ATF2

1.引言自食品药品监督管理局首次批准使用中国仓鼠卵巢（CHO）细胞生产生物制药化合物以来，已有35年以上的历史（Kaufman等人，1985年）。CHO细胞因为具有类似人类的翻译后修饰的蛋白合成过程而成为业界最喜爱的哺乳动物表达平台（MacDonald, Nöbel, Roche Recino等人，2022年；Walsh和Walsh，2022年）。在过去的二十年中，这些细胞主要是在批次式补料条件下培养的。然而，生物制药行业的进展重新激发了对灌流培养的兴趣（MacDonald, Nöbel, Roche Recino等人，2022年）。鉴于其高体积生产率，灌流培养可以满足日益增长的生物制药需求，特别是考虑到老龄人口的需求。然而，我们对CHO细胞系在灌流培养中的行为理解仍处于起步阶段（MacDonald, Nöbel, Roche Recino等人，2022年）。灌流培养系统的复杂动态以及它们对细胞施加的独特压力（Zamani等人，2018年）需要我们更深入的理解，以优化细胞性能，并最终提高连续生物加工的生产力和效率。迄今为止，行业通常侧重于通过改善培养基配方（Lin等人，2017年；Mayrhofer等人，2020年）或工艺设置和参数（Clincke等人，2013年；Villiger-Oberbek等人，2015年）来优化生物生产工艺。对于灌流系统培养方式，目前已知BAK1、BAX和BOK基因的凋亡抗性CHO细胞系存在一种非外部因素诱导的生长停滞。在灌流培养条件下，这种不寻常的细胞行为突显了影响连续生物加工的关键问题之一，即细胞适应灌流培养的能力。这种生长停滞现象可能与代谢紊乱、营养不足或其他细胞内外因素有关。因此，进一步的研究需要解决这些问题，并提供关于CHO细胞适应灌流培养的策略。另一个需要关注的重要方面是细胞的代谢工程。灌流培养条件下的CHO细胞代谢路径可能会发生变化，特别是在高细胞密度和高产物滴度的情况下。通过代谢工程策略，可以调整细胞代谢途径，以提高产物质量和产量，并改善细胞的适应性和生长性能。此外，灌流培养系统的设计和操作参数也需要优化。例如，培养基的流速、营养补给策略、在线监测和控制系统等都会对细胞的生长和代谢产生影响。通过系统地优化这些参数，可以实现更好的细胞生长和产物表达。2.方法2.1.细胞系开发在源自CHO-K1的细胞系中敲除了促凋亡基因BAK1、BAX和BOK后，该细胞系稳定了表达针对亨德拉和尼帕病毒的人类单克隆抗体mAb m104.2（Playford等人，2020年；Zhu等人，2008年）。对照和敲除细胞系在CHOKO Cellca SMD培养基（Sigma-Aldrich）中驯化，并添加0.4%的抗凝块剂（Gibco）。细胞从工作细胞库中解冻，并在摇瓶中扩增（Corning）。在接种生物反应器之前，每2-3天传代一次，并在37°C、8% CO2、130 rpm和82%湿度下孵化。2.2.灌流培养在3升搅拌罐（Sartorius, DE）中进行灌流培养，工作体积为1.2升。使用带有0.2 µm中空纤维膜的ATF2（Refine Technologies）进行细胞保留。在CHOKO Cellca SMD培养基中添加0.4%抗凝块剂，以0.5 × 10^6活细胞/mL的密度接种细胞。培养方法的更详细概述之前已由MacDonald等人描述（MacDonald, Nöbel, Martínez等人，2022年）。2.3.采样和分析每天采集样本，使用Vi-CELL BLU细胞活力分析仪（Beckman Coulter）确定细胞密度、活力和细胞直径。使用BioProfile® FLEX2™自动细胞培养分析仪（Nova Biomedical）定量葡萄糖、乳酸、氨、谷氨酰胺、谷氨酸和渗透压。此外，采集大约5 × 10^5个细胞的样本，以500g离心3分钟，丢弃上清液，并将沉淀物冷冻在-80°C以备后续的蛋白质组学分析。为了考虑生物学变异性，从每个生长期选择了连续三天。蛋白质组学样本被分为生长期（第8-10天）、静止初期（第17-19天）、静止末期（重复组A：第25-27天，重复组B：第29-31天）和第二生长期（重复组A：第32-34天，重复组B：第38-40天）。2.4.蛋白质组学样本制备细胞使用10% SDS在50 mM三甲基氨基乙酸酯缓冲液（TEAB）中裂解，然后用0.2 M二硫苏糖醇还原。在60°C下孵化30分钟并超声处理15分钟后，将样本在4°C下储存过夜以最大化二硫键还原。第二天，加入0.02 M碘乙酰胺，然后在室温下孵化30分钟。