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今天为大家介绍的是一篇Mario Oeren在《Journal of Medicinal Chemistry》上发表的文章。作者建立了用于预测酶特异性代谢位点的模型，结合量子力学模拟和基于配体的方法，将反应活性与结合口袋效应相结合。unsetunset文章摘要unsetunset在药物代谢的修饰和结合阶段中出现的意外代谢可能导致许多后期药物候选者的失败，甚至已获批药物的撤市。因此，在研究初期阶段预测与类药分子相互作用的酶的代谢位点（SoM）至关重要。作者提出了预测人类AOs、FMOs和UGTs的亚型特异性代谢及临床前物种1中CYP酶代谢的相关方法。模型使用半经验量子力学模拟，并通过实验数据和DFT计算验证，评估潜在代谢位点在整个分子背景下的活性。同时，基于配体的模型结合了潜在代谢位点的反应活性以及不同酶亚型结合口袋的取向和空间效应，这些模型的预测性能达到最高κ值0.94和AUC值0.92。unsetunset研究背景unsetunset使用计算机模拟方法表征外源性物质的代谢过程，可以帮助化学家预测潜在药物候选物、农用化学品、营养补充剂和化妆品的代谢位点（SoM）。因此，新化学实体的结构优化可以更加经济高效，并且在项目早期阶段即可识别出有毒代谢物。历史上，由于细胞色素P450（CYP）酶家族在人类药物代谢第一阶段（修饰阶段，Phase I）中的重要作用，预测模型主要集中在CYP酶亚型的代谢上。然而，针对其他修饰阶段酶（如醛氧化酶AO和黄素单加氧酶FMO）及结合阶段（Phase II）酶（如尿苷5′-二磷酸葡萄糖醛酸转移酶UGT）的代谢预测研究正在逐渐增加。化学家希望将预测模型扩展到 CYP以外的酶家族有多种原因。例如，在化合物中引入氮杂杂环可以降低其对CYP代谢的敏感性，但却可能增加被AO氧化的可能性。而AO快速清除分子（CYP模型无法预测）的情况，已经导致多个项目在临床试验阶段被终止。同样，FMO的作用也常被低估，其底物的化学空间与CYP的底物重叠，有时FMO的代谢过程会被错误归因于CYP。预测FMO的代谢位点可以帮助化学家设计化合物，以便被多个酶家族代谢，从而减少药物间相互作用，并检测潜在的有毒代谢物，如亚砜酸、亚砜和硫羰基的S-氧化物及S,S-二氧化物。此外，UGT是结合阶段的主要酶，约15%的已知药物通过葡萄糖醛酸化代谢。预测UGT的代谢有助于研究人员避免潜在药物候选物的失活，并检测可能有毒的酰基葡萄糖醛酸的形成。尽管人类CYP模型取得了成功，但动物实验仍然是常规作。对潜在药物在动物模型中的代谢测试主要用于毒理学研究。由于每种动物的代谢特性各不相同，人类的代谢无法被单一的临床前物种完全复制，因此要求这些试验必须在至少两种哺乳动物物种（一个啮齿类和一个非啮齿类）中进行。对临床前物种代谢的计算机建模可以帮助确保临床前试验能够产生可能的人类代谢物，并将模型作为选择最佳临床前物种的指标。除了这种建模方法的伦理优势外，还可以加快试验速度并降低成本。作者旨在构建可预测人类中AOs、FMOs和UGTs不同亚型代谢位点（SoM）的模型。此外，还计划将现有的 CYP代谢位点预测模型扩展到临床前物种。接下来的小节将简要概述这些酶的底物范围、反应类型以及用于构建和验证模型的可用数据。随后，作者总结了现有的建模方法谱系，概览针对上述酶的现有模型，并提出基于反应活性与可及性相结合的方法训练新模型的理论依据。醛氧化酶（AOs）早在1936年，就有研究预测了肝脏中存在醛氧化酶（AOs）。然而，AOs首次被分离是在1940年，由Gordon等人完成。AOs最初被观察到可以与醛类反应，因此得名，但它们也被发现能够催化芳香杂环和亚胺离子的氧化反应。此外，虽然AOs通常被认为参与修饰阶段的代谢，但它们也被观察到能够催化某些分子的还原反应（如硝基化合物）。不过，除了少数例外，还原代谢通常发生在较低的氧浓度下，被认为在人类生理中起到感知低氧张力的作用。2015年，Sodhi等人报道了AOs的另一种代谢活性——酰胺水解。然而，目前普遍认为AOs的主要化学反应是氧化反应，其已知底物大多是氮杂杂环。因此，作者将重点放在AOs的氧化反应上，而还原和水解反应不在作者范围内。AOs属于钼黄素酶家族，需要钼辅因子（MoCo）、黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）和铁硫簇来催化上述反应。作者的补充信息中提供了AOs的详细催化循环过程;在此，作者重点讨论氧化步骤，这是催化的限速步骤（CYP、FMO和UGT的催化循环详细描述可参见作者之前的研究）。钼辅因子的结构因钼酶类型不同而有所变化，对于AOs，钼原子被双齿的钼蝶呤、双键氧、硫原子和一个羟基离子包围。目前被广泛接受的假设是由Skibo等人提出的：在底物结合到活性位点后，MoCo的羟基离子对底物的碳原子进行亲核攻击，同时碳原子上的质子和两个电子转移到MoCo的硫原子上。Montefiori等人和Alfaro等人通过密度泛函理论（DFT）计算证实了这一协同反应。相关的过渡态如图1所示。AOs存在于某些原核生物和大多数真核生物中，包括小鼠、大鼠、兔子、狗、恒河猴、黑猩猩和人类。与CYP不同，AO家族的亚型较少：小鼠和大鼠有四种亚型，而人类只有一种（与小鼠Aox1同源）。在人类中，该单一亚型主要存在于肝脏、呼吸、消化、泌尿生殖和内分泌组织中，其中大部分位于肝脏，并存在于细胞质中。预测AOs介导的反应已成为药物开发中的一个重要方向。AOs的代谢位点通常是药物分子中常见的化学结构，如氮杂杂环。此外，研究人员正在积极尝试减少CYP介导的代谢，这导致了其他代谢途径的增加。然而，AO代谢的快速清除已导致多个药物发现项目因高代谢清除率（如carbazeran和BIBX1382）或毒性（如JNJ-38877605）而终止。