CASP5

引言血脑屏障(BBB)保护中枢神经系统免受感染或有害物质的侵害；它的损伤可导致或加重中枢神经系统的各种疾病。然而，在感染和炎症条件下血脑屏障破坏的机制仍不清楚。2024年4月17日，北京生命科学研究所邵峰及北京脑科学与类脑研究所罗敏敏共同通讯在Nature 在线发表题为“Brain endothelial GSDMD activation  mediates inflammatory BBB breakdown”的研究论文，该研究胞质脂多糖(LPS)传感器caspase-11激活成孔蛋白GSDMD，但不是通过TLR4诱导的细胞因子，在循环LPS或LPS诱导的败血症中介导血脑屏障分解。缺乏LBP-CD14脂多糖转移和内化途径10 - 12的小鼠可抵抗血脑屏障破坏。单细胞RNA测序分析显示，表达高水平GSDMD的脑内皮细胞(bECs)对循环LPS有显著的反应。LPS作用于bECs，启动Casp11和Cd14的表达，诱导GSDMD介导的质膜通透性和小鼠焦亡。电镜显示，破坏的血脑屏障发生超微结构改变，包括内皮细胞热噬，紧密连接异常，血管脱离基底膜。综合小鼠遗传分析，结合针对bECs的腺相关病毒系统，证实了GSDMD在bECs中的激活是脂多糖破坏血脑屏障的基础。向bECs输送活性GSDMD绕过LPS刺激，打开血脑屏障。在CASP4人源化小鼠中，革兰氏阴性肺炎克雷伯菌感染破坏血脑屏障;这是通过在bECs中表达GSDMD中和纳米体来阻断的。该研究概述了炎症性血脑屏障破坏的机制，并提出了与血脑屏障损伤相关的中枢神经系统疾病的潜在治疗方法。血脑屏障由bECs与周细胞、平滑肌细胞、星形胶质细胞、小胶质细胞和巨噬细胞协同作用组成，它们共同构成血管壁。血脑屏障将特定的营养物质从外周循环转运到中枢神经系统(CNS)，但阻止不需要或有害物质的进入。病理因子或全身性炎症破坏血脑屏障可导致或加重多种中枢神经系统病变，包括阿尔茨海默病、肌萎缩性侧索硬化症、亨廷顿病和多发性硬化症。脂多糖是革兰氏阴性菌单独或感染过程中产生的一种主要促炎分子，可引发血脑屏障破坏。血脑屏障破坏也发生在败血症期间，炎症因子和神经毒性物质进入大脑导致败血症相关脑病。然而，尽管有大量的研究，LPS引起血脑屏障破坏的机制仍不清楚。LPS被质膜上的TLR4-MD2复合物识别。这种识别导致许多促炎细胞因子的转录诱导，这些细胞因子被认为是引起LPS诱导的炎症的原因。有研究表明，LPS刺激后的血脑屏障破坏可能是由于TLR4依赖性调节参与维持血脑屏障完整性的蛋白质，如紧密连接蛋白或粘附连接蛋白。LPS在细胞质中也被小鼠的caspase-11和人类的caspase-4和caspase-5识别，通过诱导热作用刺激炎症。LPS激活的caspase- 4,5和11切割成孔蛋白GSDMD，释放其GSDMD-N结构域，该结构域穿过质膜，释放胞质炎症因子和/或引起热降解。caspase-11- GSDMD轴的过度焦亡激活是LPS诱导小鼠脓毒症的基础。这种非典型炎性体主要与巨噬细胞有关，但最近的研究表明，非典型炎性体的活化和焦亡也发生在上皮细胞和其他非免疫细胞中。bECs对系统性LPS反应显著，并经历GSDMD依赖性焦亡（Credit: Nature）该研究证实，bECs中caspase-11-GSDMD非典型炎性体的激活决定了循环LPS引起的血脑屏障破坏。数据显示，通过GSDMD孔的质膜渗透-可能没有bEC裂解-可能导致血脑屏障泄漏，因为材料通过大的(约22 nm)非选择性孔的双向通道。