ELAC1

感谢关注转发，欢迎学术交流回复药渡Cyber，领取文献原文请点击此处链接观看CyberSAR系统详细使用教程Sigma 2受体（σ2R）在特定癌症中过度表达，视为肿瘤增殖的生物标志物。σ2R配体正在成为癌症和神经退行性疾病有前景的治疗诊断剂。密歇根大学设计和合成一系列新型喹啉基吡嗪酰胺类化合物作为高选择且有效的σ2R配体，在胰腺癌细胞系中显示出微摩尔效力。化合物14（JR1-157）和17（JR2-298）与σ2R结合亲和力Ki分别为47nM和10nM。化合物14的口服生物利用度为60%，在非同基因胰腺癌模型中具有显著的体内疗效，且没有明显的毒性。喹啉基吡嗪酰胺的细胞毒性在铜的存在下显著增强，而在铜螯合剂四硫代钼酸铜的存在下显著减弱。化合物14具有水溶性、代谢稳定的、可以口服并且增加自噬标记物LC3B的表达，值得进一步开发用于治疗胰腺癌。图1.化合物14和17发现和分子优化过程胰腺癌是一种侵袭性疾病，占美国第三大死亡原因，约占癌症的3%和死亡原因的7%。到2022年，大约62,210患者被诊断患有胰腺癌，约有49,830患者死于该疾病。由于胰腺癌早期发现困难、预后差、有效治疗方案有限、化疗耐药等，迫切需要开发有效治疗方式。近年来，σ受体（σR）已经成为治疗胰腺癌的潜在靶点。σ受体最初分为阿片受体（μ、κ和σ）的亚型，是定位于血浆中G蛋白偶联受体相关受体膜、内质网、细胞核、溶酶体和线粒体。σR分为两种亚型，σ1和σ2受体作为伴侣蛋白，干扰离子通道和GPCR受体活性，通过内质网应激和控制细胞内Ca2+稳态调节多种生理途径。σR与各种CNS疾病、神经涂星星疾病、创伤性脑损伤、药物滥用和癌症相关。σ1受体（σ1R）和σ2受体（σ2R）已被确定为严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）的潜在治疗方式。SIGMAR1基因编码σ1R，在中枢神经系统内外的多种组织中表达，其表达的蛋白除与酵母C8-C7甾醇异构酶有66.4%同源性外，与任何已知的蛋白序列均无相似性。已经有σ1R与选择性拮抗剂PD144418和选择性激动剂4-IBP共晶结构如Fig1所示。另一方面，σ2R分子结构长期以来一直不清楚。2017年，跨膜蛋白97（TMEM97）被鉴定为编码多功能四次跨膜σ2R的基因，也称为脑膜瘤相关蛋白（MAC30）。TMEM97与激素、钙和神经元信号传导相关，通过调节胆固醇的运输，在胆固醇稳态中发挥重要作用。调节胆固醇转运蛋白Niemann-Pick C1型（NPC1）。值得注意的是，σ2R可以作为黄体酮受体膜成分1（PGRMC1）与低密度脂蛋白受体（LDLR）三元复合物的结合位点。首批高分辨率晶体结构牛σ2R复合物如σ2R和5-HT2A拮抗剂roluperidone（PDB：7M94）和σ2R激动剂PB28（PDB：7M93）被解析出来（Fig1）。多种的化学结构具有碱性氨基和疏水片段以不同的亲和力与σR结合以及选择性公开报道出来。Siramesine是一种有效且具有选择性的σ2R激动剂。SW43在胰腺癌小鼠模型中表现出活性，PB221（PB28的阿哌嗪同系物）对脑肿瘤细胞具有抗增殖活性，在小鼠模型中显示出体内活性。直到现在，只有少数的σR配体能够进入临床阶段，包括神经退行性疾病、精神障碍、疼痛或诊断试剂。然而，目前尚没有治疗癌症临床试验的σR配体，这可能是由于对σR信号通路了解不足，以及关于σRs配体在临床前癌症模型中的活性的数据不一致。然而，越来越多的证据支持σR小分子配体作为药物治疗癌症的潜在用途。SIGMAR1转录物，σ1R蛋白水平的提升和特定的σ1R拮抗剂死亡诱导作用表明功能性σ1R是肿瘤发生和发展所必需的。另一方面，TMEM97似乎在肿瘤进展中发挥作用，并且σ2R在包括乳腺癌和胰腺癌在内的多种癌细胞系中过度表达。此外，σ2R已被用作增殖的生物标志物，并且σ2R放射性配体已用于肿瘤成像。几种σ2R配体在胰腺癌小鼠异种移植模型中显示出体内活性。虽然σ1R通过增强各种离子通道功能来控制癌细胞的电可塑性，但σ2R配体的细胞毒性可归因于ROS在内的多种致癌途径、p53和半胱天冬酶单独/依赖性细胞凋亡途径。因此，σR配体在癌症中的确切作用机制仍然不清楚。此前，已有研究发现氯喹与σ1R结合，Ki=109nM，但没有发现与σ2R结合的报道。密歇根大学假设氯喹中的5-(5-(二乙氨基)戊-2基)胺片段与σ1R结合。最近，鉴定出喹啉基吡嗪酰胺衍生物QN523作为有前途的先导化合物，在胰腺癌细胞中表现出显著的活性。因此，考虑将氯喹的片段结合到QN523上，以探索该分子结构1与σR亲和力。嫁接氯喹尾部部分可以形成盐，并可能提高整个分子的溶解度。密歇根大学提供了一类新的σ2R配体，其与σ1R相比具有纳摩尔效力和选择性，在胰腺癌异种移植模型中表现出显著的抗肿瘤活性。 确认杂交分子1与σR结合亲和力首先，将杂交分子1和氯喹对接到人σ1R与PD144418（PDB：5HK1）复合物的晶体结构中。σ1R晶体结构显示了每个聚合物中具有单个跨膜结构域的三聚体结构，其中羧基末端结构域显示出广泛的平坦、疏水性膜近端表面与内质网膜的胞质表面密切相关，在其中心有一个大的疏水性配体结合腔，使得配体具有较强的可塑性。这种结构使σ1R能够与多种蛋白相互作用，最广为人知的是其伴侣功能和与多种化学结构类型配体相结合，产生不同的σ1R配体结合模式。因此，σ1R配体的碱性氮原子与σ1R中的E172之间除了与形成结合口袋内部边缘的疏水残基形成多个疏水作用外，还会形成强的离子相互作用。密歇根大学的模型表明，与氯喹分子对接打分相比，分子1与σ1R的结合亲和力更高（化合物1为-10.69kcal/mol，氯喹为-8.74kcal/mol）（Fig3）。分子1和氯喹中带正电的碱性尾部均参与σ1R中的E172的阴离子相互作用，并且两个配体的喹啉环与L95和L182存在相互作用。分子1有较高的对接分数可能是由于与σ1R形成更多的疏水作用，尤其是与V84和F107有疏水作用。为了验证假设，合成了分子1并测试了其σR结合亲和力。与建模结果一致，与氯喹（Ki=741nM）相比，分子1对σ1R显示出更高的结合亲和力（Ki=196nM）。令人惊讶的是，分子1对σ2R表现出结合亲和力，Ki=22nM，而氯喹为5719nM。由于分子1对σ2R的高亲和力，接下来探索1的构效关系，旨在发现一类具有理想理化性质的新型选择性σ2R配体。 人类σ2R的同源模建和杂化结构1的分子对接首先用最近发布的牛σ2R与PB28（PDB：7M93）复合物的晶体结构作为模板，同源模建人σ2R模型。σ2R牛晶体结构揭示了深深嵌入膜中的配体结合位点，其中配体结合腔被溶剂阻挡。