RXFP4

常见代谢性疾病，如肥胖、代谢综合征、高脂血症、高血压、非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）、糖尿病等，影响全球超过20%的人口，给社会带来巨大的医疗负担。每年超过1197万人死于这些疾病及其并发症，其中肥胖和高脂血症占死亡率的高位，肥胖和2型糖尿病（T2D）的死亡率仍在持续上升。目前虽然已有高效药物用于降低甘油三酯和胆固醇，胰岛素增敏剂的使用也有效减少、推迟T2D患者对胰岛素的需求，但亟需寻找更有效治疗手段以应对这些发病率高、死亡率日渐增长的代谢性疾病。近期，复旦大学基础医学院病原生物学系、教育部/卫健委医学分子病毒学重点实验室吴健教授团队阐述了G蛋白偶联受体（GPCR）调控代谢性疾病发生和进展的机制，揭示了关键GPCR如GPR55、GPR91、GPR119、GPR109a、GPR142、GPR40、GPR41、GPR43和GPR120在代谢综合征、NAFLD和糖尿病等常见代谢性疾病中的重要作用，为药物干预提供了理论基础。基于这些GPCR的药理学效应、临床前或临床试验结果，该团队还全面描绘了这些GPCR激动剂或拮抗剂药物研发现状，着重分析了小分子化合物的治疗效益和可能的安全性问题。因此，该长篇综述是继先前发表的“治疗非酒精性脂肪性肝炎药物临床试验更新”一文（《中国药理学报Acta Pharmacol Sin》 2022; 43: 1180–1190）的续篇，于2024年2月7日同刊在线发表 （DOI：10.1038/s41401-023-01215-2）。英文版Acta Pharmacol Sin 在JCR分区中定为医学一区，药理学一区。GPCRs是一类重要的跨膜蛋白受体，对维持各种生理活动起着关键作用。它们接收局部或循环系统中的信号配体，参与调控包括代谢、神经传递和免疫反应在内的多种生理反应。已确定大部分GPCRs的天然配体，其中大多数是代谢产物、脂肪酸、肽类或神经递质，包括胺类、氨基酸、离子、脂质、肽类、蛋白质等。尚未确定特定配体的GPCR被称为孤儿受体。GPCR数据库（GPCRdb）记录了800多个人类GPCR的基因，已经捕获和阐明了793个GPCR结构、781个受体-配体复合物结构以及381个活跃状态下的受体结构。目前，GPCR结构生物学已揭示了229个高分辨136个GPCR-配体复合物的结构，这些结构涉及48种GPCR。大部分GPCRs在结构上相似（图1），由一个细胞外N-末端、七个跨膜结构域（TM）和一个细胞内C-末端组成。三个亲水性细胞外环（ECL）连接着七个跨膜结构域，一个高度保守的二硫键连接TM3的顶部和ECL2的中部，这个二硫键形成了配体结合域的底部。此外，还有第二个二硫键连接受体的N-末端和TM7的顶部，并形成一个伪环，即ECL4。TM3、TM5和TM6在配体结合和G蛋白偶联过程中起重要作用。三个细胞内环（ICL）与TMs一起可能引起结构变化，从而暴露用于偶联和触发下游事件的功能性G蛋白亚单位。不同类型的配体结合到静止GPCRs的配体结合域，配体与受体的偶联激活GPCRs，随之GPCRs的空间构象发生改变，导致GTP取代了Gαβγ/GDP复合物上结合在Gα亚基上的GDP，复合物解离为具有活性的Gα和Gβγ亚基，并通过下游信号分子即第二信使分子：如环磷酸腺苷（cAMP）、钙离子、肌醇三磷酸（IP3）或二酰基甘油（DAG）等发挥调节作用。GPCRs的作用是多方面的，可分为两类：（1）生理作用：通过促进葡萄糖依赖型胰岛素分泌，改善血脂异常、胰岛素抵抗和糖尿病状态；（2）病理作用：从增强炎症反应和肝细胞脂质堆积，到血管内膜脂质沉积，进而导致伴有严重代谢紊乱NAFLD和动脉粥样硬化。图1：GPCRs的信号通路及对代谢性疾病的影响GPCR与G蛋白亚单位结合，触发各种第二信使的生成，调节涵盖生理功能和病理状况的各个方面，这些病理状况包括代谢综合征、肥胖、糖尿病、NAFLD等。由于其表面可及性和特定的信号传导机制，GPCRs被认为是许多种疾病的药物干预靶点，目前批准的药物中近30%是它们的激动剂或拮抗剂。因此，针对GPCRs的特异性激动剂或拮抗剂的开发对代谢调节至关重要，可能有助于对代谢性疾病进行药理学的干预。该文概述了GPCR发挥的重要生理功能，包括脂肪和葡萄糖代谢以及胰岛素释放等生理过程。最新发现指出GPCR与其配体相互作用参与了代谢性疾病的病理过程，并且可能成为这些疾病的潜在治疗靶点。本文系统地总结了参与代谢紊乱相关的关键GPCRs及其激动剂/拮抗剂小分子化合物的成药可能性，为这类药物的研发提供了理论基础和临床试验数据（表1）。表中所列GPCRs特异性激动剂或拮抗剂小分子化合物能否成为治疗代谢性疾病的新药取决于受体表征、晶体结构、化合物设计、药理学筛选、临床评估等。这类药物的研发往往耗时费力，只有少数候选化合物最终进入IIb和III期临床试验阶段。部分GPCR19、GPCR109a、GPCR142、GPCR40和GPCR120激动剂/拮抗剂已经进入临床试验阶段；然而，GPR91、GPR55、GPR41和GPR43的激动剂/拮抗剂仍处于临床前阶段。