AGO2

摘要：RNA分子的生产、修饰和细胞传递方面的最新进展促进了基于RNA的治疗学的扩展。对RNA生物学的不断深入理解也引发了RNA治疗学的相应增长。在这篇综述中，将讨论五类基于RNA的治疗学的一般概念，包括基于RNA干扰的疗法、反义寡核苷酸、小激活RNA疗法、环状RNA疗法和基于信使RNA的治疗学。此外，我们还提供了已经获得监管批准或目前正在临床试验中评估的基于RNA的治疗学的概述，以及这些技术面临的挑战。基于RNA的药物在临床试验中显示出积极的结果，并有能力解决以前“无法成药”的靶点，这为实现其全部临床潜力提供了巨大的希望，作为一种颠覆性的治疗技术。 1.  引言 从1961年发现信使RNA（mRNA）到2021年首个mRNA疫苗获批上市，已经过去了60年。在这60年的时间里，RNA领域发生了巨大的发展。1977年，Roberts和Sharp发现了RNA剪接，并因此获得了1993年的诺贝尔生理学或医学奖。1982年，Cech发现了四膜虫RNA的自剪接核酸酶，并与Altman共同获得了1989年的诺贝尔化学奖，因为他们的发现。这一发现为RNA领域翻开了新的一页，RNA分子被公认为具有复制和催化双重功能的生物分子。1993年，Ambros发现了第一个微小RNA（miRNA）; 1998年，Fire和Mello发现了RNA干扰（RNAi）现象，并获得了2006年的诺贝尔生理学或医学奖。RNAi成为了基因功能研究的重要工具，20年后，首个RNAi药物成功获批上市。1999年，Ramakrishnan、Steitz和Yonath完成了核糖体晶体结构，证明了核糖体作为一种核酸酶，并因此获得了2009年的诺贝尔化学奖。2011年，Charpentier和Doudna发现了CRISPR基因编辑技术，并因此获得了2020年的诺贝尔化学奖，揭示了sgRNA引导的DNA切割作为关键的基因治疗工具。RNA分子短短60年的历史产生了五个与RNA科学发现相关的诺贝尔奖，这突显了它在化学和生物领域的重要性，并强调了它作为一种不可替代的技术，将彻底改变医学。 基于RNA的药物主要分为两大类：（i）通过化学方法合成的寡核苷酸药物，如反义寡核苷酸（ASOs）、siRNAs（小干扰RNA）和RNA适体；（ii）通过体外转录合成的大分子RNA药物，如mRNA药物。全球近108种寡核苷酸药物进入临床管道，包括ASOs、siRNAs、适体、单导向RNA（sgRNAs）和miRNAs。此外，全球还有56种mRNA药物也进入临床管道。截至本文撰写之日，全球共有16种核酸药物获批上市，见表1。随着Biogen和Ionis开发的Nusinersen的推出，世界上首个治疗脊髓性肌肉萎缩症（SMA）的寡核苷酸药物出现，目前是销售额最高的寡核苷酸药物。 表1 全球上市的基于RNA的药物 由于大分子结构和负电荷，寡核苷酸药物容易被核糖核酸酶降解，难以穿透细胞膜，2008年至2013年因安全问题和递送系统问题而陷入低谷。药物递送在保护RNA结构、增加靶向能力、降低给药剂量和减少毒副作用方面起着至关重要的作用。随着关键递送系统的技术突破，寡核苷酸药物行业迎来了蓬勃发展。RNAi治疗是治疗遗传疾病和“无法成药”靶点的重要策略。siRNA和miRNA是有意义的基因沉默工具；四种siRNA药物候选已经获批，然而许多miRNA药物大多因安全问题而终止，只有五个候选药物继续进入临床开发，没有一个进入III期临床试验。siRNA和miRNA药物之间最大的区别是它们的作用机制。siRNAs是完全互补的靶向基因沉默序列，进入体内作用于特定的目标基因。相比之下，一个miRNA可以调节成百上千个基因，一个基因也可以被许多不同的miRNAs调节。因此，很难指定miRNA来调节一个特定的基因，并可能导致意想不到的副作用。只有解决miRNA药物的特异性问题，miRNA才能在临床环境中应用。 作为一种具有巨大潜力的技术平台，基于mRNA的治疗可用于传染病预防、肿瘤免疫治疗、蛋白质替代治疗，甚至基因编辑。mRNA的治疗途径可分为三类：预防性疫苗、治疗性疫苗和治疗药物。Pfizer和BioNTech开发的Comirnaty，以及Moderna开发的Spikevax，分别于2020年12月获得美国食品药品监督管理局（FDA）的紧急使用授权，以预防由SARS-CoV-2引起的COVID-19。2021年，Comirnaty和Spikevax的销售额分别达到368亿美元和177亿美元。这两种疫苗在全球大流行病的预防中大放异彩，标志着mRNA技术正式进入商业化时代。 RNA分子长期以来被认为在细胞过程中发挥着重要作用，从基因调控和表达到酶促反应。RNA治疗学是一个迅速扩大的药物和治疗类别，从实验室到临床实践的速度前所未有。最初认为RNA分子由于其不稳定性和相对较短的半衰期，将是一种较差的治疗剂。然而，随着稳定化学的进步和对其瞬时特性的应用，RNA分子作为治疗剂在临床上显示出价值。在这里，我们简要回顾了五类基于RNA的治疗：（i）基于RNAi的治疗，（ii）ASO治疗，（iii）小激活RNA（saRNA）治疗，（iv）环状RNA（circRNA）治疗，和（v）基于mRNA的治疗，以及其在后期临床开发中的药物候选。有数百种寡核苷酸和mRNA药物候选正在进行发现和临床前开发，目前有超过150种寡核苷酸药物和mRNA治疗正在进行临床试验。2018年和2020年是RNAi和mRNA领域的里程碑，因为基于RNA的治疗获批上市。随着更多的RNA治疗正在开发中，RNA基础治疗的未来是光明的。 2.  RNAi基治疗 近几十年来，小非编码RNA的发现及其在基因调控中的作用彻底改变了RNA生物学领域。RNAi最初由Andrew Fire和Craig Mello描述，他们因对RNAi的贡献而获得了诺贝尔生理学或医学奖。他们在秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)中发现了由外源RNA介导的基因沉默机制。像siRNA这样的小非编码RNA形成称为RNA诱导的沉默复合体(RISC)的复合物，它指导目标信使RNA(mRNA)的降解，如图1所示。RNAi的转录后基因沉默机制使其成为通过抑制基因的特定碱基序列来控制基因表达的强大工具，彻底改变了药物的发现和开发。 图1 siRNA生物生成的示意图，用于沉默目标mRNA。siRNA前体是一个双链RNA，可以由病毒、转座子或其他来源在内源或外源产生。前体被酶切割，以便正确装载Argonaute蛋白，并由一个双链RNA结合蛋白协助，这允许导向链与Argonaute结合，随后乘客链被排出。最后，沉默活动可以通过目标结合和切割发生。 鉴于RNAi的特异性和效力，许多基于RNAi的策略已经开发出来用于治疗目的，包括siRNA和miRNA治疗，它们在临床试验中作为医疗干预药物显示出有希望的结果。截至2021年底，已有四种RNAi药物获得欧洲委员会(EC)和FDA的批准和授权，为RNAi治疗的有效性和安全性提供了概念验证。siRNA和miRNA治疗的作用机制及其候选药物的例子将在讨论中。 3.  siRNA治疗 2018年，美国FDA和欧洲药品管理局(EMA)批准了patisiran(ONPATTRO; Alnylam Pharmaceuticals)，这是一种siRNA药物，用于治疗由遗传性转甲状腺素(hATTR)淀粉样变性引起的多发性神经病变的成年患者。这种siRNA药物是首个获批的基于RNAi的治疗药物，标志着RNAi治疗的新时代。目前，已有四种siRNA药物获批上市，还有许多正在进行临床试验，如表2所示。 表2 已批准上市或正在进行/已完成2期和3期临床试验的代表性siRNA药物列表 siRNA属于dsRNA类分子。顾名思义，siRNA的长度很短，大约为18到25个核苷酸(nt)，每个链的3'端有无两个悬出的磷酸化碱基。siRNA治疗的机制利用了其自然能力，即通过Argonaute 2(Ago2)的催化域切割完全互补的mRNA的特定序列。设计成模仿Dicer切割的合成siRNA，称为"Dicer-ready" siRNA，可以被传递到感兴趣的细胞并直接被Ago2-RISC复合物识别和装载，使其作为药物特别有吸引力。通过设计所需效力和特异性的siRNA序列针对目标mRNA，可以沉默疾病引起的mRNA。 最新获批用于治疗ASCVD和HeFH的siRNA药物inclisiran(LEQVIO; Novartis)，是一种首创的N-乙酰半乳糖胺(GalNac)修饰的siRNA共轭物，显示出显著降低血浆胆固醇水平。动脉粥样硬化被描述为一种慢性动脉炎症性疾病，导致慢性斑块积聚阻塞血管，导致狭窄和组织缺氧，是ASCVD的主要原因。动脉粥样硬化的发病机制复杂; 然而，已知它与增加的低密度脂蛋白胆固醇(LDL-c)水平有关。