RNASE3

必须对生物制品进行严格的物理化学和生物方法分析，以确保它们含有最低水平的宿主细胞蛋白 (HCP) 和其它与工艺相关的杂质。在此前的文章中，我们调查了有关 HCP 的相关文献、其免疫原性背后的机制，以及它们对患者安全的最终影响。这里，我们将重点介绍已发表的案例研究，以探讨检测、识别和量化此类杂质的挑战。这些例子表明，关于 HCP 如何与免疫反应相关以及如何预测免疫原性潜力，还有很多方面有待了解。体外试验的新信息和改进可以加强对现在无法检测到的安全问题的预防。治疗性蛋白质和 HCP 的首次关联HCP 仍然是生物制品开发中的一个重要问题。尽管商业可用性已近 40 年，但生物制品仍然缺乏 HCP 限制的官方范围。仔细研究有助于理解此类担忧的根源。图 1：重组人生长激素 (rhGH) 产品中大肠杆菌多肽 (ECP) 的存在与治疗患者体内抗 rhGH 抗体的诱导相关，并有佐剂作用的证据。上图绘制了用 somatren 和 ECP（S1、S2 和 Somatonorm）制剂治疗的患者的抗 ECP 抗体数量，以 Z 分数表示。每个 Z 分数是治疗患者中抗 ECP 抗体除以标准血清中抗 ECP 抗体的商。下图显示了每种制剂的最后有效血清稀释度的 log10 值。Bierich 的团队于 1986 年对重组蛋白药物产品中的 HCP 进行了初步分析。他们研究了三种用于垂体低下儿童的重组人生长激素 (rhGH) 制剂。样品含有不同量的称为大肠杆菌多肽 (ECP) 的 HCP：190–1400 ng ECP/小瓶 (S1)、30–170 ng/小瓶 (S2) 和 2–10 ng/小瓶 Somatonorm（somatren、Kabi Vitrum）（S3）。研究小组确定抗 ECP 抗体主要在接受 S1 和 S2 制剂的儿童中产生。在给药后六个月，S1 的抗 ECP 抗体数量最多，Z 分数 > 0.7。因此，结果表明 ECP 浓度与抗 ECP 和抗 rhGH 抗体的产生相关（图 1）。含有最高 ECP 浓度并在给药后产生最大数量抗 rhGH 抗体的制剂 S1 在接受治疗的儿童中诱导了最高的生长率。它还记录了比 S2 略低的标准偏差 (SD)（但仍显示出比 somatrem 产品更高的 SD）。正如该团队在研究中报告的那样，“制剂 S1 显示了最好的结果。”然而，在短期 1 期临床试验期间，科学家注意到在接受 S1 治疗的 28 名患者中，有两名患者在注射部位（肌肉注射）出现严重的过敏性皮肤反应。在 S2 或 S3 的实验期间没有报告过敏反应。已知细菌蛋白，如肽聚糖、鞭毛蛋白、菌毛和菌毛蛋白，在与 toll 样受体 (TLR) 结合时会诱导强烈的免疫原性反应。Palm 和 Medzhitov 研究表明，与脂多糖 (LPS) 混合的非免疫原性蛋白质人血清白蛋白 (HSA) 可以通过 TLR4 信号转导诱导免疫原性抗体反应。值得注意的是，半抗原化蛋白可以诱导独立的 T 细胞反应。在同一组实验中，Palm 和 Medzhitov 证明半抗原化 HSA 可以诱导对二硝基苯化 HSA (DNP-HSA) 而非标准 HSA 的强烈 CD4+ T 细胞和抗体 IgG1 和 IgG2c 反应。关于 Bierich，目前尚不清楚抗 rhGH 抗体是否是由蛋白质聚集体、N-末端甲硫氨酸或 ECP 通过 TLR 诱导的。此外，这些实验不包括相同数量的患者：12 名儿童（而不是 28 名）接受了制剂 S2，9 名儿童接受了 S3。无法消除招募患者中过敏诱导的偏倚，因为预计此类反应会在大量人群样本中发生。