血脑屏障渗漏以前被认为是通过破坏紧密连接或增加胞吞作用而发生的。该研究增加了对这一现象的理解，并且值得注意的是，在质膜上形成孔或大通道并不罕见。虽然膜穿孔并不总是最终导致细胞死亡，因为受损的膜可以修复，但它可能影响直接或间接调节bECs紧密连接或胞吞噬的途径，进一步损害血脑屏障。综上所述，该研究深入阐述了LPS破坏血脑屏障的分子与细胞生物学机制，并首次揭示了脑内皮细胞的caspase-4/11-GSDMD信号通路在此过程中发挥的关键作用。原文链接https://www-nature-com.libproxy1.nus.edu.sg/articles/s41586-024-07314-2责编|探索君排版|探索君文章来源|“iNature”End往期精选围观一文读透细胞死亡(Cell Death) | 24年Cell重磅综述（长文收藏版）热文Nature | 破除传统：为何我们需要重新思考肿瘤的命名方式热文Nature | 2024年值得关注的七项技术热文Nature | 自身免疫性疾病能被治愈吗？科学家们终于看到了希望热文CRISPR技术进化史 | 24年Cell综述

深度聚焦类器官与3D培养论坛，OTC2024论坛合作详询：王晨 180 1628 8769文章来源：科研吉娃娃一、类器官培养是什么，有什么特别，如何实现？类器官培养（OrganoidCulture）是一种细胞培养的生物技术，它允许科学家在实验室内培养出类似于真实器官的微型三维（3D）结构。这些类器官在结构和功能上都类似于体内的器官，能够模拟器官的关键特性，是研究生物学、疾病、药物开发等领域的重要工具。类器官培养的特点：1）三维结构：不同于传统的二维细胞培养，类器官形成复杂的3D结构，更接近真实器官的微环境。2）细胞类型多样性：类器官可以由不同类型的细胞构成，如上皮细胞、间充质细胞等，反映了真实器官的细胞组成。3）功能复杂性：类器官在功能上更接近原始器官，能够执行特定的生物学功能，如分泌、吸收等。4）个体化模型：从特定患者获取的细胞可以用于培养类器官，为个体化医疗和精准医疗提供了新的可能性。5）疾病模型和药物测试：类器官可用于疾病模型的建立，以及药物筛选和毒理学研究。实现方法：1）细胞获取：首先从体内获取需要的细胞，可能是干细胞（如胚胎干细胞、诱导多能干细胞）或特定器官的初级细胞。2）细胞培养：将细胞置于支持3D生长的基质中，如Matrigel或类似的胶原蛋白基质。3）培养条件：提供特定的生长因子和条件以促进细胞增殖和分化，形成类似于原始器官的结构。4）微环境调控：精确控制培养环境，如氧气、营养物质和生长因子的浓度，以模拟体内环境。5）成熟与功能化：随着培养的进行，类器官逐渐成熟并展现出特定的功能。类器官培养是一个不断进步的领域，它为疾病机制的理解、新药的开发和个性化医疗提供了强大的工具。二、类器官培养如何进行，如常规的细胞培养有什么不同？1）三维结构：类器官培养在3D结构中进行，更好地模拟细胞在体内的空间排列和相互作用，而常规细胞培养通常是在平面的2D环境中。2）细胞类型多样性：类器官可以包含多种类型的细胞，更好地重现器官的复杂性，而传统的细胞培养通常涉及单一细胞类型。3）微环境模拟：类器官培养更强调在体微环境的模拟，包括细胞间相互作用和基质组成，而2D培养则较少考虑这些因素。4）用途与应用：类器官培养适用于研究复杂的细胞相互作用、疾病模型、药物筛选等，而常规的2D细胞培养更多用于基础的细胞生物学研究。