孵化后，加入1.2%磷酸，然后将样本稀释6倍在S-Trap结合缓冲液（90% MeOH，100 mM TEAB，pH 7.1）中，并用真空管路安装的S-Trap™微旋柱。弃去流穿液，用S-Trap结合缓冲液洗涤柱子4次。然后通过添加21 µL的50 mM碳酸氢铵在pH 8.0和4 µL的0.5 µg/µL胰蛋白酶，随后在42°C下孵化2小时进行蛋白质消化。通过分别添加35 µL的50 mM碳酸氢铵、35 µL的0.2%水溶液甲酸和50 µL的50%乙腈在0.2%甲酸中，三次洗脱肽。含有肽的流穿液转移到分析瓶中，并使用真空离心机干燥。最后，样本在15 μL的分析缓冲液A（5% ACN + 0.1% FA）中重新悬浮。2.5.液相色谱/质谱（LC/MS）样本以数据非依赖采集（DIA）模式进行分析。将2 µL的样本注入到C18 nanoEaseTM M/Z CSH C18 1.8 µm（150 µm × 100 mm）柱（Waters）中，使用Ultimate 3000 RSLCnano HPLC系统（Thermo Fisher Scientific）。使用0.1%甲酸在MQ-H2O作为流动相A，80%乙腈在0.1%水溶液甲酸作为相B进行洗脱，以0.5 µL/min的流速在60分钟内从8%到95%的相B梯度洗脱。使用Thermo Fisher Scientific Q-Exactive HF-X（Thermo Fisher Scientific）生成质谱。在200 m/z处以30,000的分辨率进行全MS扫描，碰撞能量为30%。在10 m/z隔离窗口中扫描400−1100 m/z的前体质量范围，重叠1 m/z。2.6.数据分析使用Spectronaut v.13.15.200430（Bruderer等人，2015）对样本进行归一化，并鉴定蛋白质组。使用核密度估计器估计p值。将蛋白质映射到仓鼠灰色基因组组装GCF_003668045.3上。使用超几何检验识别富集途径，如公式1所示，其中k是具有特定途径注释的差异表达蛋白质的数量，M代表基因组中注释到途径的所有蛋白质。检测到的差异表达蛋白质数量为n，N是具有特定途径注释的基因组中蛋白质的数量。使用R v4.3.1中的ComplexHeatmap扩展包（Gu等人，2016）创建富集途径的热图。使用pathview扩展包（Luo和Brouwer，2013）将蛋白质在其对数变化倍数与静止相开始的关系上绘制在KEGG途径上。计算细胞特异性生产力，如之前发表的（MacDonald, Nöbel, Martínez等人，2022年）。通过整合以下方程估算特定消耗和生产速率：其中s是反应器中的底物浓度，p是反应器中产物的浓度，D是灌注速率，X是细胞密度，q是特定速率，c是进料中的浓度。整合后，使用方程4和5：其中K = e^(-D \cdot t)根据平均细胞直径14.95和15.26 µm以及干重566和408 [pg/cell]估算基于生物质的细胞数量，分别对应三重敲除细胞系和对照细胞系。2.7.基因拷贝数如其他地方所述（Jiang等人，2016），通过定量聚合酶链反应（qPCR）确定编码mAb的基因数量。从生长期、静止期和第二生长期结束时选择样本。支持信息材料中列出了使用的引物。3.结果3.1 生长停滞的可逆性和非诱导性我们在3升连续搅拌生物反应器中培养了凋亡抵抗的CHO细胞系，保持恒定的每天1反应器体积的介质交换。该细胞系之前已被证明在没有放血的情况下在连续搅拌生物反应器中保持产品数量和质量（MacDonald, Nöbel, Martínez等人，2022年）（图1a−c）。在最初的11天内，两个重复组均显示出指数生长，分别达到了50和61 × 10^6细胞/mL的密度。在达到生长停滞时，细胞进入静止相，这种状态一直持续到重复组A的第25天和重复组B的第29天。有趣的是，在没有任何工艺参数修改的情况下，细胞在静止相后期转变为第二生长阶段，此时细胞密度超过了10^8细胞/mL。值得注意的是，在整个培养期间没有使用放血，但细胞活性始终维持在89%以上。这种行为突显了凋亡抵抗的三重敲除CHO细胞系在高密度、高活性连续培养中的潜力。（MacDonald, Nöbel, Martínez等人，2022年）。对照组没有显示出任何生长停滞，并通过放血设置来控制在第11至17天之间保持恒定的细胞体积密度。基于观察到的表型，将培养过程分为三个阶段：生长期、静止期和第二生长期（图1a中分别用1、2和3圈出）。体积滴度在整个培养过程中保持相对恒定，但细胞特异性生产力发生了变化（图1e），在第二生长阶段敲除细胞系的生产力下降。