关于预测AOs代谢位点的首次尝试由Torres等人完成，他们评估了潜在代谢位点的简化四面体中间体结构的相对能量值。尽管该方法未考虑蛋白质结构，但其准确率达到了93%。然而，该方法的缺点是执行时间较慢，因为它依赖于DFT方法，并且测试的化合物数量较少（27种）。随后，Jones和Korzekwa利用这些结果预测了AOs代谢的药物清除率，Xu等人基于中间体结构的稳定性和额外的空间描述符构建了决策树模型。Montefiori等人进一步扩展了研究，从使用四面体中间体的相对能量值到计算简化MoCo的活化能值（Ea）。虽然活化能在识别代谢位点方面表现出色，但仅测试了六种底物。他们还尝试了其他活化能的替代描述符（如产物稳定性、静电势电荷），发现这些方法同样有效，但计算速度显著更快。随后，Montefiori等人将研究扩展到更大的数据集（78种化合物），并使用上述替代描述符构建分类模型，最终模型的ROC-AUC值高达0.96，κ值高达0.89。Lepri等人进行了一项重要的实验和计算研究，他们获取或合成了超过270种化合物，以研究AOs对氮杂杂环的氧化和对酰胺的水解。研究提供了识别易受AO代谢的碳原子的指南，并与Montefiori等人的研究一致，即氮杂杂环中正电荷最高的碳原子是潜在的代谢位点。图1.被AO氧化的过渡态细胞色素P450（CYPs）从数量上看，CYP酶是外源性物质代谢中最重要的酶家族。这些酶参与修饰阶段的代谢，负责75%至90%通过肝脏清除的药物代谢。CYP的催化作用主要表现为单加氧酶活性（如C-羟基化、杂原子氧化和脱烷基化），还包括环氧化物形成和芳香去卤化等反应。作者将重点关注最常见的反应类型，例如脂肪族和芳香族羟基化、醛氧化、双键环氧化以及N-和S-氧化。关于这些反应的催化循环将在下文简要描述，详细的催化循环和CYP各种反应类型的综述可参考Isin和Guengerich、Coon、Manikandan和Nagini以及Jung的研究。CYP的催化作用需要以血红素铁为辅因子，并以还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）作为电子供体。CYP催化的限速步骤如图2所示。催化循环从血红素的静息状态开始，此时一个水分子占据轴向位置，铁处于低自旋三价铁状态（FeIII）。第一步是轴向水分子的置换，底物分子与FeIII结合（I）。这种结合引发几何结构的变化，铁原子被移至卟啉平面以下，自旋状态从低自旋变为高自旋，并使氧化还原电位降低约100 mV。这种氧化还原电位的变化促进了来自氧化还原伴侣（NADPH）的单电子转移（SET），生成高自旋的二价铁（FeII）物种（II）。随后，该物种与分子氧结合，使铁被氧化回低自旋三价铁状态（III），同时铁原子返回卟啉平面内。再一次单电子转移产生了基本的二氧二阴离子物种（IV），该物种经过双质子化后，O−O键发生裂解并释放一个水分子（V）。在此步骤中形成的铁氧化合物通常被称为“化合物I”，它参与限速步骤。在第VI步中，氧原子插入R−H键中。最后，羟基化产物被释放，一个水分子回到三价铁血红素的轴向位置，起始复合物被再生（VII）。CYP在药物代谢中的重要性，加上丰富的实验数据，使得预测CYP代谢成为制药行业的优先事项。自然的选择是建立人类CYP代谢模型，从而可以虚拟筛选化合物的潜在代谢风险。成功的CYP模型在预测区域选择性和亚型特异性方面已达到约90%的准确率。如上所述，尽管当前CYP模型非常成功，但仍然需要定期使用动物模型进行测试，主要目的是确保人类安全。这些测试旨在生成候选化合物的所有可能人类代谢产物，以识别在后期试验中可能对人类产生的有害影响。选择实验动物时需要满足一系列标准，包括生成可能在人类中观察到的代谢产物、能够在实验室环境中存活以及便于操作和给药。因此，在作者中，作者将之前已发表的模型扩展到临床前物种，如大鼠、小鼠和狗。图2.CYP氧化的过渡状态黄素单加氧酶（FMOs）FMOs的发现可追溯到1964年，当时Ziegler和Pettit提出哺乳动物肝匀浆中催化氧化性N-脱烷基化的酶反应是由不同酶催化的部分反应，而非单一的混合功能氧化酶。他们的研究表明，这两个反应分别是氮原子的氧化和随后的脱烷基化。1966年，同一研究团队成功分离出催化氮原子氧化的FMO酶，证实了他们的理论。现已知FMOs能够氧化叔胺、仲胺和伯胺，芳香胺，肼类和咪唑类化合物。1974年，Poulsen等人提出了FMOs催化硫氧化的假设，目前已知FMOs能够氧化以下含硫基团：硫化物、硫醇、二硫化物、硫代氨基甲酸酯、硫代酰胺、巯基嘌呤和巯基嘧啶。此外，FMOs还被观察到能够氧化多种原子，如硼、碳（Bayer-Villiger氧化）、磷、硒和碘。此外，在人体中还观察到其他反应类型，包括N-去甲基化和去硫化反应。然而，FMO介导的主要代谢产物是N-氧化物和S-氧化物，因此作者重点关注FMOs的N-和S-氧化反应。FMOs属于黄素蛋白酶家族，其催化N-和S-氧化仅需要一个FAD作为辅因子。催化循环始于FMO生成一个稳定的过氧黄素中间体。该过程分为两步：首先，FAD利用NADPH进行双电子还原;然后，FAD迅速与分子氧反应生成过氧黄素。研究表明，细胞中的FMOs主要处于过氧黄素随时可以与底物反应的状态，因此这一系统常被比作“上膛的枪”。氧化反应通过将氧原子从过氧黄素转移到底物的“软亲核体”上实现，生成羟基黄素和氧化底物（图3）。催化循环的最后部分是通过释放水和NADP+再生FAD。FMOs是一个古老的基因家族，已在所有已研究的门类中发现，包括脊索动物门（人类属于这一门类）。在人类中，有五种功能活跃的FMO亚型（FMO1−5）以及许多非功能性伪基因（FMO6P−11P）。