YY1AP

本次培训针对CGT企业或研发机构有一定CMC基础的工艺和质量主管进阶提升，讲述工艺与治疗关键点，给与尽可能多的避坑指南，帮助其成为独当一面的CMC专家。1靶向KRAS的难度KRAS基因突变是多种癌症的驱动因素，特别是结直肠癌（CRC）、胰腺导管腺癌（PDAC）和非癌症小细胞肺癌（NSCLC）。其中KRAS-G12突变占主导地位（89%），其次是G13（9%）和Q61（1%）突变。KRAS突变的广泛存在，使得KRAS成为癌症药物开发中，“炙手可热”的靶点，但历史上很长的时间内，KRAS通常被认为是“不可成药”的靶点。KRAS靶点通常被认为是不可成药的，主要原因有三个：首先其蛋白构象在“活性”（结合GTP）和“非活性”（结合GDP）间动态变化，抑制剂需要准确的选择性不同的构象KRAS而不影响野生型，这使得抑制剂的开发难度大大增加。图注：KRAS的“活性”和“非活性”状态示意图其次，KRAS蛋白对GTP的亲和力非常强，且细胞内的GTP浓度高，这使得GTP竞争性抑制剂的开发变可行性不高；最后，KRAS蛋白的结构中，天然的缺乏小分子药物结合位点，存在典型的“不可成药特征”。2KRASG12C的突破KRASG12C是KRAS蛋白第12个密码子的甘氨酸（G）突变位半胱氨酸（C），这个突变导致了KRAS通路被严重增强，促进肿瘤的发生和增殖。图注：KRAS的G12C突变大大增强了KRAS传导的信号（右图），正常的信号通路直接被打穿，“暴走”的电闪雷鸣导致细胞癌变和疯狂增殖。2013年，Shokat及其同事发现KRASG12C突变后的半胱氨酸残基附近变构口袋结合（开关II口袋），可以通过小分子靶向（小分子和半胱氨酸残基结合），将变体KRAS锁定在“非活性”状态，同时不影响野生型KRAS蛋白。这直接促进了Sotorasib（AMG-510，Amgen）和Adagrasib（Mirati）两种药物的发现和批准，这也意味着KRAS靶点药物开发取得了“开门红”。图注：KRAS药物的发现历史在CodeBreaK 100研究中，Sotorasib患者的客观缓解率（ORR）为41.0%，无进展生存期（PFS）为6.3个月，在Adagrasib的I/Ib期KRYSTAL-1研究中也报告了类似的结果，ORR为42.9%，PFS为6.5个月。根据这些结果，FDA于 2021年和2022年加速批准了Sotorasib和Adagrasib用于治疗NSCLC。图注：Sotorasib和Adagrasib和KRAS蛋白的结合结构图3耐药机制在发现KRAS抑制药物的同时，在临床上也发现了耐药突变，这些机制包括：通过耐药突变获得的耐药性。临床数据显示几乎所有耐药突变的患者都会重建RAS-MAPK信号，这也说明了肿瘤生长对RAS信号的依赖性。这些耐药突变可分不同类型，耐药患者也可能存在不止一种耐药机制。适应性耐药。值得注意的是，很大一部分耐药患者没有可识别的基因突变，这表明非遗传机制参与了耐药，成为适应性耐药。适应性耐药可能是上游RTK、KRAS或其效应器通路的快速重新激活。（补偿机制）细胞组织转变作为耐药机制。在治疗压力下可能会发生细胞形态的转变，从而逃逸治疗。研究观察到肺腺癌在KRAS抑制下转分化为1型肺泡样状态。（可能是肿瘤本身的异质性造成的）图注：KRAS耐药机制示意图4打破耐药之：新型KRAS抑制剂的开发为打破KRAS G12C抑制剂耐药，多种管线在开发其他KRAS等位基因抑制剂，以期提高疗效、降低毒性和延迟耐药性。新型KRAS靶向药物大致可分两类。第一类是选择性抑制剂，旨在针对单个基因或蛋白质突变。