更新于：2024-09-19

EBF1

更新于：2024-09-19

基本信息

别名

COE1、Early B-cell factor、EBF

+ [6]

简介

Key pioneer transcription factor of B-cell specification and commitment (PubMed:27807034). Recognizes variations of the palindromic sequence 5'-ATTCCCNNGGGAATT-3'. Operates in a transcription factor network to activate B-cell-specific genes and repress genes associated with alternative cell fates. For instance, positively regulates many B-cell specific genes including BCR or CD40 while repressing genes that direct cells into alternative lineages, including GATA3 and TCF7 for the T-cell lineage. In addition to its role during lymphopoiesis, controls the thermogenic gene program in adipocytes during development and in response to environmental cold (By similarity). (Microbial infection) Acts as a chromatin anchor for Epstein-Barr virus EBNA2 to mediate the assembly of EBNA2 chromatin complexes in B-cells (PubMed:28968461). In addition, binds to the viral LMP1 proximal promoter and promotes its expression during latency (PubMed:26819314).

关联

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2024-10-15·Development

A change in cis-regulatory logic underlying obligate versus facultative muscle multinucleation in chordates

Article

作者: Johnson, Christopher J. ; Bi, Pengpeng ; Zhang, Zheng ; Stolfi, Alberto ; Piekarz, Katarzyna M. ; Shang, Renjie ; Zhang, Haifeng

ABSTRACTVertebrates and tunicates are sister groups that share a common fusogenic factor, Myomaker (Mymk), that drives myoblast fusion and muscle multinucleation. Yet they are divergent in when and where they express Mymk. In vertebrates, all developing skeletal muscles express Mymk and are obligately multinucleated. In tunicates, Mymk is expressed only in post-metamorphic multinucleated muscles, but is absent from mononucleated larval muscles. In this study, we demonstrate that cis-regulatory sequence differences in the promoter region of Mymk underlie the different spatiotemporal patterns of its transcriptional activation in tunicates and vertebrates. Although in vertebrates myogenic regulatory factors (MRFs) such as MyoD1 alone are required and sufficient for Mymk transcription in all skeletal muscles, we show that transcription of Mymk in post-metamorphic muscles of the tunicate Ciona requires the combinatorial activity of MRF, MyoD and Early B-cell Factor (Ebf). This macroevolutionary difference appears to be encoded in cis, likely due to the presence of a putative Ebf-binding site adjacent to predicted MRF binding sites in the Ciona Mymk promoter. We further discuss how Mymk and myoblast fusion might have been regulated in the last common ancestor of tunicates and vertebrates, for which we propose two models.

2024-10-01·Bone

Deletion of the transcription factor EBF1 in perivascular stroma disrupts skeletal homeostasis and precipitates premature aging of the marrow microenvironment

Article

作者: Fretz, Jackie A ; Nelson, Tracy A ; Tommasini, Stephen

Early B cell factor 1 (EBF1) is a transcription factor expressed by multiple lineages of stromal cells within the bone marrow. While cultures of Ebf1-deficient cells have been demonstrated to have impaired differentiation into either the osteoblast or adipogenic lineage in vitro by several groups, in vivo there has been a nominal consequence of the loss of EBF1 on skeletal development. In this study we used Prx-cre driven deletion of Ebf1 to eliminate EBF1 from the entire mesenchymal lineage of the skeleton and resolve this discrepancy. We report here that EBF1 is expressed primarily in the Mesenchymal Stem and Progenitor Cell (MSPC)-Adipo, MSPC-Osteo, and the Early Mesenchymal Progenitors, and that loss of EBF1 has a plethora of consequences to maintenance of the skeleton throughout adulthood. Stroma from the Prx-cre;Ebf1^fl/fl bones had impaired osteogenic differentiation, an age-dependent loss of CFU-F, and elevated senescence accompanying Ebf1-deletion. New bone formation was reduced after 3 months, and resulted in a quiescent bone environment with fewer osteoblasts and an accompanied reduction in osteoclast-mediated remodeling. Consequently, bones were less ductile at a younger age, and deletion of EBF1 dramatically impaired fracture repair. Disruption of EBF1 in perivascular populations also rearranged the vascular network within these bones and disrupted cytokine signaling from key hematopoietic niches resulting in anemia, reductions in B cells, and myeloid skewing of marrow hematopoietic lineages. Mechanistically we observed disrupted BMP signaling within Ebf1-deficient progenitors with reduced SMAD1-phosphorylation, and elevated secretion of the soluble BMP-inhibitor Gremlin from the MSPC-Adipo cells. Ebf1-deficient progenitors also exhibited posttranslational suppression of glucocorticoid receptor expression. Together, these results suggest that EBF1 signaling is required for mesenchymal progenitor mobilization to maintain the adult skeleton, and that the primary action of EBF1 in the early mesenchymal lineage is to promote proliferation, and differentiation of these perivascular cells to sustain a healthy tissue.