关键工艺参数，如细胞直径、乳酸和氨浓度以及渗透压，遵循之前观察到的趋势（MacDonald, Nöbel, Martínez等人，2022年）。在生长停滞时，重复组A和B的氨浓度分别为2.39 mM和3.24 mM，乳酸浓度均小于2 mM（图1）。鉴于生长停滞不能仅通过抑制性代谢产物如氨或乳酸的积累来解释，我们继续分析氨基酸消耗（图1d）。我们特别关注生长轨迹转换点处氨基酸消耗模式的变化，即生长停滞的开始和第二生长阶段的结束（图1d）。天冬酰胺是两个重复组中唯一消耗超过90%的氨基酸。尽管天冬酰胺传统上不被认为是生长必需氨基酸，但其高消耗率表明，在灌流培养条件下，这种特定的CHO细胞系对生长变化的代谢适应可能具有重要作用（Carrillo-Cocom等人，2015年；Hefzi等人，2016年）。在所有氨基酸中，消耗百分比在生长停滞期间下降。在第二生长阶段结束时，必需氨基酸亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、半胱氨酸和精氨酸以及非必需氨基酸谷氨酰胺和天冬酰胺的消耗超过了它们进料浓度的90%。这种消耗模式强烈表明，第二生长阶段的结束是由于氨基酸耗尽，尽管在生长停滞时仍有充足的营养物质可用。此外，整个培养过程中基因拷贝数没有显著下降，排除了遗传不稳定性作为细胞特异性生产力下降的原因（图2）。另外进行的氮平衡分析强烈表明，次生生长是基于从单克隆抗体生产中重新分配资源到生物质（图3）。这些发现强调了需要全面理解营养物质可用性与细胞代谢之间复杂的相互作用，以优化CHO细胞在连续培养中的性能。3.2.生长停滞与细胞周期停滞和中心碳代谢上调有关在正常情况下，细胞死亡是细胞生命周期的重要组成部分。因此，抑制凋亡，如我们三重敲除CHO细胞系的情况，会显著影响细胞代谢，这在培养后10天观察到的表型变化中得到了证实。分析在生长期和在恒定细胞体积密度下连续三个时间点采集的蛋白质组样本的全局聚类时，我们观察到敲除和对照培养的生长阶段间紧密聚类与时间无关（图2a）。这表明虽然敲除在生长期间与对照表现相似，但在静止相生长停滞时，其蛋白质组发生了变化。PCA表明细胞生长阶段间存在差异，我们通过使用超几何检验进行富集进一步探索代谢转变中涉及的途径。我们比较了与初始生长期相比具有对数变化倍数的蛋白质的调整后p值小于0.1的差异表达途径（图2c）。与对照相比，该分析证实了我们之前观察到的静止相和第二生长相之间的紧密聚类。下调的途径包括与细胞生长相关的DNA复制、剪接体、核质转运和蛋白酶体（Kito等人，2020年）。另一方面，上调的途径要么直接与中心碳代谢（三羧酸[TCA]循环、糖酵解/糖异生）相关，要么间接通过向TCA循环提供中间体（丙酸代谢、丙酮酸代谢、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解）或通过提供还原当量（氧化磷酸化）相关。这些发现表明，三重敲除CHO细胞系在响应生长停滞时，通过减少生长相关过程和上调能量产生途径，协调了代谢途径的复杂重排。为了确认我们细胞系在整个培养期间遗传修饰的稳定性，我们没有在任何培养阶段通过蛋白质组学检测到BAK、BAX或BOK，表明没有部分逆转敲除。基于途径富集研究中可能出现的假阴性，部分上调或下调途径的检测具有挑战性，但具有代谢重要性。基于上述途径富集的结果，我们假设细胞周期停滞，并使用KEGG pathview手动评估了其随时间的表达（图3）。在生长停滞期间观察到细胞周期蛋白的下调。单个蛋白如细胞周期依赖性激酶7（CDK7）或细胞周期蛋白B（CycB）在静止相期间上调，或者显示出不太明显的下调，可能有助于途径在富集期间未被识别。然而，其他细胞周期依赖性激酶（CDKs）和大多数其他蛋白质在静止相期间显示出明显的下调。3.3.氧化应激的阶段性响应鉴于观察到的氧化磷酸化上调和细胞年龄的增长，ROS可能随时间积累是合理的。ROS是细胞代谢的副产品，特别是氧化磷酸化，如果积累超过一定阈值，可以对细胞组分造成损害（Dickinson和Chang，2011）。这种ROS积累可能潜在地影响我们观察到的生长模式，促使我们进一步探索细胞的氧化应激响应及其对连续培养中细胞行为的影响。此外，我们的发现显示，在静止相期间，与过氧化物酶体活性和脂肪酸降解途径相关的蛋白质显著上调。这些途径和氧化磷酸化是细胞内ROS生成的主要贡献者。因此，它们的活性增加可能与ROS产生的增加相吻合（图4）。因此，我们分析了随时间表达的关键蛋白质在氧化应激响应中的特征（图4）。实验结果显示了基于具有相同功能的蛋白质的细胞定位的有趣差异。例如，催化超氧自由基转化为过氧化氢的酶超氧化物歧化酶（SOD），显示出显著的差异性调节。