第二类是泛RAS/KRAS抑制剂，它针对几乎所有的RAS突变，具有更大的解决耐药的潜力，理论上更有可能因为对野生型RAS的抑制而产生毒性。5打破耐药之：联合治疗鉴于KRAS G12C抑制剂作为单一疗法在NSCLC、CRC和其他癌症类型中的活性，联合用药旨在解决KRAS抑制的获得性遗传耐药性和适应性耐药机制，从而延长患者的持久获益。图注：联合治疗的临床研究情况01联合RTK抑制RAS-MAPK通路很容易受不同水平的补偿激活的影响，因此针对该通路上多个节点的组合非常有意义。临床前研究表明HER2、HER3和其他RTK家族成员可能在KRAS抑制后继续驱动生长信号传导。临床正在测试KRAS G12C选择性抑制剂与泛ERBB抑制剂阿法替尼的联合治疗，包括CodeBreaK 101（Sotorasib和阿法替尼；NCT04185883）和 KRYSTAL-1（Adagrasib和阿法替尼；NCT03785249）。02联合SOS1和SHP2抑制剂SOS1和SHP2是RTK激活的中间蛋白，抑制SOS1和SHP2可使GDP结合的 KRAS保持非活性状态。在临床前模型中，SHP2抑制剂TNO155和RMC-4630 表现出与KRAS G12C选择性抑制剂的协同作用。抑制SOS1可阻止其与KRAS-GDP的相互作用，从而阻止KRAS的GTP负载。迄今为止，两种SOS1抑制剂BI-1701963和MRTX0902已进入早期临床开发。与SHP2抑制剂的情况类似，观察到单一疗法活性有限。03新兴组合策略耐药机制除MAPK信号通路重激活产生的，还可以通过平行信号通路的重连接来驱动。最近临床前研究中，Hippo通路成员YAP和TAZ已成为KRAS抑制剂耐药性的主要调节因子。细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）是KRAS抑制剂的第二个潜在协同靶点，在临床前研究中，CDK和KRAS的联合抑制可阻止细胞周期进展。目前，正在临床评估各种组合，包括sotorasib和CDK4/CDK6抑制剂palbociclib（CodeBreaK 101）、adagrasib和palbociclib（KRYSTAL-16）以及 JDQ443和CDK4/6抑制剂ribociclib（KontRASt-03；NCT04185883、NCT05178888 和NCT05358249）。04与ICB的组合KRAS可以通过肿瘤细胞表达细胞因子、募集骨髓源性抑制细胞和抑制CD8+来促进T细胞活性，KRAS还被证明可以促进肿瘤细胞表达免疫检查点配体PD-L1。因此，将KRAS抑制剂与增强免疫的药物结合存在合理性。几项临床试验正评估KRAS抑制剂与ICB的组合。然而，CodeBreaK 101研究的早期数据联合会导致肝毒性的高发生率，最近的报告还表明，先前抗PD-1治疗可能容易导致sotorasib的肝毒性和其他毒性，这与EGFR抑制剂治疗NSCLC的经验类似。05与化疗和一线治疗方案的联合化疗仍然是KRAS突变NSCLC、CRC和PDAC患者的主要治疗手段，化疗和 KRAS抑制剂联合可以通过双重机制和加强选择性压力来增强疗效，以减少耐药。多项随机III期试验在评价与标准化疗联用进行比较（NCT05920356和NCT06119581）。还计划在CRC和PDAC中进行研究，以评估KRAS抑制剂和化疗组合（NCT06252649）。6靶向KRAS的免疫治疗多种针对KRAS的免疫治疗已被开发出来。较早的研究使用多肽疫苗，已诱导出针对突变体特异性KRAS等位基因的宿主T细胞反应，在一些临床研究中还能观察到疗效。一些新兴的治疗方法在一些研究中报道了PR的个例，包括T细胞抗原受体（TCR）靶向突变型KRAS G12D疗法。