2024-10-01·Animal Bioscience

A study of the immunomodulatory effects of coconut oil extract in broilers experimentally infected with velogenic Newcastle disease virus

Article

作者: Ahmad, Muhammad Zishan ; Tahir, Jahanzeb ; Numan, Muhammad ; Saleemi, Muhammad Kashif ; Rizvi, Farzana ; Shakir, Muhammad Zulqarnain ; Mahmood, Nasir ; Usmani, Muhammad Wasim

Objective: This study aims to evaluate the immunomodulatory effects of coconut oil extract (COE) in broilers experimentally infected with velogenic Newcastle disease virus (vNDV).Methods: A total of 150 broiler birds (day-old) were equally divided into five study groups i.e., negative control, positive control, COE-1, COE-2, and COE-3. On day 10, broilers of groups COE-1, COE-2, and COE-3 were supplemented with 1, 2, and 3 mL of COE respectively per liter of drinking water for 15 days. On day 13, 0.1 mL/bird (10–5.25 ELD50) of vNDV was inoculated in broilers of positive control, COE-1, COE-2, and COE-3 groups intramuscularly. During this study, growth performance, morbidity, and mortality rates of each study group were recorded. The antibody titer against NDV was determined on days 7, 14, 21, 28, and 35. The levels of immunoglobulins (IgY and IgM) were also determined on the 7th, 14th, and 21st days post-sheep red blood cells (SRBCs) inoculation. On day 33, avian tuberculin was injected between the 1st and 2nd toes of the left side (intradermally) to measure lymphoproliferative responses. On day 35, the phagocytic activity in the blood was assessed through a carbon clearance assay by injecting carbon black ink into the right-wing vein. The visceral organs having gross lesions were also collected for histopathology.Results: The COE significantly improved the growth performance, and lowered the morbidity and mortality rates of broilers. There was a significant rise in antibody titers against NDV and levels of IgY and IgM antibodies against SRBC in COE-supplemented broilers. The lymphoproliferative response and phagocytic activity were also enhanced. Among COEsupplemented groups, the broilers of the COE-3 group showed a significant increase in growth performance and boosted immune defense.Conclusion: Coconut oil extract has the potential to boost the growth performance and immune status of broilers. It can be used effectively as a feed additive and alternative to antibiotics to prevent the spread of infectious poultry pathogens.

