NUP98

引言 三阴性乳腺癌（TNBC）是一种高度异质性的疾病，展现出极高的侵袭性【1】，常规的内分泌治疗或化疗对此类癌症通常无效【2】。之前的基因组、转录组和蛋白质组分析发现TNBC缺乏有效的生物标志物来指导治疗决策和预测治疗反应【3】，因此从新的角度深入理解TNBC病理生物学特性尤为重要。 三维染色质结构指的是染色质在细胞核中的空间排列，包括染色质区域如何折叠、聚集以及它们如何与核小体和其他核内结构相互作用。在肿瘤中，染色质结构的异常重组可能导致染色质可及性变化，进而使原本静默的致癌基因被激活，或者抑癌基因被抑制。染色质结构的改变也可以影响染色体上的表观遗传标记，进而影响基因表达。尽管三维染色质结构对肿瘤表型的影响非常关键，但TNBC染色质结构的调控机制仍知之甚少。 2024年8月28日，广东省人民医院、中山大学、广州市妇女儿童中心、桂林医科大学附属医院及顺德医院的联合科研团队，以赵蔚和李杰两位 教授为通讯作者，在Nature Cancer上发表了题为Phase separation of phospho-HDAC6 drives aberrant chromatin architecture in triple-negative breast cancer的论文。该研究发现磷酸化形式的HDAC6蛋白在TNBC细胞的核内转录活跃区域形成了液液相分离（LLPS）凝聚体，而在非TNBC中这种现象较少见。研究还鉴定出Nexturastat A作为磷酸化HDAC6 LLPS抑制剂，显示出能够导致染色质结构重塑和转录谱改变，有效抑制TNBC的肿瘤生长。该论文首次揭示了TNBC中存在磷酸化形式的HDAC6蛋白，并且干预磷酸化HDAC6的相分离可能为开发TNBC的治疗的新策略。 该研究显示与非TNBC及相邻非癌组织相比，TNBC中HDAC6在细胞核表达显著增加，且主要以磷酸化形式存在。通过对HDAC6的潜在磷酸化位点进行突变分析，发现特定位点Ser22的磷酸化对其核内定位至关重要，这种磷酸化状态与肿瘤的分期及转移显著相关，并与患者的总生存期负相关。超分辨率显微镜观察发现，TNBC细胞中磷酸化HDAC6倾向于在细胞核中形成LLPS的凝聚体，这些凝聚体主要分布在活跃的染色质区域，并与转录活跃相关的标记物共定位。此外，实验还观察到表皮生长因子（EGF）能通过特定的激酶GRK2显著增加磷酸化HDAC6的水平和凝聚体形成。 接下来，研究团队探讨了HDAC6的两个主要固有无序区域（IDRs）在相分离作用。研究发现，HDAC6的第一个无序区域（IDR1）的删除显著减少了磷酸化HDAC6的相分离，而第二个无序区域（IDR2）的删除则对相分离没有显著影响。此外，IDR1内Ser22位点的磷酸化状态对其相分离能力有重要影响。进一步的实验表明，HDAC6的特定结构域，如核输出信号（NES）域的删除，显著增强了HDAC6在核内的定位和相分离能力。 探究肿瘤中异常LLPS凝聚体形成的机制不仅有助于理解染色质结构在基因表达调控中的角色，而且可能为开发新的治疗策略提供线索。例如，NUP98-HOXA9的LLPS有助于形成广泛的超级增强子（SE）样结合模式，从而促进白血病基因的转录激活4。此外，赵蔚团队之前的研究发现，HOXB8和FOSL1在染色质的SE位点形成的LLPS导致了骨肉瘤中转录的失调5。尽管LLPS在癌症中具有重要作用，但如何特异性破坏癌症中LLPS凝聚体仍有待探索。 研究团队通过基于相分离蛋白的筛选，发现了一种名为Nexturastat A的HDAC6抑制剂，该抑制剂能有效地抑制TNBC中磷酸化HDAC6凝聚体的形成。相比之下，另一种HDAC6抑制剂HPOB则未能达到相同的效果。实验表明，Nexturastat A通过降低磷酸化HDAC6的LLPS，从而抑制TNBC细胞的增殖、瘤球形成能力和侵袭性，同时促进细胞凋亡。Nexturastat A在体内显著抑制了TNBC的生长。此外，Nexturastat A显示出极低的非癌细胞毒性，表明其具有良好的安全性。 Nexturastat A能够显著改变HDAC6与其相互作用蛋白之间的互作，尤其是降低与14-3-3θ的结合，后者是已知的LLPS的潜在参与因子。Nexturastat A的处理还减少了磷酸化HDAC6与进出核运输蛋白Importin β的相互作用，这一过程依赖于HDAC6的S22位点。此外，研究还揭示了NUP153在磷酸化HDAC6进入细胞核过程中的关键作用。 随后，研究团队详细探讨了Nexturastat A对TNBC染色质结构的影响。通过Hi-C分析发现，Nexturastat A处理后，TNBC细胞的全基因组染色质相互作用发生了显著变化，特别是在开放和封闭染色质区域的重新分布。此外，Nexturastat A的治疗还促进了新的染色质环结构的形成，这些新环结构富含RNA聚合酶II（Pol II）特异性DNA结合和免疫系统过程通路，显示出Nexturastat A对染色质动态具有深远的影响。 通过对Nexturastat A处理的TNBC细胞进行RNA-seq和Pol II ChIP-seq分析，揭示了Nexturastat A处理主要导致染色质结构的变化和转录模式的重新编程，这体现在染色质的增加可及性和Pol II的增加结合。此外，通过ATAC-seq研究发现Nexturastat A处理能够促使肿瘤抑制基因的表达上调，原癌基因表达下调，并且激活了与免疫反应相关的基因。 最后，Nexturastat A通过改变HDAC6的结合模式和H3全乙酰化修饰，显著影响了染色质结构，尤其是在转录起始位点（TSS）周围。特别地，研究团队识别出一组基因显示HDAC6结合和H3全乙酰化的一致变化，这些基因主要富集在内质网应激和TP53信号通路中，包括肿瘤抑制基因ATF3。此外，ATF3敲减实验表明，ATF3是HDAC6的一个重要下游靶标，其敲减降低了细胞对Nexturastat A治疗的敏感性，影响了细胞的生存和侵袭能力。 综上，本研究揭示了磷酸化HDAC6在TNBC中的全新作用，特别是它在转录活跃区域形成的相分离凝聚体对染色质结构的影响。通过与14-3-3θ共凝聚，磷酸化HDAC6不仅改变了染色质的物理结构，还促进了特定的组蛋白乙酰化修饰和转录谱的重编程，从而推动了TNBC的恶性表型发展。这一发现不仅为我们提供了对TNBC中染色质动态复杂性的更深层理解，还可能指明了新的治疗策略，即通过调控磷酸化HDAC6来干预TNBC的染色质结构和细胞命运。 参考文献 1. Shi, Y., Jin, J., Ji, W. & Guan, X. Therapeutic landscape in mutational triple negative breast cancer. Mol Cancer 17, 99 (2018). 2. Garrido-Castro, A.C., Lin, N.U. & Polyak, K. Insights into Molecular Classifications of Triple-Negative Breast Cancer: Improving Patient Selection for Treatment. Cancer Discov 9, 176-198 (2019). 3. Derakhshan, F. & Reis-Filho, J.S. Pathogenesis of Triple-Negative Breast Cancer. Annu Rev Pathol 17, 181-204 (2022). 4. Ahn, J.H. et al. Phase separation drives aberrant chromatin looping and cancer development. Nature 595, 591-595 (2021). 5. Lu, B. et al. Pharmacological Inhibition of Core Regulatory Circuitry Liquid-liquid Phase Separation Suppresses Metastasis and Chemoresistance in Osteosarcoma. Adv Sci (Weinh) 8, e2101895 (2021). https://www-nature-com.libproxy1.nus.edu.sg/articles/s43018-024-00816-y 责编|探索君 排版|探索君 文章来源|“BioArt” End 往期精选 围观 一文读透细胞死亡(Cell Death) | 24年Cell重磅综述（长文收藏版） 热文 Cell | 是什么决定了细胞的大小？ 热文 Nature | 2024年值得关注的七项技术 热文 Nature | 自身免疫性疾病能被治愈吗？科学家们终于看到了希望 热文 CRISPR技术进化史 | 24年Cell综述

