GOT1

即使在氧充分的条件下（有氧糖酵解/Warburg效应），癌细胞上调葡萄糖的糖酵解途径形成乳酸，这个过程被认为是恶性肿瘤的标志。代谢活跃的癌细胞导致营养消耗、缺氧、酸性、有毒的代谢物富集的肿瘤微环境，抑制免疫系统。 肿瘤细胞代谢与肿瘤微环境 （Nat Rev Cancer . 2020 Sep;20(9):516-531） 本文简介肿瘤细胞代谢调节的5条信号通路。 其他代谢相关文章，请点击下面链接阅读 23种代谢产物与肿瘤免疫 T细胞代谢与功能的关系 1. Hippo Pathway Hippo通路控制细胞增殖、器官大小和组织稳态。它由MAPK家族、MST1/2、LATS1/2以及转录共激活因子YAP和TAZ组成。 当该通路被激活时，上游信号磷酸化并激活MST1/2和LATS1/2，从而磷酸化YAP/TAZ。因此，YAP/TAZ通过14-3-3蛋白被隔离在细胞质中，并被E3连接酶β-TRCP降解。 Annu Rev Pathol. 2021 January 24; 16: 299–322 然而，当Hippo信号通路关闭时，YAP/TAZ易位到细胞核，与转录增强相关域(TEAD)转录因子结合，诱导致癌靶基因的表达。 Hippo通路受到广泛的上游调控因子的调控，包括细胞-细胞接触、来自周围环境刺激、Wnt信号传导、GPCR-配体相互作用和各种细胞应激条件。 YAP/TAZ促进糖酵解和谷氨酸代谢 YAP/TAZ活性在许多类型的癌症中都是过度活跃。hHippo通路作为细胞生长的主调节因子，参与了多种代谢过程。YAP/TAZ活性通过直接和间接提高糖酵解酶活性来促进糖酵解。特别是，YAP/TAZ的活性增加了TEAD对GLUT3的表达，并通过FOXC2诱导了HK2的表达。YAP/TAZ还通过Hedgehog信号通路促进LncRNABCAR4的表达，上调HK2和PFKFB3。YAP/TAZ增强谷氨酰胺代谢，增加乳腺癌细胞中谷氨酰胺转运体SLC1A5和SLC7A5的表达。YAP/TAZ和TEAD通过表达氨基酸转运体上调谷氨酰胺和氨基酸代谢。YAP/TAZ诱导谷氨酰胺酶和转氨酶的表达，包括GOT1和PSAT1，它们产生NEAAs和TCA循环中间体。YAP/TAZ积累脂质，直接调节胆汁酸成分，从而增强癌细胞的转移潜能。 葡萄糖增强YAP/TAZ的活性 细胞周期进程和细胞增殖由营养物质浓度决定。葡萄糖代谢对YAP/TAZ活性有显著影响。高糖水平增加了HSP的葡萄糖通量，产生用于糖基化的UDP-GlcNAc。因此，丰富的葡萄糖诱导YAP O-GlcNAcylation，干扰LATS和βTrCP的相互作用，进而增强YAP/TAZ的活性。在胰腺癌和肝癌中，YAP被O-GlcNAcylation过度激活。 LATS2的糖基化通过干扰乳腺癌中LATS2和MOB1的相互作用来抑制其活性。相反，葡萄糖剥夺诱导的能量应激通过hippo依赖和非依赖的机制抑制YAP/TAZ活性。能量传感器AMPK随着ATP的减少而被激活。AMPK直接磷酸化YAP的丝氨酸61和丝氨酸94，从而阻断YAP-TEAD的相互作用。AMPK通过AMOTL1磷酸化和激活间接抑制YAP。 外部激素水平可以调节Hippo通路。脂质激素，如溶血磷脂酸和鞘氨醇-1-磷酸，通过GPCRs抑制该通路，肽激素胰高血糖素增加血糖水平，通过cAMP和PKA激活Hippo通路。 脂肪增强YAP/TAZ的活性 亚细胞脂质成分也可以调节Hippo通路激酶。SREBP是Hippo通路的上游调控因子。当SREBP被激活时，甲羟戊酸途径增强了RhoAGTPase的香叶酰化。