Noxa

引言 细胞死亡在生物体的发育和稳态维持中起着关键作用。不同形式的细胞死亡，包括凋亡（Apoptosis）、坏死性凋亡（Necroptosis）、焦亡（Pyroptosis）和铁死亡（Ferroptosis），不仅在清除受损或过时的细胞中发挥作用，也在抑制病原体扩散中扮演重要角色。24年1月，Cell杂志刊文综述了各种细胞死亡路径的信号机制，探讨这些细胞死亡过程的异常激活或抑制如何导致疾病，并讨论了针对细胞死亡失衡状态的现有和潜在治疗方法。 细胞死亡可以是非溶解性的，且在免疫上相对沉默（凋亡），或者是溶解性的且促炎症的（坏死）。在多细胞生物中，基因程序化的细胞死亡被认为是维持稳态的重要支柱，但即使是单细胞生物也可以通过细胞死亡来抵御病原体或为适应营养匮乏而限制群落大小。非溶解性的细胞死亡程序最初是基于其形态学特征来定义的，这些特征包括细胞质空泡化、核浓缩和细胞膜起泡。其背后的分子机制在三个不同领域的多年研究之后才逐渐清晰。首先是认识到在遗传上易于操作的秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）中某些细胞可重复地经历凋亡。随后的遗传筛选识别出了细胞死亡的介导者（egl-1、ced-3和ced-4）和细胞死亡的抑制因子（ced-9），尽管当时它们还不能被赋予可识别的生化活性。关于ced-3功能的认识来自于对哺乳动物促炎症白细胞介素-1β（IL-1β）成熟的蛋白酶的鉴定。CED-3与这种现在被称为半胱天冬酶-1（caspase-1）的IL-1β转化酶之间的同源性促使人们认识到CED-3 是一种蛋白酶，并且秀丽隐杆线虫中的程序化细胞死亡是由蛋白水解驱动的。 ced-9基因在哺乳动物中有一个功能对应物，即B细胞淋巴瘤基因2（BCL-2），这是一种在人类滤泡性淋巴瘤中通过染色体易位激活的原癌基因。与许多其他原癌基因不同，BCL-2并不诱导增殖，而是抑制细胞死亡，并且能够在线虫中功能性地替代ced-9。在这些关键发现之后，进一步鉴定出了额外的哺乳动物半胱天冬酶(Caspase，半胱氨酸依赖的天冬氨酸定向蛋白酶）。此外，BCL-2被发现是控制Caspase激活的一个更大家族的成员，这个家族被称为内源性凋亡途径的裁决者。在外源性凋亡途径的形式中，出现了更多的复杂性，以及病原体对死亡途径成分的征用。对受感染细胞的研究显示，某些形式的坏死（即细胞破裂并释放促炎症内容物）也是基因程序化的。这些细胞死亡途径被称为焦亡（pyoptosis）和坏死性凋亡（necroptosis）。拥有多种死亡方式是对抗寻求保持其复制生态位的病原体的有效寄宿策略。 在成年人中估计每天有惊人的10^11个细胞经历程序化细胞死亡，这相当于我们一年内整个体重的细胞。通过细胞增殖，身体维持现状，同时排除老化、功能失调、受感染或突变的细胞。因此，扰乱细胞增殖与细胞死亡之间的稳态平衡将导致机体功能失调。过少的细胞死亡会导致过度增殖疾病，如癌症，而过多的细胞死亡则导致退行性疾病，如神经退行性疾病。在这里，本文主要基于当前对各种细胞死亡途径的主流观点，由于研究众多，有的令人困惑，甚至矛盾。为了避免遗漏某些进展，我们主要选择那些通过生物化学和遗传学相结合的方法经过考验的观点和证据，相对更能经受住时间的考验。内源性凋亡——从线虫到哺乳动物在秀丽隐杆线虫（C. elegans）中，许多内源性凋亡信号传导在哺乳动物中也有保留，但哺乳动物的细胞死亡途径更为复杂（见图1）。相似之处包括使用支架蛋白来协调半胱天冬酶（caspase）的激活。在C. elegans中，CED-4担当此功能，用于激活半胱天冬酶CED-3，而在哺乳动物中，凋亡肽酶激活因子1（Apoptotic peptidase activating factor 1，APAF-1）介导caspase-9的聚合。这一过程在BCL-2同源区3（BH3）-仅蛋白（BH3-only proteins）（如C. elegans中的EGL-1；哺乳动物中的细胞凋亡相关BCL-2拮抗剂（BAD），BH3相互作用域死亡拮抗剂（BID），BCL-2相互作用杀手（BIK），BCL-2相互作用的细胞死亡介质（BIM），BCL-2修饰因子（BMF），harakiri（HRK），NOXA（也称为12-肉豆蔻酸-13-醋酸诱导蛋白1）、以及p53上调的凋亡调节剂（PUMA））与BCL-2蛋白家族的促存活成员（C. elegans中的CED-9；哺乳动物中的BCL-2、BCL-XL、髓细胞白血病基因1（MCL-1）、BCL-W以及胎儿肝中表达的BCL-2相关基因（BFL-1；在小鼠中称为A1））结合，从而抑制它们。这些BH3-仅蛋白（BH3-only proteins）的表达在发育信号或应激刺激（例如，营养剥夺、DNA损伤和内质网（ER）应激）的作用下增加，通过多种转录和翻译后机制实现。 图1 - 哺乳动物内源性凋亡信号传导途径与秀丽隐杆线虫和果蝇的凋亡信号传导对比（Credit: Cell） 在C. elegans中，CED-9通过阻止CED-4激活caspase CED-3来维持细胞存活。相比之下，哺乳动物中促存活的BCL-2家族蛋白通过限制它们的促凋亡成员，即BCL-2相关X蛋白（BAX）和BCL-2拮抗剂/杀手1（BAK），来防止caspase的激活。未受抑制的BAX和/或BAK聚合，并导致线粒体外膜渗透（Mitochondrial outer membrane permeabilization，MOMP），从而释放促进凋亡的线粒体因子进入细胞质。线粒体释放的细胞色素c与adaptor APAF-1相互作用，促进凋亡体复合体的组装，有助于起始caspase，即caspase-9的二聚化和激活。线粒体释放的DIABLO（也称为线粒体衍生的第二凋亡激活因子[SMAC]）或HtrA丝氨酸蛋白酶2（HTRA2）阻止X连锁的凋亡蛋白抑制剂（XIAP）对caspase的抑制。虽然C. elegans没有类似BAK或BAX的蛋白，但其他线虫却有。因此，C. elegans可能是进化中的一个特例，因为它通过与CED-4的结合，以更直接的方式抑制caspase的激活，从而放弃了对凋亡的线粒体调控。或者，被BH3-only protein EGL-1结合的CED-9可能像BAX或BAK一样发挥功能。有证据表明CED-9与线粒体外膜相关，但EGL-1的亚细胞定位不太清楚。哺乳动物的caspase-9通过蛋白水解激活所谓的执行者caspase（caspase-3、-7和可能的-6），导致数百种细胞蛋白的切割。这些切割事件中的一些有助于拆解细胞，而其他则激活促进吞噬凋亡细胞及其膜包裹的碎片（称为凋亡体，apoptotic bodies）的过程。前者的一个例子是caspase-3或-7对caspase激活的脱氧核糖核酸酶抑制剂（ICAD，inhibitor of caspase-activated deoxyribonuclease）的切割，这释放了caspase激活的脱氧核糖核酸酶（CAD，caspase-activated deoxyribonuclease）以介导染色体DNA的核间切割。后者的一个例子是对XK相关蛋白8（XKR8，XK related 8）的蛋白水解激活，导致磷脂酰丝氨酸在细胞表面显示为“吃我”的信号，以吸引吞噬细胞。吞噬作用对凋亡的非炎症性质很重要。如果凋亡细胞未被“吞噬”，它们最终可能发展出膜损伤。细胞内损伤相关分子模式（DAMPs, damage-associated molecular patterns）的释放向邻近细胞发出“警报”，触发促炎症反应。DAMPs包括DNA、ATP和蛋白质，如高迁移率族蛋白盒1（HMGB1, high mobility group box 1）和IL-1α。调节凋亡细胞的吞噬作用的过程在进化过程中得到了保留，凸显了它们对正常发育和成年组织稳态的重要性。果蝇（Drosophila melanogaster）是另一种用于研究程序性细胞死亡（programmed cell death）的模式生物。在果蝇中，Debcl、Buffy和Sayonara属于BCL-2蛋白家族（BCL-2 protein family），但它们在程序性细胞死亡中的作用比其哺乳动物和秀丽隐杆线虫（C. elegans）的对应物有限。果蝇的半胱天冬酶（caspases）主要受到细胞凋亡抑制蛋白（IAPs, inhibitor of apoptosis proteins）的控制（见图1）。果蝇中程序性细胞死亡的触发是由IAP抑制剂Reaper、Hid和Grim的诱导表达引起的。哺乳动物的IAPs在抑制细胞死亡中也扮演重要角色，但XIAP是唯一直接针对caspase的哺乳动物IAP，它抑制caspase-3、-7和-9。 BCL-2蛋白家族 BCL-2家族的成员可以分为三个亚组：促凋亡的BH3-only protein、促生存蛋白和促凋亡效应蛋白。哺乳动物的促生存蛋白具有四个BH区域（BH regions）、一个C末端跨膜域（TM domain, transmembrane domain）和一个疏水表面凹槽，用于介导与BCL-2家族两个促凋亡亚组的BH3域的相互作用。效应蛋白BAX、BAK和与BCL-2相关的卵巢杀手蛋白（BCL-2-related ovarian killer，BOK）的结构与促生存蛋白非常相似。它们也具有四个BH区域（由一个保守序列基序定义的BH4域）、一个TM域和一个BH3结合表面凹槽。相比之下，许多BH3-only protein在未与促生存家族成员结合时是未结构化的（unstructured）。 促凋亡效应蛋白BAX、BAK和BOK 大多数健康细胞都表达可检测量的BAX和BAK，尽管有些细胞表达其中之一的量要多得多。缺乏BAX的小鼠表现出雄性不育和轻微的脾肿大，而缺乏BAK的小鼠基本正常。然而，BAX和BAK的联合缺失通常产生严重的颅面异常，这在出生时是致命的。这种表型在缺乏BOK的小鼠中会加剧。与BAX和BAK不同的是，BOK似乎不受促生存BCL-2蛋白的抑制。BOK的丰度和活性反而受到位于内质网（ER）的泛素连接酶gp78的抑制，gp78将BOK定位为蛋白酶体降解。来自Bax−/− Bak−/−或Bax−/− Bak−/− Bok−/−小鼠的细胞对所有测试的内源性凋亡刺激都极度抵抗，这表明BAX和BAK在凋亡中具有很大的重叠功能，作为必需的凋亡效应蛋白，而BOK的作用是辅助的。尽管它们具有广泛的功能重叠，BAX和BAK之间还是有显著差异。尽管两者都与线粒体外膜上的促生存BCL-2蛋白相互作用，但健康细胞中的大多数BAX是细胞质的，其跨膜结构域嵌入其疏水凹槽内。BAX激活时跨膜域是如何被置换的目前还不太清楚。BAX和BAK的另一个区别是，BCL-2被认为主要抑制BAX，而MCL-1抑制BAK，但BCL-XL可以有效地抑制这两种蛋白。有趣的是，电压依赖性阴离子通道2（VDAC2, voltage-dependent anion channel 2）允许BAX定位到外线粒体膜上杀死细胞，但相反，它可以抑制BAK的激活。尽管经过多年的深入研究，BAX或BAK形成的介导线粒体外膜通透性改变（MOMP）的孔的结构仍然是个谜。BH3-only proteinsBIM、PUMA和被蛋白水解裂解的BID（称为截短的BID或tBID）与所有促生存BCL-2蛋白高亲和力结合，因此是强有力的凋亡启动因子。其他的BH3-only protein则以更选择性的方式结合。NOXA仅与MCL-1和A1/BFL-1结合，而BAD、BIK和HRK主要与BCL-XL结合，程度较小的与BCL-2和BCL-W结合。因此，这些BH3-only protein往往是较弱的杀手，因为它们只抑制保护细胞的部分促生存BCL-2蛋白。特定的BH3-only protein，尤其是BIM、PUMA和tBID，也可能通过与BAX和BAK直接相互作用来触发凋亡。然而，对缺乏所有BH3-only蛋白的细胞系的分析表明，这些相互作用对启动凋亡并非必需。当保护细胞的促生存BCL-2蛋白通过遗传手段移除或用小分子BH3模拟物抑制时，细胞仍然经历BAX或BAK介导的凋亡。这些发现总体上与一种模型一致，即BAX和BAK需要被促生存BCL-2蛋白抑制以维持细胞活性。当促生存BCL-2蛋白被BH3-only protein或蛋白酶体降解（下文描述）中和时，凋亡就会启动。启动凋亡的BH3-only protein取决于应激刺激和细胞类型。BIM在免疫耐受中起主要作用，通过清除自反应性B细胞和T细胞。它还通过移除免疫反应后不再需要的B细胞和T细胞，帮助免疫细胞的稳态。BIM和PUMA促进由生长因子剥夺、钙通量失调、糖皮质激素或内质网（ER）应激引发的凋亡。转录因子和肿瘤抑制因子p53（在小鼠中也称为转化相关蛋白53 [TRP53] (transformation related protein 53)，在人类中称为肿瘤蛋白p53 [TP53] (tumor protein p53)）通过诱导Puma和Noxa的表达促进凋亡。BID通过caspase-8在外源性凋亡途径（下文描述）或通过细胞毒性T细胞或自然杀伤细胞释放的颗粒酶B (granzyme B)裂解而激活，后者通过穿孔素孔进入细胞。