– Axatilimab BLA in refractory chronic GVHD is under Priority Review; PDUFA action date of August 28, 2024 – – Revumenib NDA in R/R KMT2Ar acute leukemia is being reviewed under RTOR; PDUFA action date of December 26, 2024 – – Pivotal AUGMENT-101 topline data from the mNPM1 AML cohort expected in 4Q24; potential sNDA filing in 1H25 – – Company to host a conference call today at 4:30 p.m. ET – WALTHAM, Mass., Aug. 1, 2024 /PRNewswire/ -- Syndax Pharmaceuticals (Nasdaq: SNDX), a clinical stage biopharmaceutical company developing an innovative pipeline of cancer therapies, today reported its financial results for the quarter ended June 30, 2024, and provided a business update. "This is an exciting time for Syndax as we transition to a commercial stage company," said Michael A. Metzger, Chief Executive Officer. "We've made significant progress advancing our pipeline this quarter, including the presentation of updated revumenib combination data from the BEAT AML and AUGMENT-102 trials and additional axatilimab data from the AGAVE-201 trial at EHA. We are excited to continue building on this momentum as we look ahead to the approval of both first-in-class assets and sharing pivotal AUGMENT-101 data in mNPM1 AML this year." Recent Pipeline Progress and Anticipated Milestones Revumenib The New Drug Application (NDA) for revumenib, a highly selective menin inhibitor, for the treatment of adult and pediatric relapsed or refractory (R/R) KMT2A-rearranged (KMT2Ar) acute leukemia was granted Priority Review and is being reviewed under the U.S. FDA's Real-Time Oncology Review (RTOR) Program. On July 29, 2024, the Company announced that the FDA extended the Prescription Drug User Fee Act (PDUFA) target action date for the revumenib NDA from September 26, 2024 to December 26, 2024 to provide FDA additional time to conduct a full review of supplemental information provided by the Company in response to the FDA's requests. The Company expects to report topline data from the AUGMENT-101 pivotal trial cohort of patients with R/R mutant nucleophosmin (mNPM1) acute myeloid leukemia (AML) in the fourth quarter of 2024. Positive data could support a supplemental NDA (sNDA) filing for revumenib in R/R mNPM1 AML in the first half of 2025. Multiple Phase 1 combination trials of revumenib in mNPM1 and KMT2Ar acute leukemias are ongoing across the treatment landscape. These trials include: BEAT AML: Evaluating the combination of revumenib with venetoclax and azacitidine in front-line AML patients. This trial is being conducted as part of the Leukemia & Lymphoma Society's Beat AML® Master Clinical Trial. The Company presented updated positive data from the trial at the European Hematology Association (EHA) 2024 Congress, showing a 96% (23 of 24 pts) composite complete remission (CRc) rate in patients with newly diagnosed mNPM1 or KMT2Ar AML. The BEAT AML trial is expanding to validate the recommended Phase 2 dose of the combination of revumenib with venetoclax and azacitidine. SAVE: Evaluating the all-oral combination of revumenib with venetoclax and decitabine/cedazuridine in R/R AML or mixed phenotype acute leukemias. The trial is being conducted by investigators from MD Anderson Cancer Center. The trial is expanding to validate the recommended Phase 2 doses, with additional data expected in the second half of 2024. Intensive chemotherapy: Evaluating the combination of revumenib with intensive chemotherapy (7+3) followed by revumenib maintenance treatment in newly diagnosed patients with mNPM1 or KMT2Ar acute leukemias. The Phase 1 trial is designed to identify the recommended Phase 2 dose for this combination to support further development. The Company plans to initiate a pivotal trial of revumenib in combination with venetoclax and azacitidine in newly diagnosed mNPM1 or KMT2Ar acute leukemia patients unfit to receive intensive chemotherapy by year-end 2024. The Company presented updated data from the AUGMENT-102 trial evaluating the combination of revumenib with