RhoA是一个f-actin的细胞骨架调节因子，而f-actin是一个成熟的LATS激酶的上游因子。因此，癌细胞中脂肪酸代谢的增加会异常激活RhoA，并通过抑制LATS来增强YAP/TAZ的活性。 有趣的是，YAP/TAZ在血液系统恶性肿瘤中几乎不表达，而YAP的强制表达已被证明可以介导肿瘤抑制功能。 2. PI3K-AKT/mTOR Pathway 在正常细胞中，细胞的增殖和合成代谢受到外部生长因子（如胰岛素和激素）的微妙调节，PI3K-AKT-mTOR通路是其中一条重要通路。 PI3K/AKT信号通路调节代谢酶。在被胰岛素激活后，AKT通过磷酸化GSK3来抑制糖原合成途径。PI3K/AKT通过代谢酶的翻译后修饰（如磷酸化、糖基化）直接或间接上调糖酵解。例如，AKT磷酸化并激活AS160蛋白，从而增强了GLUT的膜运输。AKT通过抑制磷酸化直接抑制TXNIP，通过抑制内吞作用增加GLUT1/4的膜表达。 AKT还提高了糖酵解酶的效率。AKT通过增加HK2的线粒体整合来磷酸化并激活HK2。AKT使PFKFB磷酸化；这种变化催化果糖-6-磷酸到F-2,6-BP，从而提高糖酵解。AKT信号通路也通过HIF-1α转录因子促进糖酵解。HIF-1激活一些糖酵解组分，包括GLUT。HIF-1诱导LDH促进乳酸分泌和有氧糖酵解。 PI3K/AKT信号通路上调谷氨酰胺和脂肪酸代谢。AKT通过mTORC1增加Myc的翻译，并通过GSK3和FOXO3A抑制Myc的降解。由于MYC调节谷氨酰胺代谢，MYC的激活增加了细胞氮的供应。因此，AKT促进了核苷酸的合成。癌细胞需要从头脂质合成来维持和供应持续的无限细胞分裂所需的膜成分。AKT通过直接磷酸化脂质合成的第一个酶ACLY，影响脂质的新生生物合成过程，从而提高酶的效率。AKT通过ACLY调控增加各种癌症类型中的组蛋白乙酰化 AKT诱导的mTORC1激活增强了SREBP家族的翻译和切割加工。AKT介导的GSK3抑制进一步阻止了SREBP1的降解。因此，了解通过PI3K/AKT信号通路的代谢重编程将阐明PI3K抑制剂对癌症治疗的有效治疗替代方案。 3. Myc Pathway 转录因子c-Myc通过MAX调控基因表达，是癌细胞中最过度活跃的基因之一，位于生长相关信号通路(如EGFR、AKT和GPCRs)的交叉点。 Myc调节与葡萄糖、谷氨酰胺和脂肪酸代谢相关的基因的表达。Myc通过上调糖酵解和谷氨酰胺水解来增强癌细胞的代谢重。Myc诱导许多糖酵解酶(如GLUT、HK2和PFK)，它们催化糖酵解过程相应步骤。 MYC癌基因的激活驱动谷氨酰胺的优先代谢向TCA循环添补反应（Anaplerosis）和随后的氧化磷酸化。MYC癌基因表达的缺失增加了线粒体代谢对葡萄糖的依赖。 4. p53 Pathway P53是最著名的肿瘤抑制基因之一，它影响细胞过程，包括凋亡、细胞周期进程和代谢。p53在细胞应激条件下被激活，如DNA损伤和营养剥夺。根据应激源的类型和强度，它决定了是发生适应还是细胞死亡。p53在转录、翻译和翻译后水平上被调节。p53的稳定性受E3连接酶MDM2的调控。 AMPK磷酸化，乙酰化，从而在能量应激条件下稳定p53。通过上调MDM2来促进p53的降解，p53诱导一个负反馈回路来维持稳态。 p53调节代谢（Cancers 2021, 13, 133） P53减少有氧糖酵解，上调线粒体分解代谢过程，包括脂肪酸氧化(FAO)和OXPHOS；p53转录抑制GLUT1和GLUT4的表达，抑制葡萄糖摄取；抑制TCA循环；增加脂肪酸氧化；增加氧化磷酸化（OXPHOS），积累NADH和FADH2。 