Inclisiran针对前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/半胱氨酸蛋白酶9型(PCSK9)的mRNA; PCSK9是一种与LDL受体(LDLR)结合的丝氨酸蛋白酶，调节胆固醇和细胞质载脂蛋白B(ApoB)，发现它增加了血浆LDL浓度。通过抑制PCSK9的产生，降低的PCSK9 mRNA表达减少了LDLR的降解，并增加了LDL的摄取，以降低LDL-c的浓度。 2期和3期临床试验显示了inclisiran在ASCVD和HeFH患者中的有希望的结果。ORION-9试验(NCT标识符：NCT033907121)招募了482名HeFH患者; ORION-10试验(NCT标识符：NCT03399370)在1561名ASCVD患者中进行; ORION-11试验(NCT标识符：NCT03400800)招募了1617名ASCVD或其风险等价物患者。在这些3期试验中，患者在第1天、第90天、第270天和第450天接受了1.5毫升皮下注射，注射了284毫克的inclisiran(相当于300毫克的inclisiran钠)。 所有3期研究报告说已经达到了他们的主要疗效终点。上述三项随机临床试验(RCT)的汇总分析显示，与安慰剂组相比，每年两次剂量的LDL-c总体降低了51%，并将主要不良心血管事件率降低了24%。此外，发现inclisiran降低了总胆固醇、ApoB和非高密度脂蛋白胆固醇水平。因此，inclisiran通过每年两次剂量抑制肝脏PCSK9的产生，有效降低LDL-c水平，并维持这种效果。 除了inclisiran的疗效外，其安全性同样可接受。三项RCT的安全性概况与之前的研究一致，并且没有与异常肝功能、肌酸激酶水平和血小板计数相关。与安慰剂相比，注射部位不良事件在使用inclisiran时报告得更频繁。尽管inclisiran的表现显示出LDL-c和PSCK9水平的显著降低，但另一项三项研究的荟萃分析观察到，在心肌梗死风险方面，使用inclisiran的患者与安慰剂相比没有统计学上的显著差异。总体而言，inclisiran通过每年两次剂量抑制肝脏PCSK9的产生，显著降低LDL-c水平，同时展现出理想的安全性概况。inclisiran及其前驱siRNA药物的成功展示了siRNA导向的RNAi治疗的有希望的未来。这也是第一个用于治疗常见慢性病的小核酸药物。 4.  miRNA治疗 miRNA治疗作为一种治疗不同疾病的新型治疗剂，因其在发育中的作用而开始出现。如前所述，miRNA和siRNA都是能够通过转录后基因沉默靶向mRNA的小双链RNA分子。然而，它们的生物合成和作用机制不同。miRNA的生物合成始于核内，其基因转录受到严格调控，如图2所示。miRNA双链——由处理过的pri-miRNA产生的结果——与RISC结合形成miRISC，由成熟的miRNA引导进行目标识别。与siRNA不同，miRNA通过部分互补碱基配对与目标mRNA结合，抑制mRNA翻译而不是目标mRNA的裂解。 图2 miRNA生物生成和作用机制的示意图。前体miRNA（pre-miRNA）由位于细胞核中的初级miRNA（pri-miRNA）产生，它由末端环和不匹配组成。pre-miRNA进入细胞质，由Dicer酶切割末端环，生成miRNA双链。随后的过程与siRNA的生物生成相似，其中RISC与其RNA双链形成，并装载到Argonaute上进行链的选择。最后，成熟的miRNA准备就绪，可以与目标mRNA结合并促进其降解。 miRNA治疗的应用有两种方法：miRNA抑制和miRNA替代。miRNA抑制利用合成的单链RNA类似物，与目标miRNA的活性链互补，并作为miRNA拮抗剂(也称为anti-miRs或antagomiRs)抑制内源性miRNA，这在结构上类似于反义寡核苷酸。Anti-miRs最初由Krützfeldt等人描述，其中这些化学修饰的、胆固醇结合的、与目标miRNA互补的寡核苷酸的静脉注射降低了小鼠中miR-16、miR-122、miR-192和miR-194的水平。后一种方法采用合成miRNA(也称为miRNA模拟物)来模拟目标miRNA的功能，促使mRNA抑制。 miRNA模拟物可以像化学修饰的siRNA一样使用，具有与目标miRNA相同的导向链，它们被装载到RISC上以抑制下游内源性miRNA。由于其与典型miRNA的相似性，miRNA模拟物可能作为癌症管理的治疗剂，因为肿瘤抑制miRNA在癌症发展中的作用。然而，miRNA模拟剂的传递仍然存在挑战。 miRNA治疗的出现尚未转化为医疗干预的批准药物候选。迄今为止，有几种miRNA分子正在进行临床试验。然而，没有进入3期试验。目前，Regulus和Genzyme(Sanofi)开发的lademirsen(RG-012)正在进行2期试验的患者招募(NCT标识符：NCT02855268)。Lademirsen是一种anti-miR药物候选物，通过皮下给药来沉默Alport综合征患者的microRNA-21(miR-21)的功能。Alport综合征是一种X连锁遗传疾病，其特征是由胶原蛋白IV基因突变引起的慢性肾病。Gomez等人的临床前研究发现，化学修饰的anti-miR-21寡核苷酸与磷酸硫酯键和修饰的糖单元增强了对miR-21的亲和力，并改善了Alport神经病变小鼠模型的生存率。关于lademirsen的临床数据在本次审查时尚未发布。 除了lademirsen的临床开发外，MiRagen Therapeutics(现为Viridian Therapeutics)开发的remlarsen(MRG-201)已完成2期试验，用于治疗瘢痕疙瘩患者(NCT标识符：NCT03601052)。Remlarsen是一种microRNA-29(miR-29)模拟物，旨在治疗病理性纤维化。miR-29家族被发现在纤维化调节途径中发挥作用，其中miR-29的表达水平在纤维化疾病中较低。Remlarsen模拟miR-29以抑制纤维化的形成，如皮肤纤维化。Gallant-Behm等人的研究总结了在健康志愿者中皮下给药的remlarsen的1期临床数据，该药物候选物减少了切口皮肤伤口中的胶原蛋白表达和纤维母细胞增生的发展。此外，该候选物在1期研究中所有研究剂量中被认为是安全且耐受性良好的。1期结果表明，remlarsen可能是预防皮肤纤维化的有效的治疗；然而，尚未发布的2期临床结果在有瘢痕疙瘩病史的患者中可能具有更重大的临床意义。尽管miRNA药物有大量的临床前研究，但只有少数miRNA药物候选物进入临床开发，50%的miRNA药物在临床开发阶段经历了终止或暂停。在开发miRNA药物候选物时面临挑战，例如确定不同疾病特定的miRNA靶标及其精确传递，同时避免进入细胞时的降解。 RNAi基治疗，如siRNA和miRNA治疗，是一个不断发展的领域，对许多疾病具有巨大的治疗前景。RNAi药物面临一些挑战，如内体逃逸和传递到非肝脏和非肾脏组织。尽管目前只有四种siRNA治疗获得了监管批准，但预计不久的将来会有更多的siRNA治疗出现。RNAi治疗提供的广泛的临床应用和安全性概况加强了其潜力。 5.  反义寡核苷酸治疗 1978年，Zamecnik和Stephenson利用与Rous肉瘤病毒目标序列互补的13个核苷酸长的反义寡核苷酸（ASO），在体外展示了病毒复制的抑制，这为ASO作为治疗手段的潜力打开了大门。自这一发现以来，寡核苷酸药物的开发取得了显著进展。ASO是短的单链且高度修饰的核酸类似物，旨在针对特定序列的RNA进行降解。如图3所示，ASO有几种作用机制。目标RNA通常是核内的前体mRNA（pre-mRNA），ASO与多聚腺苷酸识别位点结合，利用核糖核酸酶（RNase）H阻止多聚腺苷酸化；ASO也可以结合到细胞质中mRNA的翻译起始位点，以抑制翻译。 图3 ASO作用机制的示意图。A. 细胞质中的ASO与目标RNA结合，导致RNase H切割，引发目标mRNA降解。B. 细胞质中的ASO也可以结合到mRNA上，阻止RNA结合蛋白复合体的结合，抑制目标mRNA的翻译。C. ASO可以进入细胞核，通过结合并阻断剪接位点或外显子/内含子序列来调节剪接，这些可以通过核糖核蛋白(RNP)复合体催化，以跳过或包含目标外显子。 ASO的化学修饰对其作为治疗药物的转化至关重要，这有助于提高稳定性、特异性并减少不良反应。通常，ASO在两个修饰的2'糖的两个侧翼区域之间具有磷酸硫（PS）键，形成骨架。PS部分保护寡核苷酸不受外切酶的降解并提高稳定性。这种设计呈现了一个中心PS寡核苷酸间隙，赋予了“gapmer”的名称，当RNA-DNA双链形成时，可以激活RNase H1对目标RNA进行切割。此外，磷酸二胺吗啉寡核苷酸（PMOs）的修饰也在ASO中广泛使用，其中六元的吗啉环取代了五元的核糖呋喃糖，骨架通过磷酸二胺连接。这种修饰也稳定了PMO对抗核酸酶的能力，但最小化了对互补目标RNA亲和力的降低。此外，另一种ASO的设计是RNase H独立或仅占用途径，其设计为空间上的障碍，以空间上抑制或防止目标RNA的翻译或剪接。