口袋横向开口进入脂质双分子层，而不是开口到内质网内腔。结合口袋的开口与疏水性和芳香族残基对齐。配体以中性、去质子化形式通过此开口进入腔穴，然后在结合位点质子化，从而与保守的D29形成盐桥。另一个保守的酸性氨基酸残基E73距D29约3Å，表明这些残基彼此通过氢键结合，E73可能被质子化。此外，位于细胞外loop环的D56参与氢键网络，该网络可能对受体的正确折叠很重要，但并不直接参与配体识别。人σ2R同源模型的结合位点与已发表的牛σ2R晶体结构几乎相同（对于22个口袋残基的主链α碳，RMSD=0.077）（Fig4）。与报道的晶体结构类似，该模型在与入口相对的结合腔内侧的一个结合子位点中包含有序分子。这种有序水分子是结合口袋的组成部分，与H21、Q77和Y103形成氢键桥接相互作用，并被认为参与了部分σ2R配体的高亲和力结合。与PB28相比，分子1对σ2R采用了不同的结合模式（Fig4）。分子1的喹啉环位置靠近由F66、L70、E73、T107、L111、I114和Y150包围的有序水分子（Fig4A）。分子1的吡嗪环面向结合腔中心的保守D29。带正电荷的末端N和分子1的吡嗪氮之间的分子内氢键正在形成假环，占据I24、M28、Y50、F54、L59、V146和Y147残基相互作用的结合腔的入口（结合模式A，Fig 4A）。因此，喹啉环取代可能会通过与σ2R残基相互作用而在很大程度上影响σ2R结合。或者，分子1以替代结合姿势翻转，其中喹啉环占据σ2R结合位点的入口。附加尾部中的NH基团与D29形成氢键，而带正电荷的末端氮参与E73的阴离子相互作用（结合模式B，Fig4B）。根据这种结合模式，喹啉环上的取代可能通过与σ2R嵌入的膜成分相互作用而影响观察到的与σ2R的结合亲和力，但不与σ2R本身的残基相互作用。使用以PB28（PDB：7M93）作为模板的牛晶体结构的人σ2R同源模型的结合位点上σ2R上的分子1与PB28的对接模式比较。（A）分子1的喹啉环（橙色）靠近由F66、L70、E73、T107、T110、L111、I114和Y147相互作用的结合腔穴的入口。（B）分子1的替代对接模式，其中喹啉环占据σ2R结合位点的入口（结合模式B）。附件尾部中的NH基团与D29形成氢键，而带正电的末端氮参与E73的离子相互作用。（C）质子化哌嗪PB28（绿色）通过多个离子和氢键与D29相互作用，而甲氧基取代的芳香环与M28相互作用。与对接模式A中类似，在分子动力学（MD）模拟中主要的相互作用如下：与D29形成水桥氢键作用，与E73形成疏水作用，与Y147和Y150形成多种相互作用。对接模式B，MD模拟结果如下：D29参与多种相互作用，Y50、Y147和Y150主要为疏水作用，而E73参与相互作用，但非常弱。通过MD模拟检测到两种对接模式但针对不同氨基酸的离子相互作用，即D56用于模式A，D29用于模式B。有趣的是，D29和D56都与PB28相互作用。在没有获得σ2R与喹啉基吡嗪酰胺1的晶体结构情况下，MD模拟的结果模拟了两个对接模式看起来较为合理。因此，分子的两端都可能影响其σ2R的结合亲和力。密歇根大学准备探索取代基对喹啉吡嗪酰胺骨架的影响以及附加的氯喹尾部的性质。测试了所有合成的化合物对σR的结合亲和力，并在MIA PaCa-2胰腺癌细胞中测定其细胞毒性。 除喹啉基吡嗪酰胺的C7位外，环取代耐受性良好通过在喹啉环的不同位置引入甲基、甲氧基或卤素基团来选择喹啉环中最合适的取代位置。喹啉环2-5中带有甲基的化合物与σ2R具有显著的结合亲和力，Ki为16nM至85nM。但化合物6除外（Ki=2664nM），7-Me取代对结合亲和力不利。与σ1R相比，甲氧基类似物7-9对σ2R表现出良好的结合亲和力，Ki为13至40nM，而7-甲氧基衍生物10对σ1R表现出较差的结合亲和力（Ki=1626nM）。化合物11-15中具有吸电子氯取代的衍生物表现出显著的结合亲和力，σ2R结合亲和力（Ki为12nM-51nM）。然而，对σ2R的结合选择性较低。5-氟衍生物16和6-氟衍生物17保留了对σ2R的高结合亲和力，并且化合物17最有效（Ki=10nM）和选择性（σ1/σ2=16.5）。另一方面，大体积的6-溴衍生物18分别对σ1R和σ2R表现出中等的结合亲和力，Ki分别为46nM和27nM，在这组衍生物中表现出最低的选择性。LLE对应于pIC50（pKi）和由clogP表达的亲脂性之间的差异，多数配体与靶蛋白结合具有合理的LLE≥3，这意味着良好的药物特性。密歇根大学认为空间位阻可能是σR亲和力丧失的主要原因，如C7取代的衍生物观察到的实验结果。化合物2-6的构象分析结果表明，除了7-甲基取代的化合物6外，喹啉基吡嗪酰胺骨架需要保留平面性。化合物6的吡嗪酰胺核心骨架不是平面性，可能是由于7-甲基和C8上的羰基之间的形成冲突，导致构象变化（Fig5）。这也合理解释与7-甲氧基衍生物10一样，可以扩展到C7位的任何取代基。然而，不能排除与两个σR的空间位阻。经SAR分析C6是最适合替换的位点。因此，进一步合成了化合物19-22（表2）。与化合物6相比，化合物19-21中的这些取代对两种受体亚型的效力均较弱。而环丙基衍生物22表现出显著的结合亲和力（Ki=27nM），但其选择性较低（σ1/σ2=2.6）。在探索单取代的喹啉衍生物之后，密歇根大学开始研究双取代类似物23-26，结合单取代化合物中最好的取代基，23-26的Ki值分别为36nM、70nM、79nM和28nM。然而，对σ2R的选择性较差。通过以上的结构修饰认为，除了C7位置的分子平面性破坏造成结合活性丧失外，喹啉环中的取代都具有良好的耐受性。 碱性尾部部分对于σ2R结合至关重要接下来进一步调节尾部的链长和碱性对σ2R结合亲和力的影响。选择6-甲基和6-F取代的喹啉作为尾部片段变异的模板，它们对σ2R具有高亲和力和/或选择性，以及与其他衍生物相比具有更高的LLE。首先合成了不同链结构的衍生物（表3）。没有末端碱基中心的衍生物27、30和34-36没有与σ2R的结合亲和力。与二甲基乙基氨衍生物28（Ki=471nM）或吡咯烷乙基氨基32（Ki=165nM）相比，二甲基丙氨衍生物29（Ki=105nM）对σR表现出更高的结合亲和力，这说明链长度影响σ2R结合。如果尾部中有吸电子基团大大降低对σ2R的结合亲和力，如二甲基氨基乙氧基衍生物31（Ki=1344nM）和砜衍生物33和37（Ki=3770nM和2147nM），说明尾部的碱性是σ2R结合所必需的。与哌嗪基乙基氨基化合物39相比，氨基乙基哌嗪基38表现出更高的结合亲和力（Ki=129nM vs. 400nM）。