当代关于蛋白质免疫原性的研究指出，聚集是引发针对 rhGH 和其它生物治疗药物的免疫反应和抗药抗体 (ADA) 的主要因素。该声明的实验基础在于 Mitchinson 的观察，其将牛血清白蛋白 (BSA) 溶液高速离心过夜，次日取上清液给家兔静脉注射，结果免疫耐受。随后，将沉淀重新悬浮并注射到兔子体内，诱导强烈的抗 BSA 反应。无法验证 Bierich 研究中的样品是否纯化了 HCP 和/或聚体。然而，值得注意的是，那些大肠杆菌衍生的 rhGH 制剂是 N-末端甲酰甲硫氨酸-GH 分子。已知此类蛋白质具有免疫原性，并对蛋白质稳定性构成威胁。因此，在使用各种蛋氨酸肽酶、氨肽酶或亮氨酸氨肽酶的制造过程中，N 末端氨基酸通常会从治疗性蛋白质上剪下。Bierich 研究的另一个有趣考虑是 somatrem 产品 (S3) 不会诱导中和 ADA。研究作者认为，ECP 可能通过类似于活疫苗的佐剂活性诱导免疫原性反应。实际上，弗氏佐剂（冻干结核分枝杆菌的乳剂）、单磷酰脂 A (MPL-A)、LPS、解毒 LPS 和脂肽都可以诱导与非免疫原性蛋白质的强烈免疫原性交叉反应。那么，也许我们有一个新的免疫原性诱导模型。此外，HSA 和 LPS 被不完全弗氏佐剂（缺乏结核分枝杆菌）乳化，这有助于辅助反应。其它疫苗研究指出，要有效诱导与免疫原性蛋白的交叉反应，需要该蛋白存在于与聚（乳酸-乙醇酸共聚物）(PLGA) 混合的纳米颗粒中，有或没有 MPL-A （TLR4 的诱导剂），以及可以激活多个 TLR 的整个抗原（例如，TLR4 和 TLR7）。否则，抗体滴度不显著。Huang等描述了一种生物分析方法，其中人类胚胎肾 (HEK) 细胞（具有活性 TLR）被未说明的样本激活，诱导白细胞介素 (IL)-8 和 IL-6 的表达水平与加入鞭毛蛋白的样本相似。该结果表明 TLR 可以被 HCP 激活。这只是一种推测，但在 Bierich 的研究中，折叠/展开/聚集的 rhGH 与 ECP 的相互作用可能会形成复合物，进而刺激结合抗体的产生。事实上，错误折叠的蛋白质和聚体总是会诱发免疫原性反应。尽管该途径还不是很清楚，但边缘区 B (MZB) 细胞与这种 T 细胞非依赖性反应有关。最终，ECP 的性质对于诱导抗 rhGH 抗体至关重要。对 ECP 身份、中和抗体 (NAb) 和 rhGH 复合物和/或聚体的进一步研究将有助于阐明 HCP 与免疫反应的关系。Somatrem 产品在很大程度上已被与天然激素几乎相同的 rhGH 所取代。根据此处提供的证据，HCP 的免疫原性似乎在 Bierich 案例中发挥了关键作用。但除了特应性过敏反应外，患者没有报告对各自治疗的其它不良反应。非格司亭产品中的 HCPWadhwa 和合作者研究了两种非格司亭（filgrastim）产品的成分。粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 (GM-CSF) 的重组版本，非格司亭用于增强造血祖细胞的增殖和分化，并调节单核细胞、中性粒细胞和单核细胞的效应功能。该蛋白质在大肠杆菌细胞中过表达。Wadhwa 的团队确定，一种产品诱导了约 95% 的 NAb，而另一种则诱导了约 74%。用来自接受过治疗的患者的抗血清对第二种 GM-CSF 产品进行体外预处理，产生了针对与 GM-CSF无关的蛋白质的抗体。因此，在这种情况下，NAb 似乎与 HCP 相关。杂质经测定具有约 20 kDa 和 30 kDa 的分子量。