fludarabine and cytarabine in patients with R/R acute leukemias at the EHA 2024 Congress. Treatment with the combination in R/R mNPM1, NUP98-rearranged (NUP98r) or KMT2Ar acute leukemia patients resulted in a 52% (14 of 27 pts) CRc rate. The Company announced that it advanced into the Phase 1b portion of its Phase 1/2 proof-of-concept trial of revumenib in patients with R/R metastatic microsatellite stable (MSS) colorectal cancer (CRC) based on initial data from the Phase 1a portion of the trial. Axatilimab The Biologics License Application (BLA) for axatilimab, an anti-CSF-1R antibody, for patients with chronic graft-versus-host disease (GVHD) after failure of at least two prior lines of systemic therapy, is under FDA Priority Review with a PDUFA action date of August 28, 2024. Enrollment is ongoing in a 26-week randomized, double-blinded, placebo-controlled Phase 2 trial of axatilimab on top of standard of care in patients with idiopathic pulmonary fibrosis (IPF). The Company's partner, Incyte, plans to initiate two combination trials with axatilimab in earlier lines of treatment for chronic GVHD in the second half of 2024, including a Phase 2 combination trial with ruxolitinib and a Phase 3 combination trial with steroids. The Company presented additional positive data from the AGAVE-201 pivotal trial evaluating axatilimab monotherapy in patients with refractory chronic GVHD at the EHA 2024 Congress. Responses were noted in all fibrosis-dominant organs and the clinical activity was supported by clinician-reported and patient-reported changes in organ-specific symptoms, such as improvements in swallowing, shortness of breath, skin and joints, and sclerotic skin. Corporate Updates In May 2024, the Company announced the appointment of Aleksandra Rizo, M.D., Ph.D to its Board of Directors. Dr. Rizo has extensive clinical development experience and a track record of successfully leading the development of several oncology drugs from discovery through commercialization. Second Quarter 2024 Financial Results As of June 30, 2024, Syndax had cash, cash equivalents, and short- and long-term investments of $454.6 million and 85.3 million common shares and prefunded warrants outstanding. Second quarter 2024 research and development expenses increased to $48.7 million from $34.8 million for the comparable prior year period. The increase was primarily due to greater clinical development expenses, higher pre-commercial manufacturing costs, and increased employee-related expenses and professional fees. Second quarter 2024 selling, general and administrative expenses increased to $29.1 million from $14.9 million for the comparable prior year period. The increase was driven by a greater level of pre-commercialization activities for revumenib and axatilimab as well as higher employee-related expenses and professional fees. For the three months ended June 30, 2024, Syndax reported a net loss attributable to common stockholders of $68.1 million, or $0.80 per share, compared to a net loss attributable to common stockholders of $44.6 million, or $0.64 per share, for the comparable prior year period. Financial Guidance For the third quarter of 2024, the Company expects research and development expenses to be $70 to $75 million and total operating expenses to be $105 to $110 million. For the full year of 2024, the Company continues to expect research and development expenses to be $240 to $260 million and total operating expenses to be $355 to $375 million, which includes milestone payments that the Company expects to become due as well as an estimated $43 million in non-cash stock compensation expense. The Company continues to believe it has sufficient capital to fund its research, clinical development and commercial operations through 2026. Conference Call and Webcast In connection with the earnings release, Syndax's management team will host a