DUSP22

摘要：兔单克隆抗体已成为实验室研究的杰出试剂，并越来越多地用于诊断和治疗应用。本文介绍了兔B细胞个体发育特点、高度独特的抗体库，最后介绍了通过杂交瘤技术、噬菌体展示技术产生兔单克隆抗体，以及成功的人源化策略。 1兔单克隆抗体与多克隆抗体兔子是具有广泛用途的单克隆抗体（mAb）和多克隆抗体（pAb）的主要来源。IgG是兔单克隆抗体最常见的类型（图1）。（1）单克隆抗体（mAb）单克隆抗体含有一个特定的抗原结合位点（副表位），该位点通常仅与一个表位具有高亲和力和特异性结合。图1 IgG格式的天然兔抗体示意图单克隆抗体和单克隆抗体衍生抗体疗法目前广泛用于治疗癌症和自身免疫性疾病等人类疾病。有11种兔单克隆抗体已成为FDA批准的临床体外诊断工具。（2）多克隆抗体（pAbs）多克隆抗体则通常针对不同的表位，可以描述为针对特定病原体或抗原产生的一组不同抗体。兔pAbs被广泛应用为生物医学研究的分析工具，尤其是用于免疫技术，如免疫组织化学（IHC）、western印迹和流式细胞术。也被用作食品安全评估的重要工具。单克隆抗体和单克隆抗体衍生抗体疗法目前广泛用于治疗癌症和自身免疫性疾病等人类疾病。虽然FDA目前尚未批准任何治疗性兔单克隆抗体，但有11种兔单克隆抗体已成为FDA批准的临床体外诊断工具。其中10种单克隆抗体用于检测肿瘤相关抗原的表达，包括HER2、雌激素受体等。兔mAb已成为一种充满前景的工具。2兔在抗体库生成中的优势1兔抗体能够识别啮齿动物中非免疫原性的人类抗原上的表位，增加可靶向表位的总数，并促进与人类抗原的小鼠同源物交叉反应的抗体产生。2兔子对小分子和半抗原会产生强烈的免疫反应，这在啮齿动物中很少见。3缺乏近交系兔，而大多数小鼠系为近交系，而自交系通常会引起较少的免疫反应，这使培养牢固多样的结合物变得很困难。相应地，在许多将兔和小鼠单克隆抗体与相同的人类抗原进行比较的IHC研究中，兔单克隆抗体始终显示出更高的敏感性。 4兔子体内的B细胞数量高于老鼠体内的B细胞数量。例如从兔子处回收的脾脏B细胞数量是小鼠的50倍。同时兔子的血容量更大，有助于对大量血清IgG进行质谱分析。5与人类和小鼠相比，兔子使用不同的机制从基因上生产和多样化一级和二级抗体库，从而有效地为所讨论的应用创造了一组互补的结合物。__3兔B细胞的个体发育及抗体库兔B细胞库的发育与其他哺乳动物有显著不同。新生兔B细胞在妊娠第二周和第三周之间开始发育，而成年兔骨髓中的B淋巴细胞生成非常有限，表明B淋巴细胞生成主要局限在早期发育过程中。然而，在成人脾脏中发现了具有种系抗体序列的B细胞。此外，在兔对兔过继转移模型中，研究表明，兔B细胞能够并入到宿主干细胞微环境中。这表明：兔B细胞长寿且具有潜在的自我更新能力，因此可以在兔的整个生命周期内维持抗体库。兔主要先重排重链，再重排轻链，与Ehlich等人提出的初级B细胞发育途径一致。简言之，该模型提出重链的VH–D–JH重组，然后作为前B细胞受体表达。刺激前B细胞受体后，VL–JL轻链重组就开始了。在1日龄兔子的Vκ–Jκ重排中观察到一些非模板核苷酸加成（也称为N-核苷酸）的现象，表明末端脱氧核苷酸转移酶最近表达过。尽管有200个VH基因可能用于重链重排，但其中大多数很少表达或不表达。有10-20个D基因和4-5个J H基因。然而，已知这些簇中的某些基因被优先利用：VH1是最接近D的VH基因，存在于80–90%的重链基因重排中。已知三种不同的同种异型VHa1、VHa2和VHa3，会导致VHa阳性血清型。其余10-20%的重链含有VHx、VHy或VHz基因。这一发现有些令人惊讶，因为有另一个功能性的D-近端VH序列明显更接近VH1片段。事实上，可以证明VH1阴性Alicia品系兔80–90%的重链重排中使用了VH4片段。然而，这种重链重排在成年兔子中非常罕见，这表明VH4重排在大多数情况下是无效的，因此会在发育过程中丢失。人们认为，在重组过程中，兔子通过在VH–D和D–JH连接处添加N-核苷酸，部分抵消了某些VH、D和JH基因的优先利用，重链的第三个互补决定区（CDR）被称为HCDR3，它包括两个连接，因此是六个CDR中可变性最强的，与小鼠和人类HCDR3的平均±s.d.