TPRX1

2012年，日本学者山中伸弥因发明人工诱导多能干细胞（Induced pluripotent stem cell，iPSC）技术获得诺贝尔生理学奖。这种由成体细胞经基因转录因子转染、小分子化合物诱导等方法获得的多能干细胞类具有类似于囊胚阶段（受精卵发育5-6天）胚胎干细胞的潜能，但又避开了胚胎干细胞的伦理争议，为再生医学、组织工程、新药开发等领域开辟了一条新的道路。不过，在多能干细胞之上，还有一种分化潜能更大的干细胞，即全能干细胞（totipotent stem cell），具有分化形成完整个体的分化潜能。这种全能干细胞的状态只存在于受精卵发育的最初几天。在小鼠身上，只有合子和2细胞（2C）胚胎才是真正意义上的全能干细胞，而在人类和其他哺乳动物身上，这个时限会放宽到4-8细胞（4-8C）胚胎。之后，全能干细胞就开始迅速分化，形成外滋养层（outer trophectoderm, TE）、原始内胚层（primitive endoderm, PrE）之后发育成胎盘和卵黄囊用于母体与子代间物质交换，以及上胚层（epiblast, EPI）之后发育成多个胚胎器官。图1 细胞全能性的消失（图源：Nature）全能干细胞的特性意味着其在器官体外再生、濒危物种保护、辅助生殖技术改进等领域具有诱人前景。然而，虽然多能干细胞以及胎盘、卵黄囊祖细胞的体外培养技术已相对成熟，全能干细胞的体外培养则直到最近几年才有所突破。2018年发表于Cell Stem Cell的一项开创性工作“Capturing Totipotent Stem Cells”指出，在多能干细胞组成的小鼠胚胎干细胞培养物中，也存在着少数细胞（约0.5%）具有类似于小鼠2C阶段的全能性。这一发现表明，在体外培养繁殖全能干细胞是可能的。随后的一些工作试图找出能将细胞维持在全能状态的培养条件，但这些培养系统均未能实现持久的全能性维持。图2 全能肝细胞开创性工作(图源：[1])2022年3月，由中国科学院和深圳华大生命科学研究院牵头的体细胞诱导培养人类全能干细胞研究在Nature上发文“Rolling back human pluripotent stem cells to an eight-cell embryo-like stage”。在这项研究中，科研团队开发了一种非转基因、快速且可控的方法，从人类多能干细胞中诱导产生8C样细胞（8C-like cells，8CLC），不论在染色质可及性还是在基因表达水平上都与8C胚胎相似，成为了迄今为止在体外培养的“最年轻”的人类细胞。图3 研究成果（图源：[2]）研究人员还是用单细胞分析和功能丧失实验确定了多能干细胞转化为8CLC过程中的关键分子事件和基因网络，并确定了DPPA3和 TPRX1在其中的关键作用。DPPA3（Developmental pluripotency-associated 3）是卵母细胞DNA甲基化的主要调节因子，在整个8CLC转化过程中诱导DNA的去甲基化；TPRX1（Tetrapeptide Repeat Homeobox 1）是一种转录因子，属于ETCHbox（Eutherian Totipotent Cell Homeobox）家族，在8CLC转化过程中调控与该过程相关的基因网络的功能和表达。图4 8CL基因调控网络（图源：[2]）进一步的实验证实，8CLC能够在体外或体内形成类似于胚胎和胎盘的结构，相比于过去的多能干细胞无法分化为胚胎外组织，8CLC具有更全面的发育潜能。在体外培养小鼠全能干细胞方面，清华大学丁胜团队和中山大学王继厂团队则分别在Nature和Cell Stem Cell上发文“Induction of mouse totipotent stem cells by a defined chemical cocktail”、“Chemical-induced chromatin remodeling reprograms mouse ESCs to totipotent-like stem cells”，介绍了使用化学方法重塑小鼠胚胎干细胞细胞基因表达、染色质状态来诱导和维持体外2C样状态的两种方法。图5 丁胜团队研究（图源：[3]）丁胜团队从3000多种化合物中筛选出了能够将表达2C阶段特异性基因的细胞数量增加三倍的23种化合物，其中包括一些RAR激动剂。然而，单独激活RAR不足以建立和维持细胞的全能性，因此，丁胜团队又额外测试了一些能够增强干细胞重编程、存活和自我更新的小分子。