与5-((5(二乙氨基)戊-2-基)氨基)链密切相似的羟基取代的尾部40表现出与σ2R的显着结合(Ki=71nM)，而化合物41中的哌啶氧基尾部具有较低的σ2R结合亲和力(Ki=134nM)。通过SAR分析，5-((5(二乙氨基)戊-2-基)氨基)链非常适合与σ2R结合，并且结合亲和力取决于尾部片段的碱性和链长。 羰基和吡嗪环对于喹啉基吡嗪酰胺的σ2R结合不是必需的接下来，密歇根大学合成了化合物42和化合物43，分别考察去掉吡嗪基团和羰基的影响，这些化合物保持了显著的σ2R结合亲和力（Ki=52nM和65nM），说明结合亲和力主要来源于5-((5(二乙氨基)戊-2-基)氨基)尾部与σ2R结合位点相互作用的贡献。用其它杂环替换吡嗪环合成了一些恶唑类似物，但由于稳定性较差没有进一步探索。用化合物44中的噻唑替换吡嗪保持了与化合物17相同的活性。作为酰胺的生物电子等排体，合成了磺酰胺连接子的化合物45，与化合物17相比，亲和力提高了3倍（表4）。化合物42-45维持了σ2R的选择性，并再次验证了5-((5(二乙氨基)戊-2-基)氨基)尾部负责与σ2R结合。 吡嗪酰胺杂合体抑制胰腺癌细胞的生长筛选合成的化合物在MIA PaCa-2胰腺癌细胞系中的细胞毒性（表1-4）。对带有氯喹尾部的单取代衍生物SAR分析表明，6-甲基类似物5是最有效的化合物（IC50=1.1±0.3μM），而7-甲基衍生物6则无活性（IC50>30μM）（表1）。同时观察到氯的类似趋势和甲氧基类似物。与2-Me或2-Cl同系物相比，化合物7中仅C2位的甲氧基取代保留了效力 (IC50=1.9±0.5μM)。5-Cl、6-Cl、6-F和6-Br衍生物14-18显示出显著的细胞毒性（表1）。显示出σ2R结合亲和力减弱的化合物（如化合物6和10）的细胞毒性明显低于具有良好结合亲和力的化合物。双取代化合物与单取代化合物相比，类似物23、25-26的细胞毒性降低了3-4倍（表2）。密歇根大学同时还研究了尾部片段的取代基的耐受性。然而，在细胞毒性方面，烷基氨基链（27-32）没有观察到太大的差别（表3）。另一方面，分别在33和34中带有尾部的二氧硫代吗啉和异羟肟酸没有细胞毒性。在探索了与吡嗪环直接C、N和O键合的化合物的活性之后，又检测了硫和磺酰基键合类似物的活性。尽管NH−SO2−基团导致35和36的效力完全丧失（IC50>30μM）；与之前合成的类似物相比，具有SO2−NH−基团的化合物37表现出更高的细胞毒性（IC50=0.6±0.3μM）。哌啶氧基类似物41中的醚键 (IC50=6.5±3.5μM) 并未改善细胞毒性。经过对不同尾部基团的探索，观察到细胞毒性与σ2R结合亲和力没有明显的相关性，后者似乎仅取决于尾部基团的链长和碱性。化合物42 和43的效力丧失表明吡嗪环和酰胺官能团对于细胞毒性至关重要（表4）。噻唑类似物44显示 IC50=1.5±1.6μM（表4）。磺酰胺衍生物45的细胞毒性低4-5倍（IC50=3.8±0.9μM），与17相比（IC50=0.9±0.3μM）（表4）。最具细胞毒性的类似物14和17对σ2R的Ki分别为47nM和10nM，尽管它们与化合物6相比选择性较低。从SAR分析结果，可以得出结论：5- ((5-(二乙氨基)戊-2-基)氨基)链负责σ2R的结合亲和力，但不负责细胞毒性。两个类似物42和43尽管不具有细胞毒性，但仍显示纳摩尔范围内的σ2R结合。这与之前的研究一致，即几种σ2R配体发挥的细胞毒性与σ2R的调节无关。在TMEM97或PGRMC1敲除细胞系或 TMEM97/PGRMC1双敲除细胞系中，σ2R配体对细胞死亡的诱导不受阻碍，表明细胞毒性作用不是由TMEM97或PGRMC1直接介导的。 吡嗪酰胺类衍生物对σ2R的选择性由于σR与GPCR家族相关，密歇根大学针对一组45种GPCRs和相关跨膜靶标筛选了合成的化合物。化合物14和17相对于其他GPCRs（前20个）的选择性概况如表5所示。一般来说，大多数类似物合成的1-5、7-9、11-18和22-26表现出低纳摩尔结合，并且对σ2R的选择性比σ1R高5-10倍。 化合物14和17在人和小鼠肝微粒体中稳定在小鼠肝微粒体（MLM）和人肝微粒体（HLM）存在下，测试了对σ2R表现出高结合亲和力并在MIA PaCa-2细胞（约1μM）中为有效细胞毒性的化合物的微粒体稳定性。在MLM中，6-甲基类似物5的t1/2为21.0分钟，而相应的2-MeO类似物7, 5-氯类似物14和化合物17的t1/2分别为54.0、60.0和45.3min（表6）。6-甲基喹啉类似物5的微粒体稳定性低可能归因于苄基甲基的氧化。化合物44（MLM中t1/2=3.3min和HLM中t1/2=23.0min）和45（MLM中t1/2=15.0min和HLM中t1/2=39.2min），与化合物17（MLM中t1/2=45.3min 和HLM中t1/2>60分钟的比较，表明吡嗪具有更高的代谢稳定性。不幸的是，化合物37在MIA PaCa-2细胞中表现出所有测试化合物中最高的效力，但其微粒体稳定性较差（MLM中的t1/2=6.0min），这阻碍了进一步的探索。因此，选择化合物14和17进入体内研究。化合物14抑制多种胰腺癌细胞系的生长在人（MIA PaCa-2、PANC1和BxPC3）和鼠（PAN02和KPC-2）胰腺癌细胞中进一步评估了化合物14和17的细胞毒活性。化合物14和17在所有测试的细胞系中显示出低微摩尔细胞毒性，具有不同的效力，其中MIA PaCa-2细胞系最敏感（表7）。化合物14和17在其它五种胰腺细胞系中的MIA PaCa-2中活性更高，如集落形成测定中所示（Fig6）。化合物14对正常细胞的毒性低于吉西他滨为了评估化合物14对癌细胞的优先作用，密歇根大学在三种正常细胞系[人包皮成纤维细胞（HFF-1）、人包皮成纤维细胞（HFF-1）、人HPDE细胞系高于HFF-1细胞系(表8)。在HEK-293和HPDE细胞中，化合物14的毒性显著低于吉西他滨。化合物14与σ2R激动剂西拉美辛有轻微拮抗作用，与σ2R拮抗剂CYR-101有叠加作用为了进一步阐明细胞死亡机制，密歇根大学将14种信号抑制剂联合使用，包括铁死亡[铁他汀和去铁胺（DFO）]、细胞凋亡（Z-VAD）、坏死性凋亡（Necrostatin）、自噬（氯喹）、m-TOR（雷帕霉素）以及活性氧（ROS）、抑制剂 N 乙酰半胱氨酸 (NAC) 和铁死亡诱导剂（erastin和FIN56）。化合14与铁死亡抑制剂ferrostatin和DFO具有相加或轻微协同作用。此外，化合物14还可以通过与铁死亡诱导剂erastin和FIN56表现出叠加/协同作用来诱导铁死亡。化合物14在 MIA PaCa-2 细胞中与氯喹（自噬抑制剂）具有协同作用。