了三名研究人员加入我们的团队：来自关西医学院的吉本大蔵（Tamotsu Yoshimori），他在哺乳动物细胞中整合我们在酵母中的发现；野田武司（Takeshi Noda），他是我们在駒場实验室的第一个博士生；以及在美国约翰·霍普金斯大学学习过的河村良明（Yoshiaki Kamada）。第二年，前东京医科大学临床医生水岛伸（Noboru Mizushima）也加入实验室，成为日本学术振兴会（JSPS）的博士后研究员，后来成为助理教授。从那时起，来自日本各地的研究生和博士后加入了我们的实验室，我们进入了研究的最富有成果的时期。在NIBB，我们能够创造出一个真正独特的研究环境，将我们的工作扩展到包括哺乳动物细胞和植物细胞，这对该领域的发展非常重要。我们实验室的大多数成员都住在NIBB附近，由于吉本大蔵和我在这段时间都在外工作，我们经常工作到深夜，边喝啤酒边讨论科学。    我原本预计分离自噬所需的所有基因将需要很长时间，但感谢我妻子实验室的合作，该实验室在东京理科大学帮助我们进行克隆，以及1996年对整个酵母基因组的测序，我们能够在相对较短的时间内阐明几乎所有APG基因的遗传背景           图6. 2003年国家基础生物学研究所的大隅实验室。 之后，我们着手鉴定已表征的Apg蛋白的相互作用蛋白，并能够在氮饥饿条件下自信地鉴定出对自噬至关重要的所有18个基因。由迈克尔·图姆（Michael Thumm）领导的一个团队正在研究在饥饿条件下使用抗体降低蛋白质水平，并紧跟在我们团队之后，使用“aut”别名命名他们发现的基因。与此同时，丹·克利翁斯基（Dan Klionsky）的团队正在研究氨基肽酶Ape1从细胞质到液泡靶向的传递，现在被称为Cvt途径，他们使用“cvt”别名来识别基因。该途径实际上是负责Ape1成熟的生物合成途径。通过我们团队的协作，我们确定这一过程是通过类似膜的现象发生的，这些现象依赖于核心自噬机制和非常有选择性地隔离Ape1以传递到液泡。因此，克利翁斯基的团队发现了Cvt途径，这成为选择性自噬这一主要领域的重要模型。    随着多个团队在酵母中继续分离出具有自噬缺陷的突变菌株，我们集体决定在ATG别名下统一基因名称，以简化该领域的命名。由于我们团队鉴定了大多数关键的自噬相关基因，因此在我们团队为APG基因命名时使用的基因编号在这一系统中得到了保留。随着进一步鉴定自噬相关基因，其中大多数涉及选择性自噬，ATG基因的数量现已达到41个。 在我们在NIBB任职期间，随着我们开始研究ATG基因产物以深入了解其功能，重要的发现接踵而至。水岛伸在他的研究中取得了第一个重要突破，研究对象是最近克隆的Atg12蛋白。他发现了一个复杂的共轭系统，它以泛素样的方式起作用，产生Atg12-Atg5-Atg16复合物二聚体，这对自噬至关重要。另外两名研究生，高义切里佐（Takayoshi Kirisako）和一村吉信（Yoshinobu Ichimura），也发现了另一个泛素样共轭系统，该系统不同寻常地导致Atg8与膜磷脂磷脂酰乙醇胺结合。Atg8的同源物很快被吉本大蔵在哺乳动物中和我们的团队在植物中鉴定出来，它在整个自噬过程中的所有阶段都与自噬体相关，因此被广泛用作自噬进展的标记。因此，我们了解到近一半的必需Atg蛋白仅参与两个共轭反应。这些反应所涉及的复合物的重要结构细节得益于我们与稻垣冬彦（Fuyuhiko Inagaki）和野田伸生（Nobuo Noda）的团队之间的紧密合作而得以解决。 随着自噬特异性PI3激酶复合物的鉴定，我们将其命名为PI3激酶复合物I，从而获得了更多详细信息。木原明生（Akio Kihara）的研究表明，Atg6实际上只是斯科特·埃姆尔（Scott Emr）的团队最近鉴定出的Vps30蛋白，即液泡蛋白分选途径中的蛋白。Vps30是PI3激酶复合物的一个组成部分，我们随后发现Atg14使该复合物在自噬中发挥了特定作用。PI3激酶复合物I的另一个特定成分Atg38最近被荒木康弘（Yasuhiro Araki）发现。同时，我们还发现了Atg13在激活Atg1激酶功能方面的重要作用，并确定了Atg17、Atg29和Atg31是形成自噬诱导所必需的复合物，这在饥饿条件下尤为重要。随着我们对Atg9、Atg18和Atg2的研究，我们很快将饥饿条件下对自噬至关重要的所有18个基因分为六个功能组。铃木久仁里（Kuninori Suzuki）进一步探索了这一点，他使用荧光显微镜发现了前自噬体结构（PAS），这是一种动态结构，所有Atg蛋白至少部分组装于此，并精细协调自噬体的形成。铃木久仁里的工作还表明，Atg蛋白以分层的方式与PAS结合，以在自噬中发挥其重要作用，这进一步揭示了自噬的机制。    ATG基因的鉴定彻底改变了自噬研究。其中一个重要例子是水岛伸使用带有GFP标记的LC3转基因小鼠展示哺乳动物中自噬的进展，以及他成功生成了首个Atg5自噬敲除小鼠。