最终团队通过RNA测序，确定了一组不仅能够在体外实现表达2C阶段特异性基因的细胞的诱导和长期维持，还能使细胞进入最接近2C状态的化合物组合——TTNPB、1-azakenpaullone、WS6（统称为TAW）。在TAW处理下，被诱导出的ciTotiSC细胞（chemically induced totipotent stem cells）几乎所有经典的全能性特异性基因被激活或高度表达，而大多数多能性特异性基因被沉默，相比小鼠胚胎干细胞和先前研究中所培养出来的D-EPSC、L-EPSC、2C样细胞（2CLC）或全能卵裂球样细胞，许多其他必需的全能转录因子也在ciTotiSC中特异性激活或高度表达。在染色质可及性和关键代谢特征方面，ciTotiSC也与小鼠2细胞胚胎高度相似。在分化潜能上，ciTotiSC可以在体外形成滋养层干细胞，当将4-8个ciTotiSC 接种到宿主8C胚胎中时，ciTotiSC不仅参与了胎盘和卵黄囊的形成，也参与了胚胎本身所有细胞谱系的形成，甚至该嵌合胚胎能够发育成健康的活产幼崽。图6 王继厂团队研究（图源：[4]）王继厂团队首先考察了2CLC与2C胚胎之间的差异，并提出了DOT1L抑制可通过重塑PCH来实现多能性向全能性转变的假设。PCH即着丝粒周围异染色质（pericentromeric heterochromatin），主要由一系列名为主要卫星（major satellite，majSat）的重复DNA序列构成。实验证明，DOT1L抑制诱导出的替代2C类状态（alternative 2C-like state）不同于2CLC，但单独抑制DOT1L不足以维持该状态，还需要配合KDM5B抑制，来重建卵母细胞/2C特异性的非典型广泛H3K4me3结构域。研究团队称这种方式建立的细胞为全能样干细胞（totipotent-like stem cells，TLSC）。王继厂团队随后比较了TLSC和全能卵裂球样细胞以及L-EPSC、D-EPSC之间的差异。转录组的分析表明，TLSC和全能卵裂球样细胞与小鼠2C/4C胚胎相似，而EPSC与囊胚相似，但TLSC和全能卵裂球样细胞之间仍然在多个2C特异性基因的表达上存在可区分的差异。此外，在表观遗传特征、等位基因特异性转录上，TLSC也与2C胚胎接近。将TLSC接种到宿主8C胚胎中后，TLSC同样对外滋养层和内细胞团有所贡献，甚至比宿主细胞更具生长优势。另外，像2C胚胎自组织形成囊胚一样，TLSC也可以自组织形成囊胚样结构，即类囊胚（blastoid）。这些类囊胚转移到假孕小鼠子宫后，超过35%发生了着床并诱导子宫内膜蜕膜化，但不会进一步发育。图7 王继厂团队体外培养TLSC图形概要（图源：[4]）在本文回顾的三项研究中，所培养出的细胞体系均含有多种细胞类型，因此，需要进一步明确定义其主要亚群的关键生物学特征。此外，这些细胞体系均未通过最严格的全能性测试，即能够独立于其他细胞类型产生新生物个体的能力。母体效应的缺失也有可能在一定程度上损害全能干细胞的发育。不过，还需要注意的是，当这些不足之处得到补足，培养出的全能干细胞获得了正常发育至足月的能力，新的伦理争议恐怕又将摆上台面。责编|风立宵校对|风立宵End参考资料：[1]Baker CL, Pera MF. Capturing Totipotent Stem Cells. Cell Stem Cell. 2018 Jan 4;22(1):25-34. doi: 10.1016/j.stem.2017.12.011.[2]Mazid, M.A., Ward, C., Luo, Z. et al. Rolling back human pluripotent stem cells to an eight-cell embryo-like stage. Nature 605, 315–324 (2022). https://doi-org.libproxy1.nus.edu.sg/10.1038/s41586-022-04625-0[3]Hu, Y., Yang, Y., Tan, P. et al. Induction of mouse totipotent stem cells by a defined chemical cocktail. Nature (2022). https://doi-org.libproxy1.nus.edu.sg/10.1038/s41586-022-04967-9[4]Yang M, Yu H, Yu X,et al. Chemical-induced chromatin remodeling reprograms mouse ESCs to totipotent-like stem cells. Cell Stem Cell. 2022 Mar 3;29(3):400-418.e13. doi: 10.1016/j.stem.2022.01.010.