5）技术复杂度和成本：类器官培养技术通常更复杂、成本更高，需要专业的技术和材料。三、类器官培养细胞，可以转染过表达与沉默么？1）将转染试剂与载体混合后加入到类器官培养系统中。2）对于病毒载体，先将病毒加入培养基，然后再用这种培养基培养类器官。3）在2D正常培养情况下转染，然后进行类器官培养四、类器官培养有什么难点，有什么比较简易的方式推荐难点及简化策略：1）细胞来源的获取与维持：难点：高质量细胞的获取和维持可能很困难。简化策略：使用标准化的商业细胞线或易于培养的细胞类型，如使用人诱导多能干细胞（iPSCs）代替原始干细胞。2）构建复杂的三维结构：难点：精确模拟复杂的三维组织结构。简化策略：采用简化模型系统，如小型化的器官或使用更简单的凝胶基质，这些可以减少对精密结构控制的需求。3）模拟微环境：难点：精确控制和模拟生理微环境。简化策略：使用标准化的培养介质和条件，减少变化因素，或使用商业化的培养套件，这些通常包括了优化的培养条件。4）营养和氧气扩散：难点：确保类器官内部的细胞得到足够的养分和氧气。简化策略：制作较小的类器官，以确保充分的扩散，或使用具有改善营养输送的微流控芯片技术。5）功能的成熟和验证：难点：实现并验证类器官的功能成熟。简化策略：集中在某一或几个关键功能的验证，而不是全面的功能复杂性。6）实验操作上的一般建议：优先考虑成熟度较高的技术：一些器官类型的培养技术文献已经相对成熟，选择这些技术可以减少开发摸索的时间。利用现有培养基和模块：市场上有许多已经优化并标准化的培养套件和模块，使用这些可以大大简化实验流程。五、如何鉴定类器官？1.形态学观察：显微镜检查：使用光学显微镜或电子显微镜检查类器官的三维结构，观察其形态是否类似于目标器官的组织结构。大小和形状：记录并分析类器官的大小、形状和结构完整性。2.分子标记物检测：免疫组织化学染色：使用特定于目标器官细胞类型的抗体进行染色，如特定的细胞表面标记物、功能蛋白等。基因表达分析：通过RT-PCR、qPCR或RNA测序等技术分析类器官中的基因表达模式，确保它们与目标器官相符。3.功能性测试：细胞功能检测：根据类器官的类型，进行相应的功能性测试。例如，肠道类器官可以通过吸收测试来评估，肝脏类器官可以通过代谢功能测试来评估。生理活性测试：评估类器官是否能响应外部刺激，如药物处理、激素刺激等。4.生物力学和生物物理特性：组织硬度和弹性：使用如原子力显微镜等工具，测量类器官的物理特性。微环境参数：评估类器官中的氧气和营养物质扩散情况。5.与原始器官的比较：组织学比较：将类器官与原始器官的组织切片进行对比，观察细胞排列和组织结构的相似性。功能性对比：将类器官的功能与原始器官的已知功能进行对比，确保关键的生理功能得以模拟。6.长期稳定性和可重复性：长期培养：观察类器官在长期培养过程中的稳定性和功能维持情况。批次间一致性：确保不同批次的类器官在形态、分子特征和功能上具有一致性。注意事项：1）每种类器官的鉴定方法可能需要特定的调整，以适应不同器官的独特特性。2）结果解释应综合多种方法和指标，避免依赖单一的测试结果。3）在鉴定过程中，标准化操作和严格的实验设计是确保结果准确性和可重复性的关键。参考论文如下全文下载：链接：https://pan.baidu.com/s/1UsSu3PBqvAfM-KtmwsAf_A?pwd=a6bc 提取码：a6bc --来自百度网盘图2展示了一种用于培养卵巢癌类器官的扩展培养基，称为“Type2”。