LPP

*仅供医学专业人士阅读参考最近在各种微生物身上动脑筋，用它们来增敏免疫治疗的研究可真不少啊，比如奇点糕前两天提过的益生菌新抗原疫苗疗法，还有人想到用基因工程改造细菌，让它们表达关键炎症因子IFN-γ来破解免疫治疗耐药[1]，但基于细菌的免疫疗法还有得是想象空间呢，比如说再多改造改造，它们就能变成定植在肿瘤部位的“兵工厂”，源源不断生产抗癌分子？这可不是什么异想天开，而是中国台湾研究者们在Cell Reports Medicine期刊发表的最新研究成果[2]：通过敲除大肠埃希菌Nissle 1917(EcN)的lpp基因，研究者们让这种益生菌的外膜具有渗漏性，从而能源源不断地外泌经基因工程改造合成的免疫调节分子和溶瘤嵌合蛋白，有效激活抗肿瘤免疫应答，还能建立相应的免疫记忆，且给药只需单次静脉注射即可。论文首页截图细菌一直以来都是受青睐的治疗载体，它们能凭借肿瘤嗜性（tumor tropism）在肿瘤微环境成功安营扎寨，并成功释放搭载或自身合成的有效载荷，调整基因表达还能优化它们的给药效率[3]，不过本次研究提出把细菌“搞漏”的策略，听起来可就直接甚至粗暴得多了，但其实原理也不复杂：敲除对象lpp编码的是脂蛋白，因此lpp对细菌外膜的渗透性举足轻重。研究者们首先敲除了另一种大肠杆菌菌株（E.coli BL21）的lpp基因，以初步明确在外膜渗漏状态下，最适合构成外泌嵌合蛋白的免疫调节分子。在被测试的3种白介素-2（IL-2）变体中，人工设计的IL-2类似物Neo2/15[4]分泌水平最高，也足以激活T细胞主导的免疫应答，再加上靶向PD-L1的纳米抗体，就成了作为外泌免疫调节分子的嵌合蛋白（aPDL1-Neo2/15）。为了使细菌载体精准递送、减小潜在的脱靶毒性，研究者们还使细菌表达了另一种嵌合蛋白，即以间皮素（mesothelin）为靶标的纳米抗体与溶血素E重组蛋白融合（HlyE-aMSLN），它能选择性识别表达间皮素的癌细胞，从而与前面的免疫调节性嵌合蛋白形成了联合治疗，而这种联合治疗只需要注射一次细菌载体就能实现，简便利落多了。同时外泌两种嵌合蛋白，是细菌载体取胜的关键接下来，研究者们把测试对象换成了益生菌EcN，证实敲除lpp基因导致的外膜渗漏状态，能够有效改善静脉注射给药时的安全性：敲除lpp会使EcN在脾脏和肾脏定植，以及在外周血中增殖的能力明显减弱，改善治疗的耐受性和体重减轻等副作用，但EcN定植到肿瘤部位的能力不会受明显影响，甚至可以说乏氧和免疫抑制性的肿瘤微环境更利于它们生存。经过体外实验证实敲除EcN的lpp基因，可使它将预定产生的两种嵌合蛋白顺利外泌（下文简称改造完成的EcN为CIOP）后，研究者们在肠癌和黑色素瘤模型小鼠上进行的实验证实，单次注射CIOP就足以使肿瘤减小到肉眼不可见的程度，还能通过诱发远隔效应（abscopal effect）杀伤远处病灶，效果显著优于仅表达一种嵌合蛋白并敲除lpp的EcN，其主要激活的也是T细胞主导的抗肿瘤免疫应答，且各类提呈MHC-II类抗原的细胞增多。经改造完成的CIOP展现了出色抑癌效果单次注射，一针见效，有两种嵌合蛋白协同、只需一种益生菌载体，不得不说这次研究的思路属实很赞，那lpp基因你就安心地被敲掉吧，奇点糕也希望能更进一步全面验证这种思路的普适性，说不定还能再让EcN多表达点抑癌要素，战斗力更上一层楼呢？参考文献：[1]Li F, Yang Z, Savage T M, et al. Programmable bacteria synergize with PD-1 blockade to overcome cancer cell–intrinsic immune resistance mechanisms[J]. Science Immunology, 2024, 9(100): eadn9879.[2]Liu C-H, Pan Y-C, Lim S-K, et al. Combinatorial leaky probiotic for anticancer immunopotentiation and tumor eradication[J]. Cell Reports Medicine, 2024. [3]Lynch J P, González-Prieto C, Reeves A Z, et al. Engineered Escherichia coli for the in situ secretion of therapeutic nanobodies in the gut[J]. Cell Host & Microbe, 2023, 31(4): 634-649. e8.[4]Silva D A, Yu S, Ulge U Y, et al. De novo design of potent and selective mimics of IL-2 and IL-15[J]. Nature, 2019, 565(7738): 186-191.本文作者丨谭硕