FMOs存在于多种组织中，但与AOs类似，主要分布在肝脏，其中FMO3是最主要的亚型，对外源性物质代谢的贡献最大。FMO1存在于胎儿肝脏中，但在出生后其基因在肝脏中被关闭，其功能随后由FMO3取代。FMO1在成年人的肾脏中仍高度表达，并在小肠中也有分布。FMO5主要存在于肝脏中，但也在胃、胰腺和小肠中表达。FMO2和FMO4的浓度非常低，分布于多个器官中。尽管对FMO2的研究多于FMO4，但它们对代谢的贡献较小，其中FMO4的贡献可以忽略不计。历史上，由于FMOs的底物特异性与CYPs重叠，其在修饰阶段的代谢作用常被低估、忽视或归因于CYPs。然而，有些分子实体主要或完全由FMOs代谢。因此，忽视FMO代谢可能导致意外的代谢途径，甚至产生有毒代谢物（如亚砜酸、S-氧化物和硫羰基的S，S-二氧化物）。总体而言，FMO介导的代谢物通常被认为比CYP介导的代谢物更安全。预测FMO的代谢可以帮助研究人员设计药物候选物，避免或引导其通过FMO介导的代谢，从而规避有毒代谢物的产生。相比AOs、CYPs或UGTs，关于FMO代谢的研究数量增长较为缓慢。针对N-和S-氧化机制的计算研究非常稀少，目前仅有三篇已发表的研究。关于底物氧化步骤的机制，存在两种主要观点：Ottolina等人提出该反应是通过SN2反应进行的，而Bach则认为该反应通过自由基中间体进行。作者之前发表的研究支持SN2反应机制。目前，仅有一个关于预测FMO代谢位点的模型由Fu和Lin提出，他们使用基于量子力学的描述符（如Fukui反应性指数）和环形指纹构建了支持向量机分类模型。图3.FMO氧化的过渡态尿苷-5′-二磷酸-葡萄糖醛酸转移酶（UGTs）UGTs被认为是继CYPs之后第二重要的药物代谢酶，同时也是结合阶段中最重要的酶。UGTs预计参与了约15%通过肝脏清除的药物代谢以及约40%的所有结合反应。自20世纪60年代以来，UGTs一直是研究外源性物质代谢的最活跃的酶家族之一，仅次于CYPs的研究数量，反映了其在外源性物质代谢中的重要作用。UGTs通过将一个葡萄糖醛酸（GA）基团转移到底物中的合适官能团上来起作用，这一反应称为葡萄糖醛酸化。与GA结合使底物更极性化，因此在大多数情况下要么使底物失活，要么使其更容易被机体排除。最常见的代谢位点是胺、酰胺和N-杂环的氮原子（N-葡萄糖醛酸化）以及酚、羧酸和醇的氧原子（O-葡萄糖醛酸化）。C-和S-葡萄糖醛酸化也已被报道，但相对罕见。作者仅关注N-和O-葡萄糖醛酸化。UGTs属于一类称为糖基转移酶的酶亚类，负责催化糖苷键的形成以生成糖苷。一般来说，葡萄糖醛酸化反应遵循一种机制，其中糖供体和底物依次结合，随后发生糖基转移，导致在糖苷中心的构型反转。随后，产物释放，紧接着是核苷酸部分的释放。在UGTs的情况下，糖供体是尿苷二磷酸葡萄糖醛酸（UDP-GA）。普遍接受的UGTs反应遵循SN2机制，其中氮原子或氧原子攻击GA的糖苷碳，迫使UDP离开。酶的两个残基作为酸和碱，形成“催化二联体”，稳定反应过程，如图4所示。UGTs广泛存在于几乎所有生物界中。在人类中，总共发现了31种UGT亚型，包括22种活性亚型和9种伪基因。根据序列相似性，这些活性亚型被分为四类：UGT1、UGT2、UGT3和UGT4。从理论上讲，大量不同的亚型赋予了UGTs广泛的底物特异性，但实际上，亚型之间的底物特异性常常存在重叠。这些亚型分布在全身的不同组织中，从肝脏到鼻腔均有分布。作者主要集中于前两类，尤其是1A1、1A4、1A9和2B7亚型，这些亚型主要在肝脏中表达，负责大多数外源性UGT底物的结合代谢。关于UGTs亚型特异性代谢位点（SoM）预测的首批模型于2006年发布。Sorich等人利用文献中的实验数据，为1A1、1A3、1A4、1A6、1A8、1A9、1A10和2B7八个亚型开发了朴素贝叶斯分类器。近年来，其他一些模型也相继出现，这些模型采用了不同的方法，放弃了亚型特异性，而是基于所有已知的人类UGT催化反应进行预测。这种方法允许包含更多的数据点，因为这些数据的来源不局限于亚型特异性研究。相关文献中的数据点数量从约1400到3300个独特的代谢位点不等。图4.UGT对葡萄糖醛酸化的过渡态unsetunset研究材料与研究方法unsetunset目前有多种可用于预测代谢的建模方法，从经验方法（如统计建模或机器学习）到基于机制的方法（如分子力学 [MM]、分子动力学 [MD] 或量子力学 [QM]）。如果模型用于计算机模拟筛选，它必须快速，因此经验模型往往是首选，因为它们速度快且相对容易构建（前提是有足够的数据）。然而，这些模型的缺点在于，通常缺乏足够的数据来训练模型，即使有足够数据，这些模型通常是不可转移的，并且是定性的。在数据稀缺的情况下，研究人员可能会转向基于机制的方法。这类模型可以基于较小的数据集构建，因其基于物理原理而更具可转移性，并且可以是定量的。然而，这些模型的缺点是执行时间较长，即使是使用较为简单的方法，其计算时间也可能过长而不适合实际应用。另一种区分代谢预测计算技术的方法是将其分为两大类：基于配体的模型和基于结构的模型。前者通过对已知底物或非底物化合物的结构和性质进行建模，开发结构-活性关系；后者则关注代谢酶的结构、已知反应机制及其与底物的相互作用。基于结构的方法包括分子对接、分子动力学模拟以及QM/MM方法。在作者中，作者选择了基于配体的方法，因为现有证据表明，基于结构的方法目前在精度上的提升有限，同时计算成本较高。此外，作者结合了经验建模方法和机制方法的元素，开发了反应性-可及性模型（reactive-accessibility model），这种方法在计算成本和代谢建模精度之间取得了平衡，并已被作者及其他研究人员成功应用。反应性-可及性方法将化合物的代谢分为两部分：反应性（描述潜在代谢位点 [SoM] 的纯反应性）和可及性（描述潜在SoM在蛋白质活性位点中接近催化中心的难易程度）。