这种培养基可以改善某些类器官培养物的生长性能。实验设计包括以下几个步骤：制备扩展培养基：作者介绍了一种先前发表的扩展培养基(表2),并引入了一种类似于长期卵巢癌类器官培养物开发的替代扩展培养基(表2;图2a)。建议在建立新的类器官培养物时，使用Type 1和Type 2两种类型的扩展培养基，以确定每种培养物的最佳类型。类器官来源：描述了类器官培养物的建立过程(图2b)。首先将患者切除组织切成小块，用胶原酶消化。经过额外的洗涤和过滤后，将消化后的组织接种在基底膜提取物(BME)中，并补充扩展培养基(图2b,c)。BME是一种在10°C以上聚合的凝胶状物质，用于模拟细胞外基质并为3D类器官提供支持。Matrigel可以用作BME的替代品，具有类似的性能(图2f;参见“试剂”部分)。类器官维持：对于每个新建立的类器官培养物，分裂比例、分裂间隔和类器官解离方法因供体而异，需要针对每个供体进行优化(表1)。类器官可以在建立后的7-21天内传代(图2b,d),或者在之前的1:2到1:8比例分裂后进行传代。参考表1以获取指南。分裂时间和比例应根据每个新建立的类器官培养物的密度进行优化。最佳分裂时机是在BME中心开始死亡之前，表现为碎片脱落或外观变暗，或者当类器官直径达到300μm时(进一步称为“充分汇合孔”)。单细胞类器官传代：通过胰酸胨消化法(图2b,g)和机械切割法(图2b,g)对单个细胞类器官进行传代。大多数类器官培养物更倾向于使用碎片而不是单个细胞进行传代(表1),因为单个细胞比碎片生长成新类器官的速度慢且死亡率更高。两种方法都可以尝试新建立的培养物，特别是快速生长的培养物。在某些情况下，例如当细胞计数至关重要时，应使用单细胞传代。如果要在转染后生成克隆性类器官培养物，我们建议使用允许通过单细胞传代的类器官培养物。使用单个细胞而不是碎片，将增加在筛选后产生的类器官(例如经纯化抗生素筛选)确实是来源于单细胞的可能性。Fig.5展示了从乳腺癌(BC)组织中获得的类器官在体外培养过程中的形态变化（A）。这些类器官可以呈现为固体(约60%的培养物)、囊性(<5%)、葡萄状(约20%)或混合形态(约20%)（B）。显示了155个组织样本和95个相关的类器官培养物中BC亚型的分布情况（C）。乳腺癌类器官在生长速度上存在很大差异，但对于某些供体来说，它们可以达到高速扩张速度(每周1:6;)。一旦建立(例如，>体外第5代),乳腺癌类器官很少停止生长或减缓生长速度。大多数乳腺癌亚型的类器官建立效率在55%到70%之间（D），三阴性乳腺癌(TNBC)约为40%,这表明对于通常具有侵袭性和基因不稳定性的TNBC细胞来说，适应体外培养条件是具有一定难度（E）免疫组化检测乳腺癌组织与类器官（F）。图6.|。来自组织学上正常的乳腺组织的乳腺类器官培养的特征。a，在第5代正常乳腺类器官培养中可以看到不同的结构类型。b，类器官培养的典型例子显示成熟的管腔结构（大腔）、管腔祖细胞类型（较小的内腔可以显示出芽）和基底/干细胞类型（较大的结构类型可以显示出芽或分支）。c，培养第3代标记DAPI的代表性分支类器官的荧光共聚焦图像，标记为DAPI（白色）和f-actin（红色）。d,第5代培养物的管腔结构的荧光共聚焦图像，标记为DAPI（白色）和F-actin（红色）。e，使用乳腺特异性抗体面板进行的CyTOF分析显示，在单一培养中存在所有主要的乳腺上皮细胞类型。在一个具有代表性的类器官培养（y轴）中，显示单个细胞的指示标记物（x轴）的标准化蛋白表达水平（x轴）的热图。f，从1型扩张培养基中省略了所示的培养基成分，并生成了乳腺类器官培养物。END深度聚焦类器官与3D培养论坛，OTC2024论坛合作详询：王晨 180 1628 8769戳“阅读原文”立即领取限量免费参会名额!