[5]https://www-nature-com.libproxy1.nus.edu.sg/articles/d41586-022-01932-4 本文系生物探索原创，欢迎个人转发分享。其他任何媒体、网站如需转载，须在正文前注明来源生物探索。   往期精选 围观 ‍把病毒困在“陷阱”里！海德堡大学探明病毒渗透最后一步，或将带来预防新手段！ 热文基因振荡器：在两种衰老模式间来回切换，细胞寿命延长了82%！ 热文用超声波突破皮肤屏障！MIT科学家为皮肤给药提供可穿戴解决方案 热文新发现：加速癌症发展的染色体外DNA，甚至出现在癌症之前，推动组织癌变！ 热文 在基因组中“跳来跳去”的转座子，有望成为免疫疗法抗击肿瘤的新靶点！点击“阅读原文”，了解更多~

这项研究不仅揭示了人-鼠早期胚胎翻译组动态变化的差异性和保守性以及可能原因，也鉴定出了人类合子基因组激活的关键调控因子TPRXL, TPRX1, 和 TPRX2。 在哺乳动物卵子向早期胚胎转变的过程 (oocyte-to-embryo transition, OET) 中，翻译在减数分裂、合子基因组激活和早期胚胎发育过程中扮演了一个重要的角色。合子基因组激活 (human zygotic genome activation, ZGA) 作为生命起始时的第一次转录事件和启动胚胎发育进程的关键事件，在哺乳动物中仍未被完全理解清楚。尽管启动ZGA的关键转录因子在其他物种，如斑马鱼和果蝇等中被陆续发现，启动人类ZGA的关键转录因子仍然是一个未解之谜。 通过结合超灵敏翻译组测序技术Ribo-lite (Ligation-free, ultra-low-InpuT and Enhanced Ribo-seq) 和转录组测序技术 (Smart-seq2) 而开发出的Ribo-RNA-lite (R2-lite) 方法可以进行翻译组与转录组联合测序，该方法被应用于人类卵子和早期胚胎共8个时期。经翻译组分析比较发现，在卵子向早期胚胎转变过程中，人-鼠同源基因中有一半呈现保守的翻译水平动态变化趋势，而另一半呈现不同的翻译水平动态变化趋势，例如编码表观遗传重编程因子、小RNA生物学合成酶等基因。并且这种物种特异性的翻译变化是部分由于 (3’ UTR) 的关键调控序列，例如胞质多聚腺苷酸化元件 (cytoplasmic polyadenylation element, CPE) 和 多聚腺苷酸化信号位点(polyadenylation signal site, PAS) 的差异排布导致的。 人类早期胚胎翻译组数据还显示出一组Homeobox转录因子在人类合子基因组激活阶段附近呈现高翻译活性，并且它们潜在的DNA结合基序 (motif) 在ZGA基因的远端开放染色质区域（即可能的增强子）上高度富集。这些转录因子包括母源因子TPRXL以及在初级ZGA时期 (minor ZGA) 开始表达的TPRX1和 TPRX2。TPRXL的3’ UTR上也带有CPE调控元件，在卵子减数分裂恢复时开始翻译上调。 TPRX1/2/L 联合敲低 (TPRX triple KD or TKD) 将导致胚胎发育和ZGA的明显缺陷，大约31%的ZGA基因将被下调，并且这些基因富集PRD-like转录因子结合基序。TPRX1/2/L 联合敲低胚胎中表达水平下调的基因包括有多个下游转录因子如ZSCAN4, DUXB, DUXA, NANOGNB, DPPA4, GATA6, DPRX, ARGFX 以及 KLF5。在人类胚胎干细胞中，过表达TPRX1/2也可以结合并激活一部分ZGA基因，说明TPRX1/2/L可以通过靶向下游转录因子从而启动下游转录事件。综上所述，这项研究不仅揭示了人-鼠早期胚胎翻译组动态变化的差异性和保守性以及可能原因，也鉴定出了人类合子基因组激活的关键调控因子TPRXL, TPRX1, 和 TPRX2。 该文章于2022年9月8日在《科学》期刊以长文形式发表，题为“翻译组与转录组联合图谱发现TPRXs参与人类合子基因组激活”（Translatome and transcriptome co-profiling reveals a role of TPRXs in human zygotic genome activation）。 