【导读】 联合疗法为实体瘤的免疫抑制和异质性微环境，提供了一种令人信服的治疗方案。然而，在方案设计中纳入单独的治疗方式，可能会受到复杂的物流、制造和药代动力学考虑的阻碍。在这项研究中，团队展示了一种使用lpp基因敲除的渗漏益生菌且同步分泌免疫治疗和溶瘤效应分子的单载体联合抗癌疗法。 2024年10月22日， 台湾中央研究院Kurt Yun Mou团队在期刊《Cell Reports Medicine》上发表了题为“Combinatorial leaky probiotic for anticancer immunopotentiation and tumor eradication”的研究论文。 多功能渗漏益生菌可实现同步免疫激活和肿瘤靶向溶细胞活性， 从而有效抑制肿瘤、提高肿瘤免疫细胞浸润和建立抗癌免疫记忆。LPP基因敲除可以提高益生菌耐受性和静脉适用性，为联合方案开发，提供了一种治疗可行的方法。 https://www-cell-com.libproxy1.nus.edu.sg/cell-reports-medicine/fulltext/S2666-3791(24)00540-8#sec-3 关于溶瘤益生菌 01 最近，细菌和益生菌作为治疗媒介的出现，为治疗开发提供了新的机会。重组克隆技术中的多样化工具集，为生成表达多种生物制剂的载体，提供了合成灵活性。此外，细菌的肿瘤嗜性及其在缺氧肿瘤微环境中增殖的能力，促进了肿瘤靶向生物制剂的递送。 为了实现工程化单载体组合益生菌，团队在这项研究中采用了一种功能丧失策略，通过缺失lpp基因（Δlpp）来松动细菌的外膜，该基因编码共价吸附细菌外膜的脂蛋白。 团队表明Δlpp细菌具有渗漏表型， 能够直接释放表达的生物制剂，为联合治疗设计提供了一个灵活的平台。此外，由于Lpp脂蛋白与免疫刺激和反应原反应相关，因此，功能丧失Δlpp设计具有增强载体耐受性的额外好处。通过插入带有单个启动子的质粒，团队展示了多功能渗漏细菌的制备，这些细菌将免疫刺激、免疫检查点抑制剂和肿瘤靶向溶瘤成分结合在单个载体中，用于抗癌治疗。 为了证明用于抗癌治疗的组合渗漏益生菌的制备，团队整合了免疫刺激和溶瘤嵌合蛋白，以诱导杀瘤活性、调节肿瘤微环境和促进抗癌适应性免疫反应。团队表明，渗漏的细菌能够筛选成分设计，并且在载体工程过程中，验证了每个治疗成分的功能。优化的渗漏益生菌，表示为组合免疫治疗-溶瘤益生菌（CIOP），展示了不同效应器功能的直接和同步释放，从而实现协同抗肿瘤活性。功能丧失Δlpp策略可以提高益生菌耐受性，而不影响其肿瘤嗜性， 这使得CIOP适合静脉内给药。 CIOP在治疗侵袭性肿瘤类型方面优于单模式益生菌，它为肿瘤遏制提供了有利的抗癌免疫反应。多功能载体为单载体组合治疗开发，提供了一种通用方法。 用于单载体联合抗癌治疗的组合免疫治疗-溶瘤益生菌示意图 CIOP的组合免疫治疗和溶瘤功能，发挥协同抗癌活性 02 大的MC38肿瘤在OP和CIOP之间显示出明显的差异，因为OP显示出可以忽略不计的抑制作用，而CIOP有效地控制了原发性肿瘤。CIOP治疗在抑制远端肿瘤生长方面比OP更有效，表明CIOP载体在诱导抗癌免疫反应方面具有优势。CIOP的组合功能赋予的治疗益处在快速生长、表达间皮素的CT26肿瘤模型中也很明显，这表明双重抗癌功能增强了益生菌治疗的肿瘤抑制作用。在携带高度侵袭性B16F10黑色素瘤的小鼠中，团队进一步证明， CIOP可以实现显著的肿瘤抑制， 使肿瘤无法检测，并在单剂量治疗后诱导持久的抗癌适应性免疫。这些结果突出了CIOP在诱导杀瘤和免疫刺激活性，以实现稳健和持久的肿瘤遏制方面的协同作用。 使用表达免疫治疗、溶瘤或组合抗癌功能的益生菌进行抗癌治疗 静脉注射CIOP治疗，可实现肿瘤抑制并增加肿瘤微环境中的免疫细胞浸润 03 对免疫细胞组成的深入分析显示，在CIOP治疗的肿瘤中，CD8和CD4 T淋巴细胞的存在更高。除了T淋巴细胞外，CIOP还增加了MHCII阳性免疫细胞的数量，表明存在抗原呈递细胞，如CD19 B细胞、CD11c+树突状细胞和F4/80+ M1巨噬细胞。 团队还观察到，CIOP治疗的肿瘤具有升高的CD45肿瘤浸润白细胞水平。这些发现证实了， CIOP中免疫调节剂成分介导的免疫刺激功能， 它可以改变免疫抑制性肿瘤微环境，以改善疾病预后。渗漏益生菌提供的高剂量静脉注射治疗，进一步增强了抗癌细菌治疗的转化前景。 CIOP静脉治疗，抑制肿瘤生长并增加免疫细胞浸润 总结 04 1. lpp基因敲除方法： 通过敲除lpp基因，可以产生渗漏膜，这种方法适用于不同的细菌载体，为细菌疗法开发提供了一个多功能的平台。 2. 增强载体耐受性和安全性： 敲除lpp基因不仅产生渗漏膜，还能增强载体的耐受性和安全性，这与荚膜多糖含量的减少有关，后者是病原菌的主要毒力因子。 3. 在肿瘤微环境中的增殖： 尽管在血液中的活力降低，但这些渗漏的益生菌在肿瘤中仍然可以被检测到，表明它们能在缺氧和免疫抑制的肿瘤微环境中增殖，用于嗜瘤治疗递送。 4. 细菌疗法的广泛应用： 细菌疗法在肿瘤学领域的应用日益普及，并且也适用于其他疾病，如代谢疾病、传染病和炎症性疾病。 5. 组合抗癌成分： 文章还展示了通过整合细菌载体工程和嵌合融合蛋白设计，将多种抗癌成分组合成单个载体的可行性。这种设计可以导致协同抗肿瘤作用，增强免疫细胞扩增，同时抑制癌细胞生长。 6. 组合益生菌的优势： 与传统的联合抗癌疗法相比，组合益生菌具有简化生产和简化给药方案的优势，解决了联合疗法背后的生产、物流和药理复杂性。 