然而化合14与其他9种化疗药物没有表现出显著的协同作用。σ2激动剂西拉美辛和σ2R拮抗剂罗潘立酮 (CYR-101) 的联合研究表明，化合物14与roluperidone具有添加剂作用（Fig7）。化合物14提高ER应激标记GRP78的水平σ2受体存在于ER中，已知是引起未折叠蛋白反应（UPR）的ER应激诱导剂。在MIA PaCa-2细胞中评估了用化合物14（JR1-157）处理后的GRP78蛋白水平。蛋白质印迹分析显示，化合物14在24小时后增加了10μM的GRP78水平（Fig8A-C）。用σ2R配体西拉美辛和roluperidone治疗后，GRP78水平也增加（Fig8C）。化合物14增加LC3-B的蛋白质水平化合物14在结构上与氯喹相关，具有相似的氨基链，并且自噬已被证实是氯喹活性的主要作用机制。从SAR研究表明，氨基链对于该系列化合物的σ2R结合至关重要。σ2R配体可通过激活自噬途径促进细胞死亡。为了确定这一系列喹啉吡嗪酰胺的作用机制，密歇根大学进一步测试了14种自噬途径生物标志物LC3B水平的变化。观察到PANC1和MIA PaCa-2细胞中LC3-B水平呈剂量依赖性上调（Fig9）。化合物14诱导细胞凋亡据报道，σ2R配体可通过多种信号通路（包括细胞凋亡和自噬）促进细胞死亡。证实膜联蛋白V和碘化丙啶（PI）共染色分析。与对照相比，化合物14处理后凋亡群体增加（Fig10）。当MIA PaCa-2细胞用化合物14处理48小时时，观察到早期和晚期凋亡中膜联蛋白V阳性细胞的分布。这个实验结果与之前的报道一致，即σ2R配体通过两者促进细胞死亡凋亡和自噬途径。化合物14将细胞阻滞于G0/G1期为了评估对细胞周期的影响，用10μM浓度的14处理MIA PaCa-2和HCT116细胞24小时，并通过流式细胞仪分析细胞周期分布。与未处理的细胞相比，密歇根大学观察到停滞在G0/G1期的细胞呈剂量依赖性增加，而在S期则减少（Fig11）。化合物14是水溶性分子，可以与铜配位与QN523相关的N-喹啉-8-基吡嗪酰胺衍生物以其金属螯合特性而闻名。通过喹啉环中的氮原子、酰胺基团和吡嗪环的邻位氮原子与过渡金属发生配位，形成配体的两个分子与金属的一个分子的化学计量比的络合物。因此，测试了化合物5、14和17与各种金属（包括 Cu+、Cu2+、Mn2+、Co2+、Zn2+、Fe2+、Fe3+和Cr3+）形成配位络合物的能力，并使用LC-MS。化合物5、14和17与不同盐形式的铜形成配位络合物，如LC-MS光谱中化学计量比为1:1的变化所示。与7-甲基衍生物6的平面能量最小化结构不一致，没有观察到与Cu2+的金属配合物（Fig12）。尽管吡嗪和喹啉部分具有共平面性，但2-OMe类似物7并未显示出完全转化为Cu配合物，表明该位置的甲基破坏了金属配合物的形成推测是二体配体的原因。5-氯衍生物14和6-氟同系物17也仅与不同盐形式的铜形成络合物。然后测试了化合物14和17的铜配合物在MIA PaCa-2细胞中的细胞毒性。与相应的母体化合物相比，它们的效力提高了5-7倍（表9）。与正常细胞相比，铜是对铜有较高需求的癌细胞生长和增殖的限制性营养物质。铜螯合被认为可以通过减少线粒体中ATP的产生来杀死癌细胞。铜螯合似乎限制了铜结合MEK1/2酶的活性，这些酶通过KRAS或BRAF致癌突变驱动肿瘤发生。铜螯合剂四硫代钼酸铵（TTM）治疗乳腺癌患者的临床试验正在进行临床II期试验（NCT00195091）。与氯异喹啉相比，铜-氯异喹啉还显示出增强的抗癌活性。除此之外，补充有铜的双硫仑（DSF）[二乙基二硫代氨基甲酸铜复合物 (Cu(DDC)2)] 正在临床试验中进行测试，用于治疗不同的癌症，并已证明比单独使用DSF更有效。同样，密歇根大学的铜复合物比其母体具有更强的细胞毒性还测试了化合物14：CuCl2的各种化学计量比（4:1、2:1和1:1）；然而，观察到它们的细胞毒性是相当的，表明在所有情况下都形成相同的铜络合物。为了证实化合物14对MIA PaCa-2细胞的细胞毒性作用是Cu依赖性的，使用氯化铜和TTM与化合物14的组合进行集落形成测定（Fig13）。密歇根大学通过将化合物14与氯化铜组合（Fig13A）观察到强的叠加效应或协同作用，而TTM作为铜螯合剂显著挽救了化合物14的细胞毒性（Fig13B）。此外，QN523与氯化铜表现出协同作用，与TTM表现出显著的拮抗作用（Fig13C-D）。接下来，密歇根大学对化合物14与临床批准的铜螯合剂（如DSF或Andelesclomol）进行了类似的组合研究。化合物14与DSF或Orelesclomol没有表现出任何拮抗作用，这可能归因于以下事实：与TTM不同，DSF和elesclomol都是离子载体，能够螯合细胞外的铜，将形成的铜复合物在细胞内转运到不同的细胞区室，特别是线粒体，从而增加细胞内铜的浓度。另一方面，TTM预计会降低细胞内可用铜的浓度。用TTM降低Cu水平会影响MEK1/2激酶活性和BRAF驱动的肿瘤发生；而DSF通过影响ALDH活性和MEK-ERK途径来减少肿瘤生长。为了验证化合物14是选择性铜螯合剂，密歇根大学将14与醋酸金盐和醋酸银盐进行组合。另外，将化合物14、QN523和氯喹与TTM组合进行测试（Fig14）。通过用TTM预处理来挽救化合物14或QN523对MIA PaCa-2和HCT116细胞中集落形成的抑制作用。化合物14及其铜络合物（14-Cu）处理72小时后，分别在2.5和0.5μM下观察到LC3-B表达水平的剂量依赖性上调。 吡嗪酰胺杂合物的Cu配合物与σ2R结合密歇根大学进一步评估了 化合物14和17的Cu配合物的结合。结果表明，与其母体（Ki=47nM和Ki=10nM）相比，它们具有较低的σ2R结合亲和力（Ki=216nM和Ki=182nM）。然而，对于14-Cu和17-Cu配合物，观察到σ2R选择性高于σ1R的类似趋势（表9、Fig15）。 化合物14可口服密歇根大学测试了静脉内（i.v.）（10mg/kg）和口服（20mg/kg）给药后化合物14在CD-1小鼠中的药代动力学性质（表10）。静脉内给药后，化合物14表现出21L/kg的高分布体积，高分布体积。全身清除率为3730mL/h/kg，消除半衰期为4.7h。化合物14口服后也很容易吸收，AUC(0-inf)为3392h·ng/mL，口服生物利用度为60%。化合物14具有口服活性。基于其对σ2R的选择性（IC50<100nM）、良好的溶解度（>5mg/mL）和良好的微粒体稳定性（t1/2>30min），选择化合物14进行体内活性研究。