针对基因定位的小鼠的分析表明，BMF、BAD、BIK和HRK在启动凋亡中的作用不太突出。Pro-survival BCL-2 proteins所有促生存BCL-2蛋白（pro-survival BCL-2 proteins）都定位于线粒体外膜的外侧，但BCL-2也存在于内质网和核膜上。BCL-XL的相当部分是细胞质的。BCL-2、BCL-XL和BCL-W相对稳定，需要数小时才能转换，而MCL-1和A1/BFL-1是不稳定的蛋白，它们的半衰期以分钟而非小时计算，因为它们被泛素化并定向蛋白酶体降解。因此，当RNA或蛋白质合成停止时，MCL-1和A1/BFL-1的水平会急剧下降，依赖它们的细胞将死亡。许多病毒也产生促生存BCL-2同源物或结构类似物，强调内源性凋亡在消除病毒感染细胞中的重要作用。在小鼠中的遗传研究确定了不同促生存BCL-2蛋白的关键功能。A1的丧失只引起选择性造血细胞亚群的轻微缺陷。缺乏BCL-W的小鼠也基本正常，除了雄性不育。小鼠中缺乏BCL-2会导致过度的BIM驱动的凋亡，减少成熟B细胞和T淋巴细胞的数量，并导致过早白发以及致命的多囊肾病。BCL-XL缺乏在小鼠发育的胚胎第13天是致命的，因为这妨碍了血小板以及某些神经和红细胞群体的存活。MCL-1的缺失影响最为显著，对于早期植入胚胎和广泛的细胞类型的存活至关重要，包括造血细胞群、心肌细胞和肠上皮细胞。在某些细胞类型中，必须消除两种促生存BCL-2蛋白才能观察到严重缺陷。例如，BCL-XL或MCL-1可以维持肝细胞和某些神经细胞群的存活。促生存BCL-2蛋白和BH3-only protein的水平被精细平衡，因为基因剂量减半可能会产生戏剧性后果。例如，Mcl-1+/− Bcl-x+/−小鼠在出生后不久即死亡，表现出严重的颅面异常，但Mcl-1+/− Bcl-x+/− Bim+/−小鼠则健康。由缺陷的内源性凋亡引起的疾病 如上所述，强制表达BCL-2抑制内源性凋亡，可能导致人类滤泡性淋巴瘤。在小鼠中，淋巴细胞转基因过度表达BCL-2会引起类似于系统性红斑狼疮（SLE, systemic lupus erythematosus）的致命自身免疫疾病和低发病率的淋巴瘤。这些发现突显了内源性凋亡在维护免疫耐受以及肿瘤生成中的重要性。值得注意的是，当造血细胞还有MYC的非调节表达时，BCL-2是一个更强大的致癌基因，MYC是一个推动异常细胞分裂的转录因子。过量的BCL-2使恶性和非转化细胞对广泛的抗癌药物产生抵抗，无论这些药物是以p53依赖还是非p53依赖的方式杀死细胞。特别是BIM和PUMA这样的BH3-only protein未能中和过量的BCL-2，这阻止了内源性凋亡。因此，为癌症治疗开发了模仿BH3-only protein功能的小分子BH3类似物。特定于BCL-2的BH3类似物Venetoclax（也称为ABT-199）目前已被许多监管机构批准用于治疗慢性淋巴细胞白血病（CLL, chronic lymphocytic leukemia）和急性髓性白血病（AML, acute myeloid leukemia），这些恶性病变主要依赖BCL-2而非其他促生存BCL-2蛋白来生存。针对MCL-1和BCL-XL的BH3类似物也已被开发，但它们在正常健康细胞中的靶向毒性构成了一个挑战。针对BCL-XL的治疗可能会导致血小板减少症，而心肌细胞、肠上皮细胞和血液细胞亚群是一些可能不耐受MCL-1抑制剂的细胞类型。将BH3类似物选择性地送达癌细胞的抗体偶联物的使用可能是限制正常健康细胞毒性的策略。在某些情况下，抑制内源性凋亡可以预防而非促进肿瘤发展。例如，在小鼠中，低剂量γ-射线诱导的胸腺淋巴瘤可被Puma缺陷所预防。解释是，成熟白细胞应激诱导的凋亡触发了大量的造血祖细胞的动员和增殖，从而产生了肿瘤原性病变（oncogenic lesion）。MCL-1缺陷导致的增强凋亡促进了小鼠肠道的肿瘤生成。因此，了解BH3类似物药物诱导的正常细胞凋亡是否可能为次发性治疗相关癌症埋下伏笔，就显得很重要了。过度的内源性凋亡与急性和慢性退行性疾病有关，包括缺血再灌注损伤和神经退行性疾病。至今为止，针对caspase的治疗策略并未取得成功，抑制剂在临床试验中展现出有限的疗效以及毒性。重要的是，抑制内源性凋亡途径中的caspase并不能阻止线粒体外膜通透性改变（MOMP）后的线粒体功能障碍和细胞死亡。目前正在努力寻找抑制BAX或BAK的抑制剂，但考虑到可能的靶向毒性，是否存在治疗窗口尚不清楚。外源性凋亡和坏死性凋亡外源性凋亡和坏死性凋亡途径主要由细胞表面的死亡受体结合的细胞外配体触发。通过caspase-8传递凋亡信号，而当caspase-8被抑制时，可能发生坏死性凋亡，这是一种溶解性的细胞死亡形式。坏死性凋亡可能作为一种抗病毒防御机制而进化，因为某些病毒，包括巨细胞病毒、单纯疱疹病毒、牛痘病毒和腺病毒，编码caspase-8的抑制剂以防止凋亡。与此观点一致的是，缺乏坏死性凋亡的小鼠比野生型（WT）小鼠更易感染牛痘病毒或缺乏坏死性凋亡抑制剂病毒诱导的RIPK3降解（vIRD, viral inducer of RIPK3 degradation）的变异牛痘病毒。与内源性凋亡途径中的caspase-9一样，caspase-8通过裂解并因此激活caspase-3和-7来执行凋亡程序。配体和死亡受体(death receptor)配对包括FAS配体（FASL）与FAS、肿瘤坏死因子（TNF）或淋巴毒素-α与肿瘤坏死因子受体1（TNFR1）、TNF样细胞因子1A（TL1A）与死亡受体3（DR3）以及与TRAILR1或TRAILR2（小鼠只有一个TRAILR）相关的诱导凋亡配体（TRAIL）。尽管它们的名字，死亡受体并不专门传递细胞死亡信号。许多细胞对TNFR1的激活不是通过死亡而是通过激活核因子κB（NF-κB）和丝裂原激活蛋白激酶（MAPK）信号通路，促进促炎症和促生存基因的表达。TNFR1信号机制的扰动可能会促使细胞死亡的诱导，并在下文中进行讨论。死亡受体之外，外源性凋亡或坏死程序（necroptosis）的机制也可以通过 Toll 样受体 3（Toll-like receptor 3, TLR3）、TLR4 或 Z-DNA 结合蛋白 1（Z-DNA binding protein 1, ZBP1）被激活。TLR3 通过内体（endosomal compartment）中的双链 RNA 被激活，而 TLR4 感应细菌的外细胞脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）并随后转移到内体。ZBP1 是内部的 Z-形核酸传感器，这种核酸具有左旋的双链螺旋结构，由一些病毒和内源性逆转录元件产生。TLR3 或 TLR4 信号的典型输出是促炎和促存活的基因表达，但如 TNFR1 信号传导所见，某些细胞缺陷可能会使信号传导倾向于细胞死亡。因此，当细胞暴露于某些死亡配体或病原体相关分子模式（PAMPs, pathogen-associated molecular patterns）时，如果立即受到威胁，反映在关键信号组件的损害上，它们可以将其反应从促炎和促存活基因表达升级为外源性凋亡或坏死程序。 TNFR1 TNFR1在许多细胞类型上表达，并在病原体防御中发挥重要作用，但持续激活该受体可能助长慢性炎症。事实上，TNF抑制剂，它们阻断TNF-TNFR1和 TNF-TNFR2信号，广泛用于治疗自发炎性疾病，如炎症性肠病、类风湿性关节炎和强直性脊柱炎。与所有死亡受体一样，TNFR1有一个细胞质同型蛋白互作基序(cytoplasmic homotypic protein interaction motif)，称为死亡结构域（death domain, DD）。在配体诱导的TNFR1寡聚化后，DD通过招募与死亡结构域相关的TNFRSF1A适配蛋白（TNFRSF1A associated via death domain, TRADD）和受体相互作用蛋白激酶1（receptor interacting protein kinase 1, RIPK1）启动所谓的复合体I的组装（图 2A）。TRADD 绑定到 TNF 受体相关因子2（TNF receptor associated factor 2, TRAF2），这是 cIAP1 和 cIAP2 泛素连接酶的适配蛋白。cIAP1 和 cIAP2 通过向 RIPK1 和复合体 I 的其他组件添加K63连接的多聚泛素链，帮助对接线性泛素链装配复合体（linear ubiquitin chain assembly complex, LUBAC）和TGF-β激活的激酶1（TGF-beta activated kinase 1, TAK1）。LUBAC然后向TNFR1、TRADD 和 RIPK1添加M1连接的多聚泛素链，这增强了招募典型IκB激酶（IKK）复合体的能力。复合体I中TAK1和IKK 的激活，参与了NF-κB和MAPK 信号通路，驱动促炎基因（例如Ccl2, Ccl3, Ccl5, Csf2, Cxcl1, Cxcl2, Il1b, Il6, Nos2 和 Tnf）和促存活基因（例如Bclx和Cflar，编码细胞FLICE抑制蛋白[cFLIP]的基因）的表达。 图 2-外源性凋亡信号通路（Credit: Cell） 线性泛素链装配复合体（LUBAC，linear ubiquitin chain assembly complex）也是 TANK 结合激酶 1（TBK1）和 IKKε 进入复合体 I 的必要条件。这些激酶通过磷酸化 RIPK1，从而抑制其诱导死亡的激酶活性。TNFR1 信号激活的其他激酶，包括 IKK 和 MK2（也称为 MAPK 激活的蛋白激酶 2），通过在 RIPK1 的不同位点磷酸化促进细胞存活。RIPK1 的 K63 连接泛素化也似乎抑制了其激酶活性。阻断 RIPK1 上的这些翻译后修饰会使 TNFR1 信号向细胞死亡倾斜。TNFR1 下游 RIPK1 的激活如何促进细胞死亡仍在阐明中。RIPK1 的激酶活性对于 TNF 诱导的 NF-κB 或 MAPK 信号是非必需的，RIPK1 的主要底物似乎是其自身。RIPK1 在死亡结构域介导的激酶二聚化后的自磷酸化使 RIPK1 获得进入次级细胞质诱导死亡的复合体 II 的资格。RIPK1 从复合体 I 到复合体 II 的转变由圆柱状纤维瘤症（cylindromatosis, CYLD）增强，这是一种去泛素化酶，可以移除 M1 或 K63 连接的多聚泛素。CYLD 通过其适配蛋白: 精子生成相关蛋白 2（SPATA2）被招募到复合体 I，后者又与 LUBAC 结合。CYLD 是否能够接触其底物似乎还受到泛素结合蛋白 A20（也称为 TNF alpha 诱导的蛋白 3）和 A20 结合并抑制 NF-κB（ABIN-1）的进一步控制。这些蛋白都被招募进入复合体 I，并可能通过 CYLD 抑制多聚泛素链的切割。据此模型，缺乏 ABIN-1 和 A20 的小鼠肠上皮细胞比其 WT 对应物更易于 TNF 诱导的细胞死亡。使用环己酰胺抑制蛋白质翻译也可以增强 TNF 诱导的细胞死亡敏感性，但在这种情况下，RIPK1 的激酶活性是非必需的。TRADD 可以独立于 RIPK1 成核复合体 II。无论是 TRADD 还是 RIPK1 形成复合体 II 的骨架，两种蛋白都可以与通过死亡结构域相关的 FAS（FADD）结合，这是 caspase-8 的适配蛋白。FADD 中的死亡效应结构域（DED）然后与 caspase-8 酶原体中的两个 DED 之一相互作用。caspase-8 中的串联 DED 支持由 caspase-8 及其催化不活跃的同源物 cFLIP 组成的螺旋状 DED 丝状体的组装。caspase-8 的近邻诱导的同源二聚体，或者 caspase-8 与长型 cFLIP（cFLIPL）的异源二聚体，自我蛋白水解处理产生完全活跃的 caspase-8。caspase-8 的催化亚基之间的切割允许构象变化，稳定活性位点，但在 caspase-8/cFLIPL 异源二聚体中这一点不那么关键。异源二聚体介导的 caspase-8 同源二聚体的切割可能促进 caspase-8 的激活，至少在最初阶段如此。caspase-8 与 cFLIPL 的比例很重要，因为丰富的 cFLIPL 可以通过限制 DED 寡聚体中合并的 caspase-8 的总量来抑制 caspase-8 的激活。较短的 cFLIP 异构体（例如人类 cFLIPS 和病毒 FLIP 蛋白）通过扰乱定向 caspase-8 二聚体的螺旋状 DED 丝状体来抑制 caspase-8 的激活。环己酰胺似乎通过减少高度不稳定的 cFLIPL 量来促进 TNF 诱导的凋亡。cFLIPL 丰度的严格调控可能是为了促进快速杀死蛋白质翻译受损的病毒感染细胞而进化的。一些病毒获得了自己的 cFLIPS 版本，作为阻断外源性凋亡的手段。其他病原体，包括肠致病性大肠杆菌（EPEC），也获得了其他阻止死亡受体信号传导的手段。例如，EPEC 毒力因子 NleB1 是一种乙酰葡萄糖胺转移酶，可以修改并禁用 DD，包括 TNFR1、TRADD、RIPK1 和 FADD 中的那些。许多未感染的原代细胞对 TNF 的反应是低水平的 caspase-8 激活，不会触发凋亡。