反应性反应性通过计算对应反应的限速步骤的活化能来衡量。这是一个物理性质，基于基本和经验物理常数计算，因此可以适用于任何分子。此外，这些模型考虑了整个底物的电子效应，尤其是长程电子效应，这对决定分子中位点的反应性可能起重要作用。相比纯统计模型，这种方法的适用范围更广，因为统计模型的适用范围通常受限于用于训练模型的化合物结构。以往研究表明，活化能是潜在SoM是否能够在实验中被代谢的一个重要描述符，其原理是反应速率与活化能通过阿伦尼乌斯方程相关联。由于酶类的反应中心在所有亚型中是保守的，活化能的计算不依赖于酶的亚型，仅取决于底物。可及性可及性指潜在SoM被酶的反应中心接近的难易程度，受到多种因素的影响。在作者中，作者考虑了空间效应和取向效应。空间效应与底物本身的特征有关，这些特征可能阻碍SoM的可及性；而取向效应则与结合位点的特性有关，这些特性可能使底物的某些位点远离反应中心。空间效应考虑了底物本身的体积或刚性结构造成的阻碍，而底物在结合口袋中的取向则可能使某些SoM在结合构象中远离反应中心。这种取向受到底物和蛋白质功能基团（如氢键、电静作用和疏水性）的影响。这些因素对代谢速率的影响通过二维的空间和取向描述符进行量化，这些描述符提供了关键功能基团相对于潜在SoM的位置信息。结合位点在不同酶家族及其亚型之间存在差异，因此可及性受到酶亚型和底物的共同影响。这些空间和取向描述符不需要结合位点的三维结构信息（这是相较对接研究的一个优势），并且可以快速计算。作者使用基于二维空间和取向描述符的统计模型来修正用于表示反应性的活化能。对于反应性-可及性模型，作者假设化合物已经结合到活性位点，因为实验中用于代谢的位点特异性数据包括了被观察到发生代谢的分子。然而，对于已知未被代谢的分子，其位点特异性信息未被考虑，因为尚不清楚这些分子为何未被代谢。例如，一个分子可能具有高度反应性的位点，但如果无法到达结合位点，则不会被代谢。化合物是否是某一酶类亚型的底物可以通过一个单独的模型来解决。unsetunset结果与讨论unsetunset数据来源与处理作者的数据来源于提供实验观察到的代谢位点（SoM）详细信息的文献。由于模型旨在区分实验观察到的SoM与所有潜在SoM，因此数据集中包含的分子在大多数情况下具有两个或更多潜在SoM，其中至少一个被实验观察到发生代谢。总结来说，所收集的化合物根据负责代谢该分子的酶家族及其亚型进行了标注（需要注意的是，一些分子可能被多个酶亚型或酶类代谢）。每个分子上的潜在SoM均被标注为是否被对应的酶亚型代谢。例外情况是关于临床前物种的CYP代谢数据，因为大多数已发表的数据未包括亚型特异性的信息。在这种情况下，通过综合多个CYP亚型的影响，整理了物种特异性的SoM数据。此外，与其他酶相比，CYP底物的二级和三级SoM数量较多，因此这些位点被标注为一级（1st）、二级（2nd）、三级（3rd）或“未观察到”（未代谢的SoM）。在数据整理过程中，重点放在高质量数据上，仅保留在适当实验条件下生成的数据。关于AO、FMO和UGT模型的数据仅来自体外实验，这些实验明确说明了所研究的酶亚型（例如，在细胞系中表达的亚型或亚型特异性微粒体）。对于使用非生理底物浓度进行的实验，数据被排除，最低接受浓度为100 μM或更低。如果某一底物的代谢在文献中存在冲突（例如，一篇文献中报告的主要代谢位点在另一篇文献中未被识别为代谢位点），则该底物被排除。每个代谢物均需有实验确认（例如，通过质谱或NMR研究）；未包括仅基于专家意见的代谢物。如果代谢位点未被明确确认（例如，研究者发现芳香环被氧化，但无法确定具体的氧化原子），则该底物被排除。对于临床前物种的数据，遵循相同的规则，但不涉及亚型特异性，因为这些模型是通用的。四个数据集的总结见表1，以下段落描述了各酶家族的数据来源。数据的具体参考文献列于作者的补充信息中。AO数据集：与之前的研究一样，所有芳香碳原子均被认为是潜在SoM。此外，作者还包括了醛类SoM，但数据集中仅有8个具有此功能的分子符合纳入标准。总结来说，AOs的数据集包含157个分子和865个潜在位点，其中160个位点被实验观察到发生代谢（包括155个主要位点和5个次要位点）。FMO数据集：具有足够数据用于建模的FMO亚型为FMO1和FMO3。潜在SoM包括文献中提到的所有可能被氧化的氮和硫原子。FMO1和FMO3的数据集分子数量相对较少（分别为56和67个分子），潜在SoM数量也较少（FMO1有172个潜在SoM，其中56个位点被代谢;FMO3有209个潜在SoM，其中69个位点被代谢）。然而，根据文献，较小的数据集不应妨碍模型构建，因为FMO的代谢主要取决于位点的反应性。UGT数据集：UGT1A1数据集包含98个分子，共297个潜在SoM，其中146个位点被葡萄糖醛酸化，151个位点未被代谢。潜在SoM中大多数为酚类，其次是胺类。其余包括羧酸、醇类和少量其他类型（包括氮原子）。UGT1A4数据集：是最小的数据集，仅包含54个分子，但在SoM类型上最为平衡，其中胺类占多数，其次是酚类及其他类型（包括羧酸和氮原子）。UGT1A9数据集：结构与UGT1A1相似，主要由酚类SoM组成，其次是胺类及其他类型。UGT1A9的数据集是UGTs中最大的，包含137个分子，但由于包含大量黄酮类化合物，其位点类型的变异性与其他数据集相似。UGT2B7数据集：包含90个分子，相对更加平衡，潜在SoM中酚类仍占多数，其次是胺类、醇类、羧酸及其他含氮原子的位点。CYP数据集：选择了三种常见的临床前物种和品系：Sprague−Dawley大鼠、比格犬和多种小鼠品系。最初的目标是获取单个亚型的位点特异性代谢速率，但发现非人类物种的文献中通常未报告亚型特异性信息。因此，所有非人类物种的数据均按物种和品系进行汇总。此外，由于文献中使用的小鼠品系种类繁多，作者将所有这些品系的数据合并，以确保数据集足够大以用于模型构建。