一些ASO药物已经获得了FDA和EMA的批准，如表3所示。迄今为止，已有九种基于ASO的药物获得批准，用于商业用途，所有这些药物都治疗罕见疾病。然而，目前正在开发的ASO显示出ASO平台的应用正在向治疗其他常见病迈进。 表3 已批准上市或正在进行/已完成3期临床试验的代表性反义寡核苷酸药物列表 最近获批的基于ASO的药物casimersen获得了美国FDA的加速批准，用于治疗杜氏肌营养不良症（DMD）。DMD是一种X连锁隐性退行性神经肌肉疾病，由DMD基因中的移码或无义突变引起，该基因编码肌营养不良蛋白，这些突变抑制了功能性肌营养不良蛋白的产生。Casimersen利用基于PMO的策略，引起DMD基因中第45个外显子的跳跃，以绕过移码突变，允许内部截断但部分功能性肌营养不良蛋白的产生。在其1/2期研究中，PMO药物候选物在DMD患者中耐受性良好，适合进行第45个外显子跳跃。3期ESSENCE试验（NCT标识符：NCT02500381）的中期结果显示，所有可评估的接受casimersen的患者都显示出第45个外显子跳跃的增加；然而，由于其样本量小和正在进行的3期ESSENCE试验，很难确定casimersen改善运动功能的能力。开发ASO基药物以治疗神经肌肉疾病的剩余挑战是ASO在肌肉组织中的分布和摄取不足。除了罕见疾病，心血管疾病也是ASO的目标领域。与siRNA治疗类似，ASO药物候选物也在开发中，用于治疗心血管疾病。Pelacarsen是一种首创的GalNAc结合PS ASO，它针对载脂蛋白(a)（apo(a)）的mRNA，使用RNase H1依赖性切割。脂蛋白(a)（Lp(a)）是一种含有ApoB和apo(a)的LDL样脂蛋白，通过二硫键连接，已发现与心血管疾病风险增加有关。在其2期研究（NCT标识符：NCT03070782）中，对286名已建立心血管疾病和增加Lp(a)水平的患者，Tsimikas等人观察到通过皮下给药pelacarsen后，Lp(a)水平剂量依赖性降低了35至80%，并具有良好的安全性概况。鉴于pelacarsen在2期研究中取得了有希望的结果，心血管疾病的ASO药物候选物正在进行3期临床试验（NCT标识符：NCT04023552）。反义技术的进步推动了ASO的发展，证明了基于ASO的药物是一种多功能且安全的治疗方法。大量治疗更常见疾病的ASO候选物正处于晚期临床开发阶段，这将在不久的将来产生有意义的结果。ASO需要克服一些现有的挑战，以扩大其临床应用，例如有效靶向传递到其他组织并减少在其他器官的非靶向积累。随着新型传递平台的发展，ASO治疗更常见疾病的前景是乐观的。 6.  小激活RNA治疗 小双链RNA家族还包括小激活RNA（saRNA），首次由Li等人和Janowski等人报道。研究人员发现，这些21个核苷酸长的双链RNA靶向特定基因启动子，诱导了基因转录激活，并被命名为RNA激活（RNAa）。这两项研究描述了由小双链RNA介导的基因表达诱导的自然现象。Li等人描述了设计的21个核苷酸长的双链RNA与E-钙粘蛋白、p21和VEGF（血管内皮生长因子）基因的启动子区域互补，以序列特异性方式诱导基因表达，并依赖于Ago2，类似于RNAi。Janowski等人展示了通过互补双链RNA靶向其启动子区域诱导孕激素受体表达。此外，RNAa已被证明在多种哺乳动物细胞中保守。RNAi和RNAa在分子机制上存在相似之处，如图4所示。在RNAa中，saRNA被装载到Ago2蛋白中，形成RNA诱导的转录激活（RITA）复合物。RITA复合物由saRNA/Ago2复合物、RNA解旋酶A和与RNA聚合酶相关的蛋白CTR9组成，与RNA Pol II相互作用，触发转录启动和有效的延伸。RNAa在其分子动力学、基因组靶向能力和激活核内目标基因转录延伸方面具有独特性。 图4 saRNA作用机制的示意图。引入的saRNA被装载到Ago2蛋白中，随后Ago2切割链选择形成saRNA/Ago2复合物，并被转运到细胞核。活性的RITA复合物目标并结合到基因组目标位点的启动子区域，并与RHA和CTR9结合，通过RNA聚合酶II（RNAP II）介导的转录活性。 RNAa的发现以及saRNA的作用为选择性基因激活研究提供了新的见解。此外，saRNA本身作为上调基因表达的新型治疗方式，在具有抑制性转录或翻译活性的疾病中提供了新的可能性。开发saRNA作为治疗药物有几个优点，包括低免疫原性和位点特异性基因转录激活；然而，其缺点，如对RNase降解敏感性和非靶向效应，也是关键的挑战。目前，几个saRNA药物候选物正在开发中，如表4所示。尽管大多数候选物仍处于临床前阶段，但MiNA Therapeutics开发的MTL-CEBPA已经进入2期，与蛋白激酶抑制剂索拉非尼联合治疗乙型或丙型肝炎感染的晚期肝细胞癌（HCC）患者（NCT标识符：NCT04710641）。 表4 临床开发中的代表性小激活RNA治疗候选药物列表 MTL-CEBPA是一种首创的saRNA寡核苷酸，具有2′-O-Me修饰，由SMARTICLES脂质体纳米粒子封装，并通过静脉注射给药，治疗HCC患者。转录因子C/EBP-a是一种亮氨酸拉链蛋白，通过与髓系基因的启动子区域结合，启动并激活髓系基因表达，已知与肝细胞调节相关。在小鼠肿瘤模型中，研究人员发现髓系来源的抑制细胞中C/EBP-a的下调；C/EBP-a的上调抑制了肝癌小鼠模型中的肿瘤生长。MTL-CEBPA旨在通过诱导CEBPA基因的转录来上调C/EBP-a。在与肝硬化、非酒精性脂肪性肝炎或肝转移相关的HCC患者中进行的MTL-CEBPA首次人体1期研究结果显示，saRNA药物候选物的安全性概况可接受，建议的初始剂量为130 mg m−2，并通过其药效学分析显示了目标参与。然而，其疗效概况有限：在24名可评估MTL-CEBPA单药疗效的患者中，只有1名患者观察到客观的肿瘤反应和部分反应。在7名患者中使用酪氨酸激酶抑制剂（索拉非尼、lenvatinib或regorafenib）治疗，观察到3名完全反应，2名病情稳定，1名部分反应。1期研究得出结论，MTL-CEBPA对HCC的预处理有助于为酪氨酸激酶抑制剂，如索拉非尼的治疗效应创造更易接受的肿瘤微环境。 除了2期的MTL-CEBPA加索拉非尼外，MiNA Therapeutics还在开发MTL-CEBPA与PD1检查点抑制剂pembrolizumab联合治疗晚期实体瘤患者，已进入1期（NCT标识符：NCT04105335）。 尽管MTL-CEBPA的1期临床结果有希望，但这种新型寡核苷酸治疗方式仍存在不确定性和挑战。在目标序列识别方面仍缺乏明确的机制理解；当涉及额外的DNA元素时，目标基因组的可访问性也不清楚。 7.  环状RNA治疗 除了前述的RNA治疗方法外，另一种新兴的RNA治疗因其显著的研究进展而受到关注。环状RNA（circRNA）是一类具有环状结构的非编码RNA，它们没有末端结构，例如5'帽和3'聚(A)尾部，主要存在于真核细胞中。1976年，Sanger等人首次在类病毒中发现circRNA，现在通过RNA测序发现circRNA在众多物种中高度保守。由于circRNA的环状特性，它们的稳定性可能优于线性RNA，因为它们能够抵抗各种RNA外切酶的降解。此外，Wesselhoeft等人证明了外源性circRNA的蛋白表达比未修饰和修饰的线性RNA持续时间更长。因此，鉴于它们的稳定性和在真核细胞中表达时无需修饰，circRNA为医学应用提供了有希望的应用前景。 与大多数线性RNA不同，circRNA的生物生成涉及外显子的反向剪接，通过共价键将下游的“尾部”（3'）连接到上游的“头部”（5'）。这种共价键的形成使circRNA具有自然能力，能够抵抗主要的RNA降解途径。鉴于circRNA的异常稳定性，其调控和周转在管理其丰度方面非常重要。最近，更多的研究阐明了circRNA的周转机制，其中特定的circRNA，如CDR1as，可以通过完全互补的miRNA结合，然后通过Ago2介导的切割来降解；响应病毒感染的RNase L也可以降解circRNA；高度结构化的circRNA可以通过结构介导的RNA降解来调节。也就是说，需要额外的研究来确定circRNA的分子途径。 与其他RNA治疗方法一样，circRNA作为调节基因表达或携带模块化效应的潜在治疗方法而出现。合成的circRNA已被成功地证明在真核细胞中具有强大且稳定的翻译。Wesselhoeft等人设计了自剪接的前体RNA，使用间隔序列优化了圆环化效率，并能够圆环化长达5 kb的各种长度的RNA。经过工程化的高效液相色谱（HPLC）纯化的circRNA发现，与对照组相比，其翻译效率高达97%。此外，这种纯化的circRNA可以逃避细胞RNA传感器，如Toll样受体和RIG-I，同时提供比未纯化的circRNA更稳定的蛋白表达。此外，circRNA也可以与LNP配制而成，以实现在小鼠和恒河猴中有效的体内传递和翻译。