现有证据表明，在这种情况下，caspase-8 切割复合体 II 中的 RIPK1 支架，从而在有足够活跃的 caspase-8 有效切割和激活 caspase-3 和 -7 之前破坏复合体 II。与此模型一致的是，消除 RIPK1 中 caspase-8 切割位点的杂合突变增强了 TNF 诱导的 caspase-8 激活和凋亡。XIAP，作为 caspase-3、-7 和 -9 的抑制剂，可能增加了一层保护，防止凋亡的诱导。报道的其他限制复合体 II 的机制包括通过自噬相关蛋白 9A (ATG9A) 将复合体靶向溶酶体，以及通过聚 ADP 核糖聚合酶 tankyrase-1 的多聚 ADP 核糖化和随后的泛素化而导致的复合体的蛋白酶体降解。健康细胞中TNFR1对caspase-8的“挠痒”并非徒劳，因为它为当病原体抑制caspase-8时稳定化诱导死亡的复合体II（Complex II）奠定了基础。如果在复合体II中，活跃的RIPK1未被caspase-8切割，则它可以激活激酶RIPK3，释放caspase独立的混合谱系激酶结构域样（Mixed Lineage Kinase Domain-Like, MLKL）介导的坏死性死亡（necroptosis，如下所述）。因此，通过疱疹病毒B13R、牛痘病毒CrmA或小分子泛caspase抑制剂对caspase-8的抑制，会使某些细胞对TNF诱导的细胞死亡更加敏感。RIPK1和RIPK3通过它们的RIP同型互作基序（RIP Homotypic Interaction Motifs, RHIMs）相互作用。RHIM驱动的RIPK3寡聚化激活其激酶活性，导致伪激酶MLKL的磷酸化。MLKL随后形成寡聚体并转移到膜上，引发细胞裂解。坏死性死亡作为一种抗病毒防御机制的重要性，通过发现阻止RIPK3激活MLKL的病毒MLKL样假体（decoys）而凸显出来。已经鉴定出通过干扰RHIM依赖的RIPK3激活或针对RIPK3进行蛋白酶体降解来阻断坏死性死亡的病毒和细菌蛋白。虽然人类RIPK3的功能丧失突变与单纯疱疹脑炎（herpes simplex encephalitis）有关，但目前尚不清楚该疾病是否源于病毒感染细胞坏死性死亡受损，因为RIPK3还有坏死性死亡独立的功能。与RIPK3坏死性死亡独立作用一致，极少数MLKL缺陷病例未表现出对传染性病原体的增加敏感性。在小鼠中，肠上皮细胞或角质细胞中过量的TNFR1驱动细胞死亡是炎症的强劲驱动因素。例如，在LUBAC功能受损的Sharpincpdm突变小鼠中，慢性增生性皮肤炎可通过消除TNFR1、CYLD、FADD、caspase-8或RIPK1的激酶活性而被阻止。由于肠上皮细胞中IKK亚单位NEMO的丧失引起的结肠炎也可通过丢失TNFR1、FADD或RIPK1的激酶活性而被阻止。因此，即使在没有促炎症NF-κB信号的情况下，TNFR1诱导的细胞死亡也能驱动炎症。过度的凋亡可能会破坏皮肤或肠道这些屏障，并允许微生物的涌入，进而驱动炎症。在人类中，TNFR1诱导的细胞死亡被认为是由TBK1或OTULIN缺陷引起的自身炎症综合征的重要驱动因素。OTU去泛素化酶具有线性连接特异性（OTULIN, OTU deubiquitinase with linear linkage specificity）通过从泛素连接酶去除M1连结的多聚泛素来保持LUBAC活性。缺乏TBK1或OTULIN的患者细胞在培养中表现出对TNF诱导死亡的高度敏感性，值得注意的是，这些患者接受TNF抑制治疗可以缓解疾病。与人类不同，小鼠中Tbk1或Otulin失活突变会导致胚胎死亡。Tbk1缺陷导致胎儿肝脏中由TNFR1和RIPK1激酶活性驱动的细胞死亡，而Otulin失活（或丢失核心LUBAC基因Hoil1或Hoip）引起的胚胎致死部分依赖于TNFR1和活跃的RIPK1。缺乏NEMO的人类中的一些炎症病变对TNF阻断有反应，鉴于IKK缺陷增强了TNFR1刺激的细胞死亡，它们也可能反映了异常的TNF诱导细胞死亡。编码A20的TNFAIP3的半数不足可以引起自身炎症和自身免疫症，有些患者对TNF阻断有反应。虽然A20缺陷增加了对TNF诱导细胞死亡的敏感性，但完全缺乏A20的小鼠会发展出独立于TNF或TNFR1信号的严重早发炎症。后一观察表明，TNF诱导的细胞死亡只是A20负向调控的几个促炎过程之一。表达低活性A20且具有失活的锌指7（Zinc Finger 7, ZnF7）泛素结合结构域的小鼠会发展出TNF驱动的关节炎，而在A20中同时突变ZnF4和ZnF7会引发与A20缺陷相关的更严重表型。在完全缺乏A20或A20 ZnF4/ZnF7突变小鼠中消除依赖caspase-8的细胞死亡和依赖MLKL的坏死性死亡的影响尚未报道。因此，尚不清楚死亡受体或TRIF依赖的TLRs引发的异常细胞死亡是否是其致死性的主要驱动因素。TNFR1(肿瘤坏死因子受体1)刺激细胞死亡在没有通路负调控因子基因突变失活的情况下，其在人类炎症性疾病中的作用尚不明确。尽管如下所述，RIPK1 (受体相互作用蛋白激酶1)抑制剂的临床试验可能提供一些见解，但是抑制RIPK1的激酶活性也可能阻止FAS、TRAILR1、TRAILR2、TLR3和TLR4触发的某些形式的细胞死亡。接受RIPK1抑制剂GSK2982772治疗的类风湿关节炎和结肠炎患者在临床试验中未显示出益处（ClinicalTrials.gov 研究: NCT02858492和NCT02903966），但其他RIPK1抑制剂正在皮肤红斑狼疮（ClinicalTrials.gov 研究: NCT04781816）和肌萎缩侧索硬化症（ClinicalTrials.gov 研究: NCT05237284）的临床试验中。DR3DR3的表达范围不如TNFR1广泛，主要发现于淋巴细胞上，但它似乎与TNFR1以相似方式发出信号。TL1A (肿瘤坏死因子样配体1A) 与DR3的结合主要刺激促炎细胞因子和趋化因子的产生，但如cIAP缺乏这类扰动会促进细胞质中诱导信号复合体的组装。TL1A抑制剂已被证明对炎症性肠病患者有益，这表明TL1A像TNF一样，是慢性炎症的重要驱动因子。FAS和TRAIL受体FAS、TRAILR1和TRAILR2这些死亡受体也通过两个连续的复合体发出信号，但顺序与TNFR1和DR3相反。与受体相关的复合体触发细胞死亡，而第二个细胞质复合体称为FADDosome（FADD相关复合体），在未能死亡的细胞中可以刺激NF-κB和MAPK信号通路。FAS或TRAIL受体的DD（死亡结构域）直接与FADD结合以激活caspase-8。尽管caspase-8可以直接切割并激活caspase-3和-7，但FAS在“第二型”细胞（例如小鼠肝细胞）中诱导的凋亡需要caspase-8介导的促凋亡BH3仅限蛋白BID的蛋白水解激活，产生tBID。需要激活内在途径以克服XIAP介导的caspase-3和-7的抑制。FAS和TRAIL受体像TNFR1一样，在caspase-8被抑制时可以信号触发坏死性凋亡，这种细胞死亡依赖于RIPK1的激酶活性。RIPK1被FADD招募至受体复合体，随后与RIPK3结合促进坏死性凋亡。FADDosome的组装需要FADD和caspase-8，但不需要caspase-8的催化活性。FADDosome似乎包含了TNFR1复合体I的许多组分，包括TRADD、cIAP1/2、RIPK1、TRAF2、IKK、TAK1和A20。对于抵抗TRAIL诱导细胞死亡的肿瘤细胞，FADDosome调控的基因表达已被提出可调节抗肿瘤免疫细胞反应。FASL和TNF是细胞毒性T细胞用来杀死其靶细胞的武器，除了穿孔素和颗粒酶。过度的TNFR1驱动细胞死亡和过度的FAS或TRAILR触发的细胞死亡都可能导致组织损伤和炎症。FASL还通过杀死不再需要的淋巴细胞来维持淋巴稳态。FASL或FAS功能受损的小鼠和人类会发展成自身免疫性淋巴增生综合征（ALPS），一种通常稀有的、非传统B和T细胞异常累积的疾病。FADD或caspase-8酶活性的缺失（阻止所有外源性凋亡）对小鼠和人类的影响不同。无法激活caspase-8的小鼠会因未受控的TNFR1-、RIPK1-、RIPK3-和MLKL依赖的坏死性凋亡而在胚胎期死亡。相比之下，缺乏FADD或caspase-8的人类可能表现出ALPS、反复感染和早发性炎症性肠病。是否坏死性凋亡驱动了人类疾病尚不清楚。受损的caspase-8切割RIPK1必须促进炎症，因为杂合性RIPK1突变破坏了caspase-8切割位点，导致周期性发热综合征。NEDD4结合蛋白1（N4BP1）的切割和失活可能导致FADD或caspase-8缺陷患者的先天免疫受损。在人和小鼠的骨髓细胞中，N4BP1通过仅通过髓样分化基因88（MyD88）适配器信号的TLRs抑制细胞因子和趋化因子的产生。N4BP1是一种泛素结合内核糖核酸酶，但它如何精确地限制细胞因子和趋化因子反应还需进一步研究。TLR3、TLR4和ZBP1TLR3和TLR4都利用含RHIM（RIP同源相互作用基序）的适配蛋白Toll/IL-1受体域含有诱导干扰素-β的适配蛋白（TRIF）来与RIPK1和RIPK3结合（图3A）。反过来，RIPK1可能招募TRADD-TRAF2-cIAP1/2和FADD-caspase-8，最终导致NF-κB和MAPK激活以及caspase-8依赖的N4BP1切割。已显示阻断LUBAC或同时阻断cIAP1和cIAP2可使TLR3信号转向强烈的caspase-8激活和细胞死亡。如果caspase-8被抑制，那么TLR3和TLR4都可以刺激坏死性凋亡。抑制RIPK1可阻止巨噬细胞中TLR3或TLR4诱导的坏死性凋亡，这表明RIPK1的激酶活性通常是TRIF依赖性坏死性凋亡所必需的。然而，小鼠的遗传研究表明，即使在RIPK1缺失的情况下，TRIF或ZBP1也可以激活坏死性凋亡。实际上，小鼠RIPK1似乎利用其RHIM来抑制TRIF或ZBP1诱导的坏死性凋亡，因为RIPK1 RHIM突变小鼠中的炎症和围产期死亡可以通过失去MLKL或同时失去TRIF和ZBP1来预防。与RIPK1阻止TRIF从事细胞死亡机械相一致，缺乏RIPK1的原代人成纤维细胞对LPS或TLR3激动剂poly(I:C)诱导的细胞死亡更为敏感。总体而言，这些数据表明RIPK1的激活可能缓解其RHIM依赖性但又不甚明了的TRIF或ZBP1信号抑制。 图3-TLR3和ZBP1的细胞死亡信号（Credit: Cell） RIPK1支架也抑制caspase-8驱动的细胞死亡，因为Ripk1缺失的小鼠在围产期死亡，除非消除caspase-8和MLKL依赖的死亡程序。相比之下，RIPK1的激酶活性对小鼠的存活来说是可有可无的。RIPK1似乎至少部分限制凋亡，是通过阻止TRADD-FADD-caspase-8信号复合体的组装。考虑到RIPK1和TRADD似乎并行作用并且绑定相同的DD蛋白，RIPK1的缺失可能允许更多TRADD进入信号复合体，同时伴随着NF-κB和MAPK信号受损和cFLIPL表达减少。RIPK1缺失的原代人成纤维细胞也增强了TNF诱导的细胞死亡。尽管RIPK1的缺失在小鼠中是致命的，但缺乏RIPK1的人类主要表现为免疫细胞功能障碍，导致淋巴细胞减少、感染、关节炎和早发性炎症性肠病。小鼠与人类对RIPK1的更广泛需求可能反映了物种特异性差异，例如RIPK1的表达模式或其他通路组分的差异。ZBP1具有两个Zα结构域用于识别Z型核酸和一个RHIM与RIPK3结合。ZBP1-RIPK3相互作用可以通过MLKL触发坏死性凋亡或通过RIPK1、FADD和caspase-8触发凋亡（图3B）。RIPK1的激酶活性对这种细胞死亡来说是非必需的。制造Z-RNA的病毒包括巨细胞病毒、流感A病毒、单纯疱疹病毒1和牛痘病毒。巨细胞病毒通过产生caspase-8和RHIM-RHIM相互作用的抑制剂来逃避细胞死亡，而牛痘病毒则产生caspase抑制剂和一个Zα结构域蛋白，用以屏蔽病毒Z-RNA免受ZBP1的检测。内源性逆转录病毒元件产生的Z型核酸在过度的ZBP1依赖性细胞死亡导致皮肤或肠道炎症的小鼠模型中被暗示。有趣的是，ZBP1信号的输出不仅限于细胞死亡。ZBP1还可以独立于RIPK3、RIPK1 RHIM或细胞死亡，促进干扰素刺激基因（ISGs）的表达。解开这一信号通路将是重要的，因为ZBP1对由Adar1突变导致的ISG驱动病理有所贡献。人类ADAR1突变引起的重症特征是ISG表达增加，包括艾卡蒂-古蒂耶症候群（Aicardi-Goutieres syndrome）。特异性腺苷脱氨酶RNA（ADAR1）具有Zα结构域，似乎绑定并编辑会否则激活ZBP1的Z-RNAs。鉴于ZBP1诱导的坏死性凋亡和ISG表达的促炎性质，其他人提出利用ZBP1激动剂来增强癌症免疫疗法。焦亡(Pyroptosis) 焦亡是指由细胞质膜上的gasdermin孔洞引起的细胞死亡。焦亡作为一种独特的细胞死亡程序，起源于对感染沙门氏菌的巨噬细胞的研究。这种感染巨噬细胞的死亡依赖于caspase-1，这是一种蛋白酶，可以蛋白水解成熟IL-18和内源性发热原IL-1β。