5. LKB1/AMPK Pathway AMPK是一种保守性良好的能量传感激酶。AMPK抑制合成代谢途径（脂肪酸合成、mTOR途径），促进分解代谢（糖酵解、Krebs循环、磷酸戊糖途径、脂肪酸氧化和自噬）的细胞过程。因此，AMPK的激活允许细胞承受细胞能量应激条件。 与其他代谢蛋白不同，AMPK的调控依赖于AMP和ADP的细胞浓度，但独立于其他代谢中间体。AMP/ATP比值的增加导致AMP相互作用，随后是AMPK的构象变化。在癌症的背景下，应激环境下的AMPK激活，包括缺氧和能量或营养剥夺，赋予了各种癌症的应激抵抗特性。  *红色箭头（激活上调）（Oxid Med Cell Longev . 2019 Oct 31;2019:8730816.） AMPK是一种致癌蛋白还是肿瘤抑制蛋白仍有待确定。在临床环境中，AMPK激活剂，包括2型糖尿病药物二甲双胍和AICAR，被用于抑制癌细胞增殖；然而，AMPK也通过促进原蛋白抗性、迁移和转移作为致癌蛋白。 ACC是AMPK的一个成熟的靶点。ACC在脂肪酸从头合成过程中，ACC介导乙酰辅酶A转化为丙二酰辅酶A。AMPK通过抑制ACC磷酸化来减少ATP的消耗。AMPK降低的脂肪酸合成通量降低了NADPH的消耗。为了满足细胞对脂质代谢物的需求，AMPK通过CD36和其他脂质转运体上调脂肪酸的摄取来维持脂质稳态。 蛋白质翻译是高度耗能的，并使用多种合成代谢途径，包括PPP和谷氨酰胺水解。AMPK通过抑制mTORC1和翻译机制，允许癌细胞适应恶劣的营养条件，如葡萄糖剥夺。 主要参考文献 Jordan H. Driskill et al，The Hippo Pathway in Liver Homeostasis and Pathophysiology. Annu Rev Pathol. 2021 January 24; 16: 299–322 Robert D. Leone and Jonathan D. Powell, Metabolism of immune cells in cancer, Nat Rev Cancer . 2020 Sep;20(9):516-531 Tambay, V.; Raymond, V.-A.; Bilodeau, M. MYC Rules: Leading Glutamine Metabolism toward a Distinct Cancer Cell Phenotype. Cancers 2021, 13, 4484 : Lahalle, A.; Lacroix, M.; De Blasio, C.; Cissé, M.Y.; Linares, L.K.; Le Cam, L. The p53 Pathway and Metabolism: The Tree That Hides the Forest. Cancers 2021, 13, 133 Francesco Ciccarese et al. LKB1/AMPK Pathway and Drug Response in Cancer: A Therapeutic Perspective,Oxid Med Cell Longev . 2019 Oct 31;2019:8730816.