在静止相期间，这种酶的线粒体形式SOD2显著上调，远大于其胞质对应物SOD1。对于其他抗氧化蛋白如谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化物酶（PRDX）和硫氧还蛋白（TXN），线粒体亚型在静止相期间表现出更强的上调。这些发现表明，在静止相期间，线粒体氧化应激增加，证明了线粒体在管理生长停滞期间的氧化应激中的作用。在静止相期间，谷胱甘肽合成（GSS和GCL）被下调，TXN还原酶和Kelch样ECH相关蛋白1（Keap1），氧化应激的关键信号蛋白之一，也下调。此外，NADPH再生酶，谷胱甘肽还原酶和TXN还原酶（txnR），在静止相期间保持不变或减少。尽管并非所有同源物都被检测到，SODs和过氧化氢酶（CAT）表明在静止相期间氧化应激增加，特别是在线粒体中。谷胱甘肽和TXN响应，两者都将过氧化氢转化为水，确实显示出一些同源物的上调，但没有全局上调。4.讨论本研究首次描述了哺乳动物细胞培养中的第二生长阶段。这种现象似乎是由细胞周期停滞导致的而与非抗凋亡细胞株中看到的持续生长或凋亡的典型模式不同。这一发现自然促使我们对其背后的原因进行调查。传统上，细胞周期停滞的终止与细胞应激的减少有关，但具体情况的具体触发因素仍有待确定。大多数抑制剂已被描述，它们通过积累导致细胞周期停滞。两个重复在相近的时间内都显示出再生迹象，自发适应事件的可能性很小。第二生长阶段，通过其蛋白质组的变化揭示，显示出细胞周期停滞期间观察到的上调和下调途径的部分逆转。尽管如此，第二生长阶段的速度明显较慢，这表明最初导致细胞周期停滞的压力可能仍然存在。由于CHO细胞代谢的高度复杂性，解开代谢难题预计将为未来的细胞系工程工作提供巨大的助力，这些工作聚焦于于产生灌注特异性细胞系。同样，研究经历第二生长阶段的细胞的长期变化将有助于理解这里介绍的工作对工业应用的潜力。识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

导读肝脏具有独特的再生能力，在发生损伤后肝细胞迅速启动增殖程序，进行损伤修复。然而，在急性或慢性肝病中以及肝切除术后，肝细胞再生能力往往受损，无法恢复肝脏质量和功能。疾病相关的微环境通过复杂的细胞间互作降低肝细胞再生能力，但人们对潜在的分子机制知之甚少。德国图宾根大学的 Lars Zender 团队在肝再生领域深耕十余年，2013 年曾在 Cell 报道通过体内 RNAi 筛选鉴定出丝裂原活化蛋白激酶激酶 4（MKK4）是肝细胞再生的关键调控因子。压力信号活化 MKK4，进而活化 JNK1/2/3 和 p38，而 MKK4 的敲低上调 MKK7/JNK1 活化的 ATF2、ELK1 促再生转录程序，从而恢复肝细胞再生能力。尽管许多实验室以及初创公司进行 MKK4 抑制剂的开发，其靶向性、疗效仍不理想。2024 年 3 月 14 日，来自德国图宾根大学的 Lars Zender 和新加坡南洋理工大学等研究团队联合在 Cell  发表了题为 First-in-class MKK4 inhibitors enhance liver regeneration and prevent liver failure 的文章。在证明系统性 MKK4 的抑制促肝再生的基础上，开发了强效、选择性的 MKK4 抑制剂，在多种动物模型中证明了安全有效性，并进入 Ⅰ 期临床试验。图源：Cell研究思路作者原创创新点1. 基于结构学的开发使抑制剂具有高选择性；2. 通过严谨的临床前实验证明 HRX215 具有良好的耐受性和安全性；3. HRX215 具有强大的促肝再生能力，为更大范围肝肿瘤切除以及肝小叶移植提供基础。主要研究内容1. 敲低 MKK4 促进小鼠肝脏再生，并且长期安全为了模拟 MKK4 抑制剂的系统作用，研究员构建了 dox 诱导的 MKK4 敲低鼠（CAG-rtTA; TRE-shMKK4），dox 诱导后进行部分肝切除（PH），显示 MKK 的敲低使 Ki67 阳性细胞增多，证明 MKK4 的系统性抑制促进肝再生。Dox 处理 12 个月后，shMKK4 鼠的体重以及组织病理学形态正常，表明了 MKK4 抑制剂的安全性。Figure 1. MKK4 的敲低促进小鼠肝脏再生，并且长期安全（图源：Cell ）2.  强效、选择性小分子 MKK4 抑制剂的开发和表征首先，研究员开始进行药物发现。