后续研究揭示，在人类中，caspase-1、-4和-5，以及在小鼠中，caspase-1和-11，都可以通过切割gasdermin D（GSDMD）引起焦亡。GSDMD的N端切割片段通过寡聚化并在膜上形成孔洞，促进细胞裂解。GSDMD在细胞膜上的孔洞会破坏离子梯度，并导致水分的大量涌入，最终引发依赖于ninjurin 1（NINJ1）的细胞质膜破裂（PMR）以及大量促炎DAMPs的释放。然而，包括IL-1β在内的小型DAMPs可以通过GSDMD孔洞离开细胞。在某些情况下，细胞膜修复机制可能限制GSDMD孔洞的形成。GSDMD孔洞是否能在不触发焦亡的情况下释放IL-1β仍未解决。炎症小体(Inflammasomes)Caspase-1在细胞质复合体中形成活性二聚体，这些复合体被称为炎症小体（图4）。炎症小体的组装由感应特定DAMPs或PAMPs的蛋白质触发，然后形成寡聚骨架。一些“感应器”蛋白质直接与DAMPs或PAMPs结合，而其他蛋白质则检测DAMPs或PAMPs在细胞内引起的扰动。前者包括absent in melanoma 2（AIM2），它与病毒或细菌的双链DNA结合，以及NLR家族凋亡抑制蛋白（NAIPs），它们与细菌的鞭毛、针和内杆蛋白结合。NLR家族含有pyrin结构域的1（NLRP1）和caspase激活和招募结构域8（CARD8）能够感知某些感染，因为它们各自具有一个抑制结构域，可以被细菌或病毒酶修饰并靶向蛋白酶体降解。这种抑制结构域的去除促进了炎症小体的组装。 图4-炎症小体诱导的GSDMD依赖性焦亡（Credit: Cell） 识别PAMPs或DAMPs的炎症小体感应器包括PYRIN和NLRP3。PYRIN能够感知修改和失活Rho GTP酶的细菌毒素，PYRIN的去磷酸化和微管聚合在炎症小体组装中发挥作用。NLRP3对多种刺激物作出反应，包括细菌毒素nigericin、胞外ATP和与痛风相关的尿酸晶体。细胞内钾离子流出被认为是驱动NEK7依赖性NLRP3寡聚化的统一事件，但这一过程的机制细节仍然不清楚。NLRP3在无菌炎症的背景下激活促使了小分子NLRP3抑制剂的开发。NLRP3抑制剂的临床试验集中在自身炎症性疾病上，包括骨关节炎、神经炎症以及COVID-19。PYRIN、NLRP1和NLRP3-NIMA相关激酶7（NEK7）炎症小体都包含了caspase-1适配蛋白含有CARD的凋亡相关斑点状蛋白（ASC），它有一个CARD与caspase-1中的CARD结合。NAIP和CARD8炎症小体不需要ASC，因为NAIP相互作用蛋白NLR家族含有CARD的4（NLRC4）中的CARD或CARD8本身可以与caspase-1结合。caspase-4或-5（啮齿动物caspase-11的人类对应物）中的CARD直接与细菌LPS的细胞质寡聚体结合。这种结合不需要表面表达的LPS受体TLR4。这些非典型炎症小体复合物产生活性的caspase二聚体，触发GSDMD依赖性焦亡。焦亡细胞还释放成熟的IL-1β，因为GSDMD切割引起的扰动激活NLRP3炎症小体和caspase-1。GSDMD依赖性焦亡在病原体防御和炎症性疾病中的作用小鼠的遗传研究表明，GSDMD依赖性焦亡是限制沙门氏菌等细胞内病原体生长的重要机制。其他细胞内细菌通过使用抑制焦亡的毒力因子来保护其复制生态位。志贺氏菌有两个效应器武器来阻止焦亡，caspase-4和-11的抑制剂OspC3和泛素连接酶IpaH7.8。后者通过将人类GSDMD和GSDMB（下文将描述）靶向蛋白酶体降解来抑制焦亡。焦亡的促炎性质有助于抗击病原体，因为包括中性粒细胞在内的免疫细胞被招募到感染部位。但是，由于通路失调导致的过度焦亡会引起疾病。人类NLRP1、NLRP3、NLRC4和MEFV（编码PYRIN）的生殖系激活突变破坏了正常的炎症小体调节，并引起一系列自身炎症性疾病。这些疾病的患者通常对IL-1β阻断反应良好，异常的IL-1β产生可能反映了焦亡的增强。与这一观点一致的是，Gsdmd的缺失阻止了表达疾病相关PYRIN或NLRP3突变体的基因敲入小鼠中炎症性病变和活性IL-1β水平的升高。值得注意的是，在体外培养细胞中，Gsdmd缺失延缓而不是阻止了经典炎症小体激活后的细胞死亡和IL-1β释放。细胞死亡仍然发生，因为caspase-1还可以通过蛋白水解激活caspase-3和-7来触发较慢的凋亡过程。因此，体内的细胞死亡类型很重要。可以推测，在Mefv或Nlrp3基因敲入突变小鼠中，Gsdmd缺陷细胞通过凋亡死亡可能有益，因为在继发膜损伤释放由caspase-1产生的促炎、成熟形式的IL-1β之前，它们被吞噬细胞清除。Gsdmd缺失还改善了小鼠败血症模型中的疾病。caspase-1、IL-1β和IL-18对小鼠LPS诱导的败血性休克是可有可无的，而caspase-11依赖性焦亡在内皮细胞中似乎驱动血管泄漏和低血压。通过内皮GSDMD孔洞的Ca2+流入可能促进微血管中致命的凝血和血块形成。总体来看，这些研究表明GSDMD抑制剂在暴发性炎症环境中可能提供治疗益处。有趣的是，最近的研究报告称，外源性添加的拮抗性GSDMD纳米体能够抑制体外细胞中的GSDMD依赖性焦亡。据称，GSDMD纳米体通过最初的GSDMD孔洞进入细胞，然后抑制进一步孔洞的形成。最初的GSDMD孔洞被认为是短暂的，并且通过膜修复机制从质膜中移除。这些发现表明GSDMD是可药用的，但这些纳米体是否能在体内抑制GSDMD尚不清楚。由于纳米体只能结合人类GSDMD，因此无法在临床前小鼠模型中评估其疗效。除了半caspase-1、-4、-5和-11，还有其他蛋白酶也能切割并激活GSDMD（Gasdermin D）。由caspase-8切割GSDMD引起的细胞焦亡在应对耶尔森菌感染的宿主反应中扮演了重要角色。中性粒细胞弹力酶也被证实能够切割并激活GSDMD。相比之下，据报道caspase-3通过在N端形成孔的域内切割来使GSDMD失活。更广泛的气道上皮细胞死亡蛋白家族人类有六种气道上皮细胞死亡蛋白家族成员（GSDMA, GSDMB, GSDMC, GSDMD, GSDME, 和 GSDMF），而小鼠缺少Gsdmb，但有三种Gsdma基因（Gsdma1, Gsdma2, 和 Gsdma3），四种Gsdmc基因（Gsdmc1, Gsdmc2, Gsdmc3, 和 Gsdmc4），以及Gsdmd, Gsdme, 和 Gsdmf。除了GSDMF，每种气道上皮细胞死亡蛋白都有一个在N端的保守形成孔的域，被C端控制着。不同的蛋白酶切割不同的气道上皮细胞死亡蛋白以释放形成孔的域，这些域随后可以与细胞膜、细胞器膜或细菌的外膜结合。缺乏Gsdma1（或Gsdma1-3）、Gsdmc1-4、或Gsdme的小鼠比野生型对照组对某些细菌或蠕虫感染更易感，这表明许多气道上皮细胞死亡蛋白有助于宿主对病原体的防御。在培养细胞中，caspase-3对GSDME的蛋白水解激活被报告可以引起细胞焦亡或凋亡后的次级膜损伤。后者的生理意义不太确定，因为在体内吞噬细胞通常会迅速清除凋亡细胞。无论如何，GSDME已被证实在小鼠中介导化疗药物引起的组织损伤或感染肠道病毒71型。由细胞毒性淋巴细胞释放的Granzyme B可以切割并激活caspase-3来切割GSDME，但它也可以直接在靶向肿瘤细胞中切割GSDME。在各种肿瘤细胞中，GSDME的表观遗传沉默或突变失活暗示了GSDME在抑制肿瘤中的作用。因此，进行实验以查看Gsdme缺陷是否增强小鼠自发性肿瘤模型中的肿瘤发生将是有启发性的。已有报告称，嵌合抗原受体T细胞引起的GSDME驱动的肿瘤细胞裂解在小鼠中触发细胞因子释放综合征。GSDMA主要在上皮细胞中表达。它似乎直接作为病原体传感器，通过链球菌致热外毒素B（SpeB）的蛋白水解切割后诱导细胞焦亡。GSDMB可以被细胞毒性淋巴细胞释放的Granzyme A切割并激活，Granzyme A是另一种效应蛋白酶。值得注意的是，已在不同细胞类型中描述了多种GSDMB剪接变体，其中一些编码无功能的GSDMB蛋白，这些蛋白不能诱导细胞焦亡。哪些亚型最具生理相关性尚不清楚，这使得解释将GSDMB的单核苷酸多态性与哮喘、克罗恩病和溃疡性结肠炎相关联的全基因组关联研究变得复杂。较少研究的GSDMC可能通过从杯状细胞和潘氏细胞释放IL-33在小鼠中介导抗蠕虫防御。 NINJ1依赖的质膜修复（PMR） 由NINJ1介导的PMR负责焦亡细胞的破裂，NINJ1是一种表达在细胞表面的跨膜（TM）蛋白。消除NINJ1并不会阻止细胞死亡，但会阻碍大型细胞内分子（如乳酸脱氢酶（LDH），PMR的标准标记物，和HMGB1）的释放。在培养中诱导焦亡的Ninj1缺陷细胞因其持续膨胀的形态而显著。认为从死亡细胞中排出的大型DAMPs（损伤相关分子模式）可“警告”免疫细胞，因为缺乏Ninj1的小鼠比野生型对照组更易感染肠杆菌属鼠伤寒杆菌或伪结核耶尔森菌。在活细胞中，NINJ1似乎是单体或二聚体，但在焦亡细胞中则是寡聚体。纯化的NINJ1形成的纤维在一个表面上是疏水的，而另一个表面上是亲水的，这表明NINJ1通过封顶膜边缘245或形成类似纳米盘的环，从而撕裂膜的部分。目前尚不清楚什么触发了垂死细胞中NINJ1的寡聚化。一种可能性是NINJ1感知到随着细胞膨胀而发生的膜张力或脂质排列的变化。在培养中，NINJ1也介导凋亡细胞的次级PMR。凋亡细胞最终会膨胀，因为ATP水平下降和Na+/K+ ATPase泵功能失常。caspase-3对GSDME的切割和GSDME孔的形成可能会通过渗透压加速膨胀。有趣的是，NINJ1对经历坏死或铁死亡的细胞的PMR是可有可无的。NINJ1依赖的DAMP释放是否加剧炎症和疾病严重程度，是一个活跃的研究领域。细胞死亡的灵活途径有越来越多的证据表明哺乳动物细胞在编程性细胞死亡途径中的灵活使用。例如，巨噬细胞中的炎症小体可以激活caspase-1或-8，焦亡通常因为其更快的动力学而占优势。在小鼠中的遗传实验揭示了当通常占主导地位的死亡途径受阻时，细胞死亡的意外途径。例如，在小鼠中表达蛋白水解失活的caspase-8会激发致命的坏死，但如果消除MLKL以防止坏死，那么ASC和caspase-1信号传导则有助于致死性。在另一个例子中，FADD缺陷的小鼠肠上皮细胞的回肠炎是由坏死或GSDMD依赖的焦亡驱动的。最后，坏死可以触发细胞内NLRP3炎症小体的激活，导致caspase-1的激活和活化IL-1β的释放。假设NLRP3在垂死细胞内检测到某种形式的细胞扰动。尽管NLRP3和caspase-1不是这些细胞死亡所必需的，但它们仍然通过允许垂死细胞释放成熟的IL-1β，从而为死亡的炎症性质做出贡献。 铁死亡铁死亡指的是细胞积累致命水平的依赖铁的磷脂过氧化物，从而导致非凋亡性死亡。经历铁死亡的细胞会破裂，但磷脂过氧化物如何破坏质膜的完整性尚不清楚。合成易氧化膜脂的代谢酶（例如，长链酰基辅酶A合成酶家族成员4 [ASCL4] 和溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶3 [LPCAT3]）和氧化膜脂的铁依赖酶（例如，花生四烯酸脂氧酶）赋予细胞对铁死亡的易感性（图5）。常用的铁死亡诱导剂包括小分子erastin和RSL3，它们通过干扰限制膜脂过氧化物的机制发挥作用。RSL3抑制谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4），这是一种利用谷胱甘肽将脂质过氧化物还原为无毒的脂质醇的脂质过氧化物酶。Erastin通过抑制进口半胱氨酸和使半胱氨酸可用于谷胱甘肽合成的xc−系统来耗尽细胞内谷胱甘肽。抑制其他自由基清除代谢物的产生，包括辅酶Q10（CoQ10）和四氢生物蝶呤（BH4），也可以使细胞对铁死亡更加敏感。增加游离铁的丰度是使细胞准备好铁死亡的另一种方式。 图5-细胞组分决定对铁死亡的敏感性（Credit: Cell） 铁死亡已被暗示与许多疾病有关，但在基因层面上测试其在临床前疾病模型中的因果关系很困难，因为铁死亡的媒介物在正常细胞代谢中也扮演着关键角色。检测铁死亡是另一个挑战，因为没有一个独特的标记物能够区分这种细胞死亡形式。必须观察到脂质过氧化，并评估一系列标记物以排除其他形式的细胞应激。尽管如此，一个活跃的研究领域是探索是否可以通过诱导铁死亡选择性地消除癌细胞。例如，一些肿瘤细胞可能比正常细胞更依赖半胱氨酸的摄入。结论和未来方向细胞死亡对于多细胞生物的存活和适应性是必需的，但必须严格调节以防止疾病。对细胞死亡信号机制的全面理解揭示了在疾病中抵制异常细胞死亡的机会。就内在凋亡途径而言，成功的故事是BCL-2抑制剂Venetoclax的开发，用于治疗某些血液系统恶性疾病。基于在临床前炎症性疾病模型中遗传消除这些途径的益处，抑制促炎细胞死亡程序的抑制剂的识别是一项较新的努力。焦亡的效应器，如NLRP3和GSDMD，以及作为外源性凋亡和坏死途径的介质的RIPK1，是感兴趣的靶点。这些努力的关键是知道不同细胞死亡途径在人类疾病中何时何地被激活。各种形式的细胞死亡的分子标记已被定义，例如，坏死途径的磷酸化RIPK3或磷酸化MLKL，以及炎症小体诱导的焦亡的切割GSDMD，但它们在组织中的存在可能是短暂的，因为噬菌细胞会迅速清除死亡细胞。因此，即使在遗传学告诉我们途径处于活跃状态的临床前模型中，检测途径激活标记也可能具有挑战性。 