最近，Qu等人展示了一种针对SARS-CoV-2的circRNA疫苗，编码了三聚体RBD的刺突蛋白，为动物提供了足够的保护。此外，他们还展示了使用合成circRNA表达SARS-CoV-2中和抗体和hACE2诱饵来中和假病毒颗粒。 最后，工程化circRNA的另一个应用是RNA编辑，其中循环ADAR招募RNA被用来招募本地ADAR1或ADAR2酶，将特定的腺苷碱基改变为肌苷，以执行精确的内源性RNA编辑。除了工程化circRNA外，circRNA治疗的另一种方法是利用基于circRNA的适体，其中一种名为Tornado（twister优化的RNA，用于持久过表达）的表达系统执行RNA圆环化，并产生能够结合蛋白的RNA适体。尽管在circRNA的研究和应用方面取得了显著进展，但大多数候选物目前仍处于发现阶段或临床前开发阶段。截至本文撰写之日，尚无circRNA治疗候选物进入临床试验。circRNA提供了几种有希望的医学和研究应用，从治疗药物和蛋白替代疗法到预防性疫苗。还应注意，circRNA的另一种潜在治疗方法是使用其他方法（如CRISPR-Cas9或siRNA）调节本native circRNA，以及使用本native circRNA进行生物标记或海绵治疗各种疾病，包括癌症、心血管疾病和神经系统疾病。最后，开发合成circRNA作为治疗剂仍存在许多挑战，例如控制circRNA的表达水平以避免由于其异常稳定性而持续过度表达，大规模生产高纯度的人工circRNA，以及circRNA的靶向传递。因此，进一步的研究伴随着临床研究可能解决和克服这些挑战。尽管如此，从线性RNA治疗方法（如基于mRNA的治疗方法）中获得的理解可以转化为基于circRNA的治疗方法，并为开发circRNA作为治疗剂提供宝贵的见解。 8.  基于信使RNA的治疗 与前面描述的RNA不同，信使RNA（mRNA）是一种生命的关键分子，是一种与DNA反义链互补的单链RNA。顾名思义，mRNA是细胞核中编码蛋白质的DNA翻译和细胞质中蛋白质生产之间的信使。鉴于mRNA在作为分子生物学中心法则中介的蛋白质生产中的关键作用，为这一类新药开发了几种治疗策略，包括基于mRNA的疫苗和mRNA替代疗法。Wolff等人首次描述了在动物中成功引入体外转录（IVT）mRNA。在过去十年中，该领域取得了显著进展，使mRNA治疗成为治疗传染病和癌症等疾病的有希望的模式。 基于mRNA的治疗方法具有许多优势，例如相对较低的插入突变风险，以及在功能性方面无需进入细胞核。此外，mRNA的短暂性质为在需要时更临时地表达蛋白质提供了好处。通过将化学修饰的mRNA引入细胞的细胞质中，可以表达遗传疾病中减少或抑制的蛋白质，以类似于天然蛋白质的方式。此外，这种mRNA也可以用作预防性疫苗，在这种情况下，mRNA可以编码特定的外来抗原，以引发针对传染病的保护性免疫；或者作为治疗性疫苗，以启动免疫系统刺激细胞介导的反应，以靶向肿瘤。 8.1.  mRNA疫苗 疫苗接种预防疾病，是防止传染病传播最有效的公共卫生干预措施之一。疫苗的广泛使用导致了许多传染病的完全根除，并减少了全世界脊髓灰质炎、麻疹和其他疾病的发病率。在过去的几个世纪里，疫苗学随着传统疫苗方法的出现而发展，如减毒活疫苗和灭活疫苗，为一系列疾病提供了持久的保护。尽管传统疫苗方法取得了进展，但在疫苗开发中仍存在挑战，以满足当前的医疗需求，如新出现的传染病病原体具有更好的能力来逃避适应性免疫反应或需求细胞免疫反应。此外，面对新出现的病毒，有必要采用能够快速开发和大规模生产并具有理想特性以广泛分发的疫苗方法。 还需要针对非传染病的疫苗，传统疫苗方法可能不适用。因此，开发更具适应性和效力的疫苗平台至关重要。最近在mRNA疫苗方面的进展，如mRNA序列工程、大规模生产开发和有效的传递方法，进一步加速了该疫苗平台的开发。 9.  预防性疫苗 如前所述，mRNA疫苗可用于预防性或治疗性目的。mRNA设计、制造和传递方法的最新进展使mRNA疫苗成为传统方法的有吸引力的替代品。对于预防性目的，合成的mRNA编码抗原被传递到细胞质中，一旦表达，就能在不穿越核膜屏障的情况下引发免疫反应，如图5所示。有两种主要类型的体外转录（IVT）mRNA，它们都模仿内源mRNA结构：非复制型mRNA和自增强型mRNA。前者结构包括5'帽、5'非翻译区（UTR）、编码抗原的开放阅读框、3'UTR和聚A尾部；自增强型mRNA还包含病毒复制机制，如复制酶基因，以表达依赖RNA的RNA聚合酶，这允许细胞内RNA扩增和充足的抗原表达。 图5 mRNA疫苗作用机制的示意图。mRNA疫苗包含脂质纳米颗粒(LNP)包裹的mRNA序列（绿色），通过肌肉注射进行注射。封装的mRNA编码感兴趣的抗原（蓝色），被肌肉细胞摄取并在细胞的细胞质中表达。内源性产生的抗原被分泌并运送到局部淋巴结，这刺激了细胞介导的免疫和体液免疫，如分化的B细胞分泌抗体（紫色）。mRNA疫苗方法通过主动免疫提供保护，而不包含实际病毒或细菌的部分。 从DNA模板转录的mRNA携带遗传信息，指导细胞内蛋白、膜蛋白和细胞外蛋白的翻译和生产。同样，mRNA疫苗的核心原则是传递编码信息，如抗原蛋白，以在细胞内翻译。从而有效激活细胞免疫和体液免疫，如图6所示。 图6 mRNA疫苗在抗原呈递细胞(APCs)中诱发免疫的示意图。APCs通过内吞作用摄取mRNA疫苗后，mRNA在核糖体中被翻译成抗原肽，并刺激细胞免疫反应。蛋白酶体复合物将抗原肽处理成更小的肽表位，这些表位可以通过主要组织相容性复合体(MHC)I类或II类呈现在细胞表面，具体取决于APC的类型。MHC I类呈现的表位被CD8+细胞毒性T细胞识别，以激活并杀死感染细胞。MHC II类呈现的表位被CD4+辅助T细胞识别，这些细胞促进B细胞的激活和中和抗体的产生，并通过吞噬细胞启动体液免疫反应。 除了与内源mRNA的相似性外，mRNA疫苗还能表达复杂的抗原，没有包装限制。利用基因序列信息的无细胞制造过程允许快速、可扩展的生产，以迅速应对任何新出现的传染病。经过多年的mRNA治疗研究和投资，解决了其药理学方面的许多挑战，如稳定性和效力。 随着2020年1月严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）大流行的爆发及其完整基因组的发布，对SARS-CoV-2的有效疫苗的开发竞赛开始了。结果，针对SARS-CoV-2开发了多种疫苗，包括几种基于RNA的疫苗，如表5所示。Moderna开发的Spikevax和Pfizer及BioNTech开发的Comirnaty迅速获得了FDA的紧急使用授权（EUA）和EMA的条件性市场授权（CMA）。目前，只有Comirnaty获得了FDA的批准。这些mRNA疫苗展示了它们高效力和理想的安全性概况，以前所未有的速度被开发和施用。此外，这些疫苗的开发验证了基于mRNA的平台，并激发了对mRNA治疗应用的巨大吸引力。 表5 针对COVID-19的基于RNA的疫苗在临床试验中或已批准的列表 2019冠状病毒病（COVID-19）是由SARS-CoV-2病毒引起的一种高度传染性的病毒感染性疾病，已导致全球健康危机，对世界造成了灾难性影响。为了应对全球大流行，辉瑞和BioNTech开发的Comirnaty（BNT162b2或Tozinameran）是首个获得FDA批准的用于预防性指示的mRNA疫苗。Comirnaty疫苗是一种修饰的核苷酸mRNA，编码SARS-CoV-2的刺突（S）蛋白，并由脂质纳米颗粒包裹，允许S抗原的表达。SARS-CoV-2 S蛋白是一种I型融合糖蛋白，是病毒的主要表面蛋白和中和抗体的主要靶标。S蛋白对病毒及其感染至关重要，因为它能够显著的结构重排，将病毒和宿主细胞的细胞膜融合，将其病毒基因组传递到目标宿主细胞进行感染。Comirnaty编码了SARS-CoV-2的前融合稳定和膜锚定的全长S蛋白，这保留了中和敏感表位，有效激发对S抗原的免疫反应 Comirnaty在临床试验中展现了高疫苗效力和良好的安全性。在其2/3期试验中，共有37,706名16岁以上的参与者接受了两次剂量为30微克的接种，两次接种间隔21天。在接种第一剂后，他们观察到对COVID-19有52%的疫苗效力，表明对疾病发作有初步保护作用；在接种第二剂后7天，对COVID-19的疫苗效力达到91%。总体而言，在这项2/3期试验中，所有参与者观察到95%的疫苗效力。此外，该研究还确认了其有利的安全性概况，其中反应原性事件，如疲劳、全身反应和淋巴结病，在出现几天内自行解决。在BNT162b2的早期1/2期研究中，评估了成年参与者的免疫原性，同样的剂量方案和时间表在参与者中引发了强劲的血清SARS-CoV-2中和滴度，在第二剂后7天，并在第二剂后一个月持续存在。最后，利用以色列大规模疫苗接种活动收集的数据进行的一项研究发现，接种两剂BNT162b2的3,159,136名参与者的结果显示与随机试验一致：预防有症状COVID-19的有效性为94%；预防住院的有效性为87%；预防严重COVID-19发作的有效性为92%。