研究人员还发现，这两种大肠杆菌衍生蛋白对 GM-CSF 性能没有影响；相反，只有中和 GM-CSF 的抗体才会影响产品的临床反应。尽管研究中未提及，但产品可能含有 N 末端甲硫氨酸，这可能是诱导 NAb 的主要原因。此外，由于缺乏糖基化，在大肠杆菌中表达的蛋白质可能不溶或无活性。这些因素会导致 GM-CSF（一种不稳定的蛋白质）聚集。Wadhwa 等人未观察到过敏样不良反应。那篇文章经常在文献中被引用，它与 HCP 免疫原性的佐剂理论相矛盾。然而，HCP 在诱导 ADA 的辅助作用中的作用可能是一个有趣的研究领域。生物仿制药中的 HCP在开发 Sandoz 的 Omnitrope 产品（一种rhGH生物仿制药）的早期，临床数据显示接受该产品的患者中有 57% 产生了非中和抗体，并且所有患者都产生了抗 HCP 抗体。随后为降低 HCP 水平所做的努力被证明成功地将 ADA 降低至 2%，这一水平与创新产品辉瑞的 Genotropin（somatropin）相当。佐剂效应归因于通过液相色谱串联质谱法 (LC-MS/MS) 鉴定的核糖磷酸异构酶的存在，估计水平为 1,400 ng/mg 蛋白质。免疫印迹仅显示一条带，暗示存在单一杂质。然而，当时无法遵循官方参考，也没有官方指南来了解如何执行分析和免疫学方法。同样，HCP 对 N-末端甲硫氨酰-rhGH 的辅助作用尚不清楚。扩展纯化方案可以消除 rhGH 聚体；氧化、环化或消除反应以及rhGH 片段的展开结构 - 它可以像 HCP-rhGH 复合物/聚体一样诱导 ADA，尽管这在研究中没有得到证实。（LPS 和 CpG DNA 也是如此，它们不是蛋白质）。Omnitrope 研究的作者提到执行了完整的表征，他们得出结论，免疫原性和优化（非免疫原性）制剂之间的关键区别在于 HCP 的存在量。但是，无法验证该信息或重现这些实验。事实上，没有发现 HCP 和治疗性蛋白质之间的 NAb 交叉反应的其它例子。在这里，值得一提的是 Jones 等人的研究结果。在研究 N 末端甲硫氨酸 hGH 时，他们发现在产品制造过程中引入额外的纯化步骤后，患者的免疫原性反应减弱，没有与抗体形成相关的安全后果。该研究支持“免疫原性不是由于 N 末端甲硫氨酸或大肠杆菌蛋白质杂质，而是少量具有细微结构改变的 rhGH”。该结论表明治疗性蛋白质聚体与免疫原性问题相关。治疗性蛋白质的聚体可以诱导独立的 T 细胞反应。正如 Palm 和 Medzhitov 所表明的那样，宿主细胞和治疗性蛋白质的聚集复合物可能具有高度免疫原性。但据我们所知，还没有进行任何调查来直接证明辅助 HCP 假说。然而，前面引用的文章有一些共同的关键信息。有关源自大肠杆菌表达系统的 rhGH 的报告表明，HCP 会产生 ADA，而对在中国仓鼠卵巢 (CHO) 细胞中表达的产物的研究显示免疫原性诱导较低，但具有生物活性。这些观察结果表明，大肠杆菌 HCP 比真核宿主更“容易”诱导免疫反应。T 细胞增殖研究有关宿主细胞和治疗性蛋白质之间相互作用的潜在辅助作用的信息仍然是推测性和难以捉摸的。因此，安进的一组科学家设计并执行了专注于 HCP 和治疗性蛋白质相互关系的实验。抗原 (Ag) 在称为克隆扩增的过程中通过自分泌和旁分泌信号诱导 T 细胞增殖。T 细胞增殖与适应性细胞反应和炎症过程直接相关。Jawa等人使用体外比较免疫原性评估 (IVCIA) 测定法诱导 T 细胞增殖，使用三种不同的 MAb 混合不同的 HCP，数量范围从 4,258 ppm 到 396 ppm。这些杂质代表了来自 CHO 细胞的 139 种蛋白质。