真正重要的是，阻断一个死亡途径是否会在临床上带来好处。如果焦亡是驱动败血症中失控炎症的引擎，那么针对GSDMD等焦亡的特异性抑制剂应该是有效的。这样的治疗的前景值得进一步调查。类似地，BCL-2抑制剂在临床上的巨大成功激励了开发针对常在固态恶性肿瘤中过度表达的MCL-1和BCL-XL的抑制剂。将这些抑制剂靶向癌细胞将至关重要，以避免对正常健康细胞的靶向毒性，但正在取得进展。例如，与针对肿瘤抗原CD276的特异性抗体结合的BCL-XL抑制剂似乎在保留抗肿瘤活性的同时引起的血小板减少症较少。希望过去50年在细胞死亡研究中取得的进展将继续转化为有意义的救命疗法。 感谢您能耐心读完 原文链接 https://doi-org.libproxy1.nus.edu.sg/10.1016/j.cell.2023.11.044 责编|探索君 排版|探索君 End 往期精选 围观 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IDC2024第六届化学创新药与改良型新药研发论坛报名即将截止！（报名即将截止，扫码报名）摘要p53蛋白是人体内十分重要的肿瘤抑制因子，通过调节细胞周期阻滞、诱导细胞凋亡等作用发挥肿瘤抑制功能。突变后的p53蛋白不仅具有显性负性效应（dominant negative effect，DN）抑制野生型p53蛋白功能，而且还通过功能获得性效应（gain of function，GOF）调节细胞代谢、侵袭、迁移等方式促进肿瘤的发生。p53蛋白在超过50%的肿瘤组织中发生突变，是肿瘤细胞区别于正常细胞的一个特异性药物靶点。因此，针对突变p53蛋白开发新型抗癌药物一直是研究的热点。长期以来，由于突变p53蛋白表面较为光滑，缺乏药物结合口袋，使其被认为是一个不可成药的靶点。随着高通量筛选技术的发展以及对突变p53蛋白结构的深入了解，许多靶向突变p53蛋白的小分子化合物被报道并在体外展现出较好的抗肿瘤活性，多款基于突变p53蛋白研发的化合物已经进入临床试验阶段。本文就靶向p53蛋白治疗肿瘤的直接和间接策略进行综述，重点针对突变p53蛋白重激活剂与降解突变p53蛋白的小分子化合物作用机制进行梳理，以期为后续开发靶向突变p53蛋白药物的创新提供帮助。正文p53蛋白是由TP53基因编码的53 ku蛋白，与p63蛋白和p73蛋白同属于p53样转录因子家族，其活性对于预防肿瘤的发生和发展至关重要。自1979年p53蛋白首次以癌蛋白抗原被报道以来，经过40多年的研究，人们不仅重新发现了p53蛋白的抑癌功能，而且认识到TP53基因是迄今为止发现与人类肿瘤相关度最高的基因。p53蛋白在生物体内可以暂停细胞周期进程，启动分子应答机制对损伤的DNA进行修复，并参与细胞分化、细胞凋亡等多种途径。同时，野生型p53蛋白调控着生物三大物质的代谢，通过限制细胞核酸物质的合成与对葡萄糖的摄取等作用抑制细胞生长。总之，p53蛋白可以看作是细胞内一个复杂而庞大的信号转导与调控网络的中心枢纽，在使细胞能够各司其职发挥正常功能方面起着重要的作用。在无应激的哺乳动物细胞中，p53蛋白通过不断的泛素化和26S蛋白酶体系的降解维持在较低水平，在应激状态下，p53蛋白可经过一系列如磷酸化、乙酰化、甲基化等蛋白质加工过程后被激活。正因为p53蛋白有着难以取代的重要作用，因此它一旦发生突变对细胞正常功能的影响是巨大的。突变后的p53蛋白不仅会丧失原本抑癌功能，同时还会进一步促进肿瘤的发生发展。研究表明，约50%的人类癌症中发现了突变p53蛋白，其主要突变类型为错义突变。科学家们尝试了多种靶向突变p53蛋白治疗癌症的策略，目前以恢复突变p53蛋白野生型构象及MDM2与p53蛋白相互作用抑制剂为代表的药物研究取得了较大突破。01p53蛋白的结构与功能1.1　p53蛋白的结构p53蛋白在人体内以四聚体的形式发挥作用，单体间通过反向α螺旋和反向β折叠相互作用形成二聚体，二聚体借助平行的螺旋-螺旋接触面形成四聚体，其结构类似一个十字架。每个单体由393个氨基酸残基组成，从N端到C端依次可分为反式激活结构域（TAD）（1~61）、富脯氨酸结构域（PXXP）（62~94）、DNA结合域（DBD）（95~292）、低聚结构域（OD）（326~356）、羧基端结构域（CRD）（357~393）（图1）。TAD区包含TAD1（1~40）和TAD2（41~61），介导p53蛋白的转录活性。TAD1和TAD2不仅可以共同调节一些常见基因的转录，也可以相互独立介导不同基因的反式激活。此外，p53蛋白N端还包含泛素连接酶MDM2的结合位点，MDM2可以与p53蛋白相结合并对其进行泛素化标记，进而使p53蛋白被蛋白酶体降解。富含脯氨酸的结构域（62~94）以PXXP序列重复多次（P，脯氨酸；X可以是任何氨基酸），该区域与p53蛋白介导的细胞凋亡和生长抑制有关。DBD可以与DNA进行序列特异性结合（95~292），它包含1个中央样免疫球蛋白β夹层支架、环状片螺旋结构和2个大环状结构，该区域在整个进化过程中高度保守，大约80%的TP53基因突变都发生在该区域。DBD后面是连接区域（293~325）以及OD（326~356），其中OD是p53蛋白四聚体化从而发挥功能所必需的，此外OD还包含一个核输出信号序列。CRD（357~393）是高度非结构化的，涉及多个不同的作用，如DNA结合、赋予蛋白质稳定性、辅助因子招募等。图1  p53蛋白结构示意图Fig. 1  Schematic diagram of p53 protein structure1.2　p53蛋白的功能p53蛋白是人体内十分重要的抑癌转录因子。正常情况下，细胞中的p53蛋白维持在一个较低的水平，这主要是由体内E3泛素连接酶MDM2介导完成的。p53蛋白与MDM2形成的反馈调节通路，导致细胞内p53蛋白的半衰期为6~20 min。各种各样的细胞应激如DNA损伤、端粒侵蚀、代谢改变、缺氧、有丝分裂纺锤体功能异常以及几种不同的致癌基因如Ras、Myc和Ets的突变激活等均可以引起机体针对MDM2和p53蛋白的修饰，这些修饰抑制了MDM2的活性，导致p53蛋白水平升高并激活，启动了一系列不同的转录程序。每一种应激压力都由一组不同的蛋白质检测，这些蛋白质向MDM2和/或p53蛋白发出信号并对其进行修饰。根据修饰（磷酸化、乙酰化、甲基化等）和细胞类型（如分化状态、细胞是否转化或正常、细胞是否正在分裂或休眠），启动一个p53蛋白介导的信号通路（图2）。图2  p53蛋白的功能Fig. 2  Function of p53 proteinp53蛋白是细胞中维持稳态的重要肿瘤抑制因子。在整个生命周期中，细胞都面临着持续的压力（内源压力、外部压力），每一种压力都由一组不同的蛋白质检测，这些蛋白质向MDM2和/或p53蛋白发出信号并对其进行修饰。启动一个p53蛋白介导的信号通路诱导细胞凋亡、衰老、分化等多种作用。激活状态下的p53蛋白通过与DNA序列（称为p53反应元件或p53结合位点）特异性结合诱导下游靶基因p21、PUMA、NOXA的表达，促进细胞凋亡、衰老、细胞周期阻滞、代谢改变、血管生成等多种作用，此外p53蛋白并非所有功能都是通过充当转录因子来实现的，比如细胞质中（尤其是定位于线粒体）的p53蛋白也参与调节糖酵解、氧化磷酸化、活性氧和自噬等。除了直接调节肿瘤细胞代谢外，p53蛋白还可以通过影响肿瘤微环境抑制肿瘤的发生，其中很重要的一点是调节微环境中的免疫细胞，目前大量证据表明，p53蛋白可以影响免疫系统功能，通过调节肿瘤相关免疫细胞的代谢活动进而影响肿瘤发展。02p53蛋白主要突变类型与特征自从在人类结肠癌中首次发现TP53突变基因以来，大量DNA测序项目已经检测了所有人类癌症中TP53基因的突变频率。总的来说，TP53基因突变的频率通常取决于癌症的类型，睾丸畸形癌中突变最少（1%~3%），浆液性卵巢癌中突变最多（100%）。组织和细胞类型都影响TP53基因突变的频率，多种突变类型导致p53蛋白原本功能的丧失。在整个TP53基因突变类型中，缺失、插入、移码和无义突变的发生率为10%，大多数情况下导致蛋白质不能产生或迅速被降解。其余90%的突变类型为错义突变，在这些突变中，90%定位于DBD，其中175、245、248、249、273和282氨基酸位点是其热点突变，p53R175H与p53R273H分别为p53蛋白错义突变的第一和第三大类型，其β片层结构都被很好地保存了下来，疏水表面变大，环的灵活性变高，从而易于在细胞内积聚。其次作为p53蛋白第二大错义突变类型的p53R248Q，热稳定性较低，可通过与STAT3结合并使其磷酸化，从而持续激活STAT3信号通路促进癌细胞的迁移。事实上与野生型p53蛋白相比，大多数突变p53蛋白除丧失与DNA结合及调控转录的能力最终导致抑癌功能丧失外，还会获得新的致癌活性以促进癌症的进展，称为功能获得性效应（gain of function，GOF），突变p53蛋白的GOF活性在1993年首次得到证实，当时Dittmer等报道了p53R175H和p53R273H的异位表达赋予了p53蛋白缺失细胞在软琼脂中形成集落和在裸鼠中形成异种移植瘤的能力，此后，包括使用细胞培养系统和小鼠模型以及临床研究在内的大量证据表明，许多p53蛋白错义突变均具有GOF活性以促进癌症的发生。到目前为止，已经报道了多种突变p53蛋白GOF活性，包括促进细胞增殖、转移、基因组不稳定性、代谢重编程、肿瘤微环境重塑、免疫抑制和癌症治疗抵抗。03靶向突变p53蛋白治疗肿瘤的策略寻找靶向突变p53蛋白的药物一直是治疗癌症的研究热点。然而，野生型p53蛋白和大多数突变p53蛋白缺乏结合口袋或变构位点，阻碍了常规的药物设计，因此经常被认为是“不可成药的”靶点。更重要的是，在人类肿瘤中已经发现2 000多种p53蛋白的突变形式，它们的结构、稳定性和生物学功能各不相同，几乎不可能用单一药物靶向所有p53蛋白的突变形式，对于每一种p53蛋白突变体，可能需要专门的药物治疗。本文主要梳理了两种靶向突变p53蛋白以治疗癌症的策略：a. 恢复突变p53蛋白野生型构象；b. 降解突变p53蛋白（图3）。并简要介绍了3种间接靶向突变p53蛋白治疗癌症的策略。尽管几十年来科学家们提出了各种各样针对突变p53蛋白治疗癌症的方式，但截至目前仍没有开发出一款疗效较为理想的药物，也正因如此，科学家们对p53蛋白的研究热情持续未减，未来无论哪种治疗策略及药物，若可以有效靶向突变p53蛋白治疗癌症，都将对人类医学产生划时代意义。图3  恢复或降解突变p53蛋白治疗癌症的策略Fig. 3  Strategies for cancer therapy targeting degradation or restoration of wild-type conformation of mutated p53 protein（a）突变p53蛋白被p53蛋白激活剂恢复为野生型构象后被导入细胞核并四聚化，获得与其靶基因（如p21、Bax、PIGs、PAI）结合的能力，诱导肿瘤抑制反应（细胞周期阻滞、凋亡和衰老），抑制肿瘤发生。（b）突变p53蛋白不仅失去了与肿瘤抑制基因结合的能力，而且还获得了转录激活致癌基因（如NF-κB2、BRCA1）的功能，以诱导肿瘤的发生。突变p53蛋白降解剂可直接与突变p53蛋白结合，诱导其降解并抑制肿瘤的发生。3.1　恢复突变p53蛋白野生型构象p53蛋白属于热敏蛋白，突变后具有折叠与去折叠两种状态转换的能力，因此是否可以利用一些小分子化合物逆转突变构象，使突变p53蛋白重新恢复其野生型构象或功能呢？通过计算机对数千种化合物进行高通量筛选，发现极少数化合物似乎有这一能力，通过恢复突变p53蛋白的特定野生型功能，如诱导凋亡、促进细胞周期阻滞和抑制癌细胞增殖，证实了这种“突变体再激活”。3.1.1　COTI-2COTI-2是通过计算机高通量筛选发现的一种具有口服活性的第三代胺苯硫脲化合物（图4）。已被证明能与突变p53蛋白结合，恢复突变p53蛋白野生型活性，并使野生型p53蛋白靶基因表达正常化。除此之外，COTI-2似乎也能独立于p53蛋白发挥作用，该化合物可激活AMPK、抑制mTOR通路、诱导肿瘤细胞DNA损伤引起复制应激。COTI-2的这些不依赖p53蛋白发挥的效应可能进一步促进其抗癌作用，因为研究发现，诱导DNA损伤和复制应激会引起细胞凋亡，而抑制mTOR信号传导是一种成熟的治疗癌症的策略。图4  突变p53蛋白重激活剂结构示意图Fig. 4  Schematic diagram of reactivator structure of mutated p53 protein与上述活性一致，Synnott等发现COTI-2可抑制多种恶性肿瘤细胞系和动物模型中肿瘤的生长，并且在研究的动物模型中具有良好的耐受性，没有发病或体重减轻的不良现象出现。Salim等发现，COTI-2可作为单一药物通过两种途径对多种头颈部癌细胞发挥明显的抗肿瘤作用，一方面COTI-2显著增强了对顺铂和/或辐射出现耐药性的头颈部癌肿瘤细胞对这些治疗的敏感性，另一方面COTI-2可在TP53基因缺失或突变的头颈部癌细胞中诱导凋亡，而在含野生型p53蛋白的头颈部癌细胞中，COTI-2诱导衰老而非凋亡，这可能是由于COTI-2可增强含野生型p53蛋白的细胞中p21表达，而p21是这些细胞中已知的衰老诱导物。