因为受限于尚无足够分辨率的蛋白结构，他们从已报道的蛋白激酶抑制剂的脱靶谱中，选择了对 MKK4 具高脱靶亲和力的 vemurafenib（BRAFV600E 抑制剂）作为原型，经过 C 环置换、烷基磺酰胺修饰后产生二代抑制剂；接着解析了与激酶结构域的 NMR 结构，基于经验对 C 环修饰后，最终将选择性最高的 HRX215 作为临床候选药物。经过细胞和体内实验表明，HRX215 具细胞膜通透性，并且半衰期（3.4-3.9 h）允许进一步的体内药理学分析。Figure 2. 强效、选择性小分子 MKK4 抑制剂的开发和表征（图源：Cell ）3. HRX215 促进肝增殖、稳定肝细胞接着，研究员在体内探究 HRX215 的药效、安全性。与敲低 MKK4 一致，HRX215 以剂量依赖性方式促进 PH 后的肝细胞增殖，并且不诱导未手术肝的增殖；此外，HRX215 处理与 MKK4 敲低的肝的术后表达谱高度相关，表明 HRX215 的选择性。除了促进肝细胞增殖，肝 MKK4 的抑制具有肝保护功能。TUNEL 显示，HRX215 抑制 CCl4 诱导的肝损伤模型中的肝细胞凋亡；凋亡相关磷酸化蛋白阵列显示，HRX215 抑制 PH 后的肝细胞凋亡。最后评估安全性。通过血浆、肝脏代谢组学显示，HRX215 仅引起自身代谢物的变化；GAN-NASH 模型中，12 周的 HRX215 治疗不增加肿瘤数量，甚至降低肿瘤尺寸，但不影响异常增生，表明 HRX215 抑制肿瘤进展。Figure 3. HRX215 促进 PH 后的肝细胞增殖，减轻 CCl4 肝损伤模型中细胞凋亡（图源：Cell ）Figure 4. HRX215 长期治疗的安全性（图源：Cell ）4. HRX215 阻止 PHLF为了更好地验证人肝切除术后的情况，作者使用猪 PH 模型，其中 85% 肝切除会引发肝切除术后肝衰竭（PHLF），是严重的临床问题。与小鼠模型一致，HRX215 增加再生肝的体积，促进肝细胞增殖。在 85% 肝切除模型中，HRX215 有效阻止急性肝衰竭的发生（ICP 增加），维持肝的正常功能（代谢、合成凝血蛋白）。重要的是，HRX215 治疗阻止术后昏迷，以及肝脏变小、灌注不足，表明 HRX215 介导的肝再生有效阻止 85% 肝切除术后的致命 PHLF。Figure 5. HRX215 增加猪 85% 肝切除术后的肝再生（图源：Cell ）Figure 6. HRX215 阻止 85% 肝切除术后的肝衰竭（图源：Cell ）5. HRX215 具有良好的安全性、药代动力学特征最后在 48 名男性志愿者中进行Ⅰ期临床试验，显示 HRX215 不会引发不良反应。使用 LC-MS/MS 研究药代动力学，发现 HRX215 被快速吸收，达到最大浓度后以双相方式被清除；暴露量与剂量正相关；进食后给药延迟吸收但提高生物利用度。Figure 7. HRX215 的首次人体Ⅰ期临床试验（图源：Cell ）文章小结本文在证明系统性 MKK4 抑制剂肝再生的基础上，进行了 MKK4 小分子抑制剂的开发、临床前评估以及Ⅰ期临床毒性评估。图源：Cell参考文献：Zwirner S, et al. First-in-class MKK4 inhibitors enhance liver regeneration and prevent liver failure. Cell. 2024 Mar 28;187(1-19).声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！长按关注本公众号   粉丝群/投稿/授权/广告等请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓

中文摘要目的    对剪切力敏感哺乳动物细胞株进行灌流培养工艺开发与优化，以获得高蛋白产量。方法    利用N-1种子阶段灌流工艺获得高密度种子用于N阶段强化批次补料工艺开发；使用TPP摇管筛选灌流培养基及初步开发灌流工艺，再进行台式生物反应器工艺放大与优化。结果    “种子灌流+强化批次补料”混合工艺的单位体积产能相较于原始批次补料工艺提升46%；建立培养基筛选评分机制并筛选出1种混合培养基（基础+补料培养基）和1种通用灌流培养基，并用于2 L反应器规模灌流工艺放大，采用混合培养基和通用灌流培养基的灌流工艺单位体积产能分别提升335%和460%。结论    在N-1阶段和N阶段各自建立了剪切力敏感哺乳动物细胞株灌流工艺，并在N阶段获得高产量。正文       单克隆抗体（单抗）药物治疗靶点明确、不良反应小，治疗范围涉及肿瘤、自身免疫病以及血液疾病，其生产多采用中国仓鼠卵巢（Chinese hamster ovary，CHO）细胞，培养工艺包括批次、批次补料、强化批次补料及灌流培养工艺。