MTD研究揭示化合物14和其与硫酸铜的组合可以分别以60mg/kg单独和30mg/kg（化合物14）+3mg/kg（硫酸铜）施用，而不影响小鼠的体重（Fig16A、B）。最初，每天通过腹膜内（i.p.）途径用化合物14以60mg/kg处理6至8周龄、携带Pan02细胞的雌性C57BL/6小鼠。经由腹膜内施用的化合物14显著延迟肿瘤生长（p＝0.017；Fig16C）。继续对相同剂量水平（60mg/kg/天）的化合物14的口服体内活性进行评估。类似地，化合物14具有口服活性（p=0.002；图16D）。在单独的研究中，小鼠同时接受化合物14（30mg/kg/天）和硫酸铜（3mg/kg/天）治疗32天。除了第4天和第7天外，没有观察到体重有任何显著变化。化合物14显著延迟肿瘤生长（p＜0.05 p.o. Fig16D）。这些结果表明化合物14是一种有前途的工具化合物，可以更好地阐明胰腺癌中的σ2R抑制和铜配位。 结论密歇根大学设计了一系列新型喹啉基吡嗪酰胺作为σ2R的有效配体。先导化合物14在多种胰腺癌细胞系中具有细胞毒性，并增加ER应激标记物GRP78和自噬标记物LC3-B的表达。化合物14的口服生物利用度为60%，t1/2为6h，在胰腺癌Pan02模型中显示出显著的肿瘤抑制作用。同时还证实此类化合物具有优异的铜配位特性并且是水溶性的。该系列喹啉基吡嗪酰胺的铜配合物也与σ2R结合。喹啉基吡嗪酰胺类化合物可以作为新型抗癌药物值得临床开发。文章来源https://doi-org.libproxy1.nus.edu.sg/10.1021/acs.jmedchem.2c01769请点击此处链接观看CyberSAR系统详细使用教程1.药渡CyberSAR结合药物设计思想，挖掘了文献及专利报道的活性的结构，通过CyberSAR以方便快速获得研发人员兴趣靶向结构，以供开拓思路，就Sigma intracellular receptor 2（Homo sapiens）举例如下：2.在靶点界面选中“化学空间”选项标签下级联“聚类结构视图”选项卡，可以将CyberSAR平台收录的文献和专利具有关于Sigma intracellular receptor 2（Homo sapiens）相关实验测试活性的分子以“母核结构聚类”的形式展示。其中“绿色字体高亮的”为文献报道的体外酶、细胞活性测试实验中IC50<100nM的活性分子结构、具体实验、实验结果及实验来源。3.在靶点界面选中“化学空间”选项标签下级联“原始结构视图”选项卡，可以将CyberSAR平台收录的文献具有关于Sigma intracellular receptor 2（Homo sapiens）相关实验测试活性的分子以“研发阶段时光轴”的形式展示。其中绿色字体高亮的“数据挖掘”即为潜力Hit。登录方式CyberSAR在电脑浏览器端登录网址：https://data.pharmacodia.com/cybersar/，欢迎猛烈试用。请点击此处链接观看CyberSAR系统详细使用教程如需进一步沟通，请扫码添加微信联系药渡赵博士或药渡CyberSAR沟通群。

中文摘要目的    对冻干人用狂犬病疫苗（Vero细胞）进行动物肌内单次给药毒性、肌内重复给药毒性伴随局部刺激性和免疫原性、主动全身过敏性评价，以考察其安全性。方法    采用ICR小鼠肌内注射单次给药毒性试验评价制品的急性毒性；采用SD大鼠和食蟹猴肌内注射6周重复给药毒性伴随局部刺激性、免疫原性试验评价制品的长期毒性；采用豚鼠主动全身过敏试验评价制品的致敏性。结果    ICR小鼠单次肌内注射，所有动物未见与疫苗相关的异常反应，疫苗的最大耐受量＞125 国际单位（international unit，IU）/kg，为临床拟用剂量的3 472.2倍，等效剂量的268.8倍；除伴随的轻度局部刺激反应外，SD大鼠6周重复给药毒性伴随局部刺激试验和免疫原性试验的安全剂量为37.5 IU/kg，为临床拟用剂量的1 041.7倍，等效剂量的182.0倍；食蟹猴最大无毒性反应剂量为1.875 IU/kg，是临床拟用剂量的52.1倍，等效剂量的18.0倍；疫苗剂量为0.1 剂（0.05 ml/只）和1剂（0.5 ml/只）时，豚鼠主动全身过敏反应结果均为阳性。结论    冻干人用狂犬病疫苗（Vero细胞）显示出良好的安全性，但肌内给药可能引起过敏反应，临床应用需密切关注。正文狂犬病是一种由狂犬病病毒引起的人兽共患传染病，一旦发病，致死率几乎为100%。目前临床尚无有效治疗药物，接种疫苗是唯一有效的预防手段。当前国内市场广泛使用的狂犬病疫苗有地鼠肾细胞狂犬病疫苗、Vero细胞狂犬病疫苗和人二倍体细胞狂犬病疫苗。临床上接种疫苗后常见不良反应主要为局部的红肿、瘙痒、疼痛，全身乏力、发热、超敏反应及胃肠道反应等。本研究根据相关指导原则要求，分别从肌内单次给药毒性、肌内重复给药毒性伴随局部刺激性和免疫原性、主动全身过敏性等方面评价冻干人用狂犬病疫苗（Vero细胞）的非临床安全性。1材料与方法1.1疫苗冻干人用狂犬病疫苗（Vero细胞）由武汉生物制品研究所有限责任公司按照企业标准制备，检定合格后用于动物安全性评价研究，批号为FZ201909003。冻干人用狂犬病疫苗（Vero细胞）有效期内效价不低于2.5国际单位（international unit，IU）/剂，临床给药浓度为5 IU/ml，人均体质量按70 kg计算，临床给药剂量为0.036 IU/kg。1.2实验动物40只3~4周龄无特定病原体级ICR小鼠，雌雄各半，给药时雄性体质量18.58~21.51 g，雌性体质量18.52~21.86 g，质量合格证号：No.1107272011001630，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司；120只4周龄无特定病原体级SD大鼠，雌雄各半，首次给药时雄性体质量235.61~275.79 g，雌性体质量164.96~200.48 g，质量合格证号：No.430727201101121912，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司；30只3~5岁普通级食蟹猴，雌雄各半，给药前，雄性体质量为2.55~3.02 kg，雌性体质量为2.29~3.55 kg，质量合格证号：No.44818300000244，购自广州相观生物科技有限公司；68只4~6周龄普通级豚鼠，雌雄各半，进入实验分组时雄性体质量318.69~428.87 g，雌性体质量332.37~397.98 g，质量合格证号：No.42010000005112，购自武汉市万千佳兴生物科技有限公司。