参考资料： 1.Jin, H. ∙ Wang, L. ∙ Bernards, R. Rational combinations of targeted cancer therapies: background, advances and challenges Nat. Rev. Drug Discov. 2023; 22:213-234 2.Lu, X. ∙ Horner, J.W. ∙ Paul, E. ... Effective combinatorial immunotherapy for castration-resistant prostate cancer Nature. 2017; 543:728-732 【关于投稿】 转化医学网（360zhyx.com）是转化医学核心门户，旨在推动基础研究、临床诊疗和产业的发展，核心内容涵盖组学、检验、免疫、肿瘤、心血管、糖尿病等。如您有最新的研究内容发表，欢迎联系我们进行免费报道（公众号菜单栏-在线客服联系），我们的理念：内容创造价值，转化铸就未来！ 转化医学网（360zhyx.com）发布的文章旨在介绍前沿医学研究进展，不能作为治疗方案使用；如需获得健康指导，请至正规医院就诊。 热门推荐活动 点击免费报名 🕓 上海｜11月15日-16日 ▶ 2024第一届中国类器官转化医学大会 🕓 上海｜11月21日-24日 ▶ 第七届上海国际肿瘤内科学论坛 🕓 全国｜2024年12月-2025年03月 ▶ 中国转化医学产业大会 🕓 上海｜2025年02月28日-03月01日 ▶ 第四届长三角单细胞组学技术应用论坛暨空间组学前沿论坛 点击对应文字 查看详情

摘要:外膜囊泡（OMVs）是许多革兰氏阴性细菌在生长过程中自发释放的，是细菌的重要毒力因子，帮助它们在恶劣的环境条件下生存。天然OMVs是细菌自然释放的，其产量对于疫苗制造来说太低，需要化学处理（去污剂提取）或遗传操作，从而产生膜抗原的通用模块（GMMAs）。多年来，OMVs的特性和属性使它们成为疫苗开发的可行平台。目前已有几种OMV疫苗获得许可，主要用于预防由B型脑膜炎奈瑟菌（MenB）和b型流感嗜血杆菌（Hib）引起的脑膜炎。还有几种针对其他革兰氏阴性细菌的OMV候选疫苗处于临床开发阶段，这些细菌是OMVs的来源，但也针对异源靶标，在这些靶标中OMVs被用作载体（例如2019年冠状病毒病[COVID-19]）。将OMVs用于非自身来源靶标的开发是OMV技术的重大进步，通过能够递送蛋白质或多糖抗原，提高了其多功能性。其他进展包括可以进行的一系列遗传修饰，以提高其安全性，减少反应原性，并增加免疫原性和保护效果。然而，仍然存在重大挑战，例如识别用于在OMV表面高含量表达异源蛋白的通用工具。在这里，我们概述了迄今为止OMV疫苗的进展，特别讨论了已获许可的基于OMV的疫苗和处于临床开发的候选疫苗。本文还描述了临床前研究的最新趋势，主要集中在遗传操作和化学偶联方面，以将OMVs用作异源蛋白质和多糖抗原的载体。还讨论了使用OMVs的剩余挑战和未来研究的方向。 关键点 外膜囊泡（OMVs）是疫苗开发的一种可行平台，目前已有一些基于OMV的疫苗获得许可并处于临床使用中。OMVs在使用上有着悠久而丰富的历史，特别是在针对脑膜炎奈瑟菌和b型流感嗜血杆菌的疫苗中，并且已经产生了大量支持使用这一平台来对抗许多其他病原体的临床前数据。最近的趋势是将OMVs用作异源蛋白质和多糖抗原的载体，支持多组分疫苗的开发。 1. 引言 外膜囊泡（OMVs）是许多革兰氏阴性细菌在生长过程中自发释放的，可能是由于细胞生长和外膜生物合成之间的不平衡，导致多余的膜材料以OMVs的形式释放。已有多项研究报告了OMVs在增强细菌在恶劣环境中的存活能力以及向宿主细胞传递毒力因子和DNA方面的作用。OMVs似乎参与了细菌的致病过程，帮助生物膜形成，并在宿主中或土壤中增加存活率。此外，OMVs支持细菌抵抗抗生素，并促进细菌之间抗生素抗性的转移。 OMVs模仿细菌的外部，类似于一种没有致病能力的病原体，并含有多种表面暴露的抗原。OMVs还含有与病原体相关的分子模式（PAMPs），如脂多糖（LPS）、肽聚糖、脂蛋白和鞭毛，这些成分具有自我佐剂性。此外，OMVs的粒径有助于被抗原呈递细胞（APCs）摄取，有助于向相应的T细胞呈递，并由滤泡树突细胞（FDCs）激活特定抗原的B细胞，从而诱导适应性免疫反应。基于这些原因，过去几年中，OMVs一直被视为疫苗开发的一种多功能平台。 细菌自然释放的OMVs被称为天然OMVs（nOMVs），但对于许多细菌来说，这种释放水平对于疫苗制造来说太低。为了提高产量，已使用去污剂（例如脱氧胆酸）从整个细菌中化学提取OMVs，结果产生了称为去污剂提取的OMVs（dOMVs）的类囊泡聚集体，这些聚集体是不溶性外膜蛋白。通常丢弃含有自发囊泡的发酵上清液，然后进行OMV的提取。可以引入超声步骤以获得更小且更均匀大小的dOMVs，也简化了无菌过滤。使用去污剂大大减少了LPS和脂蛋白的含量，从而降低了反应原性并提高了OMV的耐受性。然而，这种方法也导致了重要的保护性脂蛋白抗原的丢失，并损害了囊泡的完整性，并使得最终制剂被胞质蛋白污染。 可以通过遗传操作改变细菌的OMV特性（例如产量、内毒素性、蛋白质含量），并将其归类为突变衍生的OMVs（mdOMVs）或膜抗原的通用模块（GMMAs）。