conference call and live audio webcast at 4:30 p.m. ET today, Thursday, August 1, 2024. The live audio webcast and accompanying slides may be accessed through the Events & Presentations page in the Investors section of the Company's website. Alternatively, the conference call may be accessed through the following: Conference ID: Syndax2Q24 Domestic Dial-in Number: 800-590-8290 International Dial-in Number: 240-690-8800 Live webcast: For those unable to participate in the conference call or webcast, a replay will be available on the Investors section of the Company's website at approximately 24 hours after the conference call and will be available for 90 days following the call. About Revumenib Revumenib is a potent, selective, small molecule inhibitor of the menin-KMT2A binding interaction that is being developed for the treatment of KMT2Ar, also known as mixed lineage leukemia rearranged or MLLr, acute leukemias including acute lymphoid leukemia (ALL) and AML, and mNPM1 AML. Positive topline results from the Phase 2 AUGMENT-101 trial in R/R KMT2Ar acute leukemia showing the trial met its primary endpoint were presented at the 65th American Society of Hematology Annual Meeting, and data from the Phase 1 portion of AUGMENT-101 in acute leukemia was published in Nature. Revumenib was granted Orphan Drug Designation for the treatment of AML and ALL by the FDA and for the treatment of AML by the European Commission, and Fast Track designation by the FDA for the treatment of adult and pediatric patients with R/R acute leukemias harboring a KMT2A rearrangement or NPM1 mutation. Revumenib was granted Breakthrough Therapy Designation by the FDA for the treatment of adult and pediatric patients with R/R acute leukemia harboring a KMT2A rearrangement. About Axatilimab Axatilimab is an investigational monoclonal antibody that targets colony stimulating factor-1 receptor, or CSF-1R, a cell surface protein thought to control the survival and function of monocytes and macrophages. In pre-clinical models, inhibition of signaling through the CSF-1 receptor has been shown to reduce the number of disease-mediating macrophages along with their monocyte precursors, which has been shown to play a key role in the fibrotic disease process underlying diseases such as chronic GVHD and IPF. Positive topline results from the Phase 2 AGAVE-201 trial showing the trial met its primary endpoint were recently presented at the 65th American Society of Hematology Annual Meeting, and Phase 1/2 data of axatilimab in chronic GVHD were published in the Journal of Clinical Oncology. Axatilimab was granted Orphan Drug Designation by the U.S. Food and Drug Administration for the treatment of patients with chronic GVHD and IPF. In September 2021, Syndax and Incyte entered into an exclusive worldwide co-development and co-commercialization license agreement for axatilimab. Syndax has exercised its option under the collaboration agreement to co-commercialize axatilimab in the U.S. and will provide 30% of the commercial effort. Axatilimab is being developed under an exclusive worldwide license from UCB entered into between Syndax and UCB in 2016. About the Real-Time Oncology Review Program (RTOR) RTOR provides a more efficient review process for oncology drugs to ensure that safe and effective treatments are available to patients as early as possible, while improving review quality and engaging in early iterative communication with the applicant. Specifically, it allows for close engagement between the sponsor and the FDA throughout the submission process and it enables the FDA to review individual sections of modules of a drug application rather than requiring the submission of complete modules or a complete application prior to initiating review. Additional information about RTOR can be found at: About Syndax Syndax Pharmaceuticals is a clinical stage biopharmaceutical