除此之外，Maleki等还发现，在乳腺癌细胞系中表达突变p53蛋白的细胞系比含有野生型p53蛋白的细胞对COTI-2更敏感。目前，COTI-2正在进行一项针对复发性妇科癌症治疗的临床I期试验，初步药代动力学评价显示，口服该化合物的药峰时间（Tmax）在15~90 min之间，半衰期为8~10 h，并且其耐受性良好，最常见的不良反应为恶心、呕吐、疲劳和腹痛。在接受治疗的24名患者中，只有2名（8%）需要减少剂量。然而，到目前为止在参与试验的妇科癌症患者中，还没有肿瘤消退的证据。总之，COTI-2在多种含突变p53蛋白的肿瘤细胞中具有非常有效的治疗效果，即使这些肿瘤细胞对顺铂和辐射具有固有的耐药性，此外，该药物似乎以一种新颖的方式发挥其作用，包括重新激活野生型p53蛋白靶基因，诱导肿瘤细胞凋亡等。事实上，COTI-2在含野生型TP53基因的肿瘤细胞中同样诱导许多凋亡基因上调，但细胞凋亡并不明显，很可能是因为这些促凋亡基因并没有在蛋白质水平上被COTI-2诱导。3.1.2　2-磺酰嘧啶p53Y220C突变是p53蛋白第9大突变类型，位于p53蛋白S3/S4环和S7/S8 环之间的220位酪氨酸突变成为半胱氨酸。p53Y220C突变不仅直接破坏突变氨基酸与周围氨基酸Leu145和Thr155之间的氢键，而且降低了p53Y220C cluster区域的折叠片S3和S8之间的氢键数量，使p53Y220C突变所形成的亲水性空腔变大，加速了水分子进入该蛋白质内部，大大降低p53蛋白的热稳定性。为了能够找到具有较好靶向这种特殊突变活性的小分子化合物，Bauer等通过差示扫描荧光法（DSF）筛选了一个旨在结合p53Y220C突变诱导产生的空腔配体文库，发现了一个2-磺酰嘧啶小分子PK11000（5-氯-2-甲磺酰吡啶-4-羧酸）（图4），它可将突变p53Y220C蛋白融化温度明显提高（ΔTm>1.2K），并且根据光散射法测定蛋白质聚合动力学怀疑PK11000与突变p53蛋白属于共价结合。然而后期发现PK11000还可以使细胞内其他突变类型的p53蛋白融化温度升高，证实其稳定突变p53蛋白活性不是通过与p53Y220C突变腔结合而实现的。Synnott等发现，2-磺酰嘧啶在生物环境条件下仅与高度亲核的半胱氨酸发生SNAr反应，因此是选择性化学修饰蛋白质的有用工具。通过HSQC NMR数据及ESI质谱，证实了PK11000对p53Cys182和p53Cys277的特异性烷基化作用，PK11000对Cys182和Cys277的特异性修饰可在不损害p53蛋白与DNA亲和力的情况下提高蛋白质稳定性。PK11007为PK11000的类似物，是温和的硫醇烷基化剂（图4），相对于PK11000具有更好的抗癌活性，这可能与其膜透性改善（疏水性更强）、巯基反应活性提高（吸电子取代基更强）和烷基化选择性增加（4-氟苯取代导致亲核芳香族取代的空间位阻）等有关，此外PK11007还可通过两条途径发挥抗癌作用，即p53蛋白依赖和p53蛋白非依赖途径。PK11007可选择性结合暴露于突变p53蛋白表面的两个半胱氨酸即Cys182和Cys277从而稳定突变p53蛋白，并不损害其DNA结合活性。在一些癌细胞系中，不稳定的突变p53蛋白被PK11007重新激活，导致p53蛋白靶基因如p21和PUMA的上调从而引起细胞凋亡。然而更普遍的是，PK11007可独立于p53蛋白通过消耗细胞内的谷胱甘肽，诱导细胞内活性氧水平的高度升高及内质网（ER）应激造成细胞凋亡，PK11007和其他2-磺基嘧啶化合物作为抗癌药物的先导具有很大的潜力。3.1.3　异硫氰酸苯乙酯（PEITC）PEITC大量存在于豆瓣菜和十字花科蔬菜中（图4），对多种肿瘤细胞表现出生长抑制活性，尤其对表达突变p53R175蛋白的肿瘤细胞具有优先抑制活性。p53R175H突变是人类癌症中最常见的p53蛋白错义突变，估计为5.6%的发生率。事实上，PEITC已经在临床I期和II期试验中进行了研究，作用机制包括恢复突变p53蛋白野生型构象、抑制肿瘤细胞迁移、诱导II期解毒酶、细胞周期阻滞和诱导氧化应激促进凋亡等。此外，PEITC处理还会使突变p53R175蛋白对MDM2依赖的蛋白酶体降解敏感。Lam-Ubol等将蛋白酶体抑制剂MG132或特异性MDM2抑制剂Nutlin-3与PEITC分别或共同处理SK-BR-3细胞。发现与单独PEITC处理相比，MG132或Nutlin-3均可以使SK-BR-3细胞全裂解液（WCL）中突变p53蛋白显著积累。这一结果表明，突变p53R175蛋白稳定性降低是由于MDM2依赖的蛋白酶体的降解。这可能是由于PEITC将突变p53R175蛋白恢复为野生型构象，而野生型p53蛋白在细胞内受MDM2的调控。Choudhury等用PEITC处理SK-BR-3细胞时，发现高浓度（≥8 μmol/L）的PEITC会引起突变p53R175蛋白发生聚集。由于蛋白质聚集物会引发自噬清除，Bommareddy等便研究了突变p53R175蛋白的降解是否经历自噬。他们将8 μmol/L PEITC和氯喹（CHQ）共同处理SK-BR-3细胞，在细胞裂解液中发现突变p53R175蛋白水平较单独PEITC处理时明显升高，而用4 μmol/L PEITC做相同处理时突变p53R175蛋白水平并无明显差异，这表明了高浓度PEITC可能诱导突变p53R175蛋白发生聚集并自噬。PEITC诱导的自噬，突变p53R175蛋白的再活化及其随后对降解途径的敏感性均有助于其依赖突变p53蛋白发挥抗癌活性。近年来科学家们的研究方向主要集中于从化学文库中寻找能重新激活突变p53蛋白的小分子化合物。然而，以膳食为基础预防或治疗突变p53蛋白的研究仍然很少。PEITC的发现提供了第一个突变p53蛋白被饮食中化合物激活的例子，对癌症预防和治疗具有重要意义。3.1.4　三氧化二砷（ATO）p53蛋白突变类型高达数千种，多为错义突变，由于在其DBD缺乏广泛适用的变构调控位点，这就使得针对突变p53蛋白的治疗显得尤为棘手。尽管Zinc（NSC319726）靶向锌配合位点已经显示了具有拯救突变p53蛋白的活性，但其对突变p53R175蛋白具有高度特异性并影响p53蛋白DNA结合活性。还有一个值得注意的结合位点，涉及到一个远离DNA结合表面的裂缝，目前已经开发出多种可插入这个缝隙的小分子如PK083、PK15796等，从而稳定突变p53蛋白。然而遗憾的是，这种结合裂隙是p53Y220C突变所特有的，并不适用于其他p53蛋白突变体。因此还需不断寻找靶向突变p53蛋白新的变构位点化合物。ATO是一种治疗急性早幼粒细胞白血病的药物，可通过与半胱氨酸反应拯救结构突变型p53蛋白。砷结合突变p53蛋白的晶体结构揭示了一个隐藏的变构位点，该位点位于远离突变p53蛋白DBD区的ABP口袋，涉及三个砷配位半胱氨酸。砷结合并稳定了突变p53蛋白DBD区的环-片-螺旋基序和整个β夹层结构，赋予结构突变型p53蛋白热稳定性和转录活性，值得注意的是，砷与ABP口袋中的半胱氨酸三联体的特异性结合不同于其他作用于突变p53蛋白半胱氨酸的小分子化合物，如APR-246，后者杂乱地结合暴露于蛋白质表面的半胱氨酸。但砷结合的半胱氨酸三联体同样可能存在于其他蛋白质中，从而使ATO产生独立于突变p53蛋白的抗癌活性或细胞毒性。在细胞和小鼠异种移植模型中，ATO重新激活了突变p53蛋白野生型活性并抑制肿瘤的发生。在对ATO介导拯救的25个人类癌症中最常见突变p53蛋白实验中发现，所有的结构突变型p53蛋白都可以被拯救，尽管程度不同。有趣的是，接触突变型p53蛋白p53S241F、p53R248W也显示出被拯救的迹象，这说明某些接触突变型p53蛋白活性丧失也是由于构象改变引起的。尽管ATO对结构突变型p53蛋白具有普遍的拯救作用，但它们的野生型活性并不总是被有效地恢复，因为除了整体折叠外，局部p53蛋白DNA结合表面的完整性也决定了ATO拯救转录活性的效率。ATO联合维甲酸治疗APL为癌症治疗提供了新思路。令人鼓舞的是，ATO的治疗潜力在血液和一些实体肿瘤的临床实验中已有报道。目前一项针对含有突变p53蛋白的血液系统恶性肿瘤的I期临床试验正在进行。3.2　降解突变p53蛋白TP53基因的错义突变产生异常蛋白质，其抑癌功能被取消的同时也可获得促进肿瘤细胞侵袭、转移和化疗耐药的能力（GOF），最近的研究结果表明，突变p53蛋白的敲除降低了携带突变p53蛋白的肿瘤细胞的致癌特性。因此，确定突变p53蛋白稳定/降解的特异机制以及识别不改变野生型p53蛋白水平而使突变p53蛋白降解的化合物是至关重要的。靶向降解突变p53蛋白可能是开发新型抗癌药物的一种有前景的方法。3.2.1　藤黄酸（GA）GA是从甘草干乳胶中分离出来的一种黄酮（图5），在体内外均表现出强大的生物活性，如激活凋亡途径、诱导细胞周期阻滞、抑制端粒酶和拓扑异构酶II活性以及抑制血管生成等。迄今为止的所有研究都表明，GA是一种有效的抗癌剂，通过不同的机制具有不同的分子靶点。作为抗肿瘤候选药物，GA目前正在进行中国食品和药物管理局批准的II期临床试验。GA可以抑制含有野生型p53蛋白的肿瘤细胞生长，这是由于其可以抑制MDM2表达，增加肿瘤细胞内野生型p53蛋白水平，从而发挥抑癌作用。然而，半数以上的人类癌症中发现了突变型p53蛋白，有趣的是，GA对MDM2的影响在含有突变型p53蛋白的细胞中是不同的，Qin等发现在GA处理后的MDA-MB-435细胞中，MDM2蛋白水平和p53-MDM2相互作用均未受到显著影响，尽管已有报道MDM2可促进突变型和野生型p53蛋白的降解，但越来越多的研究表明，作为E3泛素连接酶的MDM2在突变型p53蛋白的降解中并不那么重要。而另一种突变p53蛋白降解途径，涉及分子伴侣Hsc70和Hsp90以及泛素/蛋白酶体系统的密切合作，这种降解途径的重要点在于伴侣相关泛素连接酶CHIP，CHIP通过与Hsc70和Hsp90的羧基端结合，与E2酶一起介导分子伴侣结合目标蛋白的泛素化，并诱导蛋白酶体降解目标蛋白。Hsc70和Hsp90在内的多种分子伴侣可特异性识别突变型p53蛋白，并在增强突变p53蛋白的稳定性中发挥重要作用。Liu等发现，GA可以通过调节这些分子伴侣进而达到降解突变p53蛋白的目的，GA可以上调Hsc70，下调Hsp90的表达，而对CHIP的蛋白质水平没有显著影响，进一步的免疫沉淀表明，GA改变了突变p53蛋白和分子伴侣之间的相互作用，呈浓度依赖性地破坏Hsp90与突变p53蛋白相互作用，并促进Hsc70/突变p53蛋白和CHIP/Hsc70/突变p53蛋白复合物的形成。随后Wang等在MDA-MB-435细胞中转染CHIP siRNA后，用GA处理相关细胞时发现伴侣相关泛素连接酶的消失导致突变p53蛋白水平的增加，这一发现强调了GA降解突变p53蛋白的机制，即GA通过上调与突变p53蛋白特异性结合的分子伴侣，并与CHIP、E2酶、26S蛋白酶体一起介导突变p53蛋白的泛素化降解。除此之外GA还可以增加携带突变p53蛋白的癌细胞对化疗药物的敏感性。这可能是由于突变p53蛋白本身就是克服肿瘤耐药性的药物开发潜在靶点，GA显著降低了肿瘤细胞中突变p53蛋白水平，从而使其对化疗药物的敏感性增加。3.2.2　YK-3-273YK-3-237为combretastatin a4（CA-4）的硼酸查尔酮类似物（图5），是SIRT1酶激活剂并对广泛含突变p53蛋白的肿瘤细胞表现出抗增殖活性。SIRT1酶是针对p53K382残基上的一个众所周知的去乙酰化酶。无论是野生型还是突变p53蛋白的去乙酰化都明显依赖于SIRT1酶的催化。野生型p53K382残基的乙酰化被认为是其保持稳定的重要决定因素，突变p53蛋白高度稳定的机制目前尚不清楚，但Alves-Fernandes等发现，在TNBC细胞中，小分子化合物YK-3-237激活了SIRT1酶活性降低了突变p53蛋白的乙酰化，使突变p53蛋白水平明显下降。Rozenberg等通过real-timePCR定量分析发现，YK-3-273在肝癌细胞系HUH-7中可诱导GADD45、PTEN和PERP mRNA的表达，在乳腺癌细胞系T47D中，可诱导GADD45和p21 mRNA的表达，在鼻咽癌细胞系CNE-2中，诱导p21 mRNA的表达，在3种不同的TNBC细胞株HS578T、MDA-MB-468和SUM149PT中诱导野生型p53靶基因PUMA和NOXA的表达，这些结果提示，YK-3-237介导的去乙酰化可抑制突变p53蛋白在多种肿瘤细胞中的功能，并特异性释放突变p53蛋白对野生型p53靶基因的转录抑制。然而，YK-3-237激活SIRT1酶的分子机制需要进一步阐明。最近报道称，YK-3-237只有在蛋白质被7-氨基-4-甲基香豆素（AMC）标记的情况下才能激活其SIRT1酶活性，不能针对新生p53蛋白发挥作用。此外，YK-3-237还能激活人SIRT2酶活性，降低了细胞中α微管蛋白水平。通过SIRT2酶脱乙酰作用减少α微管蛋白可能与降解突变p53蛋白，上调野生型p53蛋白靶基因的表达共同发挥抗肿瘤作用。但是目前SIRT1酶在人类癌症中的作用还存在争议，已有报道称SIRT1酶抑制剂和激活剂（如白藜芦醇）都能抑制人类肿瘤细胞株的生长。