小鼠、大鼠和狗的数据集分别包含68、163和80个底物。小鼠数据集中有617个潜在SoM，其中108个位点被代谢;大鼠数据集是最大的，包含1428个潜在SoM，其中305个位点被代谢;狗的数据集中有1091个位点，其中154个位点被代谢。其他考虑但因底物数据较少而未纳入的物种和品系包括Wistar大鼠、食蟹猴、新西兰白兔和戈廷根小型猪。在大多数情况下，文献中报告的代谢物被分类为一级（1st）、二级（2nd）或三级（3rd）代谢物。然而，在某些情况下，文献中提供了每个潜在代谢位点的理想数据（如代谢速率或Vmax）。在这些情况下，实验观察到的代谢速率被转化为分子内的排名（即1st、2nd、3rd）。表1.建立反应性和无障碍模型的数据概述反应性描述符（Ea）的计算与模型结果反应性描述符Ea是使用半经验方法计算的。在以下小节中，作者描述了如何针对每个酶家族使用校正因子来考虑半经验方法的系统误差。随后，作者说明了如何将校正后的Ea值与空间和取向描述符以及实验研究结果相结合，构建用于预测代谢位点（SoM）的模型。模型结果包括数据集划分、混淆矩阵以及 y-随机化（y-scrambled）测试值。AO的高斯过程（GP）模型： 作者从Montefiori等人的研究中获取了AO催化氮杂环氧化的简化反应机制。在作者的补充信息中，作者进一步扩展了该机制以包括醛类化合物。为了验证PM6方法是否适合作为DFT的替代，作者对不同类型的SoM使用PM6和DFT计算Ea值，并确认了两者之间的相关性。为此，作者将SoM划分为七种环境，并为每种环境计算了校正因子（详细信息见补充信息）。初始平方相关系数从0.92提高到0.97，并且大多数误差低于10 kJ/mol。通过对使用PM6计算的不同SoM环境的Ea值应用校正因子，使其可以直接与DFT能量标度相比较。在159个样本中，仅使用校正后的Ea值即可在52%的情况下预测实验观察到的主要SoM为具有最低Ea的位点。由于AO底物平均具有超过五个潜在SoM，AUC（曲线下面积）比单纯的准确率更能体现Ea对AO位点特异性的描述能力。所有分子的平均AUC为0.80，表明Ea值是预测AO代谢SoM的重要描述符，但作者预计结合空间和取向描述符以考虑立体和取向效应可以进一步提高预测能力。对于AO GP模型的测试集，κ值为0.83。Ea是最重要的描述符之一，而最具影响力的描述符是识别位点是否为σ键芳香氮原子的邻位（这是氮杂杂环的常见特征，氮杂杂环占据数据集的大多数化合物）。测试集的平衡准确率为0.90，其混淆矩阵如图5所示。y-随机化结果的κ值为0.05，显著低于测试集结果，表明模型性能不是由实验结果与测量描述符之间的虚假相关性驱动的。FMO的GP模型： 作者使用之前研究中描述的简化反应机制计算FMO催化N-和S-氧化的Ea值。初步测试中，使用AM1方法验证了该机制的可行性，但与AO中两种方法的良好相关性不同，FMO中半经验方法与DFT之间的相关性仅为0.26。即使引入了针对N-和S-氧化的单独校正因子，或将SoM环境进一步细分为子环境，相关性也未改善（详见补充信息）。这种低相关性可以用过渡态中辅因子与离去基团之间短暂形成的氢键来解释。在DFT优化的过渡态中观察到了该氢键，但在使用AM1进行几何优化时，该氢键通常未形成。这是因为AM1对氢键能量的估算不如DFT准确，因此两种方法之间的相关性较弱（详见FMO补充信息）。尽管两种方法之间的逐一位点相关性不高，但在测试数据集中的底物中，AM1和DFT均能正确识别实验观察到的主要SoM为具有最低Ea的位点。在FMO1和FMO3的测试集中，仅使用校正后的Ea值即可在82%的情况下预测实验观察到的主要SoM。使用AM1计算的整个数据集AUC分别为0.91（FMO1）和0.92（FMO3），表明基于AM1计算的Ea值对反应性-可及性模型的可靠性较高。仅使用反应性描述符即可在大多数情况下预测实验观察到的主要代谢位点。对于FMO1和FMO3测试集的反应性-可及性GP模型，κ值分别为0.88和0.94。混淆矩阵如图5所示。最终模型的平衡准确率分别为0.94（FMO1）和0.98（FMO3）。与AO模型类似，Ea和ΔEa是两种模型中最重要的描述符之一。y-随机化结果的κ值分别为0.00（FMO1）和0.03（FMO3），表明模型的优异性能不太可能是由于偶然相关性导致的。UGT的高斯过程（GP）模型：与FMO类似，UGT模型中N-和O-葡萄糖醛酸化的简化反应机制也基于作者之前的研究。采用AM1半经验方法用于UGT的预测，与用于FMO代谢预测的方法相同。然而，与FMO相比，UGT中AM1与DFT的相关性更高——在校正前为0.58，校正后提高至0.97（图5所示）。值得注意的是，O-葡萄糖醛酸化的Ea值与DFT计算值更接近，而N-葡萄糖醛酸化则需要更大的校正因子（校正因子的推导和SoM环境的描述见补充信息）。UGT1A1：使用AM1计算的UGT1A1亚型的AUC为0.86。GP模型对1A1的测试结果显示κ值为0.81，平衡准确率为0.90（1A1模型的混淆矩阵如图5所示）。y-随机化结果的κ值仅为0.12，表明模型结果不太可能因随机数据相关性导致。UGT1A4：UGT1A4亚型的AUC为0.72，为所有数据集中最低值。由于UGT1A4专门代谢三级氮原子，可以推测其预测中可及性描述符可能比其他UGT亚型更加重要。此外，UGT1A4的数据集样本量是所有亚型中最少的。GP模型对1A4的测试结果显示κ值为0.68，平衡准确率为0.84（1A4模型的混淆矩阵如图5所示）。y-随机化κ值为0.02，进一步证明数据集中不存在随机相关性。UGT1A9 ：UGT1A9亚型的AUC为0.78，数据集是所有UGT亚型中样本数量最多的。GP模型对1A9的测试结果显示κ值为0.63，平衡准确率为0.82（1A9模型的混淆矩阵如图5所示）。