项与 EBF1 相关的新闻（医药）

2024-08-07

·兰卫医学

【学术前沿】单细胞结合空间转录组的研究思路和案例分享 ——遗传发育研究领域（上）

学术前沿单细胞结合空间转录组的研究思路和案例分享 ——遗传发育研究领域（上）引言 Introduction 单细胞转录组测序是在单个细胞水平进行高通量转录组测序的一项技术，其能有效解决细胞异质性以及之前bulk RNA-seq被掩盖的种种问题。随着该技术在分辨率和通量方面的不断优化，研究者从异质性样本中分析细胞类型特异性基因调控网络的能力也相对提高，但是在细胞的空间位置水平尚有欠缺。空间转录组技术于2020年被《自然》杂志评为年度技术，可以解析时间和空间维度上单个细胞的基因表达模式，以及细胞类群的空间位置关系及生物学特征。其原理是将空间条形码寡核苷酸引物固定在载玻片上，然后将组织贴于载玻片实现组织内转录组序列的捕获与检测。随着10X Genomics的空间Visium技术的登场和不断更新加强，单细胞联合空间转录组的研究如火如荼的开展，遍布了遗传、发育、肿瘤、免疫等多个生物科研和医学热门领域。研究目的 1.不同发育时期组织样本中细胞类群的差异变化； 2.发育畸形或疾病进展异常器官与正常发育器官中细胞群类的差异变化。样本选择 1.各种发育器官按照发育时间段取组织样本：比如在Chang Liu等[1]在斑马鱼发育的研究中（图一），选择了3.3hpf（受精后3.3小时）, 5.25hpf, 10hpf, 12hpf, 18hpf, 24hpf六个时间段的组织样本分别做了空间转录组和单细胞转录组检测。Yanxin Li等[2]在揭示了人类大脑发育的区域特征中选取了6-23孕周的人类多个大脑区域开展研究（图二）。图一图二 2. 异常或疾病器官vs正常器官: 由于临床上正常发育的器官获得难度较大，因此正常发育与异常发育器官的对比更多在动物模型或类器官模型中，在这里动物模型建模又可分为基因敲除型建模和疾病表型建模，比如Bruna Paulsen等[3]在研究自闭症（ASD）中枢神经发育机制中通过在类器官模型中分别敲除SUV420H1，ARID1B和CHD8单个基因，来识别由这三个ASD风险基因单倍体不足引起的细胞类型特异性发育异常。Huiya Li等[4]在研究急性缺血诱导脑损伤的研究中选取的样本为缺血再灌注3h,12h,72h的模型小鼠及sham组小鼠（下图）。研究方法 1.主要研究方法：主要应用在发现探索阶段的方法,一般包括单细胞转录组、空间转录组、多重IHC、FISH、RNAscope等； 2.其他辅助方法：辅助研究方法应用在机制验证方面，会根据验证模型的不同水平，比如细胞水平、动物模型、人源组织、数据库等等，对应各种生物检测分析方法并没有固定的思路。分析思路 1.单细胞图谱+空间图谱绘制：细胞类型的空间分布特征，亚群的图谱分类； 2.细胞/基因功能空间动态变化、空间细胞分化规律（拟时序）、各个亚群细胞中的变化； 3.关键靶点疾病机制研究和对外界刺激的反应机制：比如，病理或发育状态下，细胞和基因功能空间动态变化所引起差异以及上下游的调控机制； 4.实验验证靶点和机制：细胞水平、类器官水平、动物模型水平做敲除干预治疗等验证。文献分享案例1 《人卵巢衰老的时空转录组学变化及FOXP1的调控作用》发表期刊：NATURE AGING，影响因子：16.6 样本类型：8种卵巢细胞在衰老过程中的不同切片；技术组合：单细胞RNA转录组、空间转录组、免疫荧光、多重IHC、其他等等；研究背景：卵巢具有生殖功能和激素分泌功能，在女性生殖寿命中起着至关重要的作用，卵巢老化已逐渐成为更年期女性的主要健康问题。人类卵巢在皮层和髓质上表现出广泛的变异，卵子发生的过程始于皮层，而卵巢的髓质区域经历了戏剧性的重组。因此，对空间原型的理解对于全面理解卵巢的衰老动力学是必要的。技术路线：主要结果： 1. 人卵巢细胞的单细胞序列分析和空间定位：通过单细胞组学及空间组学反卷积算法对卵巢组织的细胞类群区分；分析出卵巢老化转录程序中整体差异基因、信号通路及某些细胞亚群特异性的差异变化（Fig.1）。 2. 对卵巢衰老过程中卵母细胞、GC细胞、T&C细胞进一步亚群鉴定（Fig.2仅例举GC细胞），并进一步探索几类细胞中亚群中分化轨迹或发育机制。 3. 通过联合分析各类细胞亚群交并集的数据，最终发现FOXP1是体外卵巢细胞衰老的核心转录调控因子，且GC细胞中敲除FOXP1加速卵巢衰老（Fig.3)。 4. 动物模型实验中发现槲皮素保护中年小鼠的卵巢储备（Fig.4）。 Fig.1 单细胞和空间转录组的整体景观图 Fig.2 GC细胞亚群时空变化 Fig.3 联合分析找到靶向基因FOXP1 Fig.4 动物模型验证机制案例2 《单细胞RNA测序揭示了胚胎阶段人类肺近端-远端模式的发育程序》发表期刊：Nature Genetics，影响因子：30.6 样本类型：受精后4-8周人胚胎肺，6周人胚胎肺组织切片；技术组合：单细胞RNA转录组、空间转录组、免疫荧光、单分子荧光原位杂交（smiFISH）等等；研究背景：肺发育是一个由内在分子机制和微环境协调的连续分支形态发生过程。在此过程中，肺内胚层祖细胞分化为近端气道上皮细胞类型，如纤毛细胞、基底细胞和分泌细胞，以及远端肺泡细胞类型。本研究目的是通过单细胞RNA测序(scRNA-seq)和空间转录组谱分析绘制了人肺胚期器官发生过程的细胞变化图谱，描绘胚期肺上皮细胞和其他细胞的空间邻近关系，揭示胚期人肺近端-远端细胞谱系命运发育进程的内在（转录调控）和外部（微环境）的调控机制。技术路线：主要结果： 1.单细胞和原位探针杂交发现人肺器官发生起始时，肺组织中已经包含三个胚层来源的6种主要细胞类型（Fig.1）。 2.整合数据库信息后发现了肺上皮在胚期已经发生了近端-远端命运特化，并发现了一系列调控近端-远端特化新的转录因子如THRB和SOX6，并从动物实验中验证（Fig.2）。 3.近端-远端命运特化除了转录因子外，在空间转录组的层面对细胞互作微环境变化中发现并鉴定了一群表达BDNF的特殊间质细胞促进上皮细胞分化（Fig.3）。 