1.3 主要试剂及仪器氯化钠注射液购自湖南科伦制药有限公司；灭菌注射用水购自安徽双鹤药业有限责任公司；戊巴比妥钠购自德国默克公司。iMark酶标仪购自美国Bio-RAD公司；BX-3010全自动生化分析仪、XN-1000IV全自动模块式血液体液分析仪购自日本SYSMEX公司；Klite8G多参数电解质分析仪购自梅州康利高科技有限公司；ACL TOP300 CTS全自动凝血分析仪购自西班牙沃芬公司；H800干化学尿液分析仪购自长春迪瑞医疗科技股份有限公司；MB-Ⅱ全自动包埋仪购自武汉赛尔思科技有限公司；ECG-1103GVET动物心电图机购自深圳凯沃尔电子有限公司；FACS Calibur流式细胞仪购自美国BD公司；Provantis 9.4.3.0系统购自英国Instem公司。1.4 安全性研究1.4.1  ICR小鼠肌内单次给药毒性    40只ICR小鼠按体质量随机均分为2组（每组雌雄各半），分别作为阴性对照组（给予0.9%氯化钠注射液）和受试组〔给予冻干人用狂犬病疫苗（Vero细胞）〕。阴性对照组和受试组都采用多点肌内注射，见表1。给药体积为0.5 ml，每点不超过0.1 ml，受试组给药浓度为5 IU/ml，小鼠体质量按20 g计算，给药剂量为125 IU/kg，临床剂量0.036 IU/kg，临床等效剂量 Db=Da • （Kb/Ka） • （Wa/Wb）1/3，其中 Ka、Kb为体型系数，Wa、Wb为体质量（kg），下标a、b分别表示已知动物及欲求动物，下同。计算得到Db为0.465 IU/kg。定义首次给药日为D1。给药后4 h内详细观察动物的一般状况（外观体征、行为活动、动物姿势、饮食、被毛、刺激反应、腺体分泌物、排泄物、呼吸状态和死亡情况等），之后每天观察1次，连续观察14 d，记录所有的死亡情况、出现的症状以及症状起始的时间、严重程度和持续时间等；分别于D1、D2、D3、D7和D14称量动物体质量；观察期内发现动物死亡时即时尸检，濒死动物即时处死进行剖检；D15解剖进行组织病理学检查。1.4.2   SD大鼠肌内6周重复给药毒性伴随局部刺激性和免疫原性    90只SD大鼠分为阴性对照组（给予0.9%氯化钠注射液）、疫苗低和高剂量组〔给予冻干人用狂犬病疫苗（Vero细胞）〕，每组30只，雌雄各半；上述每组均设立对应卫星组，每组10只，雌雄各半，用于伴随免疫原性试验。各组动物分别于D1、D4、D8、D15、D29和D43双侧后肢多点注射给药1次，每点不超过0.2 ml。低剂量组和高剂量组采用临床给药浓度5 IU/ml，给药剂量分别为1剂和3剂，大鼠体质量按200 g计算，临床等效剂量为0.206 IU/kg。分组和给药信息见表2。实验期间，每日观察动物一般情况、局部刺激性情况，每周测量1次体质量和摄食量；首次给药前（D1）和给药后2~4 h、其余每次给药后2~4 h和恢复期结束前（D71）对动物进行体温测量；给药期结束前（D43）和恢复期结束前（D71）进行眼科检查、尿液检测；D44和D72分别剖杀60只、30只动物，解剖前采集血液，检测血液学、凝血、血液生化学、免疫和电解质等指标，解剖后称量脏器，计算脏器系数（脏体比=脏器质量/动物体质量；脏脑比=脏器质量/脑质量），并进行骨髓指标、病理学检查。卫星组动物于每次给药前（D1、D4、D8、D15、D29和D43）和恢复期结束前（D71）颈静脉采血检测特异性抗体和中和抗体。1.4.3   食蟹猴肌内6周重复给药毒性伴随局部刺激性和免疫原性    30只食蟹猴分为阴性对照组（给予0.9%氯化钠注射液）、疫苗低和高剂量组〔给予冻干人用狂犬病疫苗（Vero细胞）〕，每组10只，雌雄各半。给药剂量和时间设置同1.4.2，食蟹猴体质量按4 kg计算，临床等效剂量为0.104 IU/kg。分组和给药信息见表3。实验期间，每日观察动物一般情况，测定摄食量，每周测量1次体质量；分别于首次给药前13、7 d、D1、D15、D43给药后2~6 h和D71对动物进行体温测量；首次给药前8 d、D1、D15、D43给药后2~6 h和D71检测动物心电和血压；首次给药前8 d、D43和D71对动物进行眼科检查；首次给药前13、8、2 d、D2、D44、D72对各组所有动物四肢静脉采血，检测血液学、凝血、血液生化及电解质指标；首次给药前8、2 d、D43和D71进行尿液检测；首次给药前（D1）、D44和D72对各组所有动物四肢静脉采血，进行T淋巴细胞亚群、细胞因子检测，D44和D72的血液样本还进行分泌IFN-γ的T淋巴细胞比例检测；各组动物于每次给药前（D1、D4、D8、D15、D29和D43）和D72采用四肢静脉采血，进行特异性抗体和中和抗体检测。D44和D72分别剖杀18只、12只动物，进行组织病理学、骨髓指标检查。1.4.4  主动全身过敏性    选择检疫合格、体质量在300~400 g或在同性别动物平均体质量±20%之内的豚鼠68只，按体质量分层随机分为5组，雌雄各半，依次为阴性对照组（12只，给予0.9%氯化钠注射液）、阳性对照组（12只，给予卵清白蛋白5 mg/只）、赋形剂组〔12只，给予冻干人用狂犬病疫苗（Vero细胞）赋形剂，各组分与疫苗中赋形剂组分及浓度相同〕和疫苗低剂量组、高剂量组〔每组16只，给予冻干人用狂犬病疫苗（Vero细胞），每组保留雌雄动物各2只，不进行致敏，待动物激发后出现过敏反应时备用〕。本试验低剂量和高剂量组均选择临床给药浓度。致敏时采用肌内注射，隔日1次，共3次，首次致敏日记为D1，低剂量组和赋形剂组给药量为0.05 ml/只，阴性对照组、高剂量组和阳性对照组给药量均为0.5 ml/只。分别于D19、D26进行静脉注射激发，D19选择每组每性别动物编号排序前3位的3只动物进行第1次激发，剩余动物在D26进行第2次激发。激发给药体积为致敏时的2倍，低剂量组和赋形剂组0.1 ml/只，阴性对照组、高剂量组和阳性对照组1.0 ml/只。当给药体积超过0.2 ml时采取多点注射，每点不超过0.2 ml。豚鼠体质量按0.4 kg计算，临床等效剂量为0.175 IU/kg。分组和给药信息见表4。首末次致敏和激发当日测定动物体质量；致敏期间每日观察动物的外观体征、行为活动、动物姿势、饮食、被毛、刺激反应、腺体分泌物和呼吸状态等一般状况；激发后立即按表5症状及程度详细观察每只动物的反应，包括症状出现及消失时间，观察3 h。每次激发后如发现有过敏反应症状，低剂量组和高剂量组则分别取健康未致敏的备用雌雄豚鼠各1只，静脉注射相同激发剂量的疫苗，观察有无疫苗引起的类似过敏反应症状。1.5统计学分析采用SPSS 17.0软件对数据进行统计分析，均以P<0.05表示差异有统计学意义，P<0.01表示差异有明显统计学意义。