感谢关注转发，欢迎学术交流请点击此处链接观看CyberSAR系统详细使用教程支链氨基酸转氨酶（BCATs）催化必需的支链氨基酸分解代谢为支链酮氨酸，在不同类型的癌症中起着关键作用。采用高通量筛选和基于X射线晶体结构指导的SAR研究，发现一类新颖的（三氟甲基）嘧啶二酮结构类BCAT1/2抑制剂。其中BAY-069具有良好的细胞活性和选择性，目前作为开源的探针分子使用。本文梳理BAY-069的设计策略与优化路线，可为类似项目结构优化提供宝贵经验。图1. BAY-069的优化过程支链氨基酸转氨酶（BCATs）利用α-酮戊二酸（α-KG）作为α-氨基的受体，催化必需的支链氨基酸（BCAAs）缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸分解代谢为支链酮氨酸。已知的两种同工酶分别是胞质BCAT1和线粒体BCAT2。BCAT2的表达广泛，而BCAT1表达仅限于特定的器官和组织，包括大脑和外周神经系统的神经元，此时BCAT1是合成神经递质谷氨酸的主要氮源。BCAT1在多种肿瘤中过表达，包括原发性胶质母细胞瘤、乳腺癌、急性白血病、非小细胞肺癌和前列腺癌等，并在肿瘤的发生和代谢中发挥作用。此外，BCAT1可能参与了化疗药物的耐药，参与胶质母细胞瘤局部免疫逃避。因此，BCAT1是肿瘤治疗的潜在靶点。目前已经报道了多个BCATs抑制剂。如图2所示，GSK/Strathclyde大学的吡唑并嘧啶酮衍生物A，具有合适的药代动力学特征，并在小鼠体内进行了概念验证。GSK/Northeastern大学的苯并咪唑化合物B和辉瑞公司报道的治疗神经退行性疾病的BCAT1抑制剂C。图2. 已报道的BCAT1/2抑制剂近日拜耳公司在JMC上报道了有关BCAT1/2拮抗剂的研究工作。研究人员采用高通量表型筛选方法，获得（三氟甲基）嘧啶二酮骨架的BCAT1/2抑制剂。基于化合物Hit 1的结合模式，采用基于蛋白−结构的设计，分别对2’的氧取代芳基、5’官能团、6位三氟甲基、3’氰基等开展SAR研究。优化过程中，不断平衡分子的BCAT1/2活性，PKa性质、渗透性和细胞活性。最后，将中间苯环替换为萘环，获得高亲和力、良好细胞通透性和较高的细胞活性的化合物BAY-069。设计和优化过程总结如下：Hit发现亮氨酸脱氢酶（LeuDH）催化烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）依赖的BCAAα-酮异己酸（α-KIC）还原为亮氨酸，其中NADH的消耗可通过荧光和发光读数测量（图3）。基于该实验，可以检测到具有细胞活性的BCAT1抑制剂。研究人员筛选了一个包含788,762个化合物的结构库，筛选到399个具有抑制BCAT1蛋白的化合物（＜20μM），其中BCAT1和BCAT2活性高度相关。71%的BCAT1活性分子含有酸性片段，说明BCAT1易与带负电荷的分子结合。但高电荷难以穿透细胞膜，所以需要平衡分子活性和细胞通透性。图3. 生化实验和Hit发现流程一类芳基取代嘧啶二酮结构分子（图4），包括化合物1，具有良好活性（BCAT1 IC50=554nM）和理化性质，如BEI值（17.87），LLE值（4.47），log D（1.9）和Caco2通透性（30.0nm/s，外排率为6.2）。化合物1和2具有相同的骨架结构，X晶体衍射数据显示两个分子均占据支链氨基酸的结合位点，但骨架结构的结合模式不同（图4B，C）。化合物1的甲基苯基部分伸入疏水部分，与3PP（促进BCAT1结晶的添加剂）的苯基重叠。而化合物2结构发生翻转，三氟甲基部分进入疏水口袋。两个化合物与Val175的羰基氧原子形成的氢键是唯一的共同特征。