通常引入突变以破坏外膜与内膜以及周质中的肽聚糖层之间的联系。为了实现这一目的，已经采取了不同的策略。一种常见的方法是删除大多数革兰氏阴性细菌中存在的Tol-Pal系统的tolR基因。在大肠杆菌中使用nlpI的删除改变了肽聚糖动态；在流感嗜血杆菌、霍乱弧菌和大肠杆菌中破坏VacJ/Yersinia复发ABC（ATP结合盒）运输系统，导致磷脂在体外膜的外层积累。删除lpp、mltA（gna33）、rmpM、ompT、pagL、大肠杆菌共同抗原、degP和virk也会导致细菌外膜过度脱落。 由于天然释放的OMVs中LPS含量很高，因此引入了额外的突变以减少内毒素性。这通常是通过修改脂质A结构来实现的，特别是减少脂质A的酰链和磷酸基团的数量，影响其识别/触发Toll样受体（TLR）4的能力，并减少与脂质A相关的炎症反应。在大肠杆菌、志贺氏菌和沙门氏菌中使用了MsbB（lpxM）、HtrB（lpxL）和PagP（分别向脂质A添加肉豆蔻酰、月桂酰或棕榈酰链）的酰基转移酶的删除；在脑膜炎奈瑟菌中使用了lpxL1和lpxL2的删除。 与dOMVs相比，nOMVs和GMMAs的纯化更简单，所需的步骤更少。OMVs可以通过首先进行切向流过滤（TFF）与整个细菌分离，第二个TFF保留OMVs，同时去除可溶性蛋白质和其他低分子量杂质。 在这篇综述中，我们提供了OMVs及其遗传修改版本GMMAs作为疫苗平台的概述，以呈现蛋白质或糖抗原，临床水平的关键成就，临床前研究中出现的趋势，以及该领域的未来展望。 2.已获许可的基于外膜囊泡（OMV）的疫苗 目前有几种基于OMV的疫苗已获许可并在使用中。这些疫苗针对脑膜炎奈瑟菌，针对B型脑膜炎奈瑟菌（MenB）和b型流感嗜血杆菌（Hib）感染（表1）。 Bexsero（Bexsero是GSK集团拥有或许可使用的商标）中包含三种重组蛋白，从N. meningitidis（NZ98/254菌株）提取的OMV去污剂被指示用于预防由N. meningitidis B型引起的脑膜炎和脑膜炎球菌血症。该疫苗通过刺激产生识别疫苗抗原（NHBA、NadA、fHbp）和PorA的杀菌抗体而发挥作用，PorA是OMV的主要成分。Muzzi等人对脑膜炎抗原分型系统（MATS）的综述表明，该疫苗覆盖了81%至84%的MenB分离株。在几项临床试验中进行了测试，显示出良好的免疫反应，通过人体补体血清杀菌活性（hSBA）测量。在婴儿研究中，当OMV组分增加而重组蛋白保持不变时，免疫反应相应增加，以hSBA ≥5的比例和几何平均滴度（GMTs）衡量，这以剂量依赖性方式增加，在接受Bexsero中OMV全剂量的婴儿中最低（即25μg），在接受全剂量OMV的婴儿中最高。然而，系统反应原性的类似趋势并没有观察到，在接受四分之一、一半和全剂量OMV的接受者中观察到类似的反应原性概况。对于局部反应，含有OMV的四组分MenB疫苗接受者比接受不含OMV疫苗的个体有更高的发生率。此外，与单独的重组蛋白相比，含有OMV的疫苗在引起发热的频率上要高得多。该疫苗于2013年获得许可，适用于从2个月大的个体开始主动免疫，以预防由MenB引起的侵袭性脑膜炎（IMD）。已在17项研究中评估了疫苗的安全性，包括10项随机对照临床试验，涉及婴儿、儿童、青少年和成人，当与常规疫苗联合使用时（69-79%的对象），发热的频率更高，与仅接受常规疫苗接种的对象相比（44-59%），尽管大多数事件的严重程度轻至中度且持续时间短（大约1天）。尽管疫苗是使用免疫原性终点获得许可的，但在Bexsero引入英国后3年内，疫苗合格婴儿的MenB IMD病例减少了75%。 相同的OMVs单独配方在新西兰MenB疫苗中，用于对抗该国由N. meningitidis B型引起的脑膜炎暴发。OMV疫苗在几项临床试验中进行了测试，显示出可接受的安全性概况，在接种三剂疫苗后显示出强烈的免疫反应。疫苗接种计划在2004年至2006年间在新西兰的不同地区分阶段进行，用于不同年龄组的婴儿常规疫苗接种，直到2008年。据估计，该疫苗的有效性为77%，预防了2004年7月至2008年12月期间估计210例MenB IMD及其后遗症。类似地，在挪威，1983年开发的dOMV疫苗用于对抗MenB，用于控制MenB疾病的暴发。该疫苗在1988年至1991年期间用于171,800名青少年，估计在10个月后有效性为87%，之后迅速下降，与血清细菌活性的降低相一致。该疫苗还在2006年至2009年期间用于控制法国诺曼底由相同B14:P1.7,16菌株引起的暴发，病例发病率从2006年的31.6/10万下降到2009年的5.9/10万。另一种基于dOMV的疫苗（VA-MENGOC-BC，古巴Finlay Institute）于1987年在古巴获得许可用于对抗MenB（VA-MENGOC-BC是古巴Finlay疫苗研究所的注册商标），在接下来的20年中成功将MenB疾病的发病率降低了93-98%，最终使MenB不再成为古巴的公共卫生问题。2014年，该疫苗被Abivax收购，用于在亚洲和拉丁美洲国家的古巴以外地区分销。 Hib-OMPC是第一个被广泛许可的基于OMV的疫苗。