虽然最近已经开发了几种SIRT1酶激活剂，但这些化合物的抗癌作用尚未见报道。鉴于SIRT1酶在癌症、衰老、糖尿病和神经元疾病等许多生物过程中的作用日益增加，YK-3-237可能会是一个很有研究和开发价值的小分子化合物。3.2.3　他汀类（Stains）突变p53蛋白在肿瘤细胞中的稳定存在对其GOF活性至关重要，然而目前对突变p53蛋白稳定/降解的特异机制还知之甚少。通过高通量筛选，发现了Stains降胆固醇药物可作为结构突变型p53蛋白的降解诱导物，并且对野生型p53蛋白和接触突变型p53蛋白的影响很小。突变p53蛋白本质上是不稳定的，因为细胞中E3泛素连接酶MDM2及CHIP均可以诱导其降解，但是在肿瘤细胞中，突变p53蛋白却可以与多种分子伴侣如Hsp90、Hsc70、DNAJA1等相互作用从而保持稳定的状态。甲羟戊酸途径在结构突变型p53蛋白的稳定以及GOF活性中发挥重要的作用。结构突变型p53蛋白可以结合并激活SREPB转录因子，从而上调参与甲羟戊酸途径的多种酶合成大量的5-磷酸甲羟戊酸（MVP），而 5-磷酸甲羟戊酸的上调又可以反过来促进结构突变型p53蛋白与DNAJA1等多种分子伴侣的相互作用，从而使结构突变型p53蛋白在肿瘤细胞中保持稳定的状态，就这样形成了一个正反馈循环。并且5-磷酸甲羟戊酸还可以通过调节蛋白质的异戊二烯化，促进肿瘤细胞黏附、迁移和增殖过程中靶蛋白的膜附着。HMG-CoA还原酶是催化甲戊酸途径的第一步限速酶，Stains药物通过抑制HMG-CoA还原酶活性，特异性减少细胞内5-磷酸甲羟戊酸的生成，抑制结构突变型p53蛋白与分子伴侣DNAJA1相互作用，从而使结构突变型p53蛋白被细胞内E3泛素连接酶MDM2及CHIP介导的泛素化标记并降解。Stains药物可以抑制对癌症进展至关重要的两种细胞活动——蛋白质异戊二烯化和突变p53蛋白的稳定化，它是一款较为理想的靶向结构突变型p53蛋白的小分子抑制剂。此外，Stains药物还可使含突变p53R172H蛋白的肿瘤细胞对阿霉素敏感，这表明了Stains药物可作为独立或与其他化疗药物联合治疗肿瘤的潜在作用。然而，Moon等发现在小鼠模型中只有阿托伐他汀和瑞舒伐他汀的日剂量分别达到30 mg/kg和10 mg/kg时才会有较好的抗肿瘤效果，这相当于约140 mg和约50 mg的人体剂量，高于成人规定的临床剂量，这也是为什么Stains药物治疗癌症的临床试验结果存在争议。因此目前最重要的是发现降低Stains药物剂量的同时仍保留其诱导突变p53蛋白降解能力的方法。通过Stains药物抑制甲羟戊酸途径-DNAJA1轴诱导结构突变型p53蛋白降解可能代表了一种有希望的治疗癌症的策略。3.3　间接靶向p53蛋白治疗肿瘤的策略3.3.1　重新激活被抑制的野生型p53蛋白功能在保持野生型TP53基因表达的肿瘤细胞中，最广泛采用的治疗方法是抑制野生型p53蛋白的降解。野生型p53蛋白降解的机制涉及E3泛素连接酶MDM2对其泛素化标记，最终导致野生型p53蛋白被细胞自身蛋白酶体所降解。MDM2介导的泛素化依赖其与野生型p53蛋白的直接结合，促使人们寻找抑制MDM2-p53结合的小分子作为稳定野生型p53蛋白并使其恢复效力的工具。于是大量靶向MDM2蛋白以重新激活野生型p53蛋白功能的小分子应运而生（表1）。表1  MDM2/MDMX-p53抑制剂及其作用机制Table 1  MDM2/MDMX-p53 inhibitors and their mechanisms of action3.3.2　利用miRNA抑制含突变p53蛋白的肿瘤发生miRNA是一类由内源基因编码的长度约为22个核苷酸的单链RNA分子，主要功能为抑制其靶mRNA的转译或促进其降解，因此，miRNA水平的改变可以通过转录后机制进一步影响蛋白质水平。野生型p53蛋白可通过直接激活转录或促进成熟来调节miRNA水平，而突变p53蛋白会导致p53/miRNA轴的失调和其他miRNA的上调，从而赋予额外的致癌能力，如体细胞重编程等（表2）。此外，最近一些研究聚焦于循环miRNAs，探索其诊断和预后潜力，表明miRNAs的潜在临床应用价值。miRNAs可能是一种有效的癌症治疗工具。3.3.3　利用合成致死抑制含突变p53蛋白的肿瘤发生与直接靶向突变p53蛋白药物相比，合成致死方法对p53蛋白结构的依赖较小，这表明它可以广泛作用于多种p53蛋白突变类型。根据肿瘤细胞中所含突变p53蛋白功能丧失（loss of function，LOF）和GOF的不同，可使用不同的策略（表3）。04总结与展望p53蛋白是人体内天然免疫和抗肿瘤反应的重要组成部分。其突变不仅会造成原本抑癌功能的丧失，甚至还会出现一些促进癌症发生的新功能。几十年来，科学家们为了战胜突变p53蛋白提出了各种各样的观点，除上文提到的几种策略外，还提出从水解的突变p53蛋白中提取特异性肽作为新抗原由抗原提呈细胞（antigen presenting cell，APC）提供给B细胞和T细胞以激活免疫反应，利用靶向突变p53蛋白的小分子设计蛋白质水解靶向嵌合体（proteolysis-targeting chimeras，PROTAC）化合物以降解突变p53蛋白等多种方式，达到治疗癌症的目的。然而目前绝大多数针对突变p53蛋白的药物仍处于初级阶段，没有一款上市，因此现在就断定针对突变p53蛋白的治疗会对癌症有效还为时过早，但是一旦有针对突变p53蛋白疗效较好的化合物出现，就有可能开创癌症治疗新时代，特别是在p53蛋白功能障碍在人类癌症中如此普遍存在的情况下。总的来说，突变p53蛋白是一个有吸引力的癌症治疗靶点，随着针对突变p53蛋白的治疗策略及药物不断开发，根据患者的TP53基因突变情况设计个性化的治疗方案将成为可能。来源：生物化学与生物物理学进展作者：王若亚  张鸳  张继虹  俞飞文章内容由药精通Bio小编查阅文献选取，排版与编辑为原创。如需转载必须经过同意并按要求在转载文章最前方添加“药精通Bio”公众号，谢谢！ENDIDC2024第六届化学创新药与改良型新药研发论坛报名即将截止！（扫码立即领取限量免费参会名额）

In collaboration with leading cancer centers, research results to be presented from four studies across a breadth of breast tumor types and genomic alterations demonstrating Caris' impact on precision medicine IRVING, Texas, Dec. 4, 2023 /PRNewswire/ -- Caris Life Sciences®(Caris), the leading next-generation AI TechBio company and precision medicine pioneer that is actively developing and delivering innovative solutions to revolutionize healthcare and improve the human condition using molecular science and AI, today announced that the company and collaborators within the Caris Precision Oncology Alliance™ (POA) will collectively present findings at the San Antonio Breast Cancer Symposium (SABCS) that illustrate the potential impact of molecular profiling on the treatment of breast cancer. The findings demonstrate the power of Caris' comprehensive clinico-genomic database that enables novel insights into cancer that could have profound effects on a patient's diagnosis, prognosis, care plan, and response to treatment. SABCS is being held December 5-9, 2023 (Booth #1433) in San Antonio, Texas. Continue Reading "The San Antonio Breast Cancer Symposium continues to be the premiere conference for breast cancer research," said George W. Sledge, Jr., MD, Executive Vice President and Chief Medical Officer of Caris. "As part of our continuing commitment to the breast cancer community, Caris is proud to share important clinical/translational research created with our academic partners on important breast cancer questions." The research findings demonstrate the power of Caris' comprehensive clinico-genomic database Post this Presentations and posters from Caris include: Milan Radovich, PhD, Senior Vice President and Chief Scientific Officer of Caris, will participate in a Concurrent Educational Session entitled "Genomics for Clinical Research and Cancer Care" from 3:10 – 5:00 p.m. CT on Thursday, December 7 in the Stars at Night Ballroom 1-2. Dr. Radovich will deliver a presentation on "Emerging approaches to targeting pathways using precision medicine in breast cancer" from 3:10 – 3:40 p.m. before participating in a panel discussion from 4:40 – 5:00 p.m. "Precision oncology in breast cancer is rapidly evolving with the recent approval of several targeted therapies that rely on the detection of molecular biomarkers to inform selection. On the horizon are novel genomic and AI based approaches that will further shape the future treatment of this disease," said Dr. Radovich. "This education session at SABCS will highlight advances in new drug modalities and targetable pathways; liquid biopsies and clonal hematopoiesis; emerging evidence on treatment resistance; and the forefront of AI-enabled digital pathology for biomarker detection." A Caris study will be featured in the Concurrent Poster Spotlight Sessions Block 5 in the "PS13 Special Populations: Pregnancy, Male and Geriatric Patients" section on Thursday, December 7, from 5:30 – 6:30 p.m. CT in the Stars at Night Ballroom 