图4. （A）化合物1和2的化学结构；（B，C）化合物1和3PP与BCAT1的X晶体结构叠合；（D）化合物2与BCAT1的X晶体结构；（E）化合物1和2的结构叠合SAR研究化合物1的晶体结构显示，邻位甲基伸向Phe49和Leu173之间的口袋，可能是活性的关键，因此主要考察在邻位进行单取代或二取代。邻二甲基（3）和邻氯（8）是最好的取代基。尤其是邻氯取代，活性明显提高，这可能是氯原子距离Tyr90的OH和Arg163的NH较近的原因。化合物1的晶体结构显示，5‘位置可容纳体积较大的取代基（表2）。但结果显示：（1）5‘位置耐受体积较小的官能团，如甲基（10）、甲氧基（12）或卤素（11、15、17），BCAT1的活性相较1提高了1-2倍；（2）三氟甲氧基（16）和丙氧基（14）活性降低，可能是由于体积较大的官能团会诱导产生轴手性；（3）化合物12和15具有良好的体外药代性质（大鼠微粒体Fmax分别为95%和88%）。嘧啶二酮的1-NH具有明显的酸性，影响化合物的活性和渗透性，因此，对化合物12的临近1-NH的6位取代基进行修饰（表3），尝试调节1-NH的pKa值。（1）不同的吸电子取代基（12、18−24、27和28）或供电子取代基（25和26）对活性、Caco-2细胞通透性和pKa值的影响没有发现相关性；（2）酰胺取代基（28）化合物具有轻度酸性，说明渗透性与化合物pKa值无关；（3）活性最强的化合物24（BCAT1 IC50=60nM，BEI 14.75），但渗透率较低（PappA−B=0.5nm/s）和较高的流出率（34）；（4）化合物26虽然没有外排，但对BCAT1活性较差；（5）化合物21活性与12类似，但pKa值为7.0，酸性明显低于12；（5）酸性最强的化合物23，活性没有改善。化合物1的三氟甲基伸向较小的结构口袋，但苯磺酰（化合物24）或α-二氟苯基（化合物21）等体积较大的官能团却显示出良好的活性。24和21的的X射线晶体结构与化合物1不同（图4）。但以化合物21的结合模式为依据开展进一步结构优化，似乎不可行，因为21的芳基醚部分没有与蛋白产生紧密的相互作用，也没有提供伸向Phe49两侧的位置。图4. （A）化合物24与BCAT1的X晶体结构；（B）化合物21与BCAT1的X晶体结构在化合物1的X射线共晶中，1’位氰基没有与BCAT1形成极性相互作用，但填充了Lys99、Phe49和Ala334侧链之间的一个小口袋。接下来，研究人员针对化合物1的1’基团进行修饰（表4）。（1）1‘位为吸电子基团降低pKa值，去除氰基导致pKa值显著升高（29、30和31），但活性大大降低；（2）甲基衍生物32的BCAT1活性为2.3μM；（3）氯衍生物33具有良好的活性（BCAT1 IC50=438nM）和渗透性；（4）甲氧基（化合物34）取代氰基不耐受。化合物1结构中的苯环与Phe49形成π−π相互作用。因此，采用萘环替换苯环（表5）。（1）氰基衍生物35的BCAT1的活性为70nM，分离获得相应的阻转异构体35a和35b；（2）氯取代衍生物36活性略低，但其阻转异构体36a的BCAT1活性为31nM，BEI为19.28，且无外排；（3）α，α-二氟苯取代衍生物37也具有良好的活性。将GSK公司的苯并咪唑类BCAT2抑制剂（B）和化合物12的晶体结构进行叠合（图5），显示芳香环部分构象相似，因此，设计了咪唑吡啶（化合物38）代替苯环。结果显示，BCAT1活性为850nM。化合物38的复合物晶体结构显示，嘧啶二酮的结合模式再次翻转。