前言肿瘤对凋亡的抵抗和免疫抑制的肿瘤微环境是肿瘤治疗反应差的两个主要原因。细胞焦亡是一种不同于细胞凋亡的溶解性和炎症性程序性细胞死亡途径，最新的证据表明，肿瘤细胞中的细胞焦亡诱导导致强烈的炎症反应和显著的肿瘤消退。作为其抗肿瘤作用的基础，细胞焦亡是由促进孔隙形成的gasdermin蛋白介导的，该蛋白通过释放促炎细胞因子和细胞破裂后的免疫原性物质促进免疫细胞活化和浸润。然而，考虑到其炎症性质，异常性的细胞焦亡也可能与肿瘤支持性微环境的形成有关。因此，深入了解细胞焦亡的分子途径，理清细胞焦亡与癌症之间复杂的联系，有助于我们充分利用细胞焦亡，并将其应用于现有的或新的抗癌策略。细胞焦亡上世纪90年代，在感染鼠伤寒沙门氏菌（S.typhurium）和福氏沙门氏菌的巨噬细胞中首次描述了细胞焦亡。虽然最初被认为是一个凋亡过程，但进一步的研究表明，这种细菌诱导的细胞死亡严重依赖于caspase-1。焦亡细胞与凋亡细胞有一些共同特征，如染色质浓缩和DNA断裂，但可通过其完整的细胞核、孔隙形成、细胞肿胀和渗透溶解来区分。通常，焦亡细胞破裂是通过结合损伤相关分子模式（DAMP）或病原体相关分子模式（PAMP）后，通过半胱氨酸蛋白酶介导的成孔GSDM蛋白活化实现的。这些相同的半胱氨酸蛋白酶也可能直接或间接促进促炎细胞因子的成熟，这些促炎细胞因子与DAMP一起，在释放时启动或维持炎症反应。虽然细胞焦亡在病原体分解中起着重要的保护作用，但它已被认为是几种人类疾病的复杂因素，如心血管疾病、神经退行性疾病和艾滋病。糖尿病等代谢紊乱也可能通过慢性炎症和胰岛素干扰性细胞因子的产生而促进细胞焦亡。在癌症中，细胞焦亡的作用似乎是把双刃剑。一方面，细胞焦亡可迅速导致肿瘤消退，另一方面，它可促进肿瘤微环境的发展。因此，癌细胞可能抑制或刺激细胞焦亡，以支持其进展，具体取决于环境。细胞焦亡的分子机制尽管已知的细胞焦亡途径的数量在未来可能会增加，但目前已有两条主要途径和几种替代途径被阐明。在主要途径中，细胞焦亡是由GSDMD诱导的，涉及炎症性caspase-1（经典途径）或caspase-4/5（非经典途径）。在替代途径中，最受广泛关注的是GSDME通过caspase-3诱导的细胞焦亡。经典炎症小体途径在经典的炎性小体途径中，模式识别受体（PRR）识别DAMP（例如纤维蛋白原、热休克蛋白、DNA）和/或PAMP（例如鞭毛蛋白、聚糖、脂多糖）导致被称为炎性小体的相应胞质信号复合物的激活，通常由传感器蛋白、适配器和效应器半胱氨酸蛋白酶组成。尽管多种PRR，如NLR和TLR参与了这一过程，但已知其中只有部分能够直接组装炎症小体并激活半胱氨酸蛋白酶caspase-1。具体而言，该亚群中的PRRs/炎症小体传感器包括NLR家族的NLRP1、NLRP3、NLRP4、AIM2和pyrin。激活后，这些传感器中的大多数与适配蛋白ASC相互作用，后者通过前半胱氨酸蛋白酶-1的募集和切割激活caspase-1。除了释放和激活GSDMD的致死N端结构域（GSDMD-N），caspase-1还使前IL-1β和前IL-18成熟为IL-1β和IL-18，它们通过GSDMD-N形成的坏死膜孔释放。