它是一种高度纯化的b型流感嗜血杆菌（H. influenzae type b）荚膜多糖（多核糖核糖醇磷酸[PRP]），通过从B型脑膜炎奈瑟菌（N. meningitidis serogroup B）B11菌株的OMVs中用去污剂提取，与外膜蛋白复合物（OMPC）共价结合。在关键试验中，Hib-OMPC在3486名纳瓦霍婴儿（一个特别高风险的疾病人群）中显示出93-100%的效力，这些婴儿在2个月和4个月大时接种了疫苗。作为PedvaxHib（PedvaxHIB是默克夏普和多姆公司的注册商标）许可的疫苗，在接种第一剂后的1-3个月内，88%的婴儿诱导了抗PRP水平>0.15 μg/mL，在52%的婴儿中诱导了>1.0 μg/mL，几何平均滴度（GMT）为0.95 μg/mL；在第二剂和第三剂后分别上升到91%和60%。 PRP-OMPC在早期有Hib感染高风险的儿童中，在一剂后刺激强烈的免疫反应。然而，美国免疫实践咨询委员会（ACIP）建议，之前未接种疫苗的2-6个月大的婴儿应接受至少相隔2个月的两次PRP-OMPC剂量，以确保保护的持久性。他们还根据儿童的年龄推荐一剂或两剂给未接种疫苗的儿童。 最终，PedvaxHib与乙型肝炎表面抗原（HbsAg）结合，并作为Comvax（在欧盟为Procomvax）许可。这种组合导致抗PRP抗体水平低于之前独立疫苗（Procomvax-EU/Comvax-US）报告的水平。Procomvax和Comvax是默克公司/MSD在欧洲的注册商标。 在五项临床研究中，对1602名6周至15个月大的婴儿和儿童进行了Comvax（7.5 μg H. influenzae type b PRP，5 μg HBsAg）的免疫原性评估。在这些研究中，Comvax的免疫反应与使用单价疫苗PedvaxHib（7.5 μg PRP）和RECOMBIVAX HB（5 μg HBsAg）在不同部位接种，无论是同时还是相隔1个月进行比较。在之前未接种Hib或乙肝疫苗的婴儿中，Comvax的抗体反应在第二剂后显示出抗PRP水平>1.0 μg/mL的比例，与接受单价疫苗的受试者（72.4%）相似。该疫苗适用于由HbsAg阴性女性所生的婴儿，用于预防侵袭性Hib疾病和HBV感染，接种三剂，分别在2、4和12-15个月大时（MMR每周，CDC）。Procomvax于2009年由制造商退出欧洲市场，出于商业原因选择不更新市场授权。该决定与安全问题无关。 单价疫苗还与白喉和破伤风类毒素、百日咳抗原、HbsAg和灭活脊髓灰质炎病毒结合，作为六价儿童疫苗（VAXELIS）。VAXELIS是MSP疫苗公司的注册商标。这种组合适用于6周大的婴儿和幼儿的初次疫苗接种和加强疫苗接种，主要疫苗接种时间表为两到三剂，每剂至少间隔1个月。该疫苗的安全性概况与相同适应症的其他多价疫苗相当；然而，与肺炎球菌疫苗（Prevnar 13）的联合加强研究显示，两种疫苗的接受者中有高达52.5%的发热频率，尽管发热的强度轻至中等且持续时间短（<48小时）。总体而言，Hib PRP-OMPC疫苗的安全性与其他Hib疫苗相当，它们之间没有临床上显著的差异。 3.临床开发中的OMV疫苗 外膜囊泡（OMVs）在呈现多种天然构型的抗原以及自我佐剂性方面具有优势，因此有许多基于OMV的疫苗正在进行临床开发，以对抗它们所衍生的病原体（表1）。 GMMAs在其表面自然展示O-多糖（图1），并且已被用作疫苗候选物，用于预防非伤寒沙门氏菌和志贺氏菌，目前正在进行临床试验。 图1 展示在OMVs或GMMAs上的主要策略 GMMAs 膜抗原的通用模块，LPS 脂多糖，OMVs 外膜囊泡 在小鼠中，显示在沙门氏菌鼠伤寒菌和沙门氏菌肠炎菌GMMAs上的O-多糖已被证明可以引发强烈的抗O-多糖免疫球蛋白（Ig）G抗体反应，水平与相应的CRM197结合物配制的铝佐剂所诱导的反应相当。有趣的是，GMMAs增强了IgG抗体亚型轮廓，并与蛋白质结合物相比，导致更大的血清杀菌活性。现在正在对欧洲成人进行一项I期试验（NCT05480800），测试S. typhimurium和S. enteritidis GMMAs的双价配方吸附在Alhydrogel上。这种配方还与一种针对S. typhi的糖结合疫苗（Typhibev）结合，后者的I期临床试验也已经启动（NCT 05480800）。 第一个在临床试验中测试的基于GMMAs的疫苗是1790 GAHB的志贺氏菌宋内菌GMMA疫苗。GMMAs从一种基因工程改造的S. sonnei菌株中纯化，该菌株增加了脱落（ΔtolR），产生较少的反应原性五酰基化脂A（ΔhtrB），并稳定表达编码O-多糖的毒力质粒。S. sonnei GMMAs吸附在Alhydrogel上，在两项I期临床试验、一项扩展增强试验、一项IIa期临床试验中进行了测试，并最终在一项IIb期人类挑战感染模型（CHIM）试验中进行了测试。基于O-多糖的S. sonnei GMMAs已被证明在健康成人和疾病流行国家中耐受性良好且具有免疫原性，接种一剂疫苗后引发杀菌抗O-多糖IgG反应。值得注意的是，与初次免疫相隔3年的复种显示了疫苗诱导强大的记忆反应的能力。 1790GAHB在CHIM试验中未能显示临床效力，可能由于测试的O-多糖剂量低导致的免疫反应不足。然而，基于这些结果，已经开发了一种新的S. sonnei构建物，允许增加10倍的O-多糖剂量。