4.发现平滑肌细胞中AMSC和VMSC均起源于一群早期的间质细胞，在4-5周出现了谱系命运特化，分别由新的转录因子如FOXF1和EBF1调控决定（Fig.4）。 Fig.1 主要的肺细胞类型出现在人类胚胎肺发育的起始阶段 Fig.2 TFs调节早期上皮近端-远端模式 Fig.3 多种基质细胞类型表现出近端和远端的空间异质性 Fig.4 ASMC和VSMC的发展轨迹推断参考文献： [1]. Raj B, Farrell JA, Liu J, El Kholtei J, Carte AN, Navajas Acedo J, Du LY, McKenna A, Relić Đ, Leslie JM, Schier AF. Emergence of Neuronal Diversity during Vertebrate Brain Development. Neuron. 2020 Dec 23;108(6):1058-1074.e6. doi: 10.1016/j.neuron.2020.09.023. Epub 2020 Oct 16. PMID: 33068532; PMCID: PMC8286448. [2]. Li Y, Li Z, Wang C, Yang M, He Z, Wang F, Zhang Y, Li R, Gong Y, Wang B, Fan B, Wang C, Chen L, Li H, Shi P, Wang N, Wei Z, Wang YL, Jin L, Du P, Dong J, Jiao J. Spatiotemporal transcriptome atlas reveals the regional specification of the developing human brain. Cell. 2023 Dec 21;186(26):5892-5909.e22. doi: 10.1016/j.cell.2023.11.016. Epub 2023 Dec 12. PMID: 38091994. [3]. Paulsen B, Velasco S, Kedaigle AJ, Pigoni M, Quadrato G, Deo AJ, Adiconis X, Uzquiano A, Sartore R, Yang SM, Simmons SK, Symvoulidis P, Kim K, Tsafou K, Podury A, Abbate C, Tucewicz A, Smith SN, Albanese A, Barrett L, Sanjana NE, Shi X, Chung K, Lage K, Boyden ES, Regev A, Levin JZ, Arlotta P. Autism genes converge on asynchronous development of shared neuron classes. Nature. 2022 Feb;602(7896):268-273. doi: 10.1038/s41586-021-04358-6. Epub 2022 Feb 2. PMID: 35110736; PMCID: PMC8852827. [4]. Li H, Liu P, Zhang B, Yuan Z, Guo M, Zou X, Qian Y, Deng S, Zhu L, Cao X, Tao T, Xia S, Bao X, Xu Y. Acute ischemia induces spatially and transcriptionally distinct microglial subclusters. Genome Med. 2023 Dec 11;15(1):109. doi: 10.1186/s13073-023-01257-5. PMID: 38082331; PMCID: PMC10712107. [5]. Wu M, Tang W, Chen Y, Xue L, Dai J, Li Y, Zhu X, Wu C, Xiong J, Zhang J, Wu T, Zhou S, Chen D, Sun C, Yu J, Li H, Guo Y, Huang Y, Zhu Q, Wei S, Zhou Z, Wu M, Li Y, Xiang T, Qiao H, Wang S. Spatiotemporal transcriptomic changes of human ovarian aging and the regulatory role of FOXP1. Nat Aging. 2024 Apr;4(4):527-545. doi: 10.1038/s43587-024-00607-1. Epub 2024 Apr 9. PMID: 38594460; PMCID: PMC11031396. [6]. Cao S, Feng H, Yi H, Pan M, Lin L, Zhang YS, Feng Z, Liang W, Cai B, Li Q, Xiong Z, Shen Q, Ke M, Zhao X, Chen H, He Q, Min M, Cai Q, Liu H, Wang J, Pei D, Chen J, Ma Y. Single-cell RNA sequencing reveals the developmental program underlying proximal-distal patterning of the human lung at the embryonic stage. Cell Res. 2023 Jun;33(6):421-433. doi: 10.1038/s41422-023-00802-6. Epub 2023 Apr 21. PMID: 37085732; PMCID: PMC10119843. 本文由科研学术部提供