因此，mRNA疫苗BNT162b2证明了mRNA预防性疫苗作为一个有效的平台，以保护免受传染病的侵害，同时在反应原性和免疫原性之间显示出有利的平衡。 作为RNA病毒，SARS-CoV-2容易发生基因突变，使其进化，允许与野生型菌株相比具有不同属性的突变变种出现。对BNT162b2疫苗针对各种变种进行了多项初步研究，特别是对全球流行的高传染性B.1.617.2（Delta）和B.1.1.529（Omicron）变种。Tang等人通过匹配的测试阴性病例对照研究评估了BNT162b2针对Delta变种的实际效果，并得出结论，疫苗有效性降低至51.9%，防止有症状或无症状COVID-19。此外，Nemet等人的另一项初步实验室研究发现，两剂BNT162b2针对Delta和Omicron的中和效力显著降低，对这些变种的保护效力降低。需要注意的是，这些是初步结果，需要进一步研究以检查BNT162b2对特定变种的全面影响。也就是说，这些结果表明需要针对新出现的变种调整疫苗，这对于RNA基础的疫苗方法是可能的，因为它可以快速和可扩展地生产。除了COVID-19 mRNA疫苗外，还开发了针对其他传染病的mRNA疫苗，如呼吸道合胞病毒（RSV）、HIV-1、流感和寨卡病毒，这些疫苗已显示出有希望的临床前和临床结果。BNT162b2和mRNA-1273的批准和紧急授权为mRNA疫苗方法的安全性和效力提供了充分的证据，这加速了这种疫苗技术的发展，并为转变现代疫苗策略提供了乐观的前景。 10.  治疗性疫苗 除了mRNA预防性疫苗外，基于mRNA的疫苗还应用于癌症免疫疗法。mRNA癌症疫苗编码癌症抗原，如肿瘤相关自身抗原（TAA）或肿瘤特异性抗原（TSA），以诱导针对肿瘤的特异性T细胞反应，从而实现肿瘤排斥。基于mRNA的方法在癌症免疫疗法中具有优势，因为它具有抗原传递和表达能力，以及通过mRNA设计激活先天免疫的佐剂功能。基于mRNA的癌症疫苗有两种方法：mRNA树突状细胞（DC）疫苗和mRNA直接癌症疫苗。 基于mRNA的DC疫苗涉及将TAA加载到DCs中，因为DCs具有呈递TAA并启动针对肿瘤的强大效应反应的能力。DCs的体外操作需要从患者的血液中分离出的造血前体细胞，并将转染的细胞重新输注到患者体内，这提供了一种个性化的治疗策略，因为DCs是患者衍生的。然而，这个过程也可能是昂贵和劳动密集型的，同时增加了一层复杂性。顾名思义，后一种方法涉及直接注射编码肿瘤抗原的mRNA，可以被局部细胞摄取以进行抗原呈递。目前，有几个癌症疫苗候选物正在进行临床开发，如表6所示。 表6 目前正在进行或已完成2期或3期临床试验的代表性基于RNA的癌症疫苗列表 在Kyte等人（NCT标识符：NCT01278940）的1/2期研究中，用自体肿瘤mRNA转染的黑色素瘤DC疫苗单独或与佐剂白介素-2（IL-2）一起使用，报告说在31名晚期黑色素瘤患者中有16名患者的肿瘤特异性T细胞免疫反应与生存期改善相关，并且安全性可接受。在另一项2期研究（NCT标识符：NCT03480152）中，一种编码20种不同新抗原的mRNA直接癌症疫苗，由自体癌症表达，并与LNP配制而成，被用于四名转移性胃肠道癌症患者。这种疫苗候选物被发现是安全的，并且诱导了针对预测新表位的突变特异性T细胞反应，使用肿瘤浸润性淋巴细胞；然而，由于患者数量有限，其临床疗效尚待确定。鉴于IVT mRNA技术的安全性、稳健性和相对较低的成本，使用mRNA疫苗的癌症免疫疗法的个性化是可能的，伴随着有希望的临床前数据和正在进行的临床试验。 除了预防性和治疗性mRNA疫苗外，LNP-mRNA技术最近在小鼠模型中用于短暂的抗纤维化嵌合抗原受体（CAR）T治疗。Rurik等人证明，含有修饰核苷的mRNA编码针对成纤维细胞激活蛋白（FAP）的CARs，与CD5靶向LNPs配制而成，也称为靶向抗体/LNP-mRNA载体，可以定向传递到CD5细胞以表达功能性CAR T细胞。FAP是在活跃的组织重塑和急性心肌梗死后损伤中表达的细胞表面糖蛋白。鉴于FAP在心脏成纤维细胞中的强烈表达，它是激活的心脏成纤维细胞的可行靶标和标记。在他们的一系列概念验证实验中，Rurik等人成功证明了封装在靶向LNPs中的修饰mRNA能够传递到特定细胞类型，在体内产生功能性工程化T细胞。此外，这种传递产生了短暂有效的抗纤维化CAR T细胞，表现出肌动蛋白吞噬作用。在高血压小鼠心脏损伤和纤维化模型中，58%的CD3+ T细胞是FAPCAR+，表明在CD5/LNP-FAPCAR注射的小鼠中成功转导了FAPCAR mRNA。最后，用CD5/LNP-FAPCAR治疗的小鼠显示出改善的心脏功能和减少的间质纤维化。通过针对特定细胞类型的LNPs，修饰mRNA治疗可能会扩大其应用范围，创造出一种可扩展且相对便宜的通用治疗的可能性，具有工程化免疫功能的能力。 10.1.  mRNA作为蛋白质替代疗法 体外转录（IVT）mRNA的另一个直接应用是蛋白质替代疗法，其中IVT mRNA编码所需的蛋白质，并在目标细胞中表达以实现治疗目的。因此，以蛋白质表达不足或异常蛋白质产生为特征的疾病，如遗传性疾病，可能从蛋白质替代疗法中受益。基于mRNA的蛋白质替代疗法的优势在于其能够表达几乎所有的蛋白质，包括分泌蛋白、细胞内蛋白和跨膜蛋白。蛋白质替代疗法的临床试验主要集中在遗传性代谢性疾病上，如表7所示。 表7 临床开发中的代表性基于mRNA的蛋白质替代疗法列表 在蛋白质替代疗法的临床研究中，由于其特征是必需酶的缺乏，导致酶的缺乏导致过量的代谢产物，从而产生临床表现，因此遗传性代谢性疾病是研究的重点。上述候选药物的临床数据尚未公布。因此，需要进一步证据来证明蛋白质替代疗法的安全性和有效性。除了代谢性疾病外，蛋白质替代治疗方法也被应用于血液疾病，如血友病A和B。Ramaswamy等人使用LNP配方的mRNA编码人凝血因子IX（hFIX）治疗血友病B的FIX缺陷小鼠模型，证明了他们的传递平台LUNAR在小鼠模型中的安全性和有效性；以及传递到肝脏的FIX蛋白的治疗产生。对于这种模式，仍然存在挑战，如传递方法。目前，mRNA蛋白质替代疗法的传递方法主要针对肝脏、肺和心脏。因此，需要进一步开发传递策略以传递到其他器官。 除了传递编码缺失或异常蛋白质的mRNA外，还开发了与单导向RNA（sgRNA）和编码CRISPR相关蛋白9（Cas9）的mRNA配伍的疗法。Cas9是一种相关的内切核酸酶，能够进行双链DNA断裂，并通过与导向RNA结合形成核糖核蛋白复合物。通过传递与目标基因互补的特定sgRNA以及Cas9 mRNA，可以通过Cas9对目标基因进行切割以实现基因沉默，从而实现体内基因编辑。多个药物候选物正在使用基于RNA的CRISPR-Cas9基因编辑策略进行临床开发，以治疗遗传性疾病。Intellia Therapeutics开发的NTLA-2001是一种基于CRISPR-Cas9的体内基因编辑疗法，目前正在1期临床试验（NCT标识符：NCT04601051）中用于治疗转甲状腺素（ATTR）淀粉样变性——一种罕见的、进行性的疾病，其特征是异常的转甲状腺素（TTR）蛋白的错误折叠积累。候选药物NTLA-2001由与目标TTR基因互补的sgRNA和Cas9蛋白的修饰mRNA序列配制而成，通过LNP传递到肝脏。临床前研究和首次人体中期临床数据分析显示，在动物模型和遗传性ATTR患者中血清TTR浓度降低，证明了TTR的持久靶向敲除。这些研究为体内基于RNA的CRISPR-Cas9基因编辑作为有希望的治疗策略提供了临床证据和概念验证。 在过去几年中，mRNA疫苗领域取得了关键进展，证实了基于mRNA的治疗的可行性。制造方法和传递材料的进步加速了mRNA治疗的发展。尽管基于mRNA的治疗的临床数据令人鼓舞，但仍需要针对特定细胞类型靶向的传递材料的挑战，以及需要进一步深入理解mRNA治疗的机制，以最小化不良事件并提高效力。 11.  结论和未来展望 RNA治疗学是一个迅速发展的领域，正在经历快速扩张。目前已有超过十五种基于RNA的治疗方法获得监管批准，更多的研究进入后期临床开发阶段。这个强大且多功能的平台能够解决当前治疗方法无法满足的许多医疗需求。由于RNA治疗的基本挑战，如传递、稳定性和免疫原性已得到解决，RNA药物的开发正在迅速增长。仍然有改进和优化的空间，如特定细胞类型的传递、提高内体逃逸和增强效力。 然而，RNA活性和传递平台的持续发现和增加的机制理解为RNA治疗的前景提供了乐观的展望。GalNAc-siRNAs和mRNA疫苗的最新成功，以及CRISPR的潜力，预示着RNA治疗学新时代的到来。