company developing an innovative pipeline of cancer therapies. Highlights of the Company's pipeline include revumenib, a highly selective inhibitor of the menin–KMT2A binding interaction, and axatilimab, a monoclonal antibody that blocks the CSF-1 receptor. For more information, please visit or follow the Company on X (formerly Twitter) and LinkedIn. Forward-Looking Statements This press release contains forward-looking statements within the meaning of the Private Securities Litigation Reform Act of 1995. Words such as "anticipate," "believe," "could," "estimate," "expects," "intend," "may," "plan," "potential," "predict," "project," "should," "will," "would" or the negative or plural of those terms, and similar expressions (as well as other words or expressions referencing future events, conditions or circumstances) are intended to identify forward-looking statements. These forward-looking statements are based on Syndax's expectations and assumptions as of the date of this press release. Each of these forward-looking statements involves risks and uncertainties. Actual results may differ materially from these forward-looking statements. Forward-looking statements contained in this press release include, but are not limited to, statements about the progress, timing, clinical development and scope of clinical trials, the reporting of clinical data for Syndax's product candidates, the potential use of its product candidates to treat various cancer indications and fibrotic diseases, Syndax's expected third quarter and full year research and development expenses, and expected third quarter and full year total operating expenses, and Syndax's expectations for liquidity and future operations. Many factors may cause differences between current expectations and actual results, including: unexpected safety or efficacy data observed during preclinical or clinical trials; clinical trial site activation or enrollment rates that are lower than expected; changes in expected or existing competition; changes in the regulatory environment; failure of Syndax's collaborators to support or advance collaborations or product candidates; and unexpected litigation or other disputes. Other factors that may cause Syndax's actual results to differ from those expressed or implied in the forward-looking statements in this press release are discussed in Syndax's filings with the U.S. Securities and Exchange Commission, including the "Risk Factors" sections contained therein. Except as required by law, Syndax assumes no obligation to update any forward-looking statements contained herein to reflect any change in expectations, even as new information becomes available. Syndax Contact Sharon Klahre Syndax Pharmaceuticals, Inc. [email protected] Tel 781.684.9827 SNDX-G SOURCE Syndax Pharmaceuticals, Inc.

摘要：病毒载体为真核细胞的改造提供了一种有效手段，它们在学术实验室和工业界中用于研究和临床基因治疗应用现在已非常普遍。慢病毒载体，源自人类免疫缺陷病毒，在过去二十年中已得到广泛的研究和优化。第三代自灭活慢病毒载体最近在多项临床试验中被用来向造血干细胞引入基因，以纠正原发性免疫缺陷和血红蛋白病。这些载体还被用来向成熟的T细胞引入基因，通过传递嵌合抗原受体（CARs）或克隆的T细胞受体来产生对癌症的免疫。使用慢病毒载体工程化的CAR T细胞治疗已在B细胞恶性肿瘤患者中显示出显著的临床成功，从而促成了使用慢病毒载体的第一个基因工程细胞治疗的监管批准。在这篇综述中，我们讨论了几个将对临床医生感兴趣的慢病毒载体方面，包括慢病毒载体发展的概述，病毒载体作为原发性免疫缺陷和癌症治疗的当前用途，慢病毒载体的大规模生产，以及对接受基因治疗产品的患者的长期跟踪。 1. 引言 20世纪70年代分子生物学的出现使得操纵核酸的多种工具得以发展，并彻底改变了现代医学。分子生物学构成了众多生物治疗药物的基础，例如重组酶（如血友病中的因子IX）、单克隆抗体（如曲妥珠单抗）和生长因子（如促红细胞生成素）。基因治疗涉及将编码感兴趣基因的DNA传递到细胞中，以治疗疾病为目的，扩展了分子生物学的力量，有可能纠正由遗传缺陷引起的疾病（例如，由于β-珠蛋白基因缺陷引起的β-地中海贫血）。除了纠正遗传缺陷外，基因治疗还可以赋予细胞或生物体在自然状态下不存在的能力。使用基因工程T细胞的过继细胞疗法是最引人注目的例子之一。使用合成基因，如嵌合抗原受体（CAR）或克隆的T细胞受体（TCR），可以使T细胞具有识别其内源性TCRs自然不识别的抗原的能力。这种方法甚至在对其他现有治疗高度耐药的晚期B细胞恶性肿瘤患者中也能产生强大的临床反应。通过γ-逆转录病毒、慢病毒、腺病毒和腺相关病毒进行的基因治疗因其自然能力进入细胞并传递遗传物质而具有吸引力。γ-逆转录病毒和慢病毒是逆转录病毒的亚型，它们包含一个RNA基因组，该基因组通过病毒编码的酶——逆转录酶在转导的细胞中转换为DNA。尽管在研究环境中使用γ-逆转录病毒载体更为常见，但使用慢病毒载体进行基因治疗的临床试验数量正在增加。本综述讨论了慢病毒载体的发展，并从安全性角度总结了它们当前的临床研究。 2. 慢病毒载体发展史 2.1. 慢病毒生物学 对于逆转录病毒和慢病毒的生存和功能所必需的基本基因是gag、pol和env基因；gag编码结构蛋白，pol编码逆转录和整合到宿主细胞基因组所需的酶，env编码病毒包膜糖蛋白。