肌内单次给药毒性试验计量资料用均值±标准差表示，进行独立样本t 检验。分析动物体质量变化、反应情况等，找出动物毒性反应情况与剂量之间的大致关系，得出最大耐受量或最大无毒性反应剂量（no observed adverse effect level，NOAEL）。肌内重复给药毒性伴随局部刺激性和免疫原性试验计量资料，如体质量、摄食量、血液学、凝血、血液生化、电解质、激素、脏器重量及系数等，进行单因素方差分析；计数资料，如尿液中亚硝酸盐分析采用卡方检验；等级资料，如尿液中尿蛋白采用非参数检验（Kruskal-Wallis H检验），总体差异有统计学意义时用Mann-Whitney U检验进行组间差异的比较。2结果2.1ICR小鼠肌内单次给药毒性结果所有动物一般状况未见与疫苗相关的异常出现，实验期间无动物死亡；受试组试验动物体质量增长与同期阴性对照组相似，见图1；观察期结束后，将动物麻醉后急性失血安乐死进行大体解剖检查，所有动物各组织脏器均未见明显肉眼可见异常改变。2.2SD大鼠肌内6周重复给药毒性伴随局部刺激性和免疫原性结果本试验中，给药后疫苗低剂量组和高剂量组雌雄大鼠一般状况、眼科检查、骨髓指标未见异常病理改变。与同期同性别阴性对照相比，低和高剂量组动物摄食量、体质量、电解质指标和细胞因子水平均未见与疫苗有关的明显改变；血液学指标、凝血指标、血液生化指标、免疫指标（T淋巴细胞亚群、分泌IFN-γ的淋巴细胞比例）、尿液指标、脏器重量、脏器系数有改变，但无明显时间-反应和/或剂量-反应关系，考虑无明确毒理学意义。与同期同性别阴性对照相比，低和高剂量组动物各主要脏器病理学检查均未见与疫苗有关的明显改变，仅给药期结束部分大鼠大体剖检及病理学检查可见与疫苗相关的给药局部轻微刺激反应，表现为肌纤维轻微或轻度变性，轻微单个核细胞浸润，间质水肿、出血及混合性炎细胞浸润，恢复期结束均可恢复，见图2。阴性对照组动物D1、D4、D8、D15、D29、D43和D71血清特异性抗体全部为阴性，低和高剂量组动物D1和D4血清特异性抗体全部为阴性，D8、D15、D29、D43和D71阳性率为100%；低和高剂量组动物在免疫后均可产生具有保护作用（≥0.5 IU/ml）的中和抗体。综合分析，在本试验条件下，除伴随的轻度局部刺激反应外，冻干人用狂犬病疫苗（Vero细胞）SD大鼠肌内注射6周重复给药毒性伴随局部刺激试验和免疫原性试验的NOAEL为3剂/只（37.5 IU/kg，高剂量），为临床拟用剂量的1 041.7倍，等效剂量的182.0倍。2.3食蟹猴肌内6周重复给药毒性伴随局部刺激性和免疫原性结果本试验中，所有动物均存活至计划解剖日，疫苗低剂量组和高剂量组雌雄动物一般状况、眼科检查、骨髓指标未见异常病理改变。与同期同性别阴性对照相比，低和高剂量组动物体质量、体温和免疫学指标（T淋巴细胞亚群、细胞因子、分泌IFN-γ的T淋巴细胞比例）均未见与疫苗有关的明显改变；摄食量、心电图、血压、血液学、凝血指标、血液生化、电解质、尿液、脏器重量与系数有改变，但无明显时间-反应和/或剂量-反应关系，考虑无明确毒理学意义。部分脏器系数结果见表6。大体剖检与组织病理学检查等均未见与疫苗相关的明显改变，仅少数疫苗组动物给药局部可见轻度刺激，表现为注射局部肌肉轻微或轻度肌纤维炎细胞浸润，停药后恢复，见图3。阴性对照组动物在D1~D72血清抗体全部为阴性，低剂量组D8血清特异性抗体阳性率为80% ，高剂量组D8血清特异性抗体阳性率为100%，低和高剂量组D15~D72血清特异性抗体阳性率为100% ；低和高剂量组动物在免疫后均可产生具有保护作用（≥0.5 IU/ml）的中和抗体。综合分析，在本试验条件下，食蟹猴连续6周肌内注射冻干人用狂犬病疫苗（Vero细胞），NOAEL为3剂/只，为临床拟用剂量的52.1倍，等效剂量的18.0倍。2.4主动全身过敏性各组豚鼠体质量均呈增长趋势，体质量与同期阴性对照组比较无明显差异。致敏期间各组动物一般状况均未见明显异常。在本试验所确定的条件下，冻干人用狂犬病疫苗（Vero细胞）剂量为0.05 ml/只和0.5 ml/只时，豚鼠主动全身过敏反应结果均为阳性，赋形剂组、低剂量组、高剂量组和阳性对照组随着所含人血白蛋白含量或含磷糖蛋白等致敏物含量的增加，过敏反应强度逐渐增强，结果见表7、8。低、高剂量组分别另取2只健康豚鼠给予激发量药物后，均未见过敏反应症状。3讨论自19世纪80年代Louis Pasteur发明第1剂狂犬病疫苗以来，狂犬病疫苗经历了从神经组织疫苗到禽胚培养疫苗再到细胞培养疫苗的代次更替。目前WHO推广使用的各类纯化细胞培养疫苗主要有纯化鸡胚细胞疫苗、Vero细胞疫苗、地鼠肾细胞疫苗和人二倍体细胞疫苗，广泛采用的接种程序有“5针法”（Essen法）和“4针法”（Zagreb法）。狂犬病疫苗多由抗原蛋白与人血白蛋白、多糖、明胶等保护剂成分混合制备而成，其中的外源成分常常引起患者不同程度的不良反应，为保证拟上市产品的质量，需对其安全性进行综合评价。考虑到狂犬病疫苗免疫需要在同一部位接种多次，本研究同时设计了单次和多次肌内给药刺激试验。SD大鼠长期毒性试验中，与阴性对照组相比，低、高剂量疫苗组动物肌间质单个核细胞或混合性炎细胞浸润的发病率及病变程度升高，且阴性对照组动物给药局部未见混合性炎细胞浸润，考虑与疫苗相关，可能为疫苗引起的轻微局部刺激性；阴性对照组和疫苗高剂量组个别动物出现肌纤维变性或间质轻微出血、水肿，病变程度和发生率组间无明显差别，考虑与针头的机械性刺激有关，与疫苗无明显相关性。食蟹猴长期毒性试验中，给药期结束时（D44），低和高剂量组动物注射局部肌肉可见轻微或轻度肌纤维炎细胞浸润，阴性对照组未见类似改变；恢复期结束时此病变恢复，考虑上述变化为疫苗相关，低、高剂量组发病例数和程度无剂量相关性，且此病变可恢复，认为肌内注射6周冻干人用狂犬病疫苗（Vero细胞）对食蟹猴给药局部肌肉存在轻度刺激。主动全身过敏试验结果与已有的报道类似，激发后的低剂量组和高剂量组动物均出现不同程度的过敏反应（过敏反应发生率均为100%），每组另取2只健康豚鼠给予激发量后，均未见过敏反应症状，说明低剂量组和高剂量组动物激发后出现的过敏反应并非疫苗作用引起的类过敏反应症状。疫苗中蛋白的存在以及抗原量的多少可能是影响豚鼠是否发生过敏反应的主要因素。疫苗低剂量组和赋形剂组中的人血白蛋白和抗原等致敏物含量低于高剂量组，而高剂量组的人血白蛋白和抗原等致敏物含量低于阳性对照组的含磷糖蛋白含量，激发后，阴性对照组过敏反应呈阴性，同时赋形剂组、低剂量组、高剂量组和阳性对照组随所含人血白蛋白含量或含磷糖蛋白等致敏物含量的增加，过敏反应逐渐增强。