强化批次补料培养采用"高密度接种+浓缩补料”使细胞快速进入生产阶段，缩短批次时间、增加年生产批次或产量。       基于监管机构对细胞培养技术转变与创新的鼓励，传统批次补料培养正不断向整合连续生产转变，其中的灌流工艺成为制药行业的技术热点。       CHO细胞培养时，常因搅拌或通气引发的剪切力导致细胞损伤、蛋白表达量降低及糖基化修饰等问题，虽可通过添加泊洛沙姆类物质在一定程度内缓解，但针对CHO细胞进行灌流培养工艺，尤其是大规模培养工艺开发的报道较少。       本研究主要针对剪切力敏感CHO细胞的灌流培养工艺进行开发，包括两部分：采用灌流工艺进行N-1种子阶段高密度培养，用于N生产阶段强化批次补料工艺开发；利用TubeSpin®生物反应器筛选出适合剪切力敏感细胞株的培养基，用于台式反应器进行N生产阶段灌流工艺放大与优化。1材料与方法1.1材料1.1.1  细胞系   实验所用商业化CHO细胞株已经稳定转染单抗目的基因序列并建立种子细胞库。1.1.2  耗材与设备   基础培养基（TA）、补料培养基（BCF）、生长用培养基4CHO-X和灌流用培养基M4、M5、M6、M7、M8和M9由德国默克公司定制，复苏、生长和灌流筛选用培养基BJM01、BJMF1、BJMF2购自上海奥浦迈生物科技有限公司；250 ml摇瓶购自美国Corning公司；TubeSpin®生物反应器TPP摇管购自英国TPP公司。ATF2®系统购自美国Repligen公司；Cedex Bio生化分析仪购自美国Roche公司；Bioprofile 400生化分析仪购自美国NOVA公司；Vi-cell®细胞计数仪购自美国Beckman Coulter公司；Multitron Pro二氧化碳摇床购自瑞士 INFORS公司；EZ2 Control 3 L台式生物反应器购自荷兰Applikon公司；BIOSTAT®-B 2 L台式生物反应器购自德国Sartorius公司。1.2实验方法1.2.1  种子制备   在37 °C水浴中融化解冻细胞株，解冻时间在3 min之内。解冻完成迅速将细胞种子液无菌移入装有50 ml TA或BJM01的摇瓶中，摇匀后放入二氧化碳摇床，每3天传代1次，逐步扩大体积至后续实验需要。起始活细胞密度（viable cell density，VCD）为0.5× 106 ml-1，摇床转速130 r/min，轴距50 mm。培养温度36.5 ℃，相对湿度70%，二氧化碳浓度5%。 1.2.2  3 L反应器“种子灌流+强化批次补料”混合工艺   N-1种子阶段灌流培养VCD为1.0×106 ml-1，培养7 d所获得的高密度种子用于N阶段批次补料工艺以及强化批次补料工艺培养。每天灌流换液1.00单位培养体积（vessel volume per day，VVD）的新鲜 TA，3—4 d 0.33 VVD，5—7 d 0.50 VVD，细胞截留采用0.2 μm孔径的ATF2® ，切向流流速0.9 L/min，透过流速1.7 L/d。       N阶段强化批次补料工艺同样采用3 L台式生物反应器进行14 d培养，设置1组批次补料工艺对照组（VCD为0.3×106 ml-1，TA ：BCF =1.0：1.0）和3组强化批次补料工艺实验组（VCD为2.0×106 ml-1，其中2组为TA : BCF=1.3 ：1.4，1组优化为TA ：含500 nmol/L锰离子BCF=1.3 ：1.4），补料流加比例（连续流加补料，补料比例按起始培养体积计算）：2—3 d 3%、4—10 d 4%、11—13 d 3%，培养过程及结束按1.3分析方法取样完成VCD、活率、葡萄糖和乳酸、表达量等相关检测，根据每日细胞培养液中葡萄糖浓度按需补加葡萄糖。N-1和N阶段的反应器培养参数均为：1.0 mm气体分布器、36.5 ℃、pH（7.0 ±0.1）、溶解氧60%、培养体积1.5 L。1.2.3  灌流培养基筛选   采用2种策略筛选/测试灌流培养基：（1）选择3种通用型批次补料培养基作为灌流培养基进行测试，其中BJM01、BJMF1、BJMF2的混合比例分别为97.25% ：2.50%：0.25%（混合1）、94.50% ：5.00% ：0.50%（混合2）、91.75% ：7.50% ：0.75%（混合3）；（2）选择6种通用型灌流培养基进行测试，分别为M4—M9。       