BNIP3L

引言当细胞受到应激时，来自产生能量的线粒体的DNA如果不被清除，就会泄漏出来，引发炎症免疫反应。细胞采用一种称为自噬的质量控制系统来特异性地降解受损成分。2024年5月23日，广州医科大学冯杜团队在Nature Cell Biology 在线发表题为“TFAM is an autophagy receptor that limits  inflammation by binding to cytoplasmic mitochondrial DNA”的研究论文，该研究表明TFAM是一种自噬受体，通过结合细胞质线粒体DNA来限制炎症。该研究发现线粒体转录因子A (TFAM) -一种结合线粒体DNA (mtDNA)的蛋白质-通过自噬酶体途径(称之为核吞噬)与自噬蛋白LC3相互作用，帮助消除泄漏的mtDNA。TFAM包含一个称为LC3相互作用区(LIR)基序的分子邮政编码，使这种结合成为可能。虽然突变TFAM的LIR基序不会影响其正常的线粒体功能，但更多的mtDNA积聚在细胞质中，激活炎症信号通路。因此，TFAM介导泄漏mtDNA的自噬清除以限制炎症。确定这一机制有助于了解细胞如何利用自噬机制选择性地靶向和降解炎症mtDNA。这些发现可以为涉及线粒体损伤和炎症的疾病的研究提供信息。线粒体是通过氧化磷酸化产生ATP以支持细胞内稳态的重要细胞器。它们还参与各种生理或病理过程，如细胞死亡、炎症和活性氧(ROS)的生成。线粒体含有自己的DNA(即线粒体DNA (mtDNA))，这与核DNA不同。在哺乳动物中，mtDNA是一种环状双链DNA分子，大小约为16.5千碱基，编码氧化磷酸化复合物的基本亚基。线粒体DNA可以浓缩成一种叫做线粒体核苷的蛋白质-DNA复合物。线粒体转录因子A (Mitochondrial transcription factor A，TFAM)是类核的主要组成部分，在线粒体DNA的转录、复制和包装中起着关键作用。TFAM结合并包裹mtDNA的高迁移基团(HMG)盒，然后作为HMG蛋白执行其转录功能。在各种刺激下，mtDNA可以从线粒体释放到细胞质中。这是由于线粒体通透性破坏、电压依赖性阴离子通道(VDAC)低聚化或B细胞淋巴瘤2 (BCL2)拮抗剂/杀手和BCL2相关的X大孔的形成。之前报道过线粒体内膜蛋白禁止蛋白1调节炎症应激期间的通透性和mtDNA外排。此外，胞质内mtDNA的释放—被认为是一种损伤相关的分子模式—促进了DNA感知炎症途径的激活，包括干扰素基因的环GMP-AMP合成酶刺激物。(cGAS-STING)、Toll样受体9、NOD样受体蛋白3炎性小体和黑色素瘤2炎性小体中缺失的。自噬是哺乳动物细胞中物质周转和体内平衡的保守过程。细胞质mtDNA的去除是必要的，因为它具有促炎的性质。与受组蛋白保护的核DNA不同，mtDNA的类核结构缺乏组蛋白，使其容易受到压力或损伤。已经确定了一些线粒体自噬受体，包括含有FUN14结构域1 (FUNDC1)、BCL2相互作用蛋白3 (BNIP3)、BCL2相互作用蛋白3样(BNIP3L/NIX)，禁止蛋白2 (PHB2)和含有ATP酶家族AAA结构域3B (ATAD3B)。TFAM介导的核吞噬减轻cGAS-STING炎症通路的工作模型（Credit: Nature Cell Biology）虽然有研究调查了线粒体内mtDNA的降解，但分泌到细胞质中的mtDNA的去除机制尚不清楚。有证据表明，其他途径也可能清除mtDNA，包括那些涉及3 ' DNA外切酶3 '端修复外切酶1 (TREX1)和线粒体衍生囊泡((MDVs)的途径。然而，选择性胞质mtDNA降解的机制仍未被探索。该研究鉴定了主要的mtDNA结合蛋白TFAM作为类核清除的自噬受体。研究证明，在氧化或炎症应激期间，TFAM与微管相关蛋白1轻链3B (LC3B)相互作用，通过cGAS-STING途径减轻mtDNA诱导的炎症。因此，该研究研究为解释TFAM在这些疾病中的保护作用提供了一个潜在的途径，并表明TFAM可能是抗炎症治疗的潜在靶点。