长度分别为11±2（mode=10个氨基酸）和15±4（mod e=15个氨基酸，这些发现证实，与小鼠HCDR3相比，兔HCDR3与人HCDR3具有更多的相似性。总之，B细胞个体发育和抗体库的独特特性使兔子成为产生高亲和力和特异性抗体的宝贵来源。4兔单克隆抗体的产生（1）杂交瘤技术杂交瘤技术是一种产生稳定细胞系的方法，这种细胞系可以持续分泌单克隆抗体。为此，在聚乙二醇存在的条件下，将来自免疫动物的B细胞与骨髓瘤细胞系融合。以这种方式产生的杂交瘤通过限制稀释进行克隆，筛选出良好的单克隆抗体特性，然后在培养基中扩增以获得大量所需的单克隆抗体。杂交瘤技术已被广泛用于产生数千种针对多种抗原的不同单克隆抗体。事实上，大多数FDA批准的嵌合、人源化和人源性单克隆抗体都源自杂交瘤技术。由于兔抗体的良好特性，许多研究小组试图开发出兔杂交瘤的产生方法。但受到缺乏兔骨髓瘤细胞系的限制。病毒转化兔B细胞生成骨髓瘤样细胞系也很困难，而且效率相当低。由于这些原因，人们目光主要集中在产生兔-鼠杂合杂交瘤上。但在杂交瘤技术早期，所有异种杂交瘤都显示出融合效率低、遗传不稳定和功能受损的兔重链和轻链配对的问题。 #11988年，Raybould 等人通过聚乙二醇介导的兔脾B细胞与小鼠骨髓瘤细胞系SP2 /0-Ag14融合，产生了第一个稳定的兔-小鼠异种杂交瘤。尽管他们连续数月观察到兔IgG的稳定表达，但其他研究组也观察到了遗传不稳定性和单克隆抗体分泌减少等问题。这些缺点可以通过定期亚克隆兔-鼠杂交瘤进行部分解决。#21995年，凯瑟琳·奈特实验室研制出了第一个兔同种杂交瘤。通过单细胞受精卵显微注射产生转基因兔，并交配产生v-abl /c-myc双转基因兔，最终获得了潜在的兔融合细胞系 ：第一个稳定的兔浆细胞瘤细胞系240E-1。该细胞系可以作为一种有效的融合伙伴来生成兔同源杂交瘤。来自不同兔组织的B细胞会分泌不同比例IgG、IgM和IgA的杂交瘤。然而，如何保持获得的同源杂交瘤的稳定性仍然是一个主要挑战，IgG分泌随着时间的推移而减少。#3Zhu和Pytela试图通过反复亚克隆来筛选融合效率更高的克隆，从而进一步改进最初的240E-1细胞系，以产生具有更高遗传稳定性和更稳定兔IgG分泌的杂交瘤。获得的融合细胞系240E-W及其继任者240E-W2和240W3具有更高的融合效率，且无内源性兔重链和轻链分泌（美国专利7429487）。除了治疗应用外，杂交瘤技术产生的兔单克隆抗体已成为诊断应用和实验室研究的非常有价值的试剂。例如，高度特异性的兔单克隆抗体可以通过肺癌组织的IHC检测EGFR酪氨酸激酶结构域的激活突变。此外，抗HIV-1蛋白gp120的兔单克隆抗体被证明可以模拟中和人类抗HIV-1 gp120单克隆抗体，促进兔免疫作为HIV-1疫苗开发的模型。（2）噬菌体展示技术 George Smith发明了噬菌体展示技术。他发现丝状噬菌体的次要外壳蛋白（pIII）可以在其氨基末端进行修饰，以呈现肽序列，而不会影响噬菌体的传染性。此外，这些噬菌体颗粒含有编码分别修饰的外壳蛋白的基因组信息，因此在物理上连接了基因型和表现型。噬菌体选择和扩增的结合可以有效地富集含有特定肽序列的噬菌体。然而，由于感染性降低，更大的肽序列、蛋白质结构域或整个蛋白质的掺入是一个严重的挑战。因此，开发了由编码pIII融合蛋白的噬菌体酰胺和辅助噬菌体组成的双组分系统，辅助噬菌体贡献噬菌体基因组，编码产生感染性噬菌体颗粒所需的所有蛋白质。 杂交瘤技术难以产生兔单克隆抗体的事实，为探索噬菌体展示技术对兔免疫抗体库的可及性提供了强大的动力。Ridder等人在随后的独立研究中使用单链抗体格式报告了通过噬菌体展示选择的第一个兔抗体库。Fab格式的兔抗体库在短时间内相继出现。由于人在细菌中的表达水平高于兔恒定结构域，因此，由兔可变结构域VL和VH组成的嵌合兔/人Fab格式分别与人恒定结构域CL和CH1重组融合，证明在通过噬菌体展示选择兔单克隆抗体及其随后的人源化方面尤其成功（图1）。图1 嵌合兔/人Fab和人源化兔Fab然而，上述在主要K1同种型的兔κ轻链中发现的半胱氨酸80和半胱氨酸之间的链内二硫键对嵌合兔/人Fab格式构成了挑战，因为人类CH1不含有半胱氨酸。事实上，仅选择了少数源于K1同型的Fab，表明半胱氨酸80的游离巯基不受欢迎，其存在减少了嵌合兔/人Fab的选择多样性。