引言 近年来，免疫检查点抑制剂（ICIs）已成为治疗微卫星高度不稳定（MSI-H）或错配修复缺陷（dMMR）结直肠癌的重要手段，为晚期患者带来了新的希望。然而，大多数转移性结直肠癌患者是微卫星稳定性（MSS）或高效错配修复（pMMR）类型，因此无法从这种治疗中获益。 “病毒拟态”机制是指模拟病毒感染的细胞过程，通过激活机体的抗病毒天然免疫反应，以增强抗肿瘤能力。这一机制通常涉及肿瘤细胞内源性的双链RNA（dsRNA）及其感应器。感应器识别异常的dsRNA信号后，诱导干扰素（IFN）反应，从而促进抗肿瘤免疫，提升ICI治疗效果。 “病毒拟态”机制的运行依赖于细胞质中的模式识别受体（PRR），如RIG-I样受体（RLR），这些受体在检测双链RNA（dsRNA）时发挥关键作用。RLRs识别dsRNA后可迅速触发强效干扰素反应，不仅增强T细胞的浸润，还提升了ICI治疗的成功率。因此，维持稳定的肿瘤细胞内源性dsRNA水平可能成为癌症特异性治疗的靶点，以有效激活干扰素反应并提高肿瘤细胞的免疫原性。 2024年10月4日，中山大学附属肿瘤医院廖雯婷团队，联合黄慧琳及宋立兵团队，在Science Immunology 杂志在线发表了题为Oncogenic KRAS drives immunosuppression of colorectal cancer by impairing DDX60-mediated dsRNA accumulation and viral mimicry的研究论文。本研究揭示了癌基因KRAS如何破坏结直肠癌细胞内源性dsRNA稳态，扰乱病毒拟态效应，从而推动结直肠癌的免疫逃逸机制。这一发现为克服结直肠癌免疫治疗耐药性提供了新的思路。 癌基因KRAS的激活性突变在超过40%的结直肠癌中出现，是促进肿瘤免疫逃逸的关键因素。在之前发表于Cancer Cell杂志的研究（Cancer Cell. 2019 Apr 15;35(4):559-572.e7）中，廖雯婷团队利用转移性结直肠癌转基因小鼠模型（iKAP）揭示了KRAS突变通过抑制结直肠癌细胞的干扰素（IFN）反应来诱导免疫抑制微环境，从而导致免疫检查点耐药。在该研究的延续性工作中，团队继续利用iKAP模型深入探讨了KRAS抑制IFN反应的机制。iKAP模型中具有可诱导的Kras^G12D突变，并通过强力霉素（Dox）实现对Apc和Trp53基因的条件性失活。 研究人员采用多种经典双链RNA（dsRNA）检测方法，包括J2-免疫荧光染色、J2-免疫共沉淀结合dsRNA免疫印迹、J2抗体免疫共沉淀结合dsRNA RT-PCR，以及dsRNA提取结合RT-PCR，发现KRAS突变显著降低了结直肠癌细胞内源性dsRNA的丰度，而抑制KRAS突变活性则显著增加了细胞内dsRNA的水平。这些dsRNA主要来源于基因组的转座元件（TE）、内源性逆转录病毒（ERVs）以及线粒体基因。进一步研究表明，KRAS突变并不影响这些基因序列的转录，而是通过降低转录后环节中dsRNA的半衰期来实现降低dsRNA丰度的。细胞内dsRNA可被RNA诱导的沉默复合体（RNA-Induced Silencing Complex，RISC）降解。本文中，研究人员发现KRAS突变不改变RISC 关键组分DICER和AGO2的表达；敲除AGO2能显著上调KRAS突变细胞中dsRNA总量，提示KRAS突变可能通过增强RISC介导的dsRNA降解来降低肿瘤细胞内的dsRNA水平。 此外，研究人员还发现KRAS突变的结直肠癌细胞对dsRNA的响应能力大大降低。这种能力的减弱意味着这些细胞无法有效启动抗病毒免疫反应，其结果是干扰素刺激基因（ISGs）的表达及MHC-I分子的抗原提呈功能受到抑制。通过使用合成的dsRNA类似物poly (I:C)进行实验，研究人员观察到，在KRAS野生型细胞中，poly (I:C)能够显著提升IFN反应和MHC-I分子的抗原提呈功能。然而，在KRAS^G12D突变型结直肠癌细胞中，这些反应被削弱。当RIG-I样受体（RLRs）如RIG-I和MDA5识别并结合胞内病毒RNA后，这些受体的信号被传递到MAVS，导致MAVS在线粒体膜上发生聚集。在KRAS野生型细胞中，poly (I:C)处理可引起显著的MAVs聚集；而在KRAS突变的细胞中，poly (I:C)处理引起的MAVs聚集显著低于KRAS野生型细胞。这些实验结果表明KRAS突变影响RLRs/MAVS通路对dsRNA的响应能力，这一过程对于有效的免疫应答至关重要。 RNA结合蛋白（RNA-binding proteins, RBPs）在保护RNA不被降解方面发挥着关键作用。它们通过多种机制影响RNA的命运，从而在细胞内的RNA稳态和基因表达调控中起核心作用。研究人员猜想，KRAS突变可能通过影响某种关键的RBP来调控dsRNA的稳定性。通过整合结直肠癌遗传学特征和表达谱分析，DDX60被确定为可能参与维持 dsRNA 稳定性的候选 RBP。结直肠癌中DDX60具有5%左右的缺失突变，且与KRAS突变呈互斥关系。KRAS突变显著抑制DDX60的表达。团队先前的研究（Cancer Cell. 2019 Apr 15;35(4):559-572.e7）数据表明，KRAS突变型结直肠癌中，JAK–STAT3信号通路显著下调。STAT3 是IFN-α/β反应和抗病毒基因表达的关键转录因子，其活性依赖于GSK3β介导的磷酸化。由于KRAS/AKT信号能够通过磷酸化抑制GSK3β的激酶活性，研究人员推测，KRAS突变可能通过AKT-GSK3β-STAT3通路减少DDX60的表达。通过Western Blotting实验，证实抑制KRAS活性或使用AKT抑制剂能显著上调p-STAT3（Tyr705）和DDX60的表达。进一步通过CUT&Tag技术，明确了STAT3对DDX60的转录激活作用。这些数据证实，KRAS突变通过激活AKT-GSK3β通路，降低STAT3磷酸化水平，从而下调DDX60的表达。 DDX60 具有 dsRNA 结合能力和 RNA 解旋酶活性，但其K791A位点突变会削弱这些活性。然而，DDX60 对 dsRNA 稳定性的影响尚不明确。为探索DDX60在dsRNA稳定性中的作用，研究人员在KRAS突变型细胞中，构建了稳定过表达DDX60全长、解旋酶结构域及其突变体的细胞株，发现过表达DDX60全长及其解旋酶结构域能显著恢复KRAS突变细胞中dsRNA丰度，并延长dsRNA半衰期，表明了DDX60在结直肠癌细胞中通过增强dsRNA稳定性来维持其稳态的关键作用。进一步通过RNA免疫共沉淀（RNA Immunoprecipitation）实验证明，DDX60可以与DICER竞争性结合dsRNA，从而避免dsRNA被RISC降解。 接下来，研究人员探讨了DDX60在调控抗肿瘤免疫中的作用，发现过表达DDX60在KRAS突变细胞中显著激活了内源性IFN响应，促进MHC-I上调，并增强了卵清蛋白（OVA）257–264（SIINFEKL）肽的呈递能力。此外，过表达DDX60显著抑制了C57BL/6J小鼠中MC38K肿瘤的生长，然而在裸鼠中无此效果。同时，过表达DDX60增加了小鼠肿瘤中T细胞和CD8+ T细胞的浸润。相反，敲低DDX60则消除了IFN响应和抗原呈递能力，并在体内导致MC38肿瘤生长增加，同时减少了肿瘤内T细胞浸润。这些结果表明，DDX60通过诱导病毒拟态效应促进抗肿瘤免疫浸润，其生物学作用依赖于功能性免疫系统。 DDX60在诱导病毒拟态效应方面的作用提示其可能与免疫检查点抑制剂协同增效。在抗PD-1和抗CTLA-4治疗研究中，过表达全长DDX60或其解旋酶域的MC38K肿瘤相较于对照组表现出明显的生长减缓。鉴于解旋酶结构域在dsRNA积累和病毒模拟上的效果与全长DDX60相似，研究人员设计了一种治疗性重组腺相关病毒9（AAV9）载体，携带DDX60解旋酶结构域，称为AAV-解旋酶。AAV-解旋酶与抗PD-1或抗CTLA-4治疗联合使用，显著抑制肿瘤生长并提高生存率。这些实验结果表明，DDX60的表达可增强过表达KRAS^G12D的结直肠癌细胞对免疫检查点抑制剂的反应。 此外，为了验证这些效应在人类结直肠癌中的适用性，研究人员使用了肿瘤细胞和外周血单核细胞（PBMC）与活化T细胞的共培养系统。他们使用了MSI-H细胞系HCT116和MSS细胞系SW620，二者均具有致癌KRAS突变，且DDX60低表达。实验结果显示，DDX60的过表达或KRAS的敲低均显著增强了两种细胞系对抗PD-1疗法的反应。这表明，过表达DDX60或使用KRAS抑制剂能增强MSS和MSI-H 结直肠癌对免疫检查点疗法的敏感性。 研究人员为了验证这些效应在人类结直肠癌中的适用性，构建了肿瘤细胞和外周血单核细胞（PBMC）以及活化T细胞的共培养系统，使用了MSI-H类型细胞HCT116和MSS类型细胞SW620，这两者均具有KRAS突变且DDX60表达较低。实验结果显示，DDX60的过表达或KRAS的敲低显著提高了两种细胞系对抗PD-1疗法的响应。这表明，过表达DDX60或使用KRAS抑制剂可以增强MSS和MSI-H结直肠癌对免疫检查点疗法的敏感性。 综上所述，这项研究表明 KRAS 通过降低 DDX60 表达来破坏 dsRNA 稳态和病毒拟态效应，从而驱动结直肠癌免疫逃逸。KRAS 参与 AKT-GSK3β 信号传导以抑制 STAT3 磷酸化，从而抑制由 p-STAT3 介导的 DDX60 转录。靶向 KRAS或者补充DDX60可以通过激活病毒拟态和天然免疫来释放治疗优势，从而增强免疫检查点治疗的效果。 参考文献 https://www-science-org.libproxy1.nus.edu.sg/doi/10.1126/sciimmunol.ado8758 责编|探索君 排版|探索君 文章来源|“BioArt” End 往期精选 围观 一文读透细胞死亡(Cell Death) | 24年Cell重磅综述（长文收藏版） 热文 Cell | 是什么决定了细胞的大小？ 热文 Nature | 2024年值得关注的七项技术 热文 Nature | 自身免疫性疾病能被治愈吗？科学家们终于看到了希望 热文 CRISPR技术进化史 | 24年Cell综述