这表明mtDNA质量控制对了解mtDNA相关人类疾病的重要性。原文链接https://www-nature-com.libproxy1.nus.edu.sg/articles/s41556-024-01419-6责编|探索君排版|探索君文章来源|“iNature”End往期精选围观一文读透细胞死亡(Cell Death) | 24年Cell重磅综述（长文收藏版）热文Nature | 破除传统：为何我们需要重新思考肿瘤的命名方式热文Nature | 2024年值得关注的七项技术热文Nature | 自身免疫性疾病能被治愈吗？科学家们终于看到了希望热文CRISPR技术进化史 | 24年Cell综述

最近，Roche的BTK抑制剂因肝损伤叫停了部分临床研究，其他一些经典药物，如PD-1抗体、CTLA-4抗体、对乙酰氨基酚等也存在肝毒性。通过这些经典药物，了解药物肝毒性的免疫学机制。BTK抑制剂肝损伤目前多款BTK抑制剂（例如默克的evobrutinib，赛诺菲的Tolebrutinib，罗氏的Fenebrutinib,强生ibrutinib等），均在临床及临床实验中报告肝毒性。BMC Gastroenterol (2021)BTK抑制剂诱导的肝毒性的发病机制尚不清楚。已经提出了几种机制，包括遗传变异引起的免疫机制、氧化损伤和线粒体功能障碍导致的直接肝毒性。BTK抑制剂依赖细胞色素P450，但是会产生生物活化产物，被认为是酪氨酸激酶抑制剂诱导的肝毒性的起始事件。免疫治疗肝毒性肝毒性是PD-1抗体、CTLA-4抗体主要的irAEs之一，尤其是二者联用，发生率会激增（如下图）。JHEP Rep. 2020免疫检查点抑制剂的副作用，通常与不成比例和不受调节的免疫反应有关，如自身免疫性疾病。这反过来又会导致器官损伤，可能包括直接和间接的免疫相关细胞毒性作用。PDL-1 是一种在多种组织和肿瘤中表达的跨膜蛋白。它的作用是保护细胞免受CD8+细胞毒性T淋巴细胞的攻击。PDL-1 与存在于T 细胞、B 细胞和髓系细胞中的 PD-1 结合并调节其抑制作用。因此，阻断 PDL-1/PD-1 通路会诱导细胞毒性活性并赋予对癌细胞的免疫反应，但也通过自身免疫反应造成组织损伤。此外，ICI 还可以改变CD8+ T 细胞的性质，使它们更容易合成细胞毒性物质，如干扰素 γ （IFN-γ）、颗粒酶和颗粒溶解素等。同样， CTLA-4 是一种位于调节性 T 细胞和活化 T 细胞表面的受体。在与抗原呈递细胞表面的CD80或CD86结合后，它通过抑制信号充当关闭开关，导致T细胞功能减弱，因此抑制这种受体允许T细胞高反应性。活化和不受调节的T细胞引起的细胞毒性损伤被认为是免疫检查点抑制剂肝损伤的主要机制。JHEP Rep. 2020对乙酰氨基酚肝毒性对乙酰氨基酚（Acetaminophen ，APAP) ）是最常用的感冒药之一，因为超过剂量服用会造成肝毒性，甚至急性肝功能衰竭。APAP 首先被细胞色素 P450 酶（主要通过 Cyp2E1）代谢，以产生毒性代谢物 NAPQI，其消耗肝脏 GSH 并与细胞和线粒体蛋白结合形成 APAP-加合物 （APAP-AD），导致线粒体氧化应激。氧化应激和线粒体蛋白加合物的增加引发线粒体损伤。受损的线粒体可导致细胞死亡、炎症和随后的肝损伤。p62 是一种自噬受体蛋白，被募集到 APAP-AD，促进 APAP-AD 转变为不溶性形式，被自噬体识别和隔离，并最终被自噬溶酶体去除。受损的线粒体可以通过 PINK1-Parkin 介导的选择性线粒体自噬去除。受损的线粒体可以稳定线粒体PINK1，该线粒体 PINK1 将 Parkin 募集到线粒体以触发线粒体蛋白的泛素化。线粒体泛素化-p62-LC3 复合物，通过线粒体自噬促进受损线粒体的识别和去除。除了 PINK1/Parkin 通路外，其他几种线粒体外膜蛋白（FUNDC1、Bnip3 和 Nix）可能通过其 LC3 相互作用区域直接与 LC3 相互作用，介导不依赖 PINK1- Parkin 的线粒体自噬。