最近，一种新型淋巴结靶向两亲物平台技术（使用白蛋白结合递送系统）结合了“现成”肽疫苗和双肽疫苗形式的免疫佐剂（命名为ELI-002））针对KRAS G12D和G12R正在I期试验中，一项使用七肽疫苗（G12D、G12R、G12V、G12A、G12C、G12S和G13D）的随机II期试验正在切除的PDAC （NCT05726864）中进行。图注：新疗法的临床情况7展望未来KRAS突变癌症的治疗前景发迅猛，相关药物市场预计在未来几年会显着增长，根据DelveInsight的分析，KRAS抑制剂的市场规模到2022年将达到2.4亿美元，到2032可达到惊人的100亿美元，年复合增值率36%。预计NSCLC将成为KRAS治疗的主要市场，继非小细胞肺癌之后，结直肠癌是KRAS的第二大战场。尽管KRAS在胰腺癌中比在结直肠癌和非小细胞肺癌中更常见，但该领域的管道活动有限。图注：KRAS抑制剂上市预测对有效的KRAS抑制剂的追求，证明了科学界在抗击癌症和开创精准医疗新时代方面所做的不懈努力。寻找更有效的KRAS抑制剂是患者希望的灯塔，照亮了更有效和个性化的癌症治疗之路。更多优质内容，欢迎关注↓↓↓

本文为转化医学网原创，转载请注明出处 作者：Sophia 导读： 在弥漫性胃癌 （DGC） 中已特异性发现导致 CLDN18-ARHGAP26 融合蛋白的复发性易位。然而，目前尚不清楚 CLDN18-ARHGAP26 融合对胃上皮的功能影响和潜在疗法。 近日，南方医科大学南方医院张海生团队与哈佛大学丹娜-法伯癌症研究所、哥伦比亚大学等知名机构研究者合作在《Gut》期刊发表的最新研究成果“Recurrent RhoGAP gene fusion CLDN18-ARHGAP26 promotes RHOA activation and focal adhesion kinase and YAP-TEAD signalling in diffuse gastric cancer”， 研究开发了一个模型，使我们能够研究这种融合蛋白在DGC发病机制中的功能，并确定具有这些改变的DGC肿瘤的潜在治疗靶点。 https://gut-bmj-com.libproxy1.nus.edu.sg/content/early/2024/04/14/gutjnl-2023-329686 研究背景 01 胃癌是全球第四大癌症死亡原因，每年造成70多万人死亡。GC的生存率很低，对于大多数患者，我们缺乏有效的分子靶向治疗。在组织学上，GC 根据 Lauren 分类通常分为两种类型，肠道和弥漫性。弥漫性 GC （DGC） 缺乏细胞凝聚力，具有高度侵袭性和低分化癌细胞的典型特征，包括富含粘蛋白的“印戒”细胞（也称为印戒细胞癌）。在分子上，癌症基因组分析的一项大型分析将大多数DGC归入基因组稳定肿瘤的类别，因为它们缺乏超突变和明显的染色体不稳定性。在DGC中，最显著的基因组畸变是肿瘤抑制因子CDH1（编码细胞粘附蛋白E-钙粘蛋白）的缺失。 胃癌的基因组研究已经确定了影响 RHO 信号传导的高度复发的基因组改变，尤其是在弥漫性胃癌 （DGC） 组织学亚型中。这些改变包括染色体间翻译，导致粘附蛋白 CLDN18 和 RHO 调节因子ARHGAP26融合。 目前尚不清楚这些融合结构如何影响RHO通路的活性，以及它们对胃癌发展的更广泛影响。 研究设计与进展 02 我们 建立了一个转基因小鼠模型，将LSL-CLDN18-ARHGAP26融合工程化到Col1A1位点，其表达可以由Cre重组酶诱导。 利用该模型生成的类器官，我们评估了其致癌活性和融合蛋白对RHOA通路的生化效应及其下游细胞在DGC发病机制中的生物学效应。 