图2 通过噬菌体展示与HIV-1 Rev（PDB加入代码2X7L）复合物选择的嵌合兔/人Fab的晶体结构。 使用天然Fab格式进行噬菌体展示的一个关键优势是其强大的单体性质，允许亲和力驱动选择。相比之下，非自然的单链抗体格式有二聚、三聚和四聚的趋势，可能导致亲和力驱动的选择。因此，对于需要高亲和力兔单克隆抗体的实验，建议使用基于嵌合兔/人Fab格式的噬菌体展示（图2）。 即使应用程序需要单链抗体，例如体内抗体的生成，嵌合兔/人Fab格式也被用于通过噬菌体展示进行选择，然后转换为兔单链抗体格式。除了Fab和scFv格式，单域抗体格式，即VL或VH单独存在，由于其较小的尺寸，使其在某些应用中具有优势，例如识别隐蔽的表位，也由兔单克隆抗体设计而成。兔轻链的显著优势可能使兔VL库的噬菌体展示特别有吸引力。噬菌体展示技术已引起了国内多家公司的关注，如成都仁域生物就是一家具有代表性的公司，凭借在抗体领域深耕多年的经验，成都仁域已掌握通过噬菌体展示技术构建抗体文库的核心技术，能快速筛选得到优质的兔单克隆抗体，加速实验成果转化。5兔单克隆抗体的人源化人类免疫系统旨在识别并选择性地清除潜在的致病生物体和物质。对于非人类蛋白质，如小鼠和兔单克隆抗体，也是如此。各自的免疫反应以针对这些外源抗体序列的高滴度人类抗体为特征。这会造成两个主要的生理后果：首先，它会导致与过敏反应程度相当的副作用。其次，它会导致给药的单克隆抗体迅速消除，限制治疗效果。由于这些原因，非人单克隆抗体现在通过将非人可变域与人类恒定域结合，常规转化为嵌合单克隆抗体，并通过将非人可变域的全部或部分CDR嫁接到人类框架中，进一步转化为人源化单克隆抗体。 Rader等人报告了第一批嵌合和人源化兔单克隆抗体。在这项研究中，通过噬菌体展示选择的嵌合兔/人Fab通过将六个兔CDR（轻链、重链各三个）嫁接到在特定位置多样化的人类框架中进行人源化，以允许通过噬菌体展示技术选择人或兔剩余物。由此产生的人源化兔单克隆抗体保留了其亲本单克隆抗体的高亲和力和特异性。如上所述，除了对下游临床应用具有更高的实用性外，使用嵌合兔/人Fab格式进行噬菌体展示还具有额外的优势，即在细菌中提供更高的表达水平，同时在噬菌体上提供更高的显示水平。自第一次报告以来，许多额外的人源化兔单克隆抗体已经发表并获得专利。一般来说，适用于小鼠单克隆抗体的人源化策略也适用于兔单克隆抗体，无论是通过合理设计、定向进化还是两者结合。与小鼠单克隆抗体一样，移植所有六种CDR，然后反复微调骨架残基，是人源化兔单克隆抗体最常用的方法。Borras等人使用一般受体框架对兔单链抗体进行人源化。在这项研究中，携带五种特定人对兔突变的特定人类框架能够产生针对两种不同抗原的人源化兔单克隆抗体，具有保守的亲和力和特异性，并改善生物物理特性。将亲代兔抗体序列的内容仅限于CDR中最高变的人源化策略。如LCDR3和HCDR3也已成功应用于兔单克隆抗体。到目前为止，还没有分析临床研究的人源化兔单克隆抗体免疫原性的报告。最近的研究表明，患者仍然可以对人源化甚至全人类单克隆抗体产生免疫反应。这些发现表明，其他方面，如独特型、异源型、糖基化和聚集，有助于单克隆抗体的免疫原性。尽管如此，这些副作用发生率明显低于之前观察到的非人源抗体。结 论在兔pAb和鼠mAb的成功推动下，兔mAb已成为实验室研究以及诊断和治疗应用的非常成功的试剂。通过杂交瘤技术、噬菌体展示技术获取兔抗体库的能力，推动了兔单克隆抗体在许多不同领域应用。通过噬菌体展示产生的兔单克隆抗体已发现其应用范围从水中铀的检测到嵌合抗原受体T细胞治疗癌症。在以成都仁域为代表的抗体文库技术公司的不断钻研与改进下，能通过噬菌体展示技术构建抗体文库，更快速高效的筛选优质兔单克隆抗体，助力其在临床应用中获得进一步发展。  参考文献1. Weber, J., Peng, H., & Rader, C. (2017). From rabbit antibody repertoires to rabbit monoclonal antibodies. Experimental & molecular medicine, 49(3), e305. https://doi-org.libproxy1.nus.edu.sg/10.1038/emm.2017.23