3-4. The spotlight poster is titled "Molecular and Immunological Landscape of Sex-Based Differences in Breast Cancer: A Distinct Disease in Men" (Presentation #PS13-09). The study was performed in collaboration with Caris Precision Oncology Alliance™ (POA) members Dana-Farber Cancer Institute and Legorreta Cancer Center at Brown University, as well as others including the Mayo Clinic. In the featured study, the molecular and immunological landscapes of male and female breast cancer were investigated across 10,728 breast cancer samples (male, n=137; female, n=10,591) using Caris' Next-Generation Sequencing (NGS) technology. The results of this analysis indicate that male breast cancer has differential molecular and immune features compared to female breast cancer. A better understanding of these sex-based differences may help inform disease outcomes, provide a rationale for tailored therapeutic approaches, and guide the design of future treatments. "The Caris Precision Oncology Alliance™ continues its contribution to advancing breast cancer research by presenting novel findings on the molecular and immunological features of male breast cancer at this year's SABCS," said Chadi Nabhan, MD, MBA, FACP, Chairman of the POA. "By leveraging Caris' expansive real-world clinico-genomic database, our partner academic institutions are able to uncover new insights into the underpinnings of breast cancer biology leading to better therapeutic interventions." The POA includes 90 cancer centers, academic institutions, research consortia and healthcare systems, including 42 NCI-designated cancer centers, collaborating to advance precision oncology and biomarker-driven research. POA members work together to establish and optimize standards of care for molecular testing through innovative research focused on predictive and prognostic markers that improve the clinical outcomes for cancer patients. Additional Presentations Reveal Potential Impact of Comprehensive Molecular Profiling Caris will present additional data from studies demonstrating the critical role of precision medicine and molecular profiling in the treatment of breast cancer. All presentations will be made available online through Caris' website beginning December 7. Comprehensive Molecular and Immunological Characterization of Invasive Ductal Triple-Negative Breast Cancer (Presentation Number: PO4-24-01) This investigation of the molecular and immune signatures of invasive ductal (ID) triple-negative breast cancer (TNBC) aimed to improve understanding of TNBC biology to facilitate future identification of novel targets for treatment of this heterogenous disease. The results of this retrospective study of more than 13,000 breast cancer samples indicate that ID TNBC is associated with a distinct mutational and immunological profile compared to ID non-TNBC. ID TNBC is also associated with worse overall survival compared to ID non-TNBC. However, ID TNBC patients have improved survival post-pembrolizumab treatment. Comprehensive Characterization of BCL2 Family Genes in Metaplastic Triple Negative Breast Cancer (Presentation Number: PO4-24-02) This study aimed to investigate the expression of BCL2 family genes in metastatic TNBC. Results of this molecular profiling study suggest a strong association between higher expression of PMAIP1 and worse patient survival in this cancer. This association may potentially be attributable to higher immune checkpoint and stem cell-related gene expression, in addition to higher frequency of PD-L1 positivity in PMAIP1-High tumors. Further investigation is needed to prospectively validate PMAIP1 as a potential prognostic biomarker candidate in metaplastic TNBC. Genomic Landscape of Malignant Phyllodes Tumors Identifies Subsets for Targeted Therapy (Presentation Number: PO4-24-08) Phyllodes tumors are rare tumors of the breast, a subset of which have considerable malignant potential. This study aimed to identify targetable alterations and enhance understanding of the mutational profiles of malignant phyllodes tumors (MPTs) to potentially enhance treatment options. NGS identified actionable genomic alterations, including an NTRK1 fusion and low HER2 transcriptional expression. These findings highlight the importance of NGS-based profiling, including RNA sequencing, in MPT research to uncover potential targeted treatment options for patients. About Caris Life Sciences Caris Life Sciences® (Caris) is the leading next-generation AI TechBio company and precision medicine pioneer that is actively developing and delivering innovative solutions to revolutionize healthcare and improve the human condition using molecular science and AI. Through comprehensive molecular profiling (Whole Exome and Whole Transcriptome Sequencing) and the application of advanced AI and machine learning algorithms, Caris has created the large-scale, clinico-genomic database and computing capability needed to analyze and unravel the molecular complexity of disease. This convergence of sequencing power, big data and AI technologies provides an unmatched platform to deliver the next-generation of precision medicine tools for early detection, diagnosis, monitoring, therapy selection and drug development. Headquartered in Irving, Texas, Caris has offices in Phoenix, New York, Tokyo, Japan and Basel, Switzerland. Caris or its distributor partners provide services in the U.S., Europe, Asia and other international markets. To learn more, please visit CarisLifeSciences.com. Caris Life Sciences Media Contact: Lisa Burgner [email protected] 214.294.5606 SOURCE Caris Life Sciences