寡核苷酸临床研究

2024-06-22

·生物探索

Nat Cell Biol丨揭秘衰老对B细胞发育的三维染色质结构重组调控机制

引言真核细胞的基因组在细胞核中呈现多层次、多维度且高度有序的组织形式。近年来，随着三维染色体构象捕获技术（如Hi-C）的迅速发展，我们能够在全基因组范围内捕获不同基因座之间的三维空间交互信息，并在不同的分辨率下将三维染色质结构划分为4个层级：染色质环（Chromatin loop），拓扑关联结构域 (Topologically associating domain，TAD)，染色质区室 (A/B compartment) 和染色质疆域（Territory）。越来越多的研究表明，细胞分化、个体发育、特定疾病以及细胞衰老（Senescence）过程中发生的三维染色质结构变化或重组（Reorganization），与基因复制、修复、转录和重组等最基本的生命活动密切相关。然而，关于个体衰老（Ageing）过程中染色质结构变化的研究，尤其是将这种变化与功能衰减相关联的研究却很少。 B细胞在适应性免疫中扮演着至关重要的角色，具备合成抗体、呈递抗原和分泌细胞因子等关键功能，其发育和功能直接影响机体抵御病原体的能力。然而，随着年龄的增长，B细胞的生成和功能显著下降，这也是老年个体免疫力低下的重要原因之一。为了深入理解这一现象，2024年6月12日，美国国立卫生研究院衰老研究所Ranjan Sen实验室（共同一作是马菲和曹亚强）在Nature Cell Biology杂志上发表了文章Three-dimensional chromatin reorganization regulates B cell development during ageing，利用Hi-C、RNA测序等技术，系统分析了年轻和年老小鼠的B细胞前体细胞（Progenitor B cell, pro-B）中的三维基因组结构和基因表达。这项研究揭示了小鼠pro-B细胞在衰老过程中存在显著的三维染色质结构重组。特别是在多个B细胞关键转录因子（如早期B细胞因子1，Ebf1）的基因座位置。染色质结构重组伴随着这些基因座的表观遗传修饰变化和基因表达下调。此外，研究还发现，衰老引起了免疫球蛋白重链编码基因座（Igh locus）所在的拓扑关联结构域（Topologically associating domain，TAD）内的DNA互作减弱，导致原初B细胞受体（即抗体）谱（Primary BCR repertoire）多样性降低，这些变化最终造成B细胞发育和功能的缺陷，很可能是衰老相关免疫功能下降的关键原因。作者首先通过Hi-C实验检测了年轻和年老小鼠pro-B细胞中的三维染色质组织情况，发现老年小鼠中pro-B细胞的染色质结构较年轻小鼠发生了显著变化。具体表现为远距离的compartment水平的染色质交互有所增强，而相对近距离的TAD和loop水平的染色质交互则相对减弱。此外，上百个compartments的转录活性发生了翻转，其中最显著的例子是Ebf1基因所在的区域从活跃的A compartment转变为沉默的B compartment。这种转变伴随着该基因座表观遗传修饰的变化和Ebf1基因表达的降低。Ebf1是B细胞发育过程中极为重要的转录因子，其表达失调对整个pro-B细胞的转录组有极大影响。在前B细胞中减少Ebf1表达部分模仿了衰老表型（Credit: Cell Recearch）更有趣的是，研究者发现编码免疫球蛋白重链（Immunoglobulin heavy chain, IgH）的基因座所在的TAD是衰老过程中变化最显著的一个。在pro-B细胞中，处于生殖系（Germline）状态的Igh可变区基因（VH）、多样区基因（DH）和连接区基因（JH）需通过V(D)J重排才能生成抗体重链的可变区，这是抗体能够识别海量抗原的重要基础。在这一过程中，由于整个基因座的一维距离很远（约3Mb），因此需要三维靠近彼此交互才能完成V(D)J重排。然而，作者发现衰老过程中Igh TAD内的互作显著下降，因此他们猜测这一结果可能会影响V(D)J重排，从而降低抗体谱的多样性。作者利用DNA高通量测序方法检测了年轻和年老小鼠pro-B细胞中的V(D)J重排情况，发现老年小鼠更多地使用了特定区域的可变区基因（Proximal VH），这在一定程度上影响了原初B细胞受体重链的多样性。总的来说，这项研究首次揭示了衰老对免疫细胞中三维染色质组织的影响，并将其与B细胞的发育和其前体细胞的功能联系在了一起。研究团队计划进一步解析其他关键基因和信号通路在B细胞发育和衰老过程中的作用，以全面理解衰老相关的免疫变化。这项研究不仅展示了基因组学和三维染色质研究在揭示衰老机制方面的巨大潜力，还提供了一种未来开发抗衰老疗法的可能方向。参考文献 https://www-nature-com.libproxy1.nus.edu.sg/articles/s41556-024-01424-9 责编|探索君排版|探索君文章来源|“BioArt” End 往期精选围观一文读透细胞死亡(Cell Death) | 24年Cell重磅综述（长文收藏版）热文 Cell | 是什么决定了细胞的大小？热文 Nature | 2024年值得关注的七项技术热文 Nature | 自身免疫性疾病能被治愈吗？科学家们终于看到了希望热文 CRISPR技术进化史 | 24年Cell综述