非经典炎症小体途径与标准炎症小体途径相反，非标准炎症小体途径不依赖caspase-1，而是依赖于caspase-4和caspase-5以及小鼠的caspase-11。这些半胱氨酸蛋白酶的激活是通过LPS与相应的前半胱氨酸蛋白酶的直接结合发生的，并且绕过了炎症小体传感器。尽管这些半胱氨酸蛋白酶不直接激活IL-1β和IL-18，但它们通过GSDMD裂解触发细胞焦亡导致钾离子外流，从而激活NLRP3炎症小体并上调caspase-1的作用。替代途径研究表明，在某些情况下，如化疗或靶向癌症治疗，可通过caspase-3诱导凋亡到焦亡的途径。尽管caspases-3主要与凋亡执行和形态学改变有关，但它可以通过切割GSDME介导细胞焦亡，这同样导致GSDME-N孔的形成和膜的通透性改变。当GSDME水平较高时，caspase-3激活后会迅速引发细胞焦亡，但当GSDME水平较低时，则会引发凋亡。然而，这一概念仍需要进一步的验证。此外，还有其他几种替代性细胞焦亡途径，包括caspase-8对GSDMD的切割；caspase-8或颗粒酶B（GzmB）对GSDME的切割；caspase-1或颗粒酶A（GzmA）对GSDMB的切割；通过caspase-8切割GSDMC，GSDMC通过缺氧激活的程序性死亡配体1（PD-L1）和pSTAT3转录上调以及其它未知机制形成的GSDMA孔。癌症中的细胞焦亡及其成分细胞焦亡在癌症中的模糊作用似乎与细胞类型、遗传学和诱导持续时间有关。在异常表达和延长活性后，GSDM、炎症小体和/或促炎细胞因子可通过诱导免疫抑制细胞、促进上皮细胞向间质细胞转化以及上调基质金属蛋白酶以进行细胞外基质重塑来促进肿瘤病理学。另一方面，与这些效应并列，细胞焦亡也可以抑制肿瘤，例如，在肝细胞癌模型中，通过NLRP3炎性小体激活诱导的细胞焦亡显著抑制了肿瘤的转移和生长。鉴于细胞焦亡的双重作用，其分子成分在不同癌症中存在差异表达。GSDMs在乳腺癌、胃癌、宫颈癌和肺癌等肿瘤中，已被证明同时作为癌基因或肿瘤抑制因子控制增殖、转移、治疗抵抗和抗肿瘤免疫。在胃癌（GC）中，GSDMD表达显著降低，并导致体外和体内肿瘤增殖增强。相反，非小细胞肺癌（NSCLC）中的GSDMD蛋白水平显著升高，并且与肿瘤转移以及更差的预后相关。与GSDMD类似，GSDME在胃癌、乳腺癌和大肠癌中的表达也降低。GSDMC在大肠癌中表达明显上调，在大肠癌中，GSDMC在体外促进了癌变和增殖，在体内促进了肿瘤生长。GSDMB水平越高，乳腺癌患者的转移率越高，生存率越低。在其他细胞焦亡成分中，观察到大多数结直肠癌肿瘤中AIM2表达显著降低或缺失，且与患者预后不良有关。NLRP1水平在大肠癌肿瘤组织中同样降低，并与转移增加和生存率降低有关。乳腺癌患者组织中的caspase-1 mRNA水平显著降低，此外，caspase-1的缺失与前列腺癌和大肠癌的肿瘤发生有关。阐明细胞焦亡与癌症之间的关系需要更广泛的研究。一个面临的挑战将是识别每种细胞焦亡分子成分的肿瘤特异性作用。由于多条通路导致细胞焦亡，且多个成分重叠，因此，表征每条通路的整体肿瘤特异性效应，而不是每个成分的个体效应，可能是理解和/或预测肿瘤对细胞焦亡调节的更有效策略。细胞焦亡与抗肿瘤免疫的关系细胞死亡引发适应性免疫反应的能力称为免疫原性细胞死亡（ICD）。