y-随机化结果的κ值为−0.21，表明结果不太可能由数据集中的随机相关性导致。UGT2B7：UGT2B7亚型的AUC为0.87，在所有UGT数据集中最高。GP模型显示κ值为0.63，平衡准确率为0.82，y-随机化κ值为0.21（2B7模型的混淆矩阵如图5所示）。值得注意的是，尽管2B7的AUC最高，但GP模型的κ值相对较低，部分可以通过分析2B7的数据集来解释。在测试集中共有18个化合物，其中有26个位点发生代谢。在某些情况下，模型未能识别次要代谢位点，这显著降低了κ值。CYP的加权最小二乘法（WLS）模型：对于CYP模型，构建了一个10倍交叉验证的加权最小二乘法（WLS）模型。这种交叉验证策略确保模型结果不依赖于单一的数据训练和验证集划分。每次交叉验证随机选择训练和验证化合物，并训练一个WLS模型。每个训练后的模型应用于测试集，每个测试集中，于每个潜在代谢位点输出一个介于1和0之间的浮点数预测值（1表示代谢，0表示未代谢）。对于每个位点，采用共识建模法，即10个模型的预测结果取平均值，所得浮点数作为最终预测值。在给定化合物中，将模型的位点预测值按从低到高排序，并计算ROC曲线下面积（AUC）。在测试集中每种物种的化合物的平均AUC如表2所示。关于10倍交叉验证中各单独模型的详细表现，详见补充信息。令人惊讶的是，临床前通用CYP模型的准确率与人类特定亚型（如AO、FMO和UGT）的模型相当。已知潜在代谢位点的纯反应性对CYP代谢起关键作用，但通常通过考虑亚型特异性的空间和取向效应来获得最高准确率。尽管临床前物种的实验数据未指定单个CYP亚型，但通用CYP模型结果之所以如此优秀，可能是因为实验数据集中主要由单一或少数几种主要亚型（如CYP3A家族）贡献。由此，空间和取向成分能够很好地反映所涉及的亚型影响。图5.GP模型的测试集的混淆矩阵unsetunset总结和展望unsetunset作者描述了对人类AOs、FMOs和UGTs的代谢区域选择性，以及三种临床前物种（小鼠、大鼠和比格犬）CYP代谢区域选择性的预测。这些模型在预测人类AOs、FMOs和UGTs特定亚型的主要代谢位点（SoM）方面表现出色（图6），同时也能够准确预测小鼠、大鼠和比格犬中酶家族的主要、次要和三级代谢位点。尽管作者中提出的大部分模型由于其亚型特异性无法与现有的非亚型特异性模型直接比较，但这些模型的整体准确性与已发表的最佳代谢预测模型相当。另外，据作者所知，AO1模型是目前唯一能够同时预测醛类和芳香（或氮杂芳香）环氧化的模型;FMO1和FMO3模型是迄今为止唯一发表的亚型特异性FMO反应性-可及性模型。这些预测模型基于对相关酶家族催化机制的详细理解和模拟。构建10个模型所使用的反应性-可及性方法通过半经验计算估算限速步骤的电子活化能。酶家族限速步骤的简化反应机制此前已通过实验数据和DFT计算得到验证。活化能与亚型特异性的空间和取向效应结合，这些效应来源于底物与结合位点之间的相互作用。基于量子力学的方法具有广泛的适用性和可转移性，因为它们源自于基本物理原理。此外，这些模型关注整个底物分子，考虑了长程相互作用，这对在分子内部区分不同位点起到了重要作用。相比仅基于统计训练的模型，这些模型的适用范围更加广泛，因为统计模型的适用性通常受限于用于训练模型的化学数据。作者中针对人类酶构建了七个亚型特异性模型，包括以下亚型：AOs的AO1，FMOs的FMO1和FMO3，以及UGTs的UGT1A1、UGT1A4、UGT1A9和UGT2B7。这些亚型代表了在人类肝脏中各自家族中最常见的酶。此外，还为小鼠、大鼠和比格犬构建了三个非亚型特异性的临床前物种模型。这些模型的亚型特异性将其与以往的研究区分开，这对于研究通过修饰和结合阶段研究化合物代谢命运的科研人员非常有用。而临床前物种模型则有助于减少、优化和替代动物实验。图6.AO、FMO和UGT的人类亚型的敏感性、特异性、平衡准确性和κ值未来的工作将包括将多个酶家族的底物数据整合到一个统一的模型中，以预测哪些酶家族及亚型最有可能负责化合物的代谢。亚型特异性的CYP模型已被发表，而类似的模型将对UGTs研究也具有价值。如果将预测化合物代谢相关的酶家族和亚型的模型与作者描述的代谢位点预测模型结合，便能够仅根据化合物的化学结构预测其代谢命运。作者验证了反应性-可及性方法在药物代谢建模中的普适性，并且通过增加结合阶段的人类酶扩展了模型的应用领域。作者相信，这种方法还可以进一步扩展至其他酶家族，例如硫转移酶和谷胱甘肽转移酶。这为未来药物代谢研究提供了重要的方向和工具。unsetunset论文链接unsetunset10.1021/acs.jmedchem.2c01303投稿人：周艺凌责任编辑：许燕红

正文共：1489字 1图 预计阅读时间：4分钟 2025年2月，医药资本圈被一则重磅消息震动——曾被誉为"基因疗法三冠王"的蓝鸟生物（bluebird bio）以首付款2900万美元、潜在总价1亿美元的价格被凯雷与SK Capital收入囊中。 这个数字仅为其2018年巅峰市值的千分之三，更讽刺的是，收购方提出的首付款在三个月内从1亿美元腰斩至不足三成，为这场资本寒冬中的"跳楼价"并购再添戏剧性注脚。 一、天价疗法的陨落之路 作为全球首个攻克β地中海贫血的基因疗法开创者，蓝鸟生物曾手握令同行艳羡的资本故事：2013年登陆纳斯达克后市值直逼300亿美元，三款FDA获批疗法累计定价超800万美元，被视作改写罕见病治疗史的里程碑。 然而现实给了理想主义一记重击——其明星产品Zynteglo在欧洲因疑似引发白血病遭紧急叫停，177万美元的"天价"更让医保体系望而却步，最终被迫撤离欧洲市场。后续推出的300万美元级疗法Skysona和Lyfgenia同样陷入"叫好不叫座"困境，2024年前三季度仅57名患者接受治疗，对应4528万美元营收难掩2.12亿美元亏损的残酷现实。 