由于在本试验中，冻干人用狂犬病疫苗（Vero细胞）中的人血白蛋白为异源蛋白且含量较高，因此过敏反应可能主要由此成分导致；而在临床用药中，人血白蛋白为人体同种蛋白，推测冻干人用狂犬病疫苗（Vero细胞）在临床使用中产生过敏反应的风险可能性较低。本研究中未设计皮肤被动过敏试验，考虑到制品中含有上述异源蛋白成分，推测结果也和马玉奎等的报道相似。综上所述，武汉生物制品研究所有限责任公司生产的冻干人用狂犬病疫苗（Vero细胞）具有良好的安全性，但临床应用需密切关注过敏反应。作者梁婧1  刘佐兵1  田义超2  杨莹2  徐晓1  王玲1  王玥1  林弦1  曹烨1  刘翠丽1  金文芳1  杜洪桥11武汉生物制品研究所有限责任公司科研开发部，武汉 430207；2湖北天勤生物科技有限公司武汉分公司，武汉 430075通信作者：杜洪桥，Email：duhq2002@126.com引用本文：梁婧, 刘佐兵, 田义超, 等.  冻干人用狂犬病疫苗（Vero细胞）非临床安全性研究 [J]. 国际生物制品学杂志, 2023, 46(6): 307-314.  DOI: 10.3760/cma.j.cn311962-20230103-00002识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

2022年6月17日，复星医药控股子公司复宏汉霖发布公告，其地舒单抗生物类似药HLX14（重组抗RANKL全人单克隆抗体注射液），用于治疗高危骨折风险的女性绝经后骨质疏松症（PMOP）的国际多中心III期临床研究，于中国境内完成首例患者给药。关于HLX14HLX14是复宏汉霖自主研发的地舒单抗生物类似药，为RANKL抑制剂。地舒单抗原研药为 Prolia®和Xgeva®。RANKL即核因子κ-B配体受体致活剂，是肿瘤坏死因子家族的一员，为破骨细胞分化激活的关键因子，具有诱导破骨细胞活化，抑制破骨细胞凋亡的作用，可用于骨质疏松的治疗。RANKL/RANK/OGP系统是RANKL参与骨重建的典型途径。HLX14拟用于治疗高危骨折风险的PMOP，以及其在各国获批的其他适应症。截至今年5月份，复宏汉霖已经为其投入了约0.8792亿元研发费用。关于PMOP骨质疏松症是人类第6大常见慢性病。根据国际骨质疏松联盟（IOF）的统计，目前全球有2亿骨质疏松患者，我国7000万-8000万。骨质疏松的发生率随着年龄增长而迅速升高，据统计，中国目前有老龄人口（年龄＞50岁）3.5亿，伴随着老龄化的加剧，骨质疏松市场将会持续增长。据悉，在女性绝经后早期，骨量丢失达3%-5%/年。PMOP的病因主要是雌激素缺乏，但发病机制尚未明确。导致PMOP的危险因素很多，这些因素作用于成骨和破骨的某些阶段，最终使骨量丢失。单纯的雌激素缺乏只是引发PMOP的重要原因而非全部。除此之外，老龄、女性绝经、骨折家族史（重点是父母65岁以前的髋部骨折史）等不可控因素，以及包括低体重、性激素缺乏、吸烟、过度饮酒、体力活动不足、钙和维生素D缺乏及药物等可控因素，多种因素共同作用，均可引发PMOP。临床进展根据药渡数据库调研，目前HLX14有两项临床研究正在进展中，进度最快的为高危骨折风险的PMOP，目前处于III期临床研究。另外一项是在中国健康男性受试者中比较HLX14与Prolia®的I期临床研究。CTR20220557试验详情来源：药渡数据库CTR20220557是一项比较HLX14与Prolia®治疗有高危骨折风险的PMOP的III期临床试验。试验主要目的是，评估HLX14和Prolia®治疗有高危骨折风险的PMOP的临床疗效是否等效；次要目的是，比较HLX14和Prolia®治疗有高危骨折风险的PMOP的安全性、药代/药效动力学和免疫原性。CTR20220557试验分组来源：药渡数据库合格的受试者将按1:1的比例随机分为两组，每六个月接受一次皮下注射HLX14或原研地舒单抗的治疗，共两个周期。CTR20220557终点指标来源：药渡数据库研究的主要终点为基线至第52周（D365）的腰椎骨密度（BMD）的变化率。次要终点包括基线至D365全髋BMD的变化率，基线至D365的股骨颈BMD的变化率，基线至D29、D92、D183、D274和D365的血清胶原蛋白C端肽和血清N-末端I型前胶原肽的相对变化百分比以及安全性、药代动力学和免疫原性。竞争格局双膦酸盐（BPs）是治疗PMOP的一线药物。阿仑膦酸钠和利塞膦酸钠可降低椎骨和非椎骨骨折的风险，是目前应用最广泛的抗骨质疏松的药物。 但双膦酸盐类药物在骨折保护方面是否存在差异尚不确定。对于患有更严重骨质疏松症的女性，所有这些都可能产生更大的相对和绝对骨折风险降低。雷洛昔芬雷洛昔芬是一种非类固醇的选择性雌激素受体调节剂（SERM），最常用于骨量低的绝经后妇女或患有骨质疏松症的年轻绝经后妇女，这些妇女脊柱骨折的风险高于髋部骨折的风险，SERM可以防止骨质流失并降低椎骨骨折的风险，但它在减少其他骨折方面的有效性尚不确定。考虑使用雷洛昔芬治疗时，评估除骨骼以外的风险和收益很重要。特立帕肽特立帕肽可用于治疗具有高骨折风险的女性，特立帕肽是目前唯一已经上市的能调节新骨合成从而增加骨量、改善骨结构的药物，被公认为治疗骨质疏松症的理想药物之一。先前4月21日，信立泰的特立帕肽注射液获批上市，适用于有骨折高发风险的PMOP的治疗。特立帕肽原研为礼来公司，2002年获批于美国上市，2011年获批在国内销售。上海联合赛尔拿下了首家国产获批上市的特利帕肽，信立泰为第二家。Prolia®Prolia® 是由Amgen研发的全球首个获批的特异性靶向RANK配体（RANKL）的IgG2单克隆抗体，其可阻止RANKL活化破骨细胞表面的RANK，从而抑制破骨细胞活化和发展，减少骨吸收，增加皮质骨和骨小樑两者的骨密度和骨强度，促进骨重建，降低绝经后骨质疏松症妇女椎骨、非椎骨和髋骨骨折的发生率。交易进展2022年6月14日，复宏汉霖与Organon达成合作。Organon向复宏汉霖支付包括首付款、开发和申报注册里程碑付款及商业销售里程碑付款在内 ，合计至多2.28亿美元。Organon由此获得区域（即除中国大陆以及港澳台地区以外的全球范围）及领域内（即就每一款获许可生物类似药于各国家获批上市之适应症）的独家开发和商业化（包括但不限于进口、销售、分销等）及与之相关其他权利的许可。Organon是一家专注改善女性健康的全球医疗保健公司，由默沙东分拆而成，其产品以生殖健康产品组合为主导，共拥有60多种药物和产品，同时还在不断扩大生物仿制药业务和成熟药物特许经营权的范围。参考资料北美更年期协会（NAMS）更新绝经后妇女骨质疏松症的立场声明药渡数据库复宏汉霖公告