摘要：由于线性信使RNA（mRNA）新型冠状病毒病2019（COVID-19）疫苗的成功，全球的生物制药公司和研究团队已经开始尝试开发更稳定的环状RNA（circRNA）疫苗，并取得了一些初步成果。本综述旨在总结环状RNA研究的关键发现和重要进展，环状RNA在体内的代谢和生物学功能，以及环状RNA疫苗的研究进展和生产过程。此外，本文还强调了环状RNA疫苗质量控制的考虑因素，并概述了环状RNA疫苗开发和质量控制中的主要挑战和问题解决策略，以期为环状RNA疫苗相关研究提供参考。 1.引言 2019年新型冠状病毒病（COVID-19）疫苗是目前通过多种技术途径快速成功开发并应用的首批疫苗，这些疫苗包括灭活疫苗、重组蛋白疫苗、腺病毒载体疫苗和基于mRNA的疫苗，其中COVID-19 mRNA疫苗是首批获批的mRNA疫苗。目前，大约有40种mRNA疫苗正在进行临床试验，其中2种已经上市。全球已经接种了超过40亿剂mRNA疫苗，约占总接种量的三分之一。mRNA疫苗不仅能够诱导高水平的体液免疫，还能引发相对较强的细胞免疫反应。由于mRNA疫苗技术的快速性和可编辑性，它适合作为应对新出现传染病的疫苗平台。所有上述COVID-19 mRNA疫苗都具有线性结构。目前，改良的线性mRNA分子仍然稳定性较差，这限制了它们能够表达的蛋白质量。除了线性RNA，自然界中也存在环状RNA（circRNA）。这些RNA具有由共价键形成的单链闭环结构，与线性RNA相比，在体内具有更高的稳定性。circRNA也能够编码蛋白质并进行翻译，这为疫苗开发提供了潜力。COVID-19 mRNA疫苗的成功开发和应用促使研究人员探索使用circRNA开发更稳定的核酸基COVID-19疫苗。最近，几个研究团队成功开发了COVID-19 circRNA疫苗，这些疫苗不仅具有线性mRNA疫苗的优势，而且在一系列温度下具有更高的稳定性和比自配方线性mRNA疫苗更长的蛋白质表达持续时间。因此，circRNA疫苗的低剂量可能足以引发强烈的免疫反应。研究人员尝试利用circRNA的稳定性，通过将表达CAR的circRNA引入T细胞，直接合成嵌合抗原受体（CAR）T细胞，以避免通过T细胞分离后再进行工程改造的繁琐过程。因此，一些研究人员认为circRNA疫苗可能成为应对未来新出现的主要传染病或其他常见病毒疾病（如乙型肝炎病毒（HBV）、人类疱疹病毒（HHV）、埃博拉病毒（EBV）、流感A病毒（IAV）和人类乳头瘤病毒（HPV））的强大工具，并且可能被开发成肿瘤治疗疫苗。因此，全球的生物制药公司和研究团队已经将相当大的关注和研究努力投入到circRNA疫苗的开发中。在这篇综述中，我们旨在总结circRNA疫苗的研究进展和配方过程，并突出RNA疫苗质量控制中的考虑因素和突出问题，为未来的circRNA疫苗相关研究提供参考。 2.circRNA的发现 1971年，研究人员在研究马铃薯纺锤形块茎病时发现了可以侵入植物并导致植物死亡的类病毒分子，并将其命名为“viroids”。与病毒不同，viroids是单分子且没有蛋白质外壳。Sanger等人在1976年首次将viroids描述为单链共价闭合的circRNA分子。1979年，Hsu和Coca-Prados使用电子显微镜在HeLa细胞中发现了没有自由末端的circRNA分子的存在；这是在真核细胞中首次报道circRNA分子的观察。1985年聚合酶链反应（PCR）技术的发明导致了对线性RNA研究兴趣的激增。因此，对circRNA的关注很少，一些研究人员认为circRNA仅仅是线性RNA的副产品；这导致了circRNA相关研究的停滞。在1990年代初，零星的研究识别并表征了从内源性RNA产生的circRNA。发表的报告表明，非聚腺苷酸化的RNA具有混合外显子，由非典型剪接产生的（“混合外显子”）是共价闭合的环状RNA，如EST-1基因转录本的特定环化。在接下来的几年中，一些研究提出了这些分子可能产生的机制，例如倒置重复序列对于Sry环化的假设。还可以从大鼠细胞色素P450 2C24基因、人类细胞色素P450基因等产生额外的环状RNA。2006年，研究人员在黑腹果蝇中发现了环状转录本的存在。从2010年左右开始，随着RNA测序和生物信息学技术的快速发展，结合使用这些技术的研究揭示了不同生物体中存在多样且高度保守的circRNA，如人类、小鼠、植物、隐球菌、斑马鱼和原生动物，这导致了circRNA研究的爆炸性增长。2015年，首次报道了能够编码蛋白质并进行翻译的circRNA。从2017年开始，现代分子生物学实验技术的广泛应用使通过RNA测序和生物信息学研究先前发现的各种circRNA得到了验证。2018年，研究人员成功合成了能够表达蛋白质的circRNA，这可能被应用于疫苗开发。2022年，一些研究团队开始了COVID-19 circRNA疫苗和肿瘤或遗传疾病治疗疫苗的研究（图1）。随着circRNA研究深度的不断增加，circRNA被发现在某些生理和病理条件下发挥重要作用，并且能够表达蛋白质，这可能使它们被纳入疫苗。因此，circRNA逐渐成为分子生物学和其他相关研究领域中的重要研究领域。 图 1: 环状RNA研究的关键发现和进展 3. 体内自然circRNA的代谢和功能 3.1.circRNA的合成 迄今为止，RNA通过反向剪接和外显子跳跃在体内被认识到是环化的，其中反向剪接可能更为普遍，因为它比外显子跳跃更频繁地被观察到。反向剪接的RNA环化是指在RNA出现断裂点后，下游5'剪接供体位点与上游3'剪接受体位点的反向连接。此后，某些内含子序列经历选择性剪接，最终导致circRNA的生成。目前存在两种广泛接受的RNA环化模型：套索驱动的环化和直接反向剪接环化。套索驱动的环化涉及外显子跳跃事件和内含子从去分支过程中逃逸，而直接反向剪接环化涉及顺式元件介导和反式因子介导的事件。外显子跳跃的RNA环化是指在内含子与外显子一起剪接后发生环化的过程。发表的研究表明，不同的断裂点位置有助于circRNA的多样性，不同类型的circRNA通过外显子、内含子、基因间区或非转录区的随机组合通过反向剪接生成。根据序列组合的差异，circRNA通常被分为四种主要类型：(1) 外显子circRNA只包含外显子，占所有已鉴定circRNA的80%以上，可以通过套索驱动的环化或直接反向剪接环化生成。两个相邻内含子之间的碱基配对，这些内含子包含反向互补序列，将下游5'ss和上游3'ss聚集在一起，促进反向剪接反应产生环状RNA。（图2A）；(2) 外显子-内含子circRNA，由外显子跳跃环化生成，包含核心外显子的非侧翼内含子序列，这些序列通常应该被剪接掉；因此，外显子-内含子circRNA被称为eiciRNA或保留内含子circRNA（图2B）；(3) 内含子circRNA也是由内含子从套索衍生的去分支机制中逃逸产生的，依赖于前mRNA的5'剪接位点附近的共识鸟嘌呤（G）和尿嘧啶（U）富集域以及断裂点附近的胞嘧啶（C）富集域。有趣的是，GU富集域可以保护C富集域免于分支或降解，从而生成稳定的circRNA或所谓的内含子衍生circRNA（图2C）；以及(4) tRNA内含子circRNA。对于tRNA内含子circRNA，前tRNA被tRNA剪接内切核酸酶（TSEN）复合体切割，切割产生的外显子和内含子被连接形成tRNA内含子circRNA（图2D）。 图 2: 体内和体外（人工）RNA环化方法。(A–D) 体内RNA环化方法：(A) 外显子环状RNA；(B) 外显子-内含子环状RNA；(C) 内含子环状RNA；(D) tRNA内含子环状RNA；(E, F) 体外（人工）RNA环化方法：(E) 化学合成；(F) T4 RNA连接酶连接；(G) 内含子自剪接。BrCN，溴化氰；EDC，1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺；GOI，感兴趣的基因。 