自噬可以通过去除受损的线粒体和线粒体DNA 来抑制炎症和炎症小体活化。Torin 1 或雷帕霉素可以靶向 ULK1 复合物以诱导自噬，通过去除 APAP 加合物和受损的线粒体来防止 APAP 诱导的肝损伤。相反，3-MA 抑制 VPS34 复合物以抑制上游自噬体的形成，而亮抑酶肽或 CQ 损害自体溶酶体/溶酶体功能，分别导致 APAP 诱导的坏死和肝损伤加重。Liver Int. 2018 参考资料Roche/GenentechFenebrutinib: https://www.gene.com/media/statements/ps_113023Atallah et al.Zanubrutinib-induced liver injury: a case report and literature review，BMC Gastroenterol (2021) 21:244 https://doi-org.libproxy1.nus.edu.sg/10.1186/s12876-021-01825-2Eleonora De Martin et al, Liver toxicity as a limiting factor to the increasing use of immune checkpoint inhibitors，JHEP Rep. 2020 Aug 11;2(6):100170. doi: 10.1016/j.jhepr.2020.100170. Da Cunha T. et al.Immunotherapy-induced Hepatotoxicity: A Review,Journal of Clinical and Translational Hepatology 2022，DOI: 10.14218/JCTH.2022.00105Chao et al.Role and Mechanisms of Autophagy in Acetaminophen-induced Liver Injury,Liver Int. 2018 August ; 38(8): 1363–1374. doi:10.1111/liv.13866.

线粒体自噬(mitophagy)是重要的线粒体质量及数量调控机制, 与发育、癌症、衰老和神经退行性病变等生理病理状况高度相关。现已知两类哺乳动物mitophagy通路：由PINK1-Parkin介导的泛素依赖途径，以及由BNIP3, NIX和FUNDC1等介导的受体依赖途径。然而，人们对mitophagy调控机制及其生理病理意义仍有待探索。突出的表现是，缺失已知mitophagy通路的小鼠(如Pink1-/-、Parkin-/-、Bnip3-/-等)表型微弱，与普遍认知的mitophagy重要性有明显差距。2023年12月26日，北京生命科学研究所/清华大学生物医学交叉研究院蒋辉实验室在Molecular Cell在线发表了题为"A mitophagy sensor PPTC7 controls BNIP3 and NIX degradation to regulate mitochondrial mass"的论文。该论文发现了一个感知并抑制mitophagy的因子PPTC7，阐明了PPTC7调控mitophagy的分子机制并揭示其对线粒体数量和代谢稳态的调控作用。作为监控mitophagy水平的关键因子，PPTC7感知mitophagy受体BNIP3和NIX的蛋白水平，进而起始BNIP3/NIX-PPTC7-SCFFBXL4完整复合物的组装，促进SCFFBXL4泛素化和降解BNIP3和NIX，从而抑制mitophagy。该通路对维持细胞线粒体数量、代谢平衡、和个体存活至关重要。01FBXL4介导的mitophagy调控与退行性疾病MTDPS13蒋辉实验室长期从事线粒体蛋白稳态调控机制研究，之前报道了一个线粒体外膜复合物UBXD8-VCP介导BNIP3降解，从而抑制mitophagy(链接：EMBO Reports | 蒋辉实验室揭示UBXD8调控凋亡和线粒体自噬的分子机制)。