二、资本博弈下的"割肉"求生 收购拉锯战暴露了生物科技企业的脆弱性：2024年9月，现金流濒临断裂的蓝鸟启动第二轮裁员，试图通过削减25%人力成本续命，却未能阻止资本市场的抛弃。凯雷最初1亿美元收购邀约看似救命稻草，却在财务尽调后骤降至2900万美元，附加条款要求销售额达6亿美元才能解锁剩余对价——这个看似苛刻的条件，实则暗藏对基因疗法商业化困境的精准预判。 值得玩味的是，收购协议中特别设置了"FDA优先审评券"奖励机制，这张价值1.5亿美元的市场通行证，恰恰是蓝鸟三次申请未果的遗憾。 三、寒冬中的行业镜像 蓝鸟的困境折射出CGT（细胞与基因治疗）赛道集体遇冷的现状：据弗若斯特沙利文数据，全球基因治疗市场虽保持71%的年复合增长率，但2025年305亿美元规模预期下，企业正经历"从烧钱研发到变现乏力"的阵痛。 国内Biotech同样面临生存考验，2024年亘喜生物、普方生物等相继被跨国药企收购，最高交易额达130亿元，而License-out（对外授权）总金额突破525亿美元的背后，实则是本土创新药企"断臂求生"的无奈。 四、幸存者的启示录 在这场行业大洗牌中，少数突围者提供了另一种范本：某药企凭借双抗药物半年狂揽14.7亿元收入，百利天恒更通过与BMS的84亿美元授权合作登顶盈利榜首。 这些案例揭示生物科技企业的生存法则——既要保持技术前瞻性，更需建立清晰的商业化路径。正如业内人士所言："当资本潮水退去，能自我造血的Biotech才有资格讲述下一个十年故事。" 这场估值缩水99%的收购案，终将成为教科书级的行业警示：在基因治疗这个充满理想主义色彩的领域，科学突破与商业现实的距离，或许比双螺旋结构更为复杂。当资本耐心耗尽，留下的不仅是企业估值的残局，更是对整个创新药生态系统的深度拷问。 参考资料： How bluebird's buyout offer went from $100M upfront to $29M曾经估值高达100亿美元，bluebird bio公司将被私募股权公司以2900万美元收购 蓝鸟生物：“优等生”的落寞与自救 FDA两场专家咨询委员会后，蓝鸟生物和CRISPR的「股价」头对头变化... 高票通过！FDA专家咨询委员会首日，蓝鸟生物「闯关成功」，这次他们能缓过来吗？ 以邻为师 | 从LogicBio、蓝鸟生物，看遭遇到FDA临床暂停禁令时，该如何趋吉避凶？ CFO递交辞呈，资金即将耗尽，蓝鸟生物处境堪忧... 半年报公布后，基因疗法明星公司蓝鸟生物下跌27% 其它公开资料 封面图来源：123RF 往期推荐 “万亿资本”入场，多家中国药企集中官宣融资！ Newco的三个宿命，以及LIDNewco的诞生 “做药的” 跟 “做机器人的” 合资开了家新公司...... 版权声明/免责声明 本文为原创文章。 本文仅作信息交流之目的，不提供任何商用、医用、投资用建议。 文中图片、视频、字体、音乐等素材或为药时代购买的授权正版作品，或来自微信公共图片库，或取自公司官网/网络，部分素材根据CC0协议使用，版权归拥有者，药时代尽力注明来源。 如有任何问题，请与我们联系。 衷心感谢! 药时代官方网站:www.drugtimes.cn 联系方式: 电话:13651980212 微信:27674131 邮箱:contact@drugtimes.cn 点击，查看更多精彩!

先卖后买，药明康德的CGT业务重心正往国内迁移... 据国家企业信用信息公示系统显示，近日上海药明生基发生工商变更，原全资股东无锡生基退出，新增药明康德为股东并全资持股，同时，注册资本由1亿人民币增至6亿人民币，增幅500%。 而这距离药明康德出售在美、英的两个细胞基因治疗公司才不足两月。 药明生基是药明康德在细胞基因治疗CDMO（合同研发生产组织）的核心平台，专注于细胞治疗、基因治疗等高端疗法的开发与商业化生产。此次增资可以看出，选择将关键研发和生产能力保留在中国本土及其他地区，是药明康德对细胞与基因治疗（CGT）市场深思熟虑后的战略布局。 具体来看，其核心动因或可分为几点：规避地缘政治风险、强化细胞与基因治疗（CGT）领域的战略地位、应对行业需求爆发。 01 断尾求生，拒绝“软肋” 时间回到2017年，药明康德刚开始布局细胞与基因疗法（CGT）领域，通过成立WuXi ATU（药明生基），公司迅速成为国内乃至全球CGT CDMO（合同开发与生产组织）领域的领导者。 那时WuXi ATU在全球范围内建立了四大生产基地，分别为美国费城、英国牛津、上海临港和江苏无锡，其中美国和英国占据主要地位，运营主体名为Advanced Therapies和Oxford Genetics。 好景不长，Wind数据显示，2021年至2023年，药明康德WuXi ATU板块的收入分别为10.26亿元、13.08亿元、13.10亿元；2024年前三季度该板块营收为8.53亿元，同比下滑17.04%。对应的，2023年该板块亏损1.31亿元，2024年上半年该业务毛利率为-29.71%，是药明康德唯一亏损的业务板块。 在财报中，药明康德针对WuXi ATU的发展颓势做出了解释，主要包括商业化项目仍处于放量早期，部分项目延迟或因客户原因取消，以及受美国拟议法案影响，新签订单不足等原因。 很快，地缘政治紧张局势加剧，尤其是美国《生物安全法案》的出台，药明康德面临政策不确定性，并最终决定于去年12月24日出售其在美国和英国的CGT业务。 公告显示，2024年1至11月内，美国和英国的两大CGT业务合计营收折合人民币为9.8亿元（未经审计），占公司最近一个会计年度经审计营收的2.4%。言下之意，本次出售对公司整体影响有限。 回笼资金，加强在亚太地区的细胞基因治疗技术开拓，这一决策反映了药明康德在全球化布局上的战略性调整。 