细胞疗法

2023-09-18

·生物谷

研究人员开发出基于单分子测序平台的scNanoHi-C技术，可精准检测单细胞高阶染色质互作

真核生物基因的表达受到基因组中顺式作用元件的复杂调控。哺乳动物基因组中存在大量的顺式作用元件，例如：启动子、增强子、沉默子、绝缘子等等，其数量远远超过蛋白编码基因。真核生物基因的表达受到基因组中顺式作用元件的复杂调控。哺乳动物基因组中存在大量的顺式作用元件，例如：启动子、增强子、沉默子、绝缘子等等，其数量远远超过蛋白编码基因。目前人类基因组中已知的顺式调控元件就有一百多万个，而蛋白编码基因只有大约两万个。遗传学研究也表明基因调控不仅仅是单个基因之间一对一的简单调控事件，而是以调控网络的形式发挥作用，不同的调控元件以及靶基因之间存在着复杂的相互作用。例如，一个基因的启动子可以整合来自多个增强子或者沉默子的调控作用，一个增强子元件也能够同时影响多个基因的表达1-3。随着三维基因组技术的发展，人们对基因表达调控相关的染色质构象已经有了一定的理解，但由于技术的限制，大部分研究都是集中在成对的相互作用（pair-wiseinteraction）上，而对于多个顺式调控元件同时与一个基因启动子之间的高阶相互作用（high-orderinteraction）的研究仍然比较有限。此外，多个基因组元件是如何通过三维基因组构象的变化同时参与基因表达调控的机制目前也尚不清楚。近年来，为了探究更精准和全面的染色质互作情况，检测高阶染色质互作的技术也相继出现。然而，这些技术往往局限于基因组的特定位点，或是需要特殊的仪器设备。得益于三代测序平台（单分子测序平台）的日渐成熟，最近开发的基于牛津纳米孔技术（Oxford Nanopore Technology， ONT）的Pore-C方法4在检测染色质高阶相互作用方面表现出优异的性能，可以通过应用新的统计方法有效地分析全基因组中多个染色质位点之间高阶相互作用的协同性。尽管上述这些基于大量细胞的研究方法能够有效地检测染色质的高阶相互作用，但它们无法解决细胞间的异质性问题，阻碍了它们在复杂组织器官样品中的应用。而现有的单细胞Hi-C（single-cell Hi-C，scHiC）技术受限于二代测序较短的读长（通常是双端总共300bp）也难以对染色质高阶相互作用进行检测。目前除了单细胞超分辨率成像以外，2022年开发的scSPRITE5是唯一一种可以在单细胞水平检测染色质高阶相互作用的测序方法。但是该方法更适用于远距离的间接染色质高阶相互作用，而对于与基因调控更相关的直接染色质高阶相互作用的检测能力很有限。此外，scHi-C的另一个挑战是很难平衡捕获细胞群体异质性所需的高通量（每次实验能够检测大量单细胞）与探索高分辨率3D基因组结构所需的高深度（每个单细胞中捕获大量染色质相互作用）之间的矛盾。因此，需要一种可扩展的scHi-C方法来剖析高阶染色质三维结构，并在单细胞水平上研究这些染色质高阶相互作用在不同生物过程中的协同调控机制。为了应对这些挑战，北京大学生物医学前沿创新中心汤富酬课题组在Nature Methods上发表题为“scNanoHi-C: a single-cell long-read concatemer sequencing method toreveal high-order chromatin structures within individual cells”的文章。该研究在国际上率先使用单分子测序平台开发了一种基于邻近连接的单细胞染色质构象捕获方法，称为scNanoHi-C。该方法实现了在单细胞水平的高阶染色质相互作用检测，并且在通量上具有很好的灵活性，能够满足不同的实验需求。在实验上，scNanoHi-C依次使用1%甲醛（FA）和1.5mM戊二酸二琥珀酰亚胺酯（DSG）孵育进行交联，以降低连接反应的随机噪音并兼顾对短程和长程染色质相互作用的高灵敏度检测。