加上小松正明（Masaaki Komatsu）在小鼠中敲除Atg7的研究，这些研究改变了我们对哺乳动物细胞中自噬的理解，并推动了世界各地对各种细胞、组织、器官和整个生物体中ATG基因的广泛遗传操作。这一运动有助于揭示自噬的多种生理功能。其中，自噬的回收功能是细胞中最基本的，有助于应对常见的营养限制挑战。但自噬不仅对营养回收很重要：它还涉及经常选择性地清除不必要的或有害的细胞内成分，这对于维持细胞内环境非常重要。最近，蛋白质、超分子结构和细胞器的选择性消除已成为核心自噬机制在生理上重要的应用。其中特别突出的一个例子是备受关注的选择性线粒体自噬或线粒体自噬领域。通过自噬清除老化和可能受损的线粒体可确保高效的能量产生和健康的细胞内环境，这强调了自噬与细胞的精细整合。 在东京工业大学我最后一个实验室 即使在像酵母细胞这样看似简单的生物体中，仍有许多谜团尚未解开。因此，自从吉本大蔵和水岛伸成立自己的研究小组以来，我的实验室一直专注于酵母研究，已有13年之久。 2009年，我的职业生涯又发生了另一个重要变化。东京工业大学向我提供了一个拥有先进设施的特聘教授职位，于是我决定返回东京地区。与小林仁志（Hitoshi Nakatogawa）和铃木教授担任助理教授，以及后来的山下早苗（Hayashi Yamomoto），我们成立了一个新的实验室。我带了很多来自冈崎的同事到这个新设施。我们专注于一个主题，即通过Atg蛋白的功能分析，研究自噬体的形成过程。最近，我们发现了PAS形成的早期步骤是如何组织的。另一个让我们感兴趣的研究领域是酵母的选择性自噬机制。在这个领域，我们也能够识别出各种目标选择的受体。小林仁志发现了内质网和细胞核降解的新型受体。 图7. 2015年东京大学大隅良典研究组成员 现在，我的实验室已经将研究重点转移到自噬的生理意义上。为了回到我职业生涯开始时让我着迷的原始问题——自噬降解是什么、何时、如何以及为什么——我们需要系统地考虑细胞在各种环境条件下的存在。今年，我们在东京工业大学成立了一个研究单位，并与川又友子（Tomoko Kawamata）担任助理教授，我们现在正在运行一个主要由博士后研究人员组成的实验室，这将是我最后一个实验室。在这里，我们正在努力解决那些我认为对深化我们对自噬的理解非常重要的原始问题。酵母仍然是一个极其强大的模式生物，随着新的生物化学技术的不断发展，我相信我们仍然可以做出许多开创性的贡献，特别是在确定自噬的诱导条件和各种模式方面。这些贡献将不可避免地评估自噬降解产生的产物，它们从液泡中导出的机制，以及它们对细胞代谢的影响。作为一种基本的细胞过程，自噬直接和间接地与一系列细胞通路相关联，而开发能够让我们掌握这种机制微妙特征的定量方法至关重要。对自噬的更好理解有望帮助我们阐明遗传学、表型和疾病之间的模糊关系。    自噬研究仍处于初级阶段，特别是我们对自噬生理作用的理解还处在起步阶段。当然，我很高兴我们能够揭示出有关自噬及其相关表型的如此复杂的细节，该领域吸引了世界各地的关注，这非常令人兴奋。但我最感激的是多年来与我一起工作的许多优秀的同事。我始终受好奇心驱使，而不是追求立即的实际成果，我很幸运能与欣赏基础研究重要性的博士后研究人员和研究生一起工作。他们中的许多人分享了我对研究困难项目的热情，这些项目并不总是能立即得出结果，而令人欣慰的是，他们中的许多人继续在各大学作为研究人员推动这一领域的发展。多年来，我也非常幸运能与许多合作者一起工作，他们在我们的研究过程中给予了帮助。特别是我想提到两位与我们合作了十多年，对Atg蛋白进行系统性结构分析的研究人员的贡献：目前在日本微生物化学研究所工作的野节伸吾（Nobuo Noda）和令人遗憾的是在2016年去世的稻垣文彦（Fuyuhiko Inagaki）。我非常感谢他们多年来的合作。 图8. 2016年大隅良典一家 我对自噬研究所表现出的兴趣深感感动，对我来说，这代表了过去28年不可思议的旅程。这一切要归功于对我们基础研究的资助支持，这对我们的事业至关重要。如果我们的工作能够触发人们对生命的理解，那么作为基础科学家，这将是我最大的快乐和荣幸。我满怀期待地期待着该领域在未来的持续发展。 参考资料 Yoshinori Ohsumi Biographical.The Nobel Prize.      封面图来源：正文 版权声明/免责声明 本文为授权转载文章。 本文仅作信息交流之目的，不提供任何商用、医用、投资用建议。 文中图片、视频、字体、音乐等素材或为药时代购买的授权正版作品，或来自微信公共图片库，或取自公司官网/网络，部分素材根据CC0协议使用，版权归拥有者，药时代尽力注明来源。 如有任何问题，请与我们联系。 衷心感谢! 药时代官方网站:www.drugtimes.cn 联系方式: 电话:13651980212 微信:27674131 邮箱:contact@drugtimes.cn 「K药」新增的 “潜在” 业绩 再试一次！辉瑞“复活”其口服GLP-1RA “神药” 罗沙司他的前世今生 点击这里，发现价值信息！