清华大学颉伟教授、山东大学陈子江院士与赵涵教授为本文的共同通讯作者，清华-北大生命科学联合中心2018级博士研究生邹卓宁、山东大学生殖医学研究中心2021级博士研究生张传鑫、清华大学生命学院2020级博士研究生王秋艳以及山东大学生殖医学研究中心助理研究员侯真真为本文共同第一作者。该课题得到了山东大学生殖内分泌教育部重点实验室、国家辅助生殖与优生工程技术研究中心、清华大学实验动物中心、清华大学高性能计算平台的大力支持。该研究获得了国家自然科学基金、国家重点研发计划、中国医学科学院配子发生与ART后代健康研究室项目、上海高水平地方高校创新研究团队项目、清华北大生命科学联合中心、北京市科学技术委员会以及美国霍华德休斯医学研究所国际研究学者（HHMI International Research Scholar) 的经费支持。 人类卵子和早期胚胎翻译组与转录组联合测序揭示翻译调控机制和合子基因组激活关键因子

导语：近年来，随着生活习惯和所处环境的变化，不孕症的发病率在逐渐增加。据研究显示，全世界约有8%-12%的育龄夫妇面临不孕症的困扰。在西方国家，育龄妇女中不孕症的发病率为每七对夫妇中有一对，在发展中国家为每四对中有一对，有些国家的不孕症发生率甚至可能达到30%。理解卵母细胞的成熟过程和早期胚胎的发育是解决不孕不育难题的关键。研究人员发现在卵母细胞向胚胎的转变（Oocyte-to-embryo transition，OET) 以及合子基因组的激活（Zygotic genome activation，ZGA）过程中，转录调控起到了关键的作用。早期研究表明，非洲爪蟾卵母细胞的翻译调控是通过CPEB1蛋白结合3’末端的非翻译区（3’UTRs）实现，CPEB1可以抑制卵母细胞的多聚腺苷酸化，同时在减数分裂恢复期又能促进卵母细胞的多聚腺苷酸化。在小鼠中，CPEB1通过类似的方式调节卵母细胞的发育，但是对于人类的卵母细胞转变过程中调控方式的研究还相当匮乏。另外，合子基因组激活（ZGA）作为新生命开始的第一次转录事件，其在哺乳动物中是如果进行调控的，还没有详细的报道。2022年9月8日，山东大学生殖医学研究中心陈子江院士、赵涵教授团队联手清华大学颉伟教授团队在Science发表题为“Translatome and transcriptome co-profiling reveals a role of TPRXs in human zygotic genome activation”的研究成果（图1）[1]。研究通过开发一种高度敏感的核糖体图谱检测方式（Ribo-lite），结合转录组测序（RNA-seq），揭示了人类卵母细胞向胚胎转变过程中的翻译调控方式，并识别了合子激活过程中的可能调控因子（图2）。图1 研究结果（图源：Science）图2 人类卵子向早期胚胎转变过程中的翻译图谱（图源：[1]）在此项研究中，研究人员把Ribo-lite和Smart-seq2的检测合并起来一起处理溶解的样本，称为Ribo-RNA-lite或R2-lite，以同时得到翻译组和转录组信息；利用R2-lite方法对人类卵母细胞和早期胚胎进行检测，并将人胚胎干细胞（hESCs）作为对照组，来研究人胚胎发育过程不同阶段的翻译组和转录组的变化情况。结果发现：01人卵母细胞及早期胚胎发育过程中的动态翻译调控  人卵母细胞从成熟期（FGO）发展到四细胞期（4C），转录组没有明显变化，而到了八细胞期（8C）则有较大转变。相对的，翻译组的变化则更加具有动态性，从成熟卵母细胞到减数分裂中期Ⅰ，从中期Ⅰ到中期Ⅱ，以及四细胞期到八细胞期的转变（图3b）。图3 人卵母细胞及小鼠早期胚胎发育过程中翻译组和转录组的全基因组定位（图源：[1]） 02在人与小鼠的OET过程中翻译图谱的一致性  为了比较人类和小鼠在卵母细胞向胚胎转变的过程中翻译组和转录组的一致性，研究人员对同源基因进行的研究。根据不同阶段的翻译变化趋势把人类和小鼠的同源基因分成了4大类别，并且发现人和小鼠在4大类别中共有的基因占到了50.5%（图3d），说明了这些在卵母细胞成熟过程中过程起重要作用的基因具有进化的保守性。另外，在人和小鼠卵母细胞向胚胎转变过程中上调的和下调的转录本，分别呈现出更长和更短的3’UTRs序列，进一步证明了翻译调控的保守性。 03小鼠卵母细胞MⅡ期存在大量母源RNA的去稳定化  在小鼠中，卵母细胞从FGO向MⅡ转变的过程中，翻译水平下调的基因往往伴随着mRNAs的减少，而在人类样本中，这种现象不存在（图3f）。研究认为，在卵母细胞MⅡ期，人类的mRNA相比小鼠具有更长的poly(A)尾，所以造成小鼠中mRNA减少的原因很可能是mRNA的去腺苷化。 