为了尽可能完整地保留单细胞中固定连接后的染色质三维结构信息，该研究设计了一种灵活的单细胞基因组长片段扩增方法。该方法使用两端具有相同接头的低浓度Tn5转座酶以提高DNA片段扩增长度和基因组覆盖度，并通过设计24种带有不同条码标签的Tn5酶结合后续PCR扩增中引入的条码标签共同控制测序的通量。通过这种方式，scNanoHi-C 能够在一次PromethION测序中对少至几个单细胞进行低通量、高覆盖度测序或者对数千个单细胞（最高可达24×96=2304个细胞）进行高通量、低覆盖度测序，可以根据实验需求灵活进行选择（图1）。为了评估scNanoHi-C技术的可靠性，该研究首先将scNanoHi-C应用于正常二倍体的GM12878细胞系，并分别使用低深度（~0.2Gb/cell）、中等深度（~1Gb/cell）、高深度（~4Gb/cell）三种策略进行测序，并与基于二代测序平台的大量细胞原位Hi-C标准数据集进行比较，结果显示出很高的一致性。同时每个策略检测到的串联体（含有有效染色质相互作用的测序读段）中大约一半为高阶串联体（包含三个以上不同调控元件间的相互作用）。在这些高阶串联体中，大约58%是三联体，26%是四联体，其余为五联体以上的多联体（基数从5到11不等）。接着该研究在多个方面对scNanoHi-C的应用进行了探索： scNanoHi-C可以在单细胞水平上精准捕获染色质三维结构的异质性。 scNanoHi-C能够在单细胞水平检测各层级染色质结构特征，包括染色体领域（整条染色体，50Mb-200Mb尺度的结构特征）、A/B区室（常染色质区域与异染色质区域，5Mb-20Mb尺度的结构特征），以及拓扑关联结构域样结构（TAD-like，0.5Mb-5Mb尺度的结构特征）。同时，scNanoHi-C的单个染色质片段长度（单体长度，平均610bp）相较于传统基于二代测序平台的scHi-C（测序不超过150bp）显著提高，这大大增加了其在染色质相互作用对中捕获到单核苷酸多态性（SNP）位点的机会，能够在二倍体细胞中直接判定单倍型的单体比例由原来二代测序平台的大约9%提高到了25%。因此，scNanoHi-C也可用于有效地重建单个二倍体细胞的基因组三维构象。同时，利用单细胞A/B 区室化值（single-cell A/B compartment value, scA/B value)，scNanoHi-C对GM12878、HG002 和K562三种人类细胞系进行了聚类分析，能够在单细胞精度准确将三种细胞分开，并识别了细胞类型间的染色质差异区室化区域。此外，scNanoHi-C也能够准确地检测每个单细胞的基因组拷贝数变异（CNV）特征。分析结果表明，scNanoHi-C准确地捕获了GM12878细胞培养过程中产生的非整倍体亚克隆以及K562细胞的拷贝数变异。同时，scNanoHi-C也可应用于结构变异的检测，如准确检测出了K562细胞中BCR-ABL1和NUP214-XKR3的基因融合事件（染色体易位事件）。 scNanoHi-C能够在单个细胞中准确鉴定高阶染色质相互作用。该研究在GM12878 细胞数据集中，使用scNanoHi-C得到的单细胞高阶串联体信息结合ABC模型（Activity-by-contacts model）6预测的增强子-启动子(E-P) 相互作用关系共同鉴定了增强子-启动子高阶相互作用。通过这种方式，该研究首次在单个细胞中以20kb的分辨率直接观察到1097个基因的单个启动子能够与多个增强子同时发生相互作用，表明这些基因可能同时受到多个增强子的调控。这些受到高阶调控的基因主要富集在与GM12878这种B淋巴细胞的功能相关的免疫信号通路上，并且通常表现出更高的表达水平。特别地，这些基因中还包括一些B细胞谱系特异性转录因子如EBF1以及EBV超级增强子相关基因如MIR155HG、IKZF3和ETS1等。这些结果表明，多个增强子的协同调控可能是确保关键基因高水平稳健表达的一种潜在机制。