这样的GMMAs已与志贺氏菌flexneri 1b、2a和3a GMMAs结合在一种4组分配方中，目前正在进行一项I/II期试验（NCT05073003）。 还有流行病学证据表明，B型脑膜炎奈瑟菌OMV疫苗对淋病奈瑟菌有中等程度的效力，导致人们建议基于OMV的疫苗可能适合预防淋菌感染，既可以通过针对脑膜炎球菌B的疫苗（NCT04297436和NCT04415424），也可以与特定的N. gonorrhoeae GMMAs结合，正在进行临床试验（NCT05630859）。 疫苗具有异源靶标，其中OMVs与另一种抗原结合，也在早期临床开发中，例如Intravacc BV开发的通过鼻内途径给药的针对2019年冠状病毒病（COVID-19；Avacc 10）的疫苗（NCT05604690）。 4.临床前研究中出现的趋势 传统上，OMVs被提出用于对抗它们所衍生的病原体引起的疾病，其中一些已获得许可或正在进行临床开发，还有许多处于临床前阶段。免疫反应可以针对LPS而不是蛋白质成分，正如早期对自然释放的V. cholerae OMVs的研究所显示的那样，这些研究通过粘膜免疫引发了抗体反应，保护小鼠后代免受口服V. cholerae的挑战，并确保对两种流行病学上最相关的O1血清型的Inaba或Ogawa变体的交叉保护。OMVs未能与O139交叉反应。 最近的研究已经展示了如何轻松进行遗传操作，以进一步提高OMV的安全性、免疫原性和保护效率。例如，已经显示破坏小的非编码RNA可以改善OMVs对小鼠模型中幽门螺杆菌感染的保护效率。使用鞭毛蛋白缺陷的S. typhimurium OMVs进行鼻内和腹腔免疫，有效地保护了异源S. choleraesuis和S. enteritidis的挑战，使用主要外膜蛋白缺陷的S. typhimurium突变体的OMVs进行免疫，增强了交叉保护。 最近，OMVs也被提出作为异源抗原的递送系统。事实上，OMVs可以被修改以显示来自不同（甚至是系统发育上距离很远的）病原体（病毒、细菌、寄生虫）的蛋白质或多糖。 4.1.作为异源蛋白载体的OMVs 特别是，由大肠杆菌菌株产生的OMVs已被用作重组蛋白的递送系统。通过将抗原融合到分泌信号或周质蛋白上，已用于在囊泡腔中表达重组抗原（图1）。通过双精氨酸（Tat）信号序列，GFP在大肠杆菌OMVs的腔中表达。通过与丰富的外膜蛋白OmpA的周质侧融合，在大肠杆菌OMVs的腔中表达腔隙，已针对A组链球菌（例如，Slo，SpyCEP，SpyAD）、B组链球菌（例如，SAM_1372）和沙眼衣原体蛋白抗原进行了测试。肺炎链球菌表面粘附素A（PspA）通过与N末端β-内酰胺酶信号序列的融合，在鼠伤寒沙门氏菌OMVs的腔中表达。 然而，为了更强的免疫反应，蛋白质定位在OMV表面应该更受青睐。只有少数研究报告了在OMV表面或囊泡腔中呈现相同抗原的直接比较。在V. cholerae OMVs中加载的大肠杆菌碱性磷酸酶PhoA，在小鼠鼻内免疫后引发了低免疫反应，可能因为酶位于OMV腔中的位置与表面相反。在Fantappiè等人的研究中，OMVs针对加载在大肠杆菌OMVs腔中的GAS和GBS蛋白诱导了高功能性抗体滴度，并且用Slo-OMV-和SpyCEP-OMV免疫的小鼠对GAS致死挑战有保护作用。同样，用PspA在鼠伤寒沙门氏菌OMVs腔中鼻内免疫的小鼠发展了抗原特异性血清抗体反应，而等剂量的重组PspA没有发展出可检测的反应。用重组OMV免疫的小鼠对肺炎链球菌挑战有保护作用。然而，建议进行额外的研究，以评估是否通过将抗原定位在OMV表面可以增强抗PspA免疫反应。Salverda等人证明，与具有OspA腔隙表达的构建物相比，在脑膜炎奈瑟菌OMVs表面表达的表面暴露的脂蛋白OspA导致强烈的抗OspA抗体反应，其中没有观察到抗原特异性抗体反应。Necchi等人也获得了类似的结果，他们直接比较了在S. typhimurium GMMAs内或化学连接在GMMA表面的N. meningitidis fHbp。在GMMAs腔中表达的fHbp引发的免疫反应极低，远低于在GMMA表面显示的相同抗原。作者还清楚地表明了需要在GMMAs上拥有fHbp（通过遗传操作或化学偶联），与fHbp与GMMAs物理混合相比，引发更强的杀菌反应。 然而，在OMV表面表达异源蛋白相当具有挑战性，通常以低表达水平为特征，并且取决于抗原。已经提出了不同的表面蛋白表达策略。通常通过蛋白水解处理超出细胞表面的蛋白质可以通过防止蛋白水解来保留在OMV表面。感兴趣的蛋白质可以融合到膜相关蛋白上，例如自转运体的β-桶结构域（例如Hbp，AIDA）。大肠杆菌的自转运体血红蛋白酶（Hbp）被用来在鼠伤寒沙门氏菌OMVs上表达结核分枝杆菌蛋白和沙眼衣原体的主要外膜蛋白MOMP的表位。相同的系统被用来在沙门氏菌OMVs上展示两个肺炎链球菌蛋白抗原的高密度。用得到的OMVs进行鼻内免疫在小鼠肺炎链球菌定植模型中诱导了强大的保护，无需粘膜佐剂。这种抗原展示方法非常高效，但似乎仅限于小蛋白。Kim等人将几种异源蛋白融合到孔形成细胞毒素ClyA的C-末端。工程化的大肠杆菌OMVs显示绿色荧光蛋白（GFP），与ClyA遗传融合，与单独的GFP相比，在免疫小鼠中引发了更强的抗GFP抗体滴度。