由于ARHGAP26是一种 Rho GTP 酶激活蛋白，它促进从活性 RHO-GTP 形式向非活性 RHO-GDP 形式的转变，从而减弱 RHO 信号传导。由于融合将大部分细胞粘附蛋白 CLDN18 与ARHGAP26外显子 12 及以上编码的序列连接起来， 因此融合可以调节ARHGAP26催化活性，我们评估了 CLDN18-ARHGAP26 融合表达如何影响小鼠胃类器官中的 RHOA 信号传导。 我们首先评估了 RHOA 与 RHOA 效应子 Rhotekin （Rhotekin-RBD） 的分离 RHOA-GTP 结合域 （RBD） 的相互作用，以监测活性 RHOA-GTP 的形成。尽管ARHGAP26作为促进RHOA-GDP形成的GAP作用，但我们矛盾地发现CLDN18-ARHGAP26增强而不是抑制RHOA-GTP的水平（图2A）。由于活性 RHOA 会增强下游效应通路的活性，我们通过免疫印迹分析证实了 ROCK 效应子的激活，并发现与 Mist1Cre 类器官相比，CLDN18-ARHGAP26 类器官中 Cofilin （pCofilin） 的磷酸化增强（图 2B）。免疫荧光显微镜研究显示，与 Mist1Cre 类器官相比，CLDN18-ARHGAP26类器官中的 F-肌动蛋白水平升高（图 2C）。这些结果在化合物 CLDN18-ARHGAP26 和 Trp53 模型的平行研究中得到了证实，在 RHOA 通路激活方面具有相似的结果。 为了进一步证实我们的结果，我们从p53敲低小鼠的胃上皮细胞中建立了一个同基因类器官模型，然后引入了异位CLDN18-ARHGAP26。我们发现CLDN18-ARHGAP26的这种异位诱导也诱导了显著的Rhotekin-RHOA结合和p-cofilin激活（图2D和E）。我们发现融合基因的表达（也在 p53 缺失的背景下）增强了细胞中的活性 RHOA-GTP 水平，如在效应子 Rhotekin 下拉中测量的那样，并诱导了 RHOA 信号传导，这是通过增强的 F-肌动蛋白细胞骨架和增加的 p-丝切蛋白水平确定的（图 2F 和 G）。此外，为了解决 CLDN18-ARHGAP26 的功能是否需要 ARHGAP26 的催化结构域，我们生成了融合载体的新版本，其中我们引入了一个错义突变 R293A，对应于 ARHGAP26 的 R412A，这使得融合蛋白的 Rho GAP 催化失活。我们将这个版本的融合引入到我们的类器官中，并查询了活性RhoA（Rhotekin）和下游的p-Coffilin。我们发现R293A对融合的活性-RHOA和下游p-Coffilin的升高影响不大。这些数据表明GAP功能是可有可无的，并表明融合可能已经失去了ARHGAP26的催化功能，可能损害了对RHOA抑制的抑制活性。这些数据支持融合基因可能失去 RHO GTP 酶功能，并且是 ARHGAP26 的功能丧失，导致 RHOA 信号传导的激活。总体而言， 我们的研究表明，CLDN18-ARHGAP26 引起具有 RHOA 激活和 RHOA 下游通路诱导的功能获得表型。 研究结果 03 本研究，我们证明，胃类器官中 CLDN18-ARHGAP26 表达的诱导诱导印戒细胞的形成，这是 DGC 的特征，并且当与肿瘤抑制基因 Trp53 的缺失结合时，能够协同转化胃细胞。CLDN18-ARHGAP26 促进 RHOA 和下游效应信号传导的激活。在分子上，融合促进黏着斑激酶 （FAK） 的激活和 YAP 通路的诱导。FAK和YAP/TEAD抑制的组合可以显著阻止肿瘤生长。 