图5. （A）化合物38的优化策略；（B）化合物B与BCAT2的复合物晶体和化合物12与BCAT1的晶体结构叠合；（C）化合物38与BCAT1的X晶体结构细胞水平活性研究（1）在不同肿瘤细胞系（U-87MG和MDA-MB-231）培养基中测量亮氨酸的含量，用以评价小分子的细胞水平活性。结果如表6所示，化合物的细胞活性明显弱于蛋白活性。可能是由于对细胞的渗透性较低的原因。2%血清白蛋白存在，导致IC50至微摩尔水平。因此，高血浆蛋白结合可能导致36a缺乏有效性。由于化合物36a（BAY-069）具有最好的细胞活性，因此被选为体外候选探针。（2）测试化合物36a（BAY-069）和化合物A对U-87MG（高BCAT1表达）和MDA-MB-231（BCAT2高表达）细胞增殖的影响。结果显示它们未能抑制细胞增殖。此外，在BCAT1和/或BCAT2高表达SEM、CAL-51、HCC-33和NCI-H2110细胞中，也未表显出抗增殖作用。然而，多项研究证明，与体内研究中获得的抗肿瘤效果相比，BCAT1在体外（如增殖、谷氨酸水平和菌落数）敲低的效果很弱。这可能是化合物活性与肿瘤环境和其他宿主因素具有依赖性。体内外药代动力学性质（1）化合物36a（BAY-069）在体外人肝微粒体代谢稳定性较高（Fmax=92%），在大鼠肝细胞代谢稳定性中等（Fmax=56%）（表7）；（2）Caco-2渗透率高且没有外排迹象，可能具有良好的口腔吸收特性；（3）BAY-069在大鼠体内的药代动力学研究显示，较低的血清除率（CLblood=0.64L/h/Kg）、中等的体积分布（Vss=0.25L/Kg）和较高的口服生物利用度（F=89%）。BAY-069的选择性（1）BAY-069在天冬氨酸转氨酶（GOT1和GOT2）的酶活实验中IC50>50μM；（2）对包含30个蛋白酶和30个激酶的实验中，大部分IC50>10μM，但对一个蛋白酶IC50=6μM，对一个激酶IC50=2μM；（3）在Eurofins LeadProfilingScreen（包含77个潜在靶点）活性筛选中，10μM的BAY-069，没有发现抑制或激动效率超过45%的情况；（4）为了识别（三氟甲基）嘧啶二酮潜在附加靶点，采用化合物35的共晶结构，对CavBase方法对PDB库进行搜寻，未找到类似的结合口袋。采用高通量筛选，获得（三氟甲基）嘧啶二酮骨架的BCAT1/2抑制剂。通过SAR分析和X射线晶体研究表明，发现嘧啶二酮的活性在于骨架结构的酸性。基于化合物Hit 1的结合模式，采用基于蛋白−结构的设计，在多个位点进行优化，最终获得高亲和力、良好细胞通透性和较高的细胞活性的化合物BAY-069。其在体内的整体体外药代动力学特性和选择性表明，BAY-069适用于体内实验。BAY-069已被提供给SGC联盟，供更广泛的科学研究使用。文章来源doi.org/10.1021/acs.jmedchem.2c00441请点击此处链接观看CyberSAR系统详细使用教程药渡Cyber平台整合药物设计思想，挖掘了文献及专利报道的活性结构，通过Cyber平台可以方便快速获得研发人员兴趣靶向结构，以供开拓思路，就BCAT1抑制剂举例如下：1.进入CyberSAR首页，在靶点下拉项中，输入“BCAT1”，选中关联“BCAT1 (Homo sapiens)”搜索BCAT1相关靶点信息。2.在靶点界面选中“化学空间”选项标签下级联“聚类空间”选项卡，可以将CyberSAR平台收录的文献和专利具有关于BCAT1相关实验测试活性的分子以“分子母核聚类“的形式展示。3.在靶点界面选中“试验数据”选项，可以看到BCAT1靶点分子的活性数据。4.单击分子结构，可见感兴趣分子进一步扩展信息。5.单击“骨架相似“选项卡或者”预测靶点“选项卡，还可以进一步提供结构的衍生类型，可下载进行分子学习。登录方式CyberSAR在电脑浏览器端登录网址：https://data.pharmacodia.com/cybersar/，欢迎猛烈试用。请点击此处链接观看CyberSAR系统详细使用教程如需进一步沟通，请扫码添加微信联系药渡赵博士或药渡CyberSAR沟通群。