通过相同的表达系统，表达Acinetobacter baumannii Omp22的大肠杆菌OMVs比用更高剂量的重组Omp22蛋白配制的铝免疫接种诱导了显著更高的Omp22特异性抗体。通过融合到膜锚定的第二脂蛋白fHbp，实现了在脑膜炎奈瑟菌OMVs上的OspA表面表达。 基于严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）的重组、六脯氨酸稳定的、D614G刺突蛋白（mC-Spike）与脑膜炎OMVs的LPS结合肽序列mCramp（mC）融合的COVID-19亚单位疫苗，在金黄叙利亚仓鼠模型中，通过鼻内免疫，引发了高水平的中和抗体，并检测到粘膜反应。候选疫苗在仓鼠挑战模型中也具有保护作用。工程化的OMVs，结合来自SARS-CoV-2刺突蛋白的受体结合基序（RBM）的肽，也已经制成，并在小鼠中显示可引发中和抗体。 2009年大流行性流感A病毒（H1N1）株H1型血凝素（HA）与中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）的受体结合域（RBD）的嵌合融合蛋白也已在大肠杆菌DH10ß的OMVs上表达，诱导小鼠产生免疫反应，保护免受流感挑战。 已经提出了其他装饰OMVs表面异源蛋白的方法，其中抗原分别产生并在OMV生产后添加（图1）。在这些策略中，SpyTag-SpyCatcher系统使用链球菌表面蛋白的SpyCatcher结构域，该结构域识别一个相应的13氨基酸肽（SpyTag）。识别后，在SpyCatcher的一个赖氨酸侧链和SpyTag的一个天冬氨酸之间形成了共价异肽键。SpyTag在OMVs上表达，并用于与任何蛋白融合的SpyCatcher偶联。 这种方法最近被用来将带有SpyTag的SARS-CoV2-Spike的RBD域偶联到展示Hbp并用SpyCatcher肽修饰的鼠伤寒沙门氏菌OMVs。候选疫苗在仓鼠模型中具有免疫原性和保护性。 最近，提出了一种基于亲和素的疫苗抗原交联方法，其中生物素化蛋白链接到表面经过生物素结合蛋白重塑的OMVs的外部。在小鼠中测试得到的OMVs，引发了强烈的抗原特异性抗体反应。 此外，化学偶联蛋白到OMVs也已被使用，目的是用异源蛋白抗原装饰OMVs，并有可能产生多组分疫苗。化学偶联是一种快速利用OMVs作为载体的方法，它允许在一定范围内更好地控制显示在囊泡上的抗原量和密度。来自不同病原体（N. meningitidis、Salmonella、Shigella）的OMVs已与不同蛋白（N. meningitidis fHbp、大肠杆菌SslE和FdeC、疟疾蛋白Pfs25、Pfs230和CSP等）链接，显示出OMVs上的抗原引发比单独蛋白抗原更强的功能性抗体反应。化学方法最近已扩展到病毒抗原（例如流感A病毒血凝素和狂犬病糖蛋白），证实了OMVs显著增加抗原特异性体液和细胞反应的能力。 4.2.糖偶联OMVs OMVs也被提出作为多糖的载体，从上述许可的Hib-OMPC结合疫苗开始，最初在动物中诱导抗体反应，并通过与TLR2结合触发细胞因子介导的反应。将Hib多糖偶联到B. pertussis的dOMVs也被证明是一种可行的方式，以诱导对百日咳和H. influenzae的双重反应。 考虑到它们的生产和纯化的便利性，以及增强免疫反应的潜力，最近有许多例子报道了使用GMMAs作为多糖载体。 GMMAs可以作为化学链接多糖的载体，提供将多糖偶联直接到LPS/脂寡糖（LOS）或暴露在囊泡上的蛋白质的可能性（图1）。来自不同病原体（N. meningitidis A和C群、H. influenzae b型、A组链球菌碳水化合物和Salmonella typhi Vi）的各种结构多样的多糖已成功共价结合到GMMAs上，引发动物中强烈的抗多糖免疫反应。所引发的抗体水平和功能性受每个GMMA连接的糖数量的影响不大，尽管较低的糖负荷被证明更好地确保了GMMA暴露蛋白的免疫原性。另一方面，需要针对具体情况优化糖链长度，以获得强大的免疫反应。与蛋白质连接相比，LOS/LPS导向的偶联在诱导对多糖的强大功能性免疫反应方面也同样有效。 OMV和GMMA结合了展示多拷贝碳水化合物的能力，有利于B细胞激活，并以其在天然细菌环境中的呈现。此外，它们的尺寸对免疫刺激是最佳的，并且由于存在如TLR2和4等TLRs，它们促进了内在的佐剂属性。有趣的是，使用S. sonnei和S. typhimurium的GMMAs作为模型，观察到诱导的免疫反应是由FDC向相应B细胞的抗原呈递介导的。TLR4的参与被看作是诱导强烈抗体产生的关键，而TLR2的激活似乎在GMMA的免疫原性中没有发挥作用。 除了化学偶联外，GMMAs和OMVs也可以被工程化以表达异源糖基，从而产生所谓的糖工程OMV（glyOMV）。不表达聚合O-多糖的大肠杆菌菌株已被基因改造，以在wbbL基因中插入异源多糖的生物合成操纵子，同时保持脂质A核心作为受体的生产。通过这种策略，异源糖基结构在内膜的细胞质侧合成，在天然未脱脂的焦磷酸载体（Und-PP）上组装，并通过内源性fippase Wzx的作用转移到周质侧。最后，内源性O-抗原连接酶‘WaaL’将组装好的多糖整体转移到脂质A-核心结构上。