复苏传代：用BJM01摇瓶培养扩增2代细胞，再用50 ml的TPP摇管稀释接种1.0×106 ml-1至BJM01或4CHO-X进行培养基筛选，培养参数：摇床转速225 r/min，TPP管架倾斜15o，其他同1.2.1；129×g离心5 min后灌流换液；灌流阶段1：当VCD至（5~6）×106 ml-1时分别用BJM01和4CHO-X按1.0 VVD换液；灌流阶段2：当VCD至1×107 ml-1时分别用混合1、2、3和M4—M9按1.0 VVD换液；当细胞活率低于75%收获/结束实验。1.2.4  TPP管灌流培养参数初步优化   在筛选出较优的灌流培养基后，使用50 ml TPP管进行灌流速率以及降温时间优化。M6、M7培养基各设2个灌流速率7.5和15.0 ml/d，VCD至1×107 ml-1时换液；培养温度分别为混合2全程36.5 ℃（对照组）、灌流阶段1培养9 d降温至33.0  ℃、灌流阶段1培养5 d降温至33.0 °C以及M7—M9从灌流阶段1培养9 d降温至33.0 ℃ ，其他实验阶段操作同1.2.3。1.2.5  灌流培养基筛选以及优化的评价   用“乘积求和”评分机制评价筛选效果以及优化效果，对最低细胞比灌流速率（minimum cell-specific perfusion rate，CSPRmin）、最高单日表达量、平均细胞比生产速率（average cell-specific production rate，Qp）以及培养时间4个权重因子按档赋分，赋值为1、2、3、4、5，计算公式见下。不同批次进行的实验计算的总分数之间不具有可比性。1.2.6  灌流培养基2 L规模生物反应器放大   将4次实验分为3种条件（2L01、2L02/2L03、2L04），均使用0.5 mm气体分布器；从复苏至N-2阶段使用BJM01，N-1阶段分别使用BJM01、4CHO-X、4CHO-X，搅拌转速（计算公式见下）23 W/m3，pH（6.95±0.25），温度36.5 ℃，溶解氧40%，接种密度1.0×106 ml-1，培养体积1.7 L；初始培养基分别为BJM01、4CHO-X. 4CHO-X，灌流培养基分别为混合 2、M7、25% 4CHO-X+75% M7；灌流阶段1在VCD达到（5~6）×106 ml-1时使用初始培养基进行灌流1.7 L/d，灌流阶段2在6 d或VCD达到1×107 ml-1时，换灌流培养基灌流1.0 VVD，ATF2®的抽吸流速为0.9 L/min；葡萄糖浓度低于3 g/L时补加300 g/kg葡萄糖使培养液中葡萄糖终浓度达到5 g/L，当天细胞活率低于70%或者当天VCD低于峰值VCD的一半时收获。灌流培养期间细胞截留采用ATF2®进行控制。       其中Pv为单位输入功率，Np为雷诺系数，N为转速，d为搅拌桨直径，ρ为密度，V为培养体积。1.3分析方法使用细胞计数仪检测VCD和细胞活率，使用Bioprofile 400生化分析仪检测离心换液后细胞澄清液（harvest cell-free culture fluid， HCCF）中葡萄糖和乳酸含量；使用Cedex Bio生化分析仪检测抗体表达量。       对“N-1阶段灌流+强化批次补料”混合工艺所获得的抗体，检测分子排阻色谱纯度、毛细管区带电泳纯度及糖基化修饰等质量属性。2结果2.1N-1阶段灌流+强化批次补料        使用TA进行N-1阶段种子灌流培养，第7天VCD可达5.07× 107 ml-1，细胞活率为95%（图1A）。期间种子的细胞比生长速率（μ）在0.2~0.8 d-1（图1B），表明细胞一直处于对数生长期。      采用N-1阶段灌流高密度接种（2.0×106 ml-1）+强化批次补料培养工艺，在同样的培养时间（14 d）内最高VCD和收获时活率与批次补料工艺无明显差异（图2A），但单位产能高46%（图2B），且Qp均高于典型的批次补料工艺（图2C）。强化补料工艺由于采用较高密度接种，因此细胞更早进入平台期（μ更快接近于0）（图2D）。      在抗体质量属性方面，未优化的强化批次补料工艺-1/2获得的抗体糖基化峰形5的比例明显低于对照组（图3），优化组的质量属性与原批次补料工艺可比。2.2N阶段灌流培养工艺开发2.2.1  灌流培养基筛选   使用TPP摇管进行培养基筛选实验，对灌流培养基评分结果见表1。培养基M7、混合2和M6所获得分数明显高于其他培养基，初步判定具有进一步放大至台式反应器的可能。2.2.2  灌流培养基培养工艺优化   对筛选出的3种培养基M7、M6和混合2进行初步灌流优化实验，优化实验使用同一种评分机制。由表2可见，采用1.0 VVD的M7每日换液获得较好的灌流效果，采用M7降低温度或者减少换液体积均会影响细胞灌流工艺表现；采用1.0 VVD混合2每日换液、36.5 ℃培养获得最佳灌流效果，降低温度会影响细胞生长（9 d降温）或者影响Qp（5 d降温）。