与基本上是免疫耐受过程的凋亡不同，细胞焦亡具有诱导强烈炎症反应的分子机制，在某些情况下被认为是ICD的一种形式。虽然细胞焦亡与抗癌免疫之间的联系尚不清楚，但越来越多的研究表明，细胞焦亡介导的肿瘤清除是通过增强免疫激活和功能实现的。GSDMA研究发现，将GSDMA的小鼠亚型Gsdma3选择性地递送到人类HeLa、小鼠EMT6和小鼠4T1癌细胞，导致20-40%的细胞发生细胞焦亡。在体内模型中，通过静脉或瘤内注射NP–Gsdma3进行三轮治疗，导致肿瘤明显缩小。与PBS对照组相比，NP–Gsdma3治疗的肿瘤中CD4+、CD8+、自然杀伤（NK）和M1巨噬细胞数量增加，但单核细胞、中性粒细胞、髓源性抑制细胞和M2巨噬细胞的数量减少。此外，除了在血清和肿瘤水平IL-1β、IL-18和HMGB1水平增加外，还发现许多免疫刺激和抗肿瘤效应基因（如Cd69、Gzma、Gzmb）的上调，各种免疫抑制和肿瘤前体基因（如Csf1、Vegfa、Cd274）下调。GSDMD通过研究CTLs在肺鳞状细胞癌（LUSC）和黑色素瘤肿瘤样本中与CD8+T细胞标记物有关的GSDM基因的表达，发现在五个GSDM基因成员中，只有GSDMD表达与CTL中的CD8+T细胞标记基因（例如CD8A、CD8B、PRF1、GZMA、GZMB和IFNG）呈正相关。进一步研究表明，与原始T淋巴细胞相比，OT-1小鼠活化的CTL中GSDMD的表达显著增加。类似地，人CD8+T细胞在激活后上调GSDMD，肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）中可见高水平的GSDMD蛋白。此外，GSDMD敲除后，CTL对3LL-OVA细胞的细胞毒性降低。使用人CTL和H1299非小细胞肺癌细胞系记录了类似的结果。考虑到CTL杀死肿瘤细胞的一个关键途径是通过将细胞毒性分子释放到它们形成的免疫突触中，推测GSDMD和GzmB进入效应癌细胞可能是研究中发现的CTL细胞毒性的潜在机制。GSDMBGSDMB介导细胞焦亡与GzmA密切相关。在HEK-293F细胞中的五种人类颗粒酶中，发现只有GzmA以类似于NK细胞杀伤试验的模式快速切割GSDMB。当GzmA电穿孔到GSDMB重组的293T细胞中时，引起广泛的GSDMB裂解和细胞焦亡。同样，在生理条件下，GzmA介导的GSDMB切割在NK细胞杀伤293细胞时也是必需的。值得注意的是，其他GSDMB水平不明显的癌细胞系，如OE33（食管癌细胞）和HCC1954（乳腺癌细胞），可通过暴露于通常由活化的CTL释放的细胞因子（如IFN-γ和TNF-α）来转录诱导GSDMB表达增加。反过来，IFN-γ启动显著增强了这些细胞系的细胞焦亡，这种效应最终取决于GzmA。总之，这些发现不仅表明GSDMB介导的细胞焦亡作用于GzmA下游，而且细胞毒性淋巴细胞可将GzmA传递到表达GSDMB的癌细胞中，以促进抗肿瘤免疫。GSDME研究发现，GSDME介导的细胞焦亡与GzmB相关。在小鼠4T1E乳腺癌细胞中异位表达小鼠GSDME（mGSDME），在体内模型中可显著抑制4T1E肿瘤生长，并导致NK细胞和肿瘤相关巨噬细胞（TAM）浸润增加。此外，当受到刺激时，肿瘤中表达GzmB和穿孔素的NK细胞和CD8+TIL增加。进一步研究表明，人NK细胞系YT可以激活表达GSDME的HeLa细胞中的细胞焦亡，这种诱导是通过GzmB实现的，它不仅在与caspase-3相同的位置切割GSDME，而且间接激活caspase-3。