或者，工程化的糖基可以从头开始，一个残基接一个残基地组装，从内膜细胞质侧表达的截断的脂质A-核心的末端糖开始，然后以MsbA依赖的方式翻转到周质中。得到的LPS分子被运输到外膜，并通过Lpt蛋白复合物翻转到细胞外空间，使糖基工程化的脂质A-核心结构被转移到外膜并结合到囊泡中。由于可以在大肠杆菌中结合多种质粒编码的O-多糖生物合成途径，这种方法使OMV成为一个“即插即用”的平台，用于展示来自不同致病细菌的糖表位。 使用这种策略，Chen等人产生了一组包含来自八种致病细菌的O-多糖的糖基工程OMVs（glyOMVs），包括高度致病的弗朗西斯菌属土拉热菌A型Schu S4菌株（创建ft-glyOMVs）。免疫两周后，ft-glyOMVs在小鼠中诱导了与天然ftLPS相比O-多糖特异性IgG水平高出两到三倍。小鼠免受F.tularensis Schu S4的致命挑战，以及与F. tularensis亚种holarctica B型菌株的挑战，这些菌株表现出具有相同结构的O-多糖。Ft-glyOMVs在皮下给药时还引发了保护性的IgA介导的粘膜免疫反应。 Price等人成功地将大肠杆菌OMVs工程化以表达肺炎链球菌的荚膜多糖。GlyOMVs诱导的血清IgG调理吞噬滴度与PCV13中相应的化学结合物相当。大肠杆菌OMVs还被糖基工程化以表达C. jejuni的七糖，显示出在接种的鸡中挑战后细菌定植减少。 Stevenson等人使用大肠杆菌的超囊泡化JC8031菌株，在OMV表面实现了PNAG多糖的高水平表达。在PNAG阳性JC8031细胞中表达S. aureus PNAG去乙酰化酶IcaB（dPNAG-glyOMV），以富含去乙酰化的PNAG的glyOMVs。用两种工程glyOMVs免疫小鼠，结果产生了高水平的PNAG特异性抗体，但只有由dPNAG-OMVs诱导的抗体能够在体外杀死两种不同的PNAG产生细菌物种（即，革兰氏阳性的S. aureus和革兰氏阴性的F. tularensis holoartica）。候选疫苗还在小鼠中诱导了对致命剂量的S. aureus和F. tularensis的保护。 Tian等人在沙门氏菌OMVs中生物合成了S. flexneri 2a O-多糖，研究表明，通过鼻内和腹腔免疫小鼠，OMV疫苗在血清中诱导了显著的特异性抗-志贺氏菌LPS抗体，在阴道分泌物和支气管肺泡灌洗液中诱导了IgA，并提供了对致病性S. flexneri 2a感染的显著保护。 5. 结论 OMVs在使用上有着悠久而丰富的历史，特别是在针对N. meningitidis和b型流感嗜血杆菌的疫苗中。已经产生了大量临床前数据，以对抗许多其他病原体，支持使用OMVs及其遗传修改版本（GMMAs）作为提供同源和异源蛋白和多糖抗原的有前途的、负担得起的平台。 OMVs的纳米尺寸被认为可以增强被APCs的摄取，其激活是通过TLRs识别OMVs上的多种PAMPs而发生的。B细胞激活是通过OMV表面表位的重复和OMVs的尺寸促进的，这允许它们直接进入淋巴系统。T细胞/B细胞合作对于产生高亲和力抗体的浆细胞和记忆B细胞至关重要。对OMV作用方式的更多研究将有助于更好地理解这类疫苗的免疫是如何诱导的，并有助于阐明所确定的机制是与平台相关的还是病原体特定的。 COVID-19大流行以及抗生素抗性的出现，正在催化基于新型囊泡的候选疫苗进入临床开发（表1）。同源脑膜炎奈瑟菌OMVs包含在许可的疫苗中，并且正在对源自它们的同源病原体进行GMMAs的临床研究。当前试验的数据，无论是安全性还是免疫原性，将关键地进一步支持使用该平台进行新型疫苗开发。 该领域的当前进展集中在OMVs和GMMAs作为异源蛋白和多糖抗原的载体（图1）。使用这种技术开发的COVID-19疫苗（Avacc 10）正在进行临床测试。通过不同的新技术，包括化学偶联、分子工程和Spy-tag/Spy-capture，已经证明生成这种多组分囊泡是可行的。这些新方法将有助于简化针对各种不同病原体机制或甚至不同病原体的疫苗。我们预计，未来这类疫苗将取得显著进展，并将有更多的基于囊泡的疫苗可用，以帮助对抗新兴疾病和未满足的医疗需求。 为了推动人用及兽用疫苗行业交流，共同探讨该领域的最新研发进展、产业化现状及未来发展趋势，生物制品圈联合四叶草会展将于2024年8月16日-17日在苏州共同举办“第三届新型疫苗研发峰会”。诚邀全国相关领域专家、学者和企业家共享学术盛会。现将有关事宜通知如下。 名称：2024第三届新型疫苗研发峰会 时间：2024年8月16-17日（周五-周六） 地点：苏州（酒店定向通知） 主办单位：四叶草会展、生物制品圈 媒体支持：药时空、抗体圈、细胞基因研究圈 会议费用：点击二维码即可查询。 报名方式：扫描下方二维码→ 填写表格 → 报名成功（报名志愿者，免交报名费，承担一定工作任务）！ 转发分享福利：疫苗研发企业、科研院校和监管机构人员，前30位报名人员转发分享会议信息可免费参会（不含餐饮）报名后，扫描下方二维码加工作人员微信后，发送截图即可。 组委会获得报名信息后，根据报名信息进行初筛，并进一步与报名者沟通确认，实现精准邀请，最终有机会进入大会微信群（严格审核通过）。 大会日程 已经确定的报告人 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。