2.2.3  灌流工艺2 L反应器规模放大   用配置0.5 mm气体分布器的2 L反应器，通过从反应器移除部分细胞控制VCD为3×107 ml-1，采用M7（36.5 °C和1.0 VVD）和混合2（36.5 °C和1.0 VVD）进行灌流工艺放大。如图4所示，由于混合2的VCD在培养14 d后出现下降，因此仅培养至17 d，单位体积产能是批次补料培养工艺的4.35倍，但累积抗体浓度较M7组低（图4D）。使用M7的灌流工艺表现出更好的单位体积产能和Qp（图4C），后续将选择M7进行优化实验以期延长灌流培养时间，达到稳态培养。        M7组的细胞活率在灌流后期不能很好维持（图4B），对其反应器罐内留存HCCF进行营养物质分析，结果显示各类氨基酸都有剩余，说明细胞活率的下降并非由营养物质缺乏所造成。考虑到4CHO-X中的某些营养组分有利于更好地维持细胞的生长和活率，选用75% M7+25% 4CHO-X作为灌流培养基，先进行TPP摇管实验再进行2 L反应器放大。该优化组2 L反应器规模实验培养时间为21 d，累积抗体浓度约为22 g/L，单位体积产能是批次补料培养工艺的5.6倍（图4D）。3讨论       作为连续整合生产的灌流培养工艺越来越受到生物制药行业的重视，灌流培养工艺集中应用在N-1种子制备阶段和N阶段。在实现同样年产能的情况下，使用N-1阶段的灌流种子接种N批次补料混合工艺或直接使用N阶段灌流工艺能减小反应器规模，从而使得工厂设计更灵活。       高密度接种强化工艺，能迅速提升N阶段细胞培养密度，提高生产效率。我们利用灌流工艺进行N-1高密度种子培养，随后将灌流种子用于N阶段强化批次补料工艺，单位体积产能较批次补料工艺提升46%。在实验中我们发现抗体浓度提升的同时质量结果发生漂移（较原始批次补料工艺），推测是糖基化酶的修饰速率无法匹配较高的蛋白生产速率，通过向补料培养基额外添加锰离子使得单抗质量结果在可接受范围内。这种混合工艺考虑到剪切力敏感细胞株在批次补料培养后期Qp下降，通过提高接种密度使得培养过程维持较高的Qp，进而提升单位体积产能。       通用型批次补料培养基按一定比例混合可以作为开发灌流培养基的一种方法，但混合2因为从TPP摇管放大至2 L台式生物反应器工艺表现不佳而舍弃。通用型灌流培养基即用即配、无需混合，在2 L台式生物反应器放大效果更佳，于是选定M7作为灌流培养基。在此基础上为了维持灌流培养后期细胞活率，我们进一步引入M7+4CHO-X混料作为现阶段使用的灌流培养基。现阶段灌流工艺能培养至21 d，单位体积产能较原批次补料工艺提升460%。由于剪切力损伤，细胞在培养后期累积过多的活性氧导致细胞凋亡，后续还会尝试在N阶段灌流培养基中额外添加抗氧化剂（如迷迭香酸等）减少细胞氧化应激水平以延长灌流培养时间，为连续性生产做好铺垫。       N阶段灌流培养作为一种高生产能力的工艺方式，更适合一些不稳定和对质量/产能要求更高的抗体分子，灌流工艺不仅可以控制更低的产物异质性，更高的单位体积产能还赋予整个培养工艺更高的规模灵活性以及更低的总成本。我们估算了另一个项目采用灌流细胞培养工艺和批次纯化工艺生产总成本，按照年产500 kg单抗，使用一次性工艺2 g/（L•10 d）、25 d/批的设定，相较于同样年产能的批次补料工艺在总生产成本上降低约28%（固定资产投资＋生产成本，使用Biosolve Model 进行模拟）。       一次性技术和过程分析技术的发展也将赋能灌流工艺。一次性技术例如一次性取样组件的使用，可以大大降低灌流工艺过程取样的污染风险。而以拉曼光谱为代表的在线检测技术能同步实时监控细胞培养过程多个参数，拉曼在线检测技术的应用加上负反馈控制将降低长周期灌流培养工艺参数偏离的风险，提高工艺稳健性。作者马为民1  周伟棠1  张亮2  张慧娟1  王晖2  纪仁智11广州百济神州生物制药有限公司工艺开发部，广州 510555；2默克中国生命科学工艺解决方案，上海 200126通信作者：马为民，Email：mawm1313@126.com引用本文：马为民，周伟棠，张亮，等.  剪切力敏感哺乳动物细胞灌流培养工艺开发与实践 [J]. 国际生物制品学杂志, 2023, 46(4): 192-197.  DOI: 10.3760/cma.j.cn311962-20221207-00083近期直播推荐识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。