表1：GPCR激动剂和拮抗剂治疗代谢性疾病的研发概况总之，目前已确定特定GPCR生理功能和组织分布，及其参与营养和能量代谢分子机制，已开发出一系列GPCR激动剂和拮抗剂小分子化合物，例如MBX-2982、MK0354、LY3325656、Tak-875等，部分化合物已经进入早期或晚期临床试验，为治疗代谢性疾病如代谢综合征、血脂异常、非酒精性脂肪肝病、糖尿病及其并发症找到后备新药。然而，代谢性疾病作为一类慢性进行性疾病，通常涉及多个器官或系统，且GPCR具有广泛的组织分布和复杂的生理功能，在没有消除病因的情况下，仅依靠特定GPCR的激动剂或拮抗剂难以实现疾病的根治。因此，在研发针对上述GPCR高特异性和高准确性激动剂或拮抗剂小分子化合物的同时，减少疾病的风险因素并维持健康生活方式是预防代谢性疾病最有效且经济的方法。本文第一作者为复旦大学上海医学院8年制临床医学专业金诚同学，通讯作者为复旦大学基础医学院病原生物学系吴健教授与复旦大学附属中山医院消化科刘黎黎医师。吴健教授为复旦大学中山医院消化科双聘教授，现受自然科学基金面上项目资助，曾承担科技部重大研发专项。近30年首款！渤健ALS新药或将将在欧洲获批，如果不是沾了基因疗法的光......14.6亿美元！诺和诺德又有新交易想要加速审批上市的药物退市分几步？高管被捕、试验失败、自愿撤市、专家咨询委员会反对……点击这里，欣赏更多精彩内容！

2023年1月31日（北京时间），由复旦大学基础医学院王明伟、中国科学院上海药物研究所柳红和杨德华领衔的合作团队在Nature Communications在线发表了题为“Ligand recognition mechanism of the human relaxin family peptide receptor 4 (RXFP4)”的研究论文。该论文首次报道了人源松弛素/胰岛素样肽受体4（Relaxin family peptide receptor 4, RXFP4）分别结合内源性配体胰岛素样肽5（Insulin-like peptide 5, INSL5）、小分子RXFP4/RXFP3双激动剂Compound 4及小分子RXFP4选择性激动剂DC591053并与Gi蛋白形成复合物的高分辨率冷冻电镜结构，不仅阐明了INSL5独特的受体识别模式，而且揭示了Compound 4拟肽作用的关键位点和DC591053受体亚型选择性的分子机制。RXFP4为A类G蛋白偶联受体（G protein-coupled receptor, GPCR），2003年首见于人类基因组数据库1，2005年被证实为INSL5的内源性受体2。INSL5属于松弛素/胰岛素超家族，1999年Conklin等人在研究该超家族保守的B链半胱氨酸基序（Motif）时，通过检索人类表达序列标签（Expressed sequence tags, EST）数据库而被发现3，二者均高表达于结直肠组织。2015年，王明伟课题组通过对RXFP4的多年研究发现其配体INSL5既可促进小鼠胰岛瘤细胞MIN-6分泌胰岛素，又可提高小鼠肠系L细胞GLUTag释放胰高血糖素样肽-1（Glucagon-like peptide-1, GLP-1）的能力；动物实验亦证实INSL5可改善小鼠的血糖稳态4。此外，INSL5/RXFP4还参与调控能量代谢、食欲调节和肠道蠕动等生理功能5。由于INSL5是由A链和B链通过3个二硫键连接的多肽，化学合成非常困难；现有小分子配体数量稀少，诺华公司报道的Compounds 1、2、3和4均为RXFP4/RXFP3双激动剂6，特异性低，从而限制了对RXFP4生物效应的深入研究和相关新药的发现。2020年，王明伟/杨德华团队通过高通量筛选获得了特异性靶向RXFP4的小分子化合物JK17，并在此基础上经过结构优化改造得到了靶点特异性更佳的激动剂9-(S)-14b8。遗憾的是，上述两个化合物都存在活性弱、毒性大和溶解不易等问题。参与本论文研究的国际合作团队在利用大肠杆菌表达、高密度发酵和专有蛋白纯化技术批量生产INSL5的同时，通过化合物筛选和基于四氢异喹啉母核的结构优化改造，发现了非肽类RXFP4选择性激动剂DC591053（pEC50 = 7.24 ± 0.12），且在NanoBiT系连技术9的助推下获得了分别与上述三种不同配体结合、颗粒均一和性状稳定的 RXFP4–Gi蛋白复合物。他们借助中国科学院上海药物研究所的300 kV冷冻电镜所拍摄的清晰图像和后继单颗粒三维重构，成功解析了分辨率各自为3.19 Å、3.03 Å和2.75 Å的INSL5–RXFP4–Gi、Compound 4–RXFP4–Gi及DC591053–RXFP4–Gi三个复合物的分子结构（图1）。图1. RXFP4–Gi分别结合INSL5、Compound 4和DC591053的冷冻电镜结构。a，INSL5–RXFP4–Gi复合物结构；b，Compound 4–RXFP4–Gi复合物结构及Compound 4的化学结构；c，DC591053–RXFP4–Gi复合物结构及DC591053的化学结构。研究显示，RXFP4识别INSL5的方式不同于已报道的A类GPCR：INSL5 B链羧基末端的α-螺旋深入受体跨膜域（Transmembrane domain, TMD），而A链则覆盖正构位点从而维持配体的完整性和结构稳定性。