根据发表的研究，序列特征、蛋白质调节因子和转录阶段等因素可能影响反向剪接环化的效率。实际上，除了顺式元件，许多RNA结合蛋白（RBPs）被发现可以积极调节环状RNA的生物生成。较长的侧翼内含子元素包含几个互补或重复序列可能有助于提高环化效率。不同的剪接相关蛋白也对环化效率产生不同的影响。例如，作用于RNA的腺苷脱氨酶1（ADAR1）抑制RNA环化。 3.2.circRNA的生物学功能 根据几项研究，circRNA存在于不同物种的各种组织类型中，并具有多种生物学功能，如调节基因转录和蛋白质编码。circRNA还在调节生理学以及各种疾病的发生、进展和结果中发挥重要作用。 3.2.1.基因转录的调节 研究人员报告称，circRNA可以与宿主基因的DNA结合，形成称为R-环的DNA:RNA杂合体，影响DNA复制、转录和后损伤修复。例如，circSEP3（来自SEPALLATA3的外显子6）通过与cSMARCA5（来自SMARCA5的外显子15）形成R-环导致转录终止。circRHOT1招募Tat相互作用蛋白60 kDa（TIP60）到核受体亚家族2组F成员6（NR2F6）启动子，从而通过诱导原癌基因表达促进肝细胞癌的细胞增殖、迁移和侵袭。 3.2.2.“海绵”效应 自然circRNA对微小RNA（miRNAs）表现出“海绵”效应。例如，circHIPK3（来自homeodomain interacting protein kinase 3 (HIPK3)的外显子2）可以结合miR-124并抑制其活性，从而阻止miR-124抑制人类细胞增殖；circHIPK2通过靶向miR124-2HG调节星形胶质细胞的激活。研究表明，circRNA可能对蛋白质表现出海绵效应。Y-box结合蛋白-1（Ybx1）是许多基因的转录因子，其显著的过度表达与各种常见肿瘤的不良预后和复发有关。据研究人员称，circNfix可以结合Ybx1和E3泛素连接酶Nedd4l，促进它们的相互作用并诱导Ybx1降解。 3.2.3.通过复合物形成激活蛋白 许多类型的分子参与宿主生物体内的宿主-病毒相互作用的生物过程。先前的研究发现，在感染宿主细胞后，Epstein-Barr病毒（EBV）产生circRNA circBART2.2，该RNA可以被细胞的RIG-I受体识别。此后，发生RIG-I受体激活，通过随后激活下游的干扰素信号通路实现抗病毒效果。另一项研究发现，在N6-甲基腺苷（m6A）甲基化后，circRNA不被RIG-I受体识别，这是病毒逃避宿主免疫反应的机制之一。 3.2.4.蛋白质翻译 2015年，在果蝇中首次发现了circRNA编码和翻译蛋白质的能力。这一关键发现为后续circRNA疫苗的开发提供了理论基础。一些研究报告称，circRNA通过内部核糖体进入位点（IRES）介导或m6A诱导的核糖体结合位点（MIRES）介导的翻译启动，而不是5'帽子依赖的翻译启动，来翻译其编码的蛋白质。IRES是RNA元素，它们将核糖体招募到mRNA的内部区域以启动翻译，并且可以通过招募不同的反式作用因子来促进核糖体组装并启动翻译。IRES被许多类型的circRNA用于翻译，包括circMbl和circFGFR1。MIRES介导的翻译启动涉及RNA中一个或多个位点发生m6A甲基化，这使得eIF4G2的招募以启动翻译。例如，由人乳头瘤病毒（HPVs）编码并定位于细胞质中的circE7含有m6A修饰并执行E7致癌蛋白的翻译。另一项研究报告称，m6A修饰增强了IRES介导的circZNF609翻译效率。 3.3.circRNA降解 circRNA的稳定闭环结构使它们免受外切核酸酶的切割。因此，circRNA不容易通过常规RNA降解途径降解，并且短期内抵抗外切核酸酶RNase R的切割。它比线性RNA更稳定，这是circRNA疫苗开发的自然优势。然而，circRNA仍然可以通过某些方式降解，包括内切核酸酶。在先前的研究中，双链RNA（dsRNA）或多肌苷酸：多胞苷酸（poly (I:C)）被发现在体内激活内切核酸酶RNase L，导致circRNA的全局降解。ATP依赖的RNA解旋酶，上游框移1（UPF1），和内切核酸酶G3BP1可以识别具有复杂二级结构的circRNA并诱导其降解。circRNA可能经历m6A修饰，被m6A阅读蛋白HRSP12识别。因此，HRSP12可能与RNase P/MRP内切核酸酶复合体相互作用以诱导circRNA降解。值得注意的是，circRNA可以通过内切核酸酶RNase H通过特定引物和探针靶向降解。miR-671与circRNA CDR1as序列的互补结合也诱导AGO2介导的circRNA降解。 4.circRNA疫苗的研究进展 2015年之前，研究人员仅在生物体中观察到非编码蛋白质的circRNA的存在。2015年在果蝇中发现能够编码和翻译蛋白质的circRNA，为circRNA疫苗的研究和开发提供了理论基础。随着circRNA相关研究深度的不断增加，出现了三种人工制备circRNA的方法：(1) 化学合成：溴化氰（BrCN）或1-乙基-3-（3-二甲氨基丙基）碳二亚胺（EDC）诱导线性RNA的5'末端磷酸和3'末端羟基形成共价键以产生circRNA。在环化反应过程中发生副反应，如形成2'-5'磷酸二酯键，是这种方法的限制。此外，RNA寡核苷酸中的化学键通常不如DNA类似物中的化学键有效（图2E）；(2) T4 RNA连接酶连接：线性RNA分子可以通过T4 RNA连接酶的作用，将5'末端单磷酸与3'末端羟基形成共价键而环化。然而，环化反应只能在5'末端有一个磷酸的条件下发生。使用T7 RNA聚合酶体外合成的RNA含有5'三磷酸末端，因此在合成的线性RNA环化之前必须去除两个磷酸基团。目前，RNA 5'焦磷酸水解酶（RppH）用于直接去除b和g磷酸（图2F）；(3) 内含子自我剪接：I组和II组内含子可以执行RNase功能，使线性RNA分子自我剪接形成circRNA，无需其他酶的帮助（图2G）。 2015年，研究人员构建了一个包含分裂GFP的单外显子小基因，并发现前mRNA确实通过在人类和果蝇细胞中有效的反向剪接产生可翻译的circRNA。2018年，研究人员使用I组内含子剪接环化方法和IRES介导的翻译启动，合成了编码增强绿色荧光蛋白（EGFP）的circRNA。这种合成在293T细胞中成功表达了EGFP。令人惊讶的是，circRNA可以连续表达长达168小时，而自配方mRNA的表达仅持续48小时。目前报道的人工合成的表达蛋白质的circRNA主要通过内含子剪接或T4 RNA连接酶连接产生，两种环化方法的组成元素不同（图3）。 图3: 目前用于配制环状RNA疫苗的方法。(A) 通过内含子剪接环化；(B) T4 RNA连接酶连接。GOI，感兴趣的基因。 魏等人最近采用I组内含子剪接RNA环化方法和IRES介导的翻译启动，以及使用脂质纳米颗粒（LNPs）作为递送系统，开发了一种针对原始COVID-19毒株的circRNA疫苗。在分别用10 mg/动物和50 mg/动物剂量免疫的小鼠中，加强后5周的血清中和抗体滴度分别约为103和105，两种剂量均引发了相对较强的Th1免疫反应。在猴子接受两次剂量为100 mg/动物的疫苗后，使用原始病毒株进行挑战实验，发现免疫组在肺部病毒载量、肺损伤程度和肺部浸润性炎症细胞数量上显著减少。随后利用该技术平台生成了针对COVID-19 Delta变种的circRNA疫苗，该疫苗以10 mg/动物的剂量用于小鼠免疫。加强后7周，针对Delta变种的血清中和抗体滴度约为104，针对Omicron BA1变种的滴度约为103.5，从而证明了疫苗的广谱活性。配制的circRNA疫苗在4°C、25°C和37°C下也比线性mRNA疫苗更稳定。另一种使用T4 RNA连接酶方法制备的COVID-19 circRNA疫苗在小鼠中也显示出一定水平的免疫原性。 Seephetdee等人采用I组内含子剪接方法进行RNA环化，以原始COVID-19毒株的刺突（S）蛋白作为抗原结合构建，并包含多个突变（包括K417N、L452R、T478K、E484K、N501Y和D614G），配制了COVID-19 circRNA疫苗。在用5 mg/动物剂量接种两次疫苗的小鼠中，对Alpha、Beta、Delta和Omicron变种和假病毒表现出一定的中和活性，并在T细胞中引发了IFN-g反应。 王等人采用II组内含子剪接方法进行RNA环化，配制了COVID-19 circRNA疫苗。用于小鼠免疫时，该疫苗引发了强烈的RBD特异性记忆B细胞反应和平衡的Th1/Th2细胞免疫反应。用circRNA疫苗免疫的小鼠血清IgG滴度是线性mRNA疫苗免疫小鼠的10倍。此外，circRNA疫苗对假SARS-CoV-2表现出良好的中和活性，并有效阻断了三种受体结合域（RBD）突变体（野生型、Delta、Omicron）与293T细胞上的hACE