所有逆转录病毒都有相似的生命周期。生命周期始于成熟的病毒通过直接膜融合或通过包膜内糖蛋白与其在目标细胞表面的相应受体结合所促进的受体介导的内吞作用进入细胞。这一初始融合步骤之后是脱壳过程；在这个阶段，几种病毒蛋白（包括一些Gag亚基）从病毒核心中解离出来。病毒RNA通过一个复杂的多步骤逆转录过程转化为前病毒双链DNA。然后前病毒DNA与病毒蛋白复合，以促进核输入和整合到宿主基因组中。整合过程由关键病毒蛋白（如整合酶）和内源性宿主细胞转录因子（如LEDGF）协助。野生型慢病毒的整合前病毒基因组依赖宿主机制来启动和完成组装传染性颗粒所需的病毒蛋白的转录和翻译。然后病毒后代通过称为出芽的过程离开细胞，其中病毒颗粒从质膜释放到细胞外空间，与其他经常出芽的病毒不同。像许多包膜病毒一样，慢病毒利用所需的内体分选复合物进行运输途径来执行复杂的出芽过程，并将病毒颗粒释放到细胞外空间。在出芽过程中，宿主细胞中存在的内源性膜蛋白可以并入病毒颗粒的包膜中，如MHC分子，这可能影响释放后病毒颗粒的后续处理。病毒出芽和随后的病毒传播过程对野生型慢病毒的生命周期至关重要，但对于理解复制无能的重组慢病毒载体的基本特征并不相关。逆转录病毒生命周期的两个独特步骤，逆转录和整合，是慢病毒载体功能的核心。脱壳后，剩余的病毒核酸和蛋白复合物通常被称为逆转录复合物（RTC）。这个RTC被积极运输到染色体DNA上，那里可能会发生整合。在迁移过程中，病毒RNA在RTC内通过逆转录过程转化为双链病毒DNA。这个过程始于转移RNA与病毒RNA基因组5'端的引物结合位点结合（图1）。 图1 逆转录步骤。该图示说明了将HIV的单链RNA(ssRNA)基因组转换为双链DNA(dsDNA)所涉及的步骤。RNA以红色显示，DNA以黄色表示[1]。转运RNA(tRNA)引物(蓝色椭圆)与引物结合位点(PBS)[2]进行碱基配对。使用逆转录酶(RT; 紫色椭圆)启动逆转录，从tRNA引物开始，复制基因组5'端的U5和R序列。在这个阶段，形成了RNA/DNA双链，并且RT酶的核糖核酸酶(RNase)H活性降解了已被复制的病毒RNA(虚线红色)[3, 4]。负链DNA已通过病毒RNA两端都存在的R序列转移至病毒RNA的3'端，负链DNA合成继续进行。HIV-1基因组有两个RNase H抗性多嘌呤序列(PPTs)[5]。这两个PPT作为正链DNA合成的引物。一个正链在U3处启动，另一个在中央PPT处启动(cPPT)[6]。正链和负链DNA随后延长，最终形成了一个完整的病毒RNA副本，其5'和3'端都有额外序列，使得病毒DNA在两端都有相同的U3RU5副本。在U3处启动的正链取代了从cPPT启动的正链的一部分，形成一个称为中央翻盖(cFLAP)的小翻盖。LTR 长末端重复序列。 当负链病毒DNA由逆转录酶的聚合酶活性合成时，病毒RNA被同一酶的RNAse H活性降解。这个过程产生了一个短片段的负义单链DNA，通常被称为强停复制DNA（sscDNA）。这个sscDNA片段随后被转移到病毒RNA的3'端，作为合成负链病毒DNA的引物。在这个过程中，对病毒生命周期至关重要的长末端重复序列（LTR）中的U3RU5序列得以恢复。正链病毒DNA的合成是通过RNase H抗性多嘌呤序列启动的，一个靠近3' LTR，另一个是中心多嘌呤序列。总之，整个过程使用多个引物步骤，从而获得病毒RNA的完整DNA副本。这个病毒DNA在LTR两端都有一个与U3RU5序列相同的副本。当逆转录接近完成时，该复合物可以被称为前整合复合物（PIC）。由于可能存在多个引物事件来合成正义链，可能会形成重叠正义链DNA的翻盖。人们认为这些翻盖很可能在整合过程后被宿主DNA修复酶修复。尽管中心多嘌呤序列（或它们产生的DNA翻盖）对逆转录过程并不重要，但对病毒载体的研究表明它们的存在增强了病毒载体的效力。这可能是由于第二链合成的增强速率，这也可能保护RTC免受先天限制因素的侵害，如载脂蛋白B mRNA编辑催化多肽样酶（APOBEC）。然而，也有研究表明这种三链DNA翻盖可能也增强了核输入。逆转录是在细胞质还是细胞核中完成尚不清楚。RTC的确切组成可能允许更有效的逆转录。衣壳似乎保护病毒核酸免受先天传感器的侵害；同时，它提供了一个结构，允许更有效的逆转录，错误率更低。逆转录在细胞系中比在无细胞系统中更准确，但转录速率要慢得多（70 nt/min vs. 1000 nt/min）。这个速率在原代细胞中更慢，如巨噬细胞和静止的T细胞，它们的核苷酸库更低。将RTC从细胞包膜运输到细胞染色质的过程是积极的，需要能量，并且尚未充分研究；然而，对整合过程的最新研究揭示了几种宿主-病毒相互作用，可能促进了这一过程。其中一个模型表明，衣壳蛋白在病毒生命周期的早期阶段具有基本作用，通过使用环孢素A，剪切和聚腺苷酸化特异性因子6（CPSF6），Nup358和TNPO3来协调衣壳脱壳、DNA合成和整合的协调过程，促进逃避先天反应和插入到首选的染色质区域。 整合的步骤包括（1）锚定（2），3' 处理/切割精确数量的末端核苷酸（3），链转移，以及（4）DNA修复。γ-逆转录病毒（小鼠白血病病毒[MLV]）和慢病毒（人类免疫缺陷病毒[HIV]）之间的重要差异在设计使用逆转录病毒的基因治疗载体时应予以考虑。在大多数逆转录病毒中，整合过程并非随机。每个逆转录病毒类别都有其特征性的偏好。γ-逆转录病毒MLV倾向于在转录起始位点附近插入，而慢病毒HIV则更倾向于在转录单元内插入。α逆转录病毒禽肉瘤白血病病毒对转录单元有较轻微的偏好。β逆转录病毒小鼠乳腺肿瘤病毒没有明显的偏好。像MLV这样的γ-逆转录病毒只有在核膜溶解后才能进入染色质。MLV的锚定机制导致插入位点位于增强子内，并涉及p12 MLV蛋白与BRD2,3,4（bromodomain和外部结构域蛋白2、3和4）之间的相互作用。同样，似乎那些由于缠绕在核小体上而高度弯曲的DNA序列也受到青睐。慢病毒具有与其独特的能力相关的额外选择标准，即通过完整的核膜的核孔进行转位。γ-逆转录病毒必须在有丝分裂期间进入宿主基因组，此时核膜被解体，而慢病毒可以通过核孔的主动运输进入染色体。尽管核输入的过程仍然不甚了解，但认为PIC中的病毒蛋白，如衣壳，以及逆转录宿主基因组的元素对于通过核孔的运输是必要的。此外，Yamashita等人的精妙研究表明，HIV的衣壳蛋白（而不是MLV）使HIV能够通过核孔进行转位。在非分裂细胞中，靠近核孔也在整合位点选择中起作用。异染色质倾向于与核膜相关，而活跃转录的基因更靠近核孔。核孔内的几种宿主蛋白（Nup153, Nup98, Nup358, CPSF6和TPR）似乎在HIV的输入中起作用。宿主蛋白LEDGF, BAF和HMG都与HIV-1的PIC相关。LEDGF与PIC和表观遗传（H3K36me3）标记相互作用，导致更倾向于在转录单元内进行整合。这些慢病毒的独特特性可能具有优势，因为某些基因治疗平台针对的是静止的细胞类型，例如长期造血干细胞（HSCs）。多年来，该领域的共识是HIV不感染生命周期G0阶段的静止CD4 + T细胞，但可以感染激活的CD4 + T细胞。大约在同一时间，对患者细胞的研究表明，静止的CD4 + T细胞含有HIV DNA。因此，假设感染的静止CD4 + T细胞的来源是被感染并返回到静止状态的激活T细胞。这些静止的CD4 + T细胞对HIV感染有抵抗力是令人困惑的，尽管它们表达了HIV融合所需的受体（CD4和CXCR4或CCR5），但与激活的CD4 + T细胞相比，这些静止的CD4 + T细胞中的逆转录水平在接种后不久（<24小时）测量病毒中间体时低几个数量级。随着时间的推移，人们认识到静止CD4 + T细胞中核苷酸的低水平和限制因子的高表达水平减慢了逆转录的速度，直接感染静止CD4 + T细胞的潜力降低，但并未阻止最终逆转录产物随后在静止CD4 + T细胞中积累2至3天，而在激活的T细胞中为8至12小时。慢病毒载体感染静止细胞的另一个挑战是静止的CD4 + T细胞与常用的病毒包膜G蛋白——泡状口腔病毒（VSV-G）融合效率不高。VSV-G受体介导的内吞作用不会导致静止CD4 + T细胞的有效感染，因为内吞作用有限。使用几种细胞因子（如白细胞介素7）的治疗克服了这一限制，并增强了细胞存活，因为G0 T细胞在HIV感染后也容易很快死亡。了解这些限制因子的影响将很重要，因为这些慢病毒生物学的细微差别在基于这些载体的基因治疗开发过程中需要考虑。 2.2.  慢病毒载体 第一代慢病毒载体包含了HIV基因组的大部分，包括gag和pol基因，以及几种额外的病毒蛋白。第一代慢病毒载体的设计中包括了另一种病毒的包膜蛋白，最常见的是VSV-G。VSV-G识别一种普遍表达的受体，最近被确定为低密度脂蛋白（LDL）受体，允许慢病毒载体转导广泛的细胞。VSV-G基因编码在与其他慢病毒基因不同的质粒上。慢病毒辅助基因vif、vpr、vpu和nef，以及调节基因tat和rev被包括在第一代慢病毒载体中。vif、vpr、vpu和nef为慢病毒在体内的复制提供生存/适应优势，但它们对体外病毒的生长并不必需；tat和rev对病毒复制是必需的。 随后开发了更安全的第二代慢病毒载体，这些载体缺乏辅助毒力因子vif、vpr、vpu和nef。