该研究发现了细胞质中的GOT1、CAD及UMPS结合一起，并通过线粒体外膜蛋白VDAC3和锚定在内膜的DHODH形成嘧啶小体（Pyrimidinosome）。AMPK是嘧啶小体调控的重要因子，应激条件 在增殖细胞中，嘌呤核苷酸和嘧啶核苷酸可以通过回收途径回收或从头途径合成。所有催化嘌呤从头生物合成的六种酶都可以形成一种被称为“嘌呤小体”的多酶复合物来调节嘌呤通量。 嘧啶的从头合成由3种代谢酶催化的6种化学反应组成，分别为位于胞质的CAD、锚定于线粒体内膜的二氢乳清酸脱氢酶（DHODH）以及胞质的尿苷5'-三磷酸合成酶（UMPS）。前三个步骤由多功能蛋白CAD催化合成二氢乳清酸（DHOA）。DHODH介导DHOA转化为乳清酸（OA），最后通过双功能酶UMPS转化为尿苷单磷酸（UMP）。作为CAD的直接前体，人体血液中的天冬氨酸水平很低，它主要由胞质谷氨酸草酰乙酸转氨酶1（GOT1）和线粒体的GOT2主动合成。因为催化嘧啶合成的酶并不是都在细胞质中，即使已有证据表明嘧啶合成中的单个代谢酶能发生聚集，但是否存在嘧啶小体以及其调控机制和生理功能尚不清楚。 2023年6月8日，首都医科大学附属北京佑安医院/北京肝病研究所李兵辉课题组在 Nature Cell Biology 期刊发表了题为：De novo pyrimidine biosynthetic complexes support cancer cell proliferation and ferroptosis defense 的研究论文。 该研究发现，参与嘧啶从头合成的代谢酶会形成一个多酶复合体调控嘧啶合成通量，称为“嘧啶小体”，同时发现嘧啶小体可由能量应激关键蛋白AMPK调控，在肿瘤细胞增殖和铁死亡抵抗中发挥的重要作用。 该研究揭示了嘧啶小体在调控嘧啶代谢流和铁死亡抵抗中的作用，并为针对嘧啶小体的肿瘤治疗策略开发提供理论依据。 首先，研究团队在HeLa细胞中分别敲低了GOT1和GOT2，并利用代谢质谱分析观察嘧啶的合成情况，发现尽管两个酶之间存在互补关系，但相比于GOT2，敲低GOT1的细胞中嘧啶合成通路中被标记的代谢物水平明显下降，说明GOT1在将谷氨酰胺转化到天冬氨酸和嘧啶中起到更关键的作用。之后，研究团队在细胞中补充标记的天冬氨酸并示踪，发现细胞优先利用新合成的天冬氨酸参与到嘧啶从头合成之中。 那么发生这种现象的原因为何呢？研究团队猜想GOT1是否与CAD存在紧密联系。通过实验发现GOT1不仅与CAD存在相互作用，同时也能与DHODH和UMPS结合。说明，参与嘧啶合成的酶作为一个多酶复合体发挥功能。 DHODH是存在与线粒体中的蛋白，又是如何与其他位于胞质中的组分相互作用呢？研究团队发现阴离子DHOA作为CAD的产物以及DHODH的底物，穿梭于线粒体与细胞质，而线粒体膜上存在阴离子通道如VDAC家族。通过实验发现VDAC3与嘧啶合成途径中的代谢酶都存在相互作用。同时，研究团队分离出完整的线粒体，检测到CAD与UMPS存在于线粒体外膜上。此外，VDAC3敲除明显降低了CAD与DHODH和UMPS的相互作用。