一直以来，高度依赖美国客户向来是药明康德的业务特征。但CGT业务涉及人类细胞，属于高度敏感领域，容易受到《生物安全法》等相关政策的影响，更容易成为药明康德的“软肋”。 在地缘政治风险加大的背景下，出售WuXi ATU的英美业务，并不意味着药明康德完全放弃了CGT领域。相反，目的是通过剥离部分非核心资产，将重心转移至更具可控性的市场，这点也正好与此次增资上海药明生基的事件契合。 未来，药明康德可能会更加注重亚洲市场的拓展，尤其是在中国本土市场的深耕，以应对国际环境的不确定性和政策风险。 02 “留学生”归国，拥抱百亿市场 药明康德本身强硬的CGT业务正与国内渐趋成熟的CGT市场不谋而合。 近年来，CGT领域因其在个性化治疗和罕见病治疗中的潜力而备受关注。药明康德通过其全球化平台和“一体化”服务模式，在CGT领域积累了显著的优势，尤其是在中国的市场份额中占据了领先地位。 数据显示，药明康德在国内CGT CDMO领域的市占率达到55.86%，远超竞争对手。公司还计划在未来继续扩大产能，预计2025年资本支出将大幅增加，以支持其在全球范围内的业务扩张。 此前，药明生基与多家国际知名药企建立了合作关系，提供CDMO服务，并且已在上海临港等地布局生产基地，此次增资6亿可能用于进一步扩建产能或提升工艺技术，以贴近客户需求，也可能为后续资本运作（如分拆上市或引入战略投资者）奠定基础。 可见，随着中国市场的渐趋成熟，美国的所谓“制裁”手段似乎越发“肌无力”。海外的“制裁”还未落地，国内的CGT已经着手准备迎接新一轮的繁荣了。 据弗若斯特沙利文统计，2025年全球CGT CDMO市场规模将达到78.6亿美元，2020—2025年复合增速为35.5%，其中美国市场占比最大，但中国市场预期复合增速最快。 仅国内来看，2023年中国CGT行业市场规模达到约33.81亿元，同比增长113.64%。预计2024年市场规模将增至88.48亿元，2025年更有可能突破100亿元，甚至达到178.9亿元。这一快速增长的趋势吸引了大量资本和技术资源进入市场，进一步加剧了竞争。 当前，国内CGT行业的竞争格局较为集中，大部分市场份额由少数几家龙头企业占据。行业集中度较高。具体来看： 复星凯特和药明巨诺是国内最早实现CGT产品 commercialization 的企业，分别推出了CAR-T细胞治疗产品，占据了较大的市场份额。 药明生基作为药明康德旗下的CDMO（合同开发生产组织），凭借其强大的研发能力和国际化的服务网络，在行业中占据重要地位。 其他如纽福斯、本导基因等公司在研发管线数量上表现突出，但在商业化进程中尚未形成显著的竞争优势。 目前，国内布局细胞与基因治疗（CGT）业务的公司已超过100家，但不可否认，行业仍处于快速发展阶段，尚未形成完全垄断的竞争格局。与国际巨头相比，国内企业在技术储备、产品管线丰富度以及全球化运营能力上仍有差距。因此，加强国际合作和技术引进仍是国内企业提升竞争力的重要途径。 03 正视差距，后来者居上 当前，全球CGT市场主要被Catalent、Lonza、Thermo Fisher等国际巨头占据，CR5（前五名企业市场份额总和）高达81%。相比之下，国内企业在技术积累和国际化布局上仍有较大差距。 如国内CGT产品的个体化差异大、生产批量小，导致订单分散，且部分头部企业倾向于自建产能，使得CDMO企业的生存空间受到挤压。 数据显示，中国CGT在研管线总数为647余项，其中大部分处于I/II期临床阶段，仅有少量进入III期或已上市，而复星凯特和药明巨诺凭借已上市的产品占据了领先地位。 但与此同时，一些专注于CDMO（合同开发与生产组织）和CRO（合同研究组织）的企业也在细分市场中崭露头角。例如，高腾生物被评为“最具潜力CGT CDMO”榜首，而Novotech则在CRO领域排名第一。这种梯队式的竞争格局表明，行业正在逐步向专业化和细分化方向发展。 此外，政府对CGT行业的支持力度不断加大，相关政策的出台加速了行业的发展进程。例如，《“十四五”生物经济发展规划》明确提出支持细胞与基因治疗技术的研发和应用。此外，国家药品监督管理局（NMPA）也在不断优化审评审批流程，加速CGT产品的上市进程。 《2025-2030年中国细胞与基因治疗（CGT）行业市场前瞻与投资战略规划分析报告》指出，政策利好和技术投入的增长将推动市场规模的快速扩张。同时，监管部门也在不断完善法规体系，为创新企业提供更清晰的指导和支持。 资本市场的高度关注也为CGT行业注入了强劲动力。近年来，国内外投资者对CGT领域的兴趣持续升温，大量资金流向该领域。例如，药明巨诺和复星凯特均获得了多轮融资，为其产品研发和商业化提供了充足的资金支持。 此外，一些初创企业在基因治疗领域的创新成果也吸引了资本的目光。例如，本导基因凭借其在基因递送技术上的突破，获得了多轮融资，进一步巩固了其在行业中的地位。 展望未来，CGT行业将继续受益于技术创新和政策支持。然而，要在激烈的市场竞争中脱颖而出，国内企业需要加强自主研发能力，加快国际化布局，并探索多元化商业模式。 总结：药明康德此次增资生基医药，既是其聚焦高增长赛道（细胞与基因治疗）的战略选择，也是应对全球生物医药行业复苏和国内政策红利的主动布局。未来，药明康德能否进一步巩固在CRO/CDMO领域的龙头地位，值得期待。  喜欢我们文章的朋友点个“在看”和“赞”吧，不然微信推送规则改变，有可能每天都会错过我们哦~ 免责声明 “汇聚南药”公众号所转载文章来源于其他公众号平台，主要目的在于分享行业相关知识，传递当前最新资讯。图片、文章版权均属于原作者所有，如有侵权，请在留言栏及时告知，我们会在24小时内删除相关信息。 信息来源：原创 Fariy 新康界 往期推荐 本平台不对转载文章的观点负责，文章所包含内容的准确性、可靠性或完整性提供任何明示暗示的保证。