去除辅助基因并未抑制遗传物质向宿主细胞的转移。 第三代慢病毒载体通过将病毒基因组分割成不同的质粒，进一步提高了安全性，使得重组病毒的产生更加不可能（图2）。在第三代系统中，gag和pol基因被编码在与rev或env基因不同的质粒上，从而产生了由三个独立的质粒组成的载体，这些质粒包含包装所需的必要病毒序列。由于在含有转基因的构建物的上游LTR中设计了一种持续活跃的启动子，第三代慢病毒载体中去除了tat基因，因为它的功能不再必要。在病毒基因组的3' LTR中引入缺失，以创建自灭活（SIN）慢病毒载体，破坏了LTR的启动子/增强子活性，进一步提高了安全性。 图2 第三代慢病毒载体。第三代慢病毒载体由两个独立的包装质粒组成，一个编码gag和pol，另一个编码rev。还有一个质粒编码来自VSV-G的包膜蛋白。编码感兴趣基因的质粒包含已经改变为自灭活（SIN）的慢病毒LTR序列，以防止重组。LTR 长末端重复序列，VSV 泡状口腔病毒。 第三代SIN慢病毒载体中使用的内部启动子的选择也很重要。最初的研究使用了巨细胞病毒立即早期基因启动子，它在大多数活跃分裂的细胞系中显示出强大的表达。然而，启动子在原代细胞中的活性差异很大，如CD34 + 干细胞和T细胞，与T细胞激活相比，巨细胞病毒启动子在活性上显示出更大的变化，与持续活跃的细胞启动子（如延伸因子1-α）相比。 尽管大多数当前的基因治疗方法在转导前激活T细胞进行分裂，但HIV-1转导G0期非分裂T细胞的能力依赖于PIC通过完整的核膜的导入，为基因治疗提供了一些理论上的优势。当细胞在其静止的非激活状态下被转导时，细胞可能保留更大的功能潜力。例如，幼稚T细胞具有非常长的间期半衰期，人类的估计约为3.5年。同样，HSCs也观察到缓慢的细胞周期，长期重归潜能与细胞周期呈负相关。通过转导非分裂的T细胞或干细胞，基因修饰细胞的持久性可能会增加。 针对非分裂细胞也可能降低致癌潜力。鉴于大多数逆转录病毒载体针对转录单元，当转导分裂细胞时，插入到参与细胞分裂的转录单元的机会增加。这由临床数据表明，唯一的插入性突变病例报告在基因修饰的增殖性HSCs中，而不是静止的细胞类型。然而，致癌潜力可能高度依赖于背景，特别是接受治疗的患者中预先存在的遗传异常。尽管如此，由于其整合模式靠近原癌基因，γ-逆转录病毒已经显示出相当大的白血病风险。慢病毒载体也可以插入到癌基因附近，并且在至少一个使用非灵长类慢病毒衍生载体转导胚胎细胞的模型中已经注意到肿瘤形成。然而，现有的临床数据表明，新一代载体大大减少了插入性突变的风险，因为在涉及遗传修饰HSCs或非分裂T细胞的基因治疗试验中，至今没有报告白血病发生的病例。 在使用慢病毒载体进行肾上腺脑白质营养不良的基因治疗试验中观察到具有共同整合位点的细胞扩增。在感染HIV-1的患者中也观察到高度扩增的CD4 + T细胞克隆。然而，克隆整合位点扩增似乎与致癌选择无关。 长距离染色质相互作用也被证明对由逆转录病毒载体引起的肿瘤形成有贡献[55]。Montini等人展示了通过交换逆转录病毒和慢病毒LTRs的区域，当携带来自逆转录病毒的强大启动子/增强子元件时，慢病毒载体可以诱导插入性突变。在模型系统的并行比较中，自灭活（SIN）慢病毒载体被证明比γ-逆转录病毒载体具有更低的插入性肿瘤形成风险，并且在小鼠模型中，临床相关的SIN慢病毒载体表明，通过包含工程化染色质绝缘体盒，可以降低慢病毒载体的基因毒性潜力。然而，正如已经讨论的，当慢病毒载体整合在已知的癌基因内时，克隆扩增可能会发生；因此，使用慢病毒载体时的突变风险可能较低，但并未消除。为测试逆转录病毒和慢病毒载体的致癌潜力而开发的检测方法可能会进一步提高设计临床用载体的安全性。 3.  慢病毒载体的大规模生产用于临床应用 慢病毒载体的生产主要围绕使用一种细胞系，通常称为包装细胞，来生产病毒载体颗粒。大规模生产载体始于培养足够数量的这些包装细胞，如HEK293T细胞系的衍生物（图3）。 图3 大规模载体生产的概述。慢病毒载体的生产始于在采用良好生产规范的设施中培养包装细胞系。这些细胞被转染构成第三代慢病毒载体的质粒，并且生产载体的细胞在培养中被扩增。从细胞和培养碎片中纯化载体，并进行过滤以确保无菌，单个等分被冷冻保存。 包装细胞的小样本在培养中扩展数天后，然后通过瞬时转染含有生产慢病毒载体所需蛋白质编码的质粒DNA。这些核心包装质粒包括包膜蛋白（最常见的是VSV-G）、HIV-1 gag和pol基因产物以及HIV辅助蛋白，如Rev。将这些质粒与含有感兴趣基因的慢病毒载体基因组共转染，为细胞系生产功能性载体颗粒提供了所有必要的组分。在数天的过程中，包装细胞产生慢病毒载体颗粒，可以从培养基中收获。经过流过滤，澄清的载体经过处理以去除污染的DNA产品，使用各种方法如梯度纯化或色谱法纯化病毒产品。纯化后，洗脱的分数经过一系列过滤步骤进行灭菌和去除任何剩余的细胞碎片。产品的纯度至关重要；包装细胞的碎片很容易与载体产品一起收集，这些杂质可能会在体外和体内引起炎症反应。一旦生成，据报道，当在-80°C下冷冻保存时，载体库存可以保持稳定长达9年。 在临床环境中使用载体的生成需要采用现行良好生产规范（cGMP）来确保生产高质量载体，这些载体经过验证具有明确的身份、纯度和效力。载体生产所需的步骤并不复杂；然而，与生产逆转录病毒载体相比，生产符合cGMP的慢病毒载体生产系统已被证明更具挑战性。尽管慢病毒载体生产与γ-逆转录病毒载体生产有许多相似之处，但一个关键的区别是，目前缺乏稳定转染核心包装质粒的包装细胞系，这显著影响了生产过程的一致性并增加了慢病毒载体的成本。每次载体生产批次需要瞬时转染三到四个不同的质粒，这引入了在大规模、cGMP生产过程中不受欢迎的变异机会。过去尝试生产与γ-逆转录病毒载体生产中使用的相当的稳定慢病毒包装细胞系大多失败，并且是载体开发的主要研究领域。最近，有报道称一种生成临床级稳定包装细胞系的方法，这些细胞系持续生产慢病毒载体。这种策略使用了Cre重组酶介导的将密码子优化的HIV-1 gag-pol构建物插入到293FT细胞中的一个持续表达的位点。然后，剩余的载体组分被转染到一个表达高水平gag-pol的克隆中。这种方法解决了先前研究中发现的慢病毒载体生产的关键问题，即质粒转染gag-pol盒没有诱导持续的高水平表达。稳定包装细胞系的可用性可能会加速新基于慢病毒载体的基因疗法的开发和生产，以及降低基因疗法这一关键组成部分的成本。然而，由包装所用的其他病毒蛋白（即Rev或VSV-G）表达引起的毒性仍然是一个挑战。 4.  慢病毒载体的临床应用 慢病毒和逆转录病毒载体是目前正在开发的重要技术，用于许多需要转移遗传物质的临床应用（图4）。 图4 慢病毒载体的关键临床应用。a 矫正原发性免疫缺陷。使用病毒载体传递共同的γ链（γc），恢复X1型SCID（严重联合免疫缺陷）患者的免疫功能。b 传递肿瘤特异性T细胞受体（TCR）。慢病毒载体可以用来体外向患者的T细胞中引入能够识别黑色素瘤抗原的MART-1 TCR。这些经过改造的T细胞现在能够识别黑色素瘤细胞，作为癌症治疗被输回给患者。c 嵌合抗原受体（CAR）T细胞治疗。通过三个不同的域（抗原识别、共刺激信号和T细胞信号）工程化的CAR，可以使用慢病毒载体引入T细胞。表达修改后受体的细胞能够识别感兴趣的抗原，并利用T细胞的强大细胞毒性活动攻击肿瘤细胞。目前，大多数临床试验中的CAR T细胞治疗针对的是CD19抗原，这是一种在B细胞和B细胞恶性肿瘤上表达的蛋白。SCID：严重联合免疫缺陷。 由于慢病毒载体能够更有效地转导非增殖或缓慢增殖的细胞，如CD34 + 干细胞，因此它们已成为临床应用的特别吸引人的选择。在临床环境中使用慢病毒载体的首个应用是使用一种条件复制能力的慢病毒载体，该载体编码针对HIV包膜基因的反义RNA。这个载体被用来转导成熟的外周血T细胞，用于治疗自然HIV感染。在这个试验中没有报告可归因于慢病毒载体的不良事件，其中包括一些患者的长达8年的随访。此外，整合位点分析显示，如预期的那样，更倾向于在转录基因内整合，预充细胞产品和植入T细胞的整合位点分布没有显著变化。基于慢病毒载体的基因转移进入CD34 + HSCs已在治疗几种遗传疾病中得到应用，包括β-地中海贫血、X-连锁肾上腺脑白质营养不良、脑硫脂沉积病和Wiskott-Aldrich综合征。在这些试验中没有报告与载体相关的不良事件。在β-地中海贫血患者中使用β-球蛋白转导HSCs的初步研究中，一名βE/β0-地中海贫血患者实现了输血独立。有趣的是，这种反应与一个主要的髓系克隆的相对增加有关，该克隆带有HMGA2基因位点内的慢病毒载体插入。目前尚不清楚这一主要克隆内的插入是否仅仅是巧合，或者是由于HMGA2基因的失调导致的增殖增强而被选中。几项使用慢病毒载体修改HSCs的研究仍在继续（表1），需要更长时间的随访才能充分确立慢病毒载体在这种治疗环境中的安全性。 表1 使用慢病毒载体修改造血干细胞的正在进行的临床试验 ADA（腺苷脱氨酸酶）是一种对维持免疫系统功能至关重要的酶。SCID（严重联合免疫缺陷）是一种导致免疫系统严重受损的遗传性疾病。ADA缺乏症是SCID的一种类型，称为腺苷脱氨酸酶缺乏性SCID。 