为进一步发掘mitophagy调控机制，研究生曹钰通过靶向线粒体的遗传筛选发现多个mitophagy抑制因子，其中包括FBXL4和PPTC7(链接：EMBO Journal | 蒋辉实验室揭示线粒体自噬调控及线粒体疾病新机制)。已知FBXL4突变导致致死性退行性疾病线粒体DNA耗竭综合征13(MTDPS13)1,2，但其机理未明。作者发现FBXL4定位于线粒体外膜，与Skp1和Cullin1组成SCFFBXL4 E3泛素连接酶。SCFFBXL4通过泛素化降解BNIP3和NIX来抑制mitophagy。而病人来源的FBXL4突变抑制SCFFBXL4组装，导致BNIP3和NIX蛋白积累和mitophagy过度激活。FBXL4突变患者表现出mtDNA耗竭、线粒体数量减少、酸中毒、神经和肌肉退行性病变等严重症状。与FBXL4突变病人类似，Fbxl4-/-小鼠表现出BNIP3和NIX蛋白积累、mitophagy失控、线粒体数量减少、代谢紊乱和围产期死亡等严重表型。更重要的是，在Fbxl4-/-小鼠中敲除Bnip3或Nix可以挽救线粒体数量、恢复代谢平衡并挽救小鼠寿命。这些结果表明过度mitophagy导致的线粒体数量减少是MTDPS13的致病原因并为治疗提供了思路。02PPTC7调控FBXL4介导的BNIP3和NIX降解鉴于BNIP3和NIX强大且危险的线粒体清除能力，细胞必须牢牢控制其水平，但细胞监控并调节BNIP3和NIX降解的分子机制仍不清楚。研究生孙雨秋研究另一个筛选发现的mitophagy抑制因子PPTC7。前人研究表明PPTC7是定位于线粒体基质的磷酸酶。但令人诧异的是，与敲除FBXL4类似，敲除PPTC7同样导致BNIP3和NIX的积累和过度mitophagy；Pptc7-/-小鼠表现出mitophagy失控、线粒体数量减少和围产期死亡的表型，且该表型可以被Nix敲除所挽救(图1)。此外，PPTC7过表达可促进内源BNIP3和NIX被FBXL4降解，而FBXL4过表达则没有效果，提示PPTC7作为上游限速因子调控FBXL4介导的BNIP3和NIX降解。但是，线粒体基质蛋白PPTC7如何调控线粒体外膜上的蛋白降解？图1PPTC7缺失过度激活BNIP3和NIX依赖的mitophagy，造成线粒体数量减少和小鼠死亡。A,Pptc7 -KO升高小鼠肝脏中mitophagy受体BNIP3和NIX的蛋白水平(红框)并导致其他线粒体蛋白减少(蓝框)。B,小鼠生存曲线。03PPTC7前体通过与BNIP3/NIX直接互作，滞留在线粒体外膜通常情况下，线粒体基质蛋白的前体形式(precursor)在N端定位序列(targeting sequence)的引导下进入线粒体，并在线粒体基质切除定位序列，完成成熟过程。作者发现在野生型细胞里，PPTC7以成熟形式(mature form,切除了定位序列)存在于线粒体基质，而在FBXL4-KO细胞里，PPTC7同时具有定位于线粒体基质的成熟形式和定位于线粒体外膜的前体形式。进一步分析表明，FBXL4-KO细胞中积累的BNIP3和NIX导致PPTC7前体出现在线粒体外膜;在野生型细胞中直接过表达BNIP3或NIX也可诱导PPTC7前体出现在线粒体外膜定位。通过体外重组蛋白实验，作者发现BNIP3和NIX与PPTC7直接互作，并使用交联质谱分析了NIX-PPTC7的互作区域。在截去NIX与PPTC7的直接互作区域后，NIX无法诱导PPTC7前体的外膜定位，表明BNIP3和NIX通过与PPTC7的直接互作，将PPTC7前体定位于线粒体外膜。04弱化的PPTC7定位序列帮助PPTC7在线粒体外膜滞留有意思的是，作者发现与经典线粒体基质定位序列相比，PPTC7的定位序列长度短且引导能力差，推测该特征削弱了PPTC7前体进入线粒体基质的能力，有利于PPTC7前体被外膜BNIP3/NIX滞留。