通过类似的方法，该研究还在单个细胞中鉴定出了1422个能够与多个启动子同时发生相互作用的增强子。此外，该研究发现部分高阶基因调控作用能够在多个单细胞中被检测到，这可能与细胞中频繁使用的关键转录程序有关，后续可以通过发展基于富集策略的具有更高分辨率的Hi-C技术进行进一步的深入研究。 scNanoHi-C能够揭示不同基因组区域之间的协同调控关系以及染色体外环形DNA与线性基因组间的复杂相互作用。倾向于形成高阶相互作用的一组基因组位点称为“基因组协同调控区域”。该研究针对scNanoHi-C的数据特点对鉴定基因组协同调控区域的算法进行了优化，并将该算法运用到GM12878细胞活跃启动子和增强子的集合中，在全基因组范围内共鉴定出了917组增强子-启动子协同调控区域。其中，大约20%（187/917）的协同调控区域包含来自不同染色体的基因组位点（提示不同染色体之间的反式相互作用）。这些协同调控区域在活跃转录的基因组区域、淋巴细胞特异性转录因子和染色质环相关因子（CTCF等）的结合位点区域中高度富集。此外，在917个协同调控区域中，有167个被发现与GM12878细胞特异性的超级增强子有关。接着，该研究将scNanoHi-C运用到携带大量染色体外环形DNA（ecDNA）的COLO320DM人类结直肠癌细胞系中，检测到了染色体外环形DNA与线性基因组（染色体内的基因组）之间存在广泛的染色质高阶相互作用，并且首次在单个细胞中观察到四个主要的染色体外环形DNA的基因位点之间存在复杂的高阶相互作用。这些结果表明，染色体外环形DNA可能通过建立复杂的高阶染色质三维结构来驱动癌基因的过量表达。 scNanoHi-C能够高效辅助单细胞基因组从头组装。在可用细胞数量有限的情况下，该研究表明使用scNanoHi-C辅助单细胞基因组（single-cell whole genome sequencing，scWGS）从头组装7可以大幅度提高组装质量。例如，使用20个单细胞的基因组长读长测序数据和12个单细胞的scNanoHi-C数据组装的人类基因组支架（scaffold）的NG50要优于使用30个单细胞的基因组长读长测序数据直接组装的效果（2.49 Mb vs. 1.34 Mb）总之，scNanoHi-C具有很好的可扩展性和灵活性，在一次测序中可对少至几个单细胞或多达数千个单细胞进行染色质三维结构测序，并且实验流程相对简单、易于操作，仅需要基本的PCR仪等分子生物学设备，适合于各种生物学实验室使用。scNanoHi-C还是一种强大且多功能的工具，可用于在单细胞分辨率准确区分细胞类型、对单个二倍体细胞进行高效单倍型分型、检测单个正常细胞和肿瘤细胞中的基因组拷贝数变异和各种复杂结构变异以及高效辅助单细胞基因组从头组装。更重要的是，scNanoHi-C首次实现了在单个细胞中在全基因组水平对增强子-启动子的高阶直接相互作用的检测，在单个细胞中准确鉴定了高阶基因调控事件，同时能够对复杂的染色体外环形DNA与线性基因组间的高阶相互作用进行精准检测。总之，scNanoHi-C显示了单细胞长读长Hi-C测序技术在分析由高阶染色质三维结构介导的不同细胞间基因调控异质性方面的潜力，为将来进一步研究发育和疾病进展过程中高阶染色质结构变化机制，揭开基因组中各种复杂调控关系中的“暗物质”奠定了坚实的基础。北京大学生物医学前沿创新中心、前沿交叉学科研究院生命科学联合中心博士生李文、生命科学学院博士生卢健森为该论文的共同第一作者，汤富酬为该论文通讯作者。该研究得到了国家自然科学基金基础科学中心项目、北京未来基因诊断高精尖创新中心、昌平实验室的资助，北京大学高通量测序平台以及北京大学“北极星”高性能计算平台的协助与支持，北京大学邢栋课题组为本研究提供了重要的帮助。参考文献： 1、Hafner, A. & Boettiger, A. 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