04细胞质多腺苷酸化元件（CPE）介导的调控密码揭示了人和小鼠OET过程中的翻译调控的驱动基因  在人和小鼠同源的基因中，49.5%表现出物种特有的翻译水平的动态变化（图4A）。为了验证CPEs是否可以解释这些物种的特异性变化，作者识别了366个属于人OET上调，但是在小鼠中下调的基因，发现这些基因具有更高的CPE密度，并且在人里面有更多的papCPEs。相反的，在人OET中下调，而在小鼠中上调的基因则表现出更低的CPE密度，并且在人里面有更少的papCPEs。图4 人类和小鼠卵母细胞及早期胚胎之间的翻译组差异（图源：[1]） 05合子基因组激活前（Pre-ZGA）翻译对于人类合子基因组的激活是非常重要的  为了探究翻译活性是怎么调节胚胎发育和合子基因组激活的，研究利用环己酰亚胺（CHX）抑制了人类不同阶段胚胎的翻译水平，并培养到第5天后，进行RNA-seq测序。结果显示，相比于四细胞期，一细胞期经过处理的胚胎具有更加严重的ZGA和母源RNA的消失。说明，早期的ZGA翻译对于人类合子的基因组激活时非常重要的。 06PRD相似（PRD-like）的同源转录因子在ZGA阶段具有较高的翻译水平  为了识别特殊的ZGA调控子，研究寻找了在ZGA期间具有较高翻译水平的转录因子（TFs）。在四细胞期，前三名转录因子是OTX2、LEUTX、和TPRXL，同属于PRD-like的转录因子家族（图5d）。在八细胞期，两个额外的PRD-like家族转录因子，TPRX1和TPRX2，翻译水平较高。总共至少有10个PRD-like的转录因组在ZGA时期被高度翻译。图5 ZGA翻译是人类盒子基因组激活的必要条件（图源：[1]） 07TPRX因子调控人类胚胎植入前的发育  为了研究这些PRD-like的转录因组在人类ZGA和早期发育过程中的作用，研究人员敲低了这些人类胚胎中这些因子的表达水平后发现，在TPRX1，TPRX2，TPRX1/2，TPRXL敲低（KD）的胚胎中，八细胞时期的胚胎发育发生迟缓。说明这些因子能够共同调节人类早期胚胎的发育。 08TPRX因子对于人类合子基因组激活是必须的  在TPRX三敲除（TKD）实验中，作者发现三敲除的胚胎比单个转录因子敲除的胚胎发育更加迟缓。进一步研究发现，在TPRX三敲除的胚胎中，ZGA相关的基因有非常明显的表达下调。 09TPRXs的异位表达（ectopic expression）可以激活人类ZGA标志基因的表达  在TPRX过表达的hESCs样本中，受到TPRX1和TPRX2影响而激活的基因具有大量的重叠，说明它们可能具有相似的功能。同时，在这些激活的基因中，有参与ZGA的重要基因，如DUXB，HESX1，KLF5，RBP7，ZSCAN4等等。而这些基因在TPRX三敲除的样本中，有一半都下调表达，说明TPRXs可以激活部分ZGA基因的表达。此项研究通过把核糖体测序和转录组测序结合的方式，能够同时检测样本的翻译和转录组水平的变化。在比较了人类和小鼠卵母细胞和胚胎发育过程不同时期翻译水平和转录水平的差别后，证实了3‘UTR区域对于物种特异的翻译调控以及稳定性方面的重要性，并认为TPRX家族转录因子在合子基因组激活过程中扮演者重要的角色。为研究人类早期胚胎发育过程，探究生殖疾病，提高辅助生殖健康水平奠定了重要的基础。但是，本研究虽然提供了TPRX家族转录因子在胚胎发育和合子基因组激活过程中参与重要的身份的一些证据，但对于这些转录因子是如何调节这些过程，以及这些因子之间是否存在相互配合的关系，并未进行更加深入的研究。撰文|钱俊 文竞择排版|文竞择End参考资料：[1]Zou Z, Zhang C, Wang Q, et al. Translatome and transcriptome co-profiling reveals a role of TPRXs in human zygotic genome activation. Science. 2022 Sep 8:eabo7923. doi: 10.1126/science.abo7923. Epub ahead of print. PMID: 36074823. 本文系生物探索原创，欢迎个人转发分享。其他任何媒体、网站如需转载，须在正文前注明来源生物探索。 往期精选 围观 远离不粘锅和化妆品！PFAS一旦入体，无法排出，持续产生永久化学伤害！ 热文 久坐增加死亡风险？这个动作或可抵消久坐危害 热文 神药跌下神坛？辉瑞新冠口服药Paxlovid对年轻人“几乎无效”！ 热文 Science：大脑受伤了如何自行恢复？华大构建全球首个脑再生时空图谱 热文 全球癌症负担报告公布！吸烟、饮酒、肥胖是癌症三大帮凶 点击“阅读原文”，了解更多~