此外，CAR-T细胞可以通过穿孔素和GzmB释放，在B细胞白血病和实体瘤细胞中诱导GSDME介导的肿瘤细胞的细胞焦亡。用共同培养的CD19-CAR-T细胞和癌细胞（NALM-6、Raji或原发性B白血病细胞）的上清液处理人源性巨噬细胞，可促进巨噬细胞激活caspase-1，切割GSDMD，并释放IL-6和IL-1β。同时发现共培养上清液中的ATP和HMGB1分别足以促进巨噬细胞IL-1β分泌和IL-6上调。总的来说，这些发现表明CAR-T细胞治疗通过GSDME促进的细胞焦亡诱发CRS，对CD19-CART细胞治疗前患者的肿瘤细胞进行分析，显示GSDME水平升高与更严重的CRS相关。细胞焦亡在抗癌治疗中的应用前景近年来，越来越多的研究表明，利用细胞焦亡通过不同的靶向和传递方法进行抗肿瘤免疫的可行性和治疗潜力。例如，利用肿瘤细胞衍生微粒（TMP）将甲氨蝶呤注入胆管癌（CCA）细胞，以诱导GSDME介导的细胞焦亡，从而激活患者衍生的巨噬细胞，并将中性粒细胞募集到肿瘤部位进行药物导向的肿瘤破坏。此外，当这种甲氨蝶呤TMP输送系统注入肝外CCA患者的胆管管腔时，25%的患者观察到中性粒细胞活化和胆道梗阻的缓解。此外，还发现GSDME介导的细胞焦亡通过BRAF和MEK抑制剂的组合在黑色素瘤中引起免疫细胞浸润/激活，并导致黑色素瘤消退。在另一种策略中，二甲双胍是治疗2型糖尿病最常用的药物，其可以通过caspase-3间接激活细胞焦亡来抑制癌细胞增殖。一系列针对KRAS、EGFR或ALK突变型肺癌的小分子抑制剂也被发现，在线粒体固有凋亡途径激活后，通过caspase-3介导的GSDME裂解诱导细胞焦亡。在乳腺癌细胞中，用RIG-1激动剂治疗可触发外源性凋亡途径和细胞焦亡，激活STAT1和NF-κB并上调淋巴细胞募集趋化因子。因此，在小鼠中RIG-1激活后，乳腺癌转移和肿瘤生长的减少伴随着肿瘤淋巴细胞的增加。几乎所有抗癌免疫治疗策略面临的另一个主要障碍是免疫抑制肿瘤微环境引起的失调。为了解决这个问题，Lu等人设计了含有嵌合共刺激转化受体（CCCR）的NK92细胞，该受体将抑制性PD-1信号转化为激活信号，有效地增强了抗肿瘤活性。在体外，CCCR-NK92细胞通过GSDME介导的细胞焦亡迅速杀死H1299细胞，在体内显著抑制肿瘤生长。此外，越来越多令人兴奋的研究报告表明，细胞焦亡诱导与PD-1抑制剂协同作用使肿瘤由“冷”变“热”，表明这种组合的巨大潜力。小结作为一种炎性细胞死亡模式，细胞焦亡通过激发抗肿瘤免疫反应而在肿瘤抑制中发挥重要作用。在某些情况下，单纯的细胞焦亡诱导就可能足以阻碍肿瘤生长。然而，细胞焦亡治疗应用面临的最大挑战之一是细胞焦亡相关成分的表达和功能的不规则性，不仅在不同的癌症之间，而且还存在于同一类型的癌症中。尽管如此，分子、遗传和表观遗传靶向/递送系统的进步，以及精准和个性化的医学的发展，让我们有希望很快能够利用这些强大机制作为治疗癌症的工具。参考文献：1.Pyroptosis at the forefront of anticancerimmunity. J Exp Clin Cancer Res. 2021; 40: 264.封面图来源：123rf君实PD-1通过FDA生产现场核查背后：翻译文件超千万字，5次模拟考，2次正式核查，以及持续建设的国际化体系……中国基因疗法赛道驶入高速期，跨国药企纷纷牵手本土新锐DRUGTIMES点击在看 共济新药研发浪潮