慢病毒载体在体外基因转移到造血干细胞（HSCs）的安全性仍然是一个有待解决的问题；然而，该领域现在已经积累了超过10年的使用慢病毒载体将基因转移到成熟T细胞的经验。最近在利用基因修饰T细胞的癌症免疫治疗方面取得了一些进展。一种方法涉及通过将肿瘤特异性TCR转导到患者自身的T细胞中，产生细胞毒性T细胞。目前，正在进行的1期和2期临床试验正在使用已经转导表达肿瘤抗原NY-ESO-1、MART-1、WT-1等的自体T细胞。在一个使用慢病毒载体转移针对由NY-ESO-1和LAGE-1共享的肽段的TCR作为治疗多发性骨髓瘤患者的试验中，20名患者中有16名观察到临床反应，安全问题最小。此外，慢病毒载体在转导针对Melan-A/MART-1抗原的TCR的T细胞方面，比逆转录病毒载体展现出更好的转导效率，并且正在进行使用慢病毒转导表达MART-1的T细胞治疗转移性黑色素瘤的2期试验。在使用TCR修饰细胞的一些试验中，已经观察到由转移的T细胞引起的不良反应；然而，目前还没有报告将慢病毒载体在这些研究中使用导致的不良反应。 在使用TCR重新编程T细胞的类似方法中，通过慢病毒和逆转录病毒载体将靶向B细胞标记CD19的CARs引入T细胞，在B细胞恶性肿瘤患者中产生了值得注意的临床反应。使用CD19靶向CAR T细胞治疗B细胞急性淋巴细胞性白血病的临床试验已经显示出高疗效，对复发或难治性疾病患者的持久完全反应率超过60%。此外，在非霍奇金淋巴瘤患者中观察到大约40%到70%的完全反应率。已经提出了一些关于CAR T细胞治疗的安全问题；然而，与TCR一样，CAR T细胞治疗的不良反应似乎是机制性的，而不是使用病毒载体的结果。 CD19 CAR T细胞治疗的一个重要的靶向副作用是B细胞缺乏，这与长期CAR T细胞持久性相关。由于慢病毒载体的整合性质以及T细胞克隆在过继转移后的持久性，经过慢病毒载体修饰的T细胞似乎能够在治疗后持续存在并诱导持续的B细胞缺乏超过5年。这些经过慢病毒载体工程改造的T细胞的半衰期目前尚不清楚，但可能是终身的。同样重要的是要认识到，接受基于慢病毒载体的基因治疗的个体在某些HIV检测平台上也可能表现出阳性测试，这取决于所使用的载体结构和检测试剂。因此，将这些与自然HIV-1感染区分开来将很重要，并且需要更广泛的检测。 除了将细胞在体外修改后回输到患者体内，慢病毒载体也直接在体内用于治疗目的。一项基于非灵长类慢病毒载体的1/2期研究，该载体基于马传染性贫血病毒（EIAV）表达参与多巴胺代谢的三个基因，证明了局部慢病毒基因传递到中枢神经系统的安全性，并有一些临床效益的证据。慢病毒载体的体内基因传递也在临床上应用于眼睛。这些方法面临许多障碍，包括效率、需要组织特异性启动子和免疫原性。后者特别重要，因为免疫原性可能与传递的基因以及载体组分有关。如前所述，慢病毒载体包膜在出芽过程中捕获包装细胞系的膜蛋白。已经描述了对载体包膜内HLA I类蛋白的异体免疫反应，并且可能限制载体存活。基因编辑包装细胞以产生缺乏HLA I类蛋白的细胞系可以增强慢病毒载体在血清中的稳定性。除了载体基因组工程外，表面工程对于这些载体在体内的成功应用可能至关重要。 5.  慢病毒载体的使用在监管方面的考量 在使用γ-逆转录病毒或慢病毒载体的治疗中，存在一个理论上的潜力，即在载体生产过程中可能发生重组事件，导致复制能力型逆转录病毒或慢病毒（RCRs/RCLs）的出现。如果载体中存在RCRs/RCLs，由于病毒复制和插入宿主DNA的潜力，患者中插入性突变的发生率可能会增加。因此，美国食品药品监督管理局（FDA）、欧洲药品管理局和大多数监管机构要求对载体产品以及患者进行RCRs/RCLs的广泛检测。对包装细胞系、纯化的载体产品以及在输注给患者之前的基因修饰细胞治疗产品进行RCRs/RCLs的检测。常用的检测载体或细胞产品的方法是S+L−检测，该检测涉及将测试样本与能够使病毒复制的细胞系一起孵育。可以通过聚合酶链反应或血清学检测监测患者的RCRs/RCLs，FDA建议在患者接受基因治疗后的第一年每3个月监测一次重组病毒。有人建议，由于重组病毒生成的可能性不大、检测的高成本和劳动量，应该重新修订对RCRs/RCLs的严格检测要求。第三代自灭活（SIN）慢病毒载体系统由于病毒基因组被分割成不同的质粒，使得RCLs的生成非常不可能。 由于RCRs/RCLs和继发性恶性肿瘤的理论可能性，美国和欧洲的卫生当局要求对使用病毒载体的细胞和基因治疗研究进行长期跟踪。跟踪要求因国家而异；在美国，建议在患者接受基因治疗后至少每年监测一次，持续15年。最近FDA批准的tisagenlecleucel（CTL019；Kymriah）所需的长期市场后监测部分是由这些理论担忧驱动的。然而，患者跟踪的最佳持续时间取决于几个因素，包括载体持久性和转基因表达。除了监测患者的继发性恶性肿瘤和RCRs/RCLs外，还应检查患者是否有新的发生或现有神经、风湿或自身免疫性疾病的恶化。FDA还要求参与使用病毒载体的临床试验的患者接受有关其作用机制和DNA整合可能影响的信息，包括延迟恶性肿瘤的风险。为了帮助建立跟踪程序并收集接受基因治疗的患者的数据，正在进行针对特定基因治疗产品的患者的跟踪的临床试验。 6.  未来的方向和挑战 几个正在进行的研究领域旨在通过新的病毒载体设计进一步提高基因治疗。非整合慢病毒载体（NILVs）已被研究作为避免插入性突变的手段。NILVs缺乏病毒整合酶蛋白，能够转导分裂和非分裂细胞，病毒基因组作为游离基因体存在于细胞中，而不是整合到宿主基因组DNA中。预计NILVs的非整合基因组结构在分裂细胞中的基因表达可能是短暂的。虽然这在某些应用中可能不受欢迎，但这种稀释效应在某些情况下可能有用，例如CAR T细胞，其中长期表达遗传有效载荷可能不是必需的。 NILVs已被有效地用作疫苗策略，在临床前模型中产生细胞和体液免疫以及抗肿瘤免疫。NILVs也可以与锌指核酸酶共转导到细胞中，这些酶促进编码在载体中的DNA与宿主DNA的特定位点的重组。在一项临床前研究中，锌指核酸酶被用于T细胞中，用NILV引入的肿瘤特异性TCR替换内源性TCR。以这种方式替换内源性TCR可以消除由内源性TCR介导的非靶向活性，从而提高安全性。为了在分裂细胞中允许长期表达，开发了一种双重NILV载体系统，包括噬菌体phiC31的整合酶。 已经研究了两种使用慢病毒载体的癌症疫苗：树突细胞疫苗和癌细胞疫苗。加载肿瘤抗原肽的树突细胞可以用作针对表达该抗原的癌症的疫苗。其中一种树突细胞疫苗，Sipuleucel-T，已被FDA批准作为前列腺癌治疗。慢病毒载体已被研究作为在树突细胞中表达肿瘤抗原或修改共刺激信号的方法，以进一步提高其效力。慢病毒载体也已被用于在树突细胞中恒定激活MAP激酶途径，这在小鼠中增强了抗肿瘤反应。 另一种疫苗方法是使用已经表达相关肿瘤抗原的癌细胞，而不是必须加载肽的树突细胞。一项关于B细胞淋巴瘤细胞的研究，这些细胞通过慢病毒转导共刺激蛋白和白介素-12，表明使用这些修饰细胞作为疫苗可以在小鼠模型中增强对亲本淋巴瘤细胞系的免疫原性。慢病毒载体也被用来将K562红白血病细胞系转化为人工抗原呈递细胞，这些细胞可以用于体外T细胞扩增，可能还可以用于体内疫苗接种，类似于之前报道的GVAX。尽管需要更多的研究来确定使用慢病毒载体开发的癌症疫苗的临床效果和安全性，但这些方法可能会为患者带来新的治疗方法。 慢病毒载体也被用来传递基因组编辑的组成部分，如用于簇状规则间隔短回文重复序列（CRISPR）-Cas9系统的引导RNA。CRISPR-Cas9系统使用RNA序列引导Cas9核酸酶创建精确的双链断裂，然后可以通过同源重组来实现基因删除或点突变。一项研究使用慢病毒CRISPR引导RNA库在胚胎干细胞中引入目标突变，随后对表型突变体的鉴定证明了这种方法作为使用RNA干扰进行基因筛选的替代方法的有效性。围绕基因组编辑的非目标效应放大存在一些担忧，因为由于病毒整合导致基因组编辑机械的持续表达。为了克服这些潜在的限制，Chen等人描述了一种通过共表达识别CAS9本身的引导RNA来限制编辑持续时间的方法，目标是摧毁表达盒。如果这种系统提供了比NILVs或AAV载体更短的CRISPR表达窗口，它可能是有利的。通过NILVs的短期传递也可能绕过这些挑战。慢病毒载体也常被用于研究环境中通过表达短发夹RNA或反义RNA来改变基因表达。这些方法大多仍处于开发的早期阶段，需要进一步的研究来确定慢病毒载体是否可以作为传递这些基因组编辑工具的治疗平台。 7.  结论 使用慢病毒载体的基因治疗已成为几种疾病的有希望的治疗选择。第一种慢病毒转导的细胞治疗，tisagenlecleucel（CTL019，Kymriah），于2017年8月在美国获批，用于治疗儿童和年轻成人的急性淋巴细胞性白血病。几种基于慢病毒载体工程细胞的额外细胞治疗正处于后期开发阶段。特别是第三代SIN慢病毒载体，在将基因转移到干细胞和T细胞时已证明其安全性。尽管慢病毒载体存在插入性肿瘤发生的潜在理论可能性，但使用自然HIV或慢病毒载体的基因治疗中尚未报告病例。继续跟踪已经接受基于慢病毒载体的基因治疗的患者仍然必要，以了解这些载体的长期安全性和有效性。还需要额外的基础和临床研究来提高转导效率和生产。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。