使用疏水相互作用层析纯化 MAb，HCP 水平降至 44 ppm 至检测不到的水平。IVCIA 测试表明，具有高和低 HCP 浓度的 MAb 样品之间没有差异的 T 细胞增殖（图 2）。即使是 ~4,300 ng HCPs/mg MAb 的水平也没有比治疗性蛋白质本身观察到的更明显的免疫反应。图 2：在用不同单克隆抗体 (MAb) 治疗 5 至 8 天后，健康人的体外比较免疫原性评估 (IVCIA)；下面的曲线表示在与混合了不同水平宿主细胞蛋白 (HCP) 的“MAb 2”样本孵育后，T 细胞捕获的氚化胸苷信号。该实验堪称典范；然而，它并没有对特定的 HCP 进行鉴定 - 而且，正如我们所知，特定杂质的存在对于诱导免疫原性反应至关重要。此外，由于人类受试者在典型条件下不会暴露于 CHO 细胞，并且因为 CHO 细胞不是表面存在病原体相关分子模式分子 (PAMP) 的感染性生物体。安全 HCP 的示例人们普遍认为，原料药中的 HCP 水平必须降至 1–100 ppm。然而，例外情况是可能的。Epoetin Hospira 是 Epogen 产品（一种重组人促红细胞生成素 (rhEPO)）的生物仿制药。美国食品和药物管理局 (FDA) 于 2018 年 5 月批准了该生物仿制药的商业化。HCP 含量占药品的 0.2–0.3%，反相高效液相色谱 (RP-HPLC)报告为约 2,000–3,000 ppm（ng HCPs/mg rhEPO）。FDA 要求 Hospira 提供有关药品中 HCP 的身份以及分析方法准确性和再现性验证的信息。制造商使用 RP-HPLC-MS 和基于胰蛋白酶消化的肽图分析将一种杂质鉴定为“嗅觉受体蛋白”。该机构要求在 Epoetin 产品标签上应用适当的警告，包括关于“严重过敏反应”和“严重皮肤反应”可能性的注释。FDA 还要求制定关于药品引起的不良事件的后续记录（药物警戒）。然而，从那以后，没有关于 Retacrit 类过敏反应的报告被提交，这表明 HCP 可能不会对患者造成危险。磷脂酶 B 样蛋白 2 (PLBL2)已知该蛋白质可与几种人源化抗体结合并共纯化。撰写了 lebrikizumab 产品中 HCP 问题 的基因泰克（现为罗氏子公司）科学家提到，尽管在早期临床测试期间使用该产品会产生针对 CHO 蛋白 PLBL2 的抗体反应，但未在患者中引起有害的免疫相关类过敏反应或过敏反应。尽管如此，在临床 2 期之后，基因泰克改进了产品的纯化工艺，以进一步降低 PLBL2 水平。在 2b 期研究期间，试验参与者暴露于约 9.1–82 µg/剂量（37.5–250 mg lebrikizumab/月）。这样的水平显示对 lebrikizumab 免疫原性没有影响，并且没有来自已鉴定的抗 PLBL2 抗体的后续影响。根据作者的说法，这里特别有趣的是，PLBL2 杂质无法通过酶联免疫吸附测定 (ELISA) 检测到。原文: V.P.M.Martínez, C.E.E.Garza, N.O.Pérez, Opportunities in the Field of Host Cell Proteins Part 3: Case Studies in Impurity Detection and Identification, Bioprocess International, 2022.在抗体圈微信公众号回复“JPM23”可下载60 家药企PPT合集。识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。