因此，VDAC3作为一个平台，通过线粒体外膜整合嘧啶生物合成复合体，为DHOA和OA提供内部通路。至此，研究团队发现用于嘧啶合成的代谢酶CAD、UMPS、VDAC3、DHODH和GOT1形成了一个复合体，命名为“嘧啶小体”（Pyrimidinosome）。 研究团队在代谢组学结果中发现，乏氧条件下增强了细胞的DHOA和OA，而降低了UMP的生成，同时乏氧促进了嘧啶小体各组分间的结合。那么是否存在嘧啶小体的调控呢？作者从CAD和DHODH的蛋白质谱结果中鉴定出AMPKα1，并通过Co-IP验证了相互作用。结果显示，AMPKα1与嘧啶小体的所有组分之间的相互作用在乏氧时被减弱，AMPKα1/2-敲除明显增强了组分间的相互作用。说明AMPK被激活后与嘧啶小体结合减弱，嘧啶小体本身结合增强，因此使得嘧啶核苷酸的前体合成是增强的。 AMPK作为激酶能够使底物发生磷酸化，进而调控底物活性。作者发现，UMPS可作为AMPK的底物被磷酸化进而抑制其代谢活性。通过质谱鉴定出UMPS的磷酸化位点为S214，同时制备了位点特异性磷酸化抗体。乏氧、AMPK激活剂处理促进了UMPS S214的磷酸化，而在AMPK敲除细胞中完全消除。以上结果表明AMPK通过失活UMPS将嘧啶代谢通量阻止于OA的生成，说明DHODH介导的代谢转换可能在拮抗AMPK相关应激中发挥了关键作用。 DHODH将电子传递到辅酶Q（CoQ），并保持其还原形式（CoQH2），以此抵抗铁死亡。当缺失CAD、DHODH或VDAC3时，铁死亡抑制剂ferrostatin-1可以部分营救细胞并联合尿苷挽救细胞死亡，说明嘧啶小体除了在嘧啶合成中发挥作用，还参与到抵抗铁死亡之中。研究团队通过联合使用AMPK的激活剂和DHODH的抑制剂，以及敲低嘧啶小体的组分进行了铁死亡相关的研究，在细胞生长以及裸鼠成瘤实验中均发现嘧啶小体的存在的确能够使细胞抵抗铁死亡，尤其是面临诱导AMPK激活的压力情况下。最后，研究团队发现在AMPK敲除或低表达时，肿瘤细胞中的嘧啶核苷酸代谢更加旺盛，因此这类细胞更加依赖于嘧啶小体介导的嘧啶合成。 综上所述，该研究发现了细胞质中的GOT1、CAD及UMPS结合一起，并通过线粒体外膜蛋白VDAC3和锚定在内膜的DHODH形成嘧啶小体（Pyrimidinosome）。AMPK是嘧啶小体调控的重要因子，应激条件下AMPK被激活后与嘧啶小体结合减弱并离开，从而提高各组分的结合，促进嘧啶核苷酸前体的合成，但AMPK同时抑制UMPS的活性，导致终产物UMP下降。这样能确保通过DHODH生成CoQH2抑制应激条件下的铁死亡。因此，AMPK激活剂能提高肿瘤细胞对DHODH抑制剂的敏感性。同时，如果细胞表达低水平的AMPK，则使细胞更依赖嘧啶从头合成，这类细胞对DHODH抑制更敏感。该项研究揭示了嘧啶小体在调控嘧啶代谢流和铁死亡抵抗中的作用，并为针对嘧啶小体的肿瘤治疗策略开发提供理论依据。 值得一提的是，Nature Cell Biology 期刊同期配发评论文章：The pyrimidinosome is cancer's Achilles' heel（嘧啶小体是癌症的阿喀琉斯之踵），认为该发现毫无疑问是ground-breaking的进展，有望为肿瘤的靶向治疗带来革命。 首都医科大学附属佑安医院/北京肝病研究所李兵辉教授为论文通讯作者，首都医科大学基础医学院杨传真老师，博士研究生赵一亮、博士生王燎为论文共同第一作者。首都医科大学研究生郭子豪、马凌迪、吴颖、李雪雪，牛静、褚巧云、付艳霞老师，首都医科大学附属佑安医院/北京肝病研究所博士后阳荣辉也为本研究做出了重要贡献。