特别是B链羧基末端的R23B与RXPF4上的E1002.63（右上标数字为Ballesteros–Weinstein编号10，用于确定TMD氨基酸的相对位置）形成盐桥，而W24B除了与T1213.32、Q2055.39和R2085.42等残基形成众多极性作用网络外，亦可与W972.60及H2997.43发生与受体激活密切关联的堆叠效应（图2）。人为突变E1002.63、T1213.32和R2085.42导致INSL5完全失活，破坏W972.60、Q2055.39和H2997.43等残基也不同程度地影响了RXFP4的活化。图2. RXFP4识别INSL5的结构基础。a，INSL5与RXFP4结合的整体示意图；b，INSL5的B链羧基末端R23B和W24B深入RXFP4的正构位点并形成多个极性相互作用；c-e，RXFP4胞外环参与INSL5的识别。非选择性激动剂Compound 4也能深入RXFP4的结合口袋，其胍基模拟INSL5的B链R23B与RXFP4上的E1002.63形成盐桥，而吲哚母核则模拟W24B的吲哚环与周围残基形成广泛的相互作用；该小分子配体对RXFP4的激活能力在发生W972.60、E1002.63、T1213.32与H2997.43等残基的突变后显著降低（图3a-b）。然而，选择性激动剂DC591053则展现与Compound 4迥异的结合方式，其马琳环占据RXFP4独特的配体结合口袋（图3c-d），在3.29、3.33、5.39、5.42和7.39等位点上（Ballesteros–Weinstein编号10）与RXFP3的氨基酸差异明显，与亚型选择性相关（图3e）。这个发现得到了功能性实验数据的支持：置换RXFP3和RXFP4上述同源位点的氨基酸，Compound 4对RXFP4突变体L1183.29S+V1223.33S的作用没有显著变化，但DC591053的效价却降低20.9倍；较之Compound 4，DC591053激活Q2055.39H和R2085.42K等RXFP4突变体的能力也受到更大影响。可以预期，这项成果将有助于深入研究RXFP4的生理功能和开发高效的的选择性RXFP4小分子激动剂，同时也有望提升人们对胰岛素超家族成员多元识别相关受体的认识。 图3. 小分子激动剂的拟肽作用及和DC591053选择性激活RXFP4的分子机制。a，Compound 4的结合口袋截面图；b，Compound 4与RXFP4的相互作用；c，DC591053特异性激活RXFP4；d，DC591053结合口袋截面图；e，小分子激动剂与受体相互作用模式示意。复旦大学基础医学院博士研究生陈彦、复旦大学基础医学院青年研究员周庆同和中国科学院上海药物所王江研究员为该论文的共同第一作者；复旦大学王明伟讲席教授、中国科学院上海药物研究所柳红研究员和杨德华研究员为该论文的共同通讯作者。合作者包括澳大利亚墨尔本大学Ross A.D. Bathgate教授、中国科学院上海药物所徐华强研究员和常州健亚生物科技有限公司沈纯博士等。该研究成果先后获得了国家自然科学基金委员会、国家科学技术部、国家卫生与健康委员会、中国科学院和上海市科学技术委员会等的经费资助。原文链接：https://doi-org.libproxy1.nus.edu.sg/10.1038/s41467-023-36182-z（也可后台留邮箱，获取PDF版本）参考文献：Boels, K. & Schaller, H. C. Identification and characterisation of GPR100 as a novel human G-protein-coupled bradykinin receptor. Br J Pharmacol 140, 932-938 (2003)Liu, C. et al. INSL5 is a high affinity specific agonist for GPCR142 (GPR100). J Biol Chem 280, 292-300 (2005).Conklin, D. et al. Identification of INSL5, a new member of the insulin superfamily. Genomics 60, 50-56 (1999).Luo, X. et al. The insulinotrophic effect of insulin-like peptide 5 in vitro and in vivo. Biochem J 466, 467-473 (2015).Hechter, D. et al. Reviewing the physiological roles of the novel hormone-receptor pair INSL5-RXFP4: a protective energy sensor? J Mol Endocrinol 69, R45-R62 (2022).DeChristopher, B. et al. 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