因此，研究者将PPTC7的定位序列替换成经典序列，发现它使PPTC7全部进入线粒体基质，无法被滞留在外膜，失去调节BNIP3和NIX降解的能力。05外膜PPTC7起始组装BNIP3/NIX-PPTC7-SCFFBXL4复合物那么外膜PPTC7如何促进SCFFBXL4介导的BNIP3和NIX降解呢？作者发现除与BNIP3/NIX直接互作之外，PPTC7还与SCFFBXL4复合物中的Cullin1直接互作。作者表达纯化了NIX，PPTC7，FBXL4,Cullin1-Rbx1和Skp1的重组蛋白，发现只有在所有蛋白都存在的情况下，这些蛋白才能组装成完整的NIX-PPTC7-SCFFBXL4复合物，缺少NIX，PPTC7，FBXL4任何一个组分都导致复合物散架。以上结果提供了一个mitophagy的负反馈调控模型:积累在线粒体外膜的mitophagy受体BNIP3和NIX与PPTC7前体直接互作，将其滞留在外膜，起始BNIP3/NIX-PPTC7-SCFFBXL4复合物的组装，从而泛素化和降解BNIP3和NIX，防止mitophagy过度激活(图2)。06禁食情况下，肝脏诱导PPTC7来抑制mitophagy和维持代谢稳态一个重要的问题是在负反馈调控mitophagy之外，PPTC7是否还会响应生理信号？鉴于PPTC7过表达能促进BNIP3和NIX降解，作者重点研究了生理信号对PPTC7表达的调节，发现禁食不改变骨骼肌PPTC7的表达，但在肝脏强烈诱导PPTC7。与之相对应，禁食强烈诱导骨骼肌mitophagy，但不改变肝脏mitophagy水平，作者推测肝脏mitophagy受到PPTC7上调的压制。因此，作者在小鼠肝脏敲除PPTC7，发现禁食导致缺失PPTC7的肝脏丢失大量线粒体。禁食情况下，肝脏负有重要使命-通过糖异生(gluconeogenesis)维持血糖水平。而糖异生需要线粒体提供两个重要支持：ATP和丙酮酸羧化酶(pyruvate carboxylase)。作者发现，敲除肝脏PPTC7导致禁食状态下肝脏ATP缺乏，糖异生受阻，造成严重的低血糖。因此，禁食情况下，肝脏特异上调PPTC7以压制mitophagy，从而维持线粒体数量和代谢稳态(图2)。图2 PPTC7调控mitophagy的工作模型。1. mitophagy的负反馈稳态调控。正常情况下，PPTC7表达后进入线粒体基质行使正常功能。当mitophagy受体BNIP3和NIX积累时，BNIP3/NIX将PPTC7前体滞留于外膜，起始BNIP3/NIX-PPTC7-SCFFBXL4复合物组装，从而降解BNIP3和NIX，防止mitophagy过度激活和线粒体丢失。2. 在禁食情况下，肝脏上调PPTC7以压制mitophagy，从而维持肝脏能量供应和糖异生通路活力，维持血糖水平。综上，该工作报道了一个感知和抑制mitophagy的PPTC7-SCFFBXL4通路。PPTC7作为关键调控因子，能够整合稳态维持和生理信号来调控mitophagy水平，以此维持线粒体数量和细胞代谢稳态。该通路的发现显著增进了我们对mitophagy与线粒体数量控制(mitochondrial mass control)的理解。禁食情况下，肝脏和骨骼肌对mitophagy的差异化调节及其功能研究也丰富了我们对生理情况下组织特异性mitophagy调控的认知。清华大学生物医学交叉研究院博士生孙雨秋为论文第一作者，蒋辉博士为通讯作者。该论文其他作者包括蒋辉课题组的曹钰和万华云，董梦秋实验室的阿达莱提买买提明和董梦秋博士，代谢组学中心的马燕博士和曹杨，蛋白质组中心的陈涉博士和李琳，遗传筛选中心的李祺博士和吴重阳，刘清华实验室的王濛。该研究由科技部、北京市政府和清华大学共同资助，在北京生命科学研究所完成。论文链接：https://www-cell-com.libproxy1.nus.edu.sg/molecular-cell/fulltext/S1097-2765(23)01014-6本文仅用于学术分享，转载请注明出处。若有侵权，请联系微信：bioonSir 删除或修改！