总之，DGC 是一种高度致死的 GC 变体，容易发生早期侵袭、快速转移、生存率低且对当前治疗相对不敏感。确定这种疾病的基本机制和新的有效疗法显然具有紧迫性。 这项研究揭示了DGC的基本疾病机制，并将它们与可以优先用于临床试验的新候选疗法联系起来。 参考资料： https://gut-bmj-com.libproxy1.nus.edu.sg/content/early/2024/04/14/gutjnl-2023-329686 注：本文旨在介绍医学研究进展，不能作为治疗方案参考。如需获得健康指导，请至正规医院就诊。 热门·直播/活动 🕓 上海｜06月14日-16日 ▶ 第六届上海国际癌症大会将于6月14-16日在上海举办，学科交叉，共同推进肿瘤研究与诊治多模态！ 🕓 北京｜09月20日-21日 ▶ 第五届单细胞技术应用研讨会暨空间组学前沿研讨会欢迎您的参与！ 点击对应文字 查看详情

引言YAP从细胞质向细胞核的转位对其激活至关重要，并在肿瘤进展中发挥着关键作用。然而，调控YAP核入的精确分子机制尚不完全清楚。2024年4月24日，海军军医大学谢渭芬，张新及中国科学院上海药物研究所罗成共同通讯在Signal Transduction and Targeted Therapy（IF 39）在线发表题为”SRY-Box transcription factor 9 triggers YAP nuclear entry via direct interaction in tumors“的研究论文，该研究揭示了SOX9在激活YAP中的关键作用。SOX9通过直接相互作用促进了YAP的核转位。重要的是，该研究发现SOX9的Asp-125与YAP的Arg-124之间的结合对于SOX9-YAP相互作用及随后的YAP核入至关重要。此外，该研究发现PRMT1催化的YAP在Arg-124上的新型不对称二甲基化（YAP-R124me2a）。YAP-R124me2a增强了YAP与SOX9的相互作用，并与多种癌症的不良预后相关。该研究使用竞争性肽S-A1破坏了SOX9与YAP之间的相互作用，该肽模拟了含有Asp-125的SOX9的α-螺旋结构。S-A1显著抑制了YAP的核转位并有效地抑制了肿瘤生长。这项研究首次提供了SOX9作为驱动YAP核转位的关键调节因子的证据，并提出了通过靶向SOX9-YAP相互作用治疗YAP驱动的人类癌症的潜在治疗策略。Yes-associated protein（YAP）从细胞质向细胞核的转位是促进异常细胞生长和肿瘤发生的中心细胞事件。已经进行了大量研究以阐明调控YAP在细胞质中的封存和在细胞核中的保留的机制。在细胞质中，YAP与一组蛋白相互作用，包括14-3-3、AMOT、PTPN14和α-连环蛋白，它们负责将其封存在细胞质中。与之相反，YAP与其在细胞核中的伴侣直接结合，包括TEADs和MAML1/2，促进了YAP的细胞核保留，从而刺激了细胞增殖、存活和迁移，并推动了药物抵抗。维持细胞质封存和细胞核保留之间的微妙平衡对于YAP的功能至关重要。此外，YAP含有一个常规的核出口信号，有助于其核出口。然而，与其果蝇同源基因Yorkie不同，尚未在哺乳动物YAP蛋白中鉴定出经典的核定位信号（NLS）。缺乏经典的NLS对于在哺乳动物细胞中调节YAP的核入的机制提出了一个有趣的问题。尽管施加到细胞核的力会通过减少核孔的机械限制而增加YAP的核入，但仍需要进一步的分子研究来解开YAP核入的机制及其在疾病发病机制中的潜在意义。SRY相关高迁移率基因箱9（SOX9）作为转录因子，在各种生物学过程中发挥着关键作用，包括干细胞性、性别决定和祖细胞发育。SOX9已被广泛地表征为候选癌症干细胞标记物。SOX9在癌症发生、化疗抵抗和干细胞维持中的参与突显了其在肿瘤生物学中的关键调控功能。YAP和SOX9在许多肿瘤中被异常上调，它们作为驱动肿瘤进展的关键调节因子。YAP在几种肿瘤的发育过程中通过转录促进SOX9的表达，而SOX9在调节YAP活性方面的作用和机制尚存在争议。已经证明，SOX9通过增加食管鳞状细胞癌中YAP靶向microRNA的水平来抑制YAP的表达。最近的研究表明，SOX9可能会破坏肝细胞中YAP/TEAD之间的协同相互作用，并改变YAP靶向基因的响应元件。相反，已经发现SOX9增加了YAP的活性，并在胃癌中促进了上皮间质转化（EMT）。这一发现表明，SOX9可能会作为YAP活性的正调节因子，这取决于细胞微环境和肿瘤的异质性。此外，虽然YAP的动态活性取决于其相对水平的核入，但SOX9是否影响YAP的核转位尚未得到探讨。后转录修饰（PTM）是参与YAP核浆分布的重要调节机制。丝氨酸-127的磷酸化是通过Hippo途径介导的，这是决定YAP亚细胞定位的关键因素。这个过程作为14-3-3蛋白的结合位点，导致YAP在细胞质中的封存和抑制其靶基因的活性。影响YAP亚细胞定位的另一种PTM是由SET1A介导的赖氨酸342（K342）的单甲基化。YAP的这种修饰阻碍了CRMX1介导的YAP的核出口，导致其在多种肿瘤细胞的细胞核中的积累。PRMT1是I型蛋白精氨酸甲基转移酶（PRMTs）家族的主要成员。PRMT1选择性地催化底物蛋白的精氨酸残基上的不对称二甲基化（Rme2a，也称为ADMA）修饰。先前的研究已经揭示，PRMT1在肿瘤细胞中表达异常，并且甲基化多种涉及癌症侵袭性、药物敏感性和预后判断的底物蛋白。最近，已经验证了PRMT1通过精氨酸甲基化影响p14（ARF）的亚细胞定位和周转。值得注意的是，已经报道在软骨肉瘤标本中PRMT1水平升高与YAP的核积累呈正相关。然而，特定的YAP精氨酸甲基化是否负责其亚细胞定位尚未报道。模式图（Credit: Signal Transduction and Targeted Therapy）在本研究中，作者观察到当SOX9被敲除或沉默时，癌细胞中YAP的转录活性和核分数显著降低。作者确认了SOX9与YAP之间的直接相互作用，这一结果在体外和体内均有证实。此外，研究阐明了外源SOX9如何通过其在SOX9的Asp-125和YAP的Arg-124之间的特定相互作用促进YAP从细胞质进入细胞核的机制。作者还发现，PRMT1介导的YAP在R124处的不对称二甲基化增强了YAP与SOX9的结合，导致YAP在细胞核中的积累。高水平的YAP-R124me2a，而不是单独的YAP，预示着多种癌症的不良预后。基于这些发现，作者开发了一种选择性肽，模拟了含有D125（111-126a.a.）的SOX9片段，破坏了YAP与SOX9之间的相互作用，特异性地抑制了YAP驱动的HCC生长。研究揭示了SOX9在YAP进入细胞核中的作用，并深入探讨了其潜在机制。原文链接https://doi-org.libproxy1.nus.edu.sg/10.1038/s41392-024-01805-4责编|探索君排版|探索君文章来源|“iNature”End往期精选围观一文读透细胞死亡(Cell Death) | 24年Cell重磅综述（长文收藏版）热文Nature | 破除传统：为何我们需要重新思考肿瘤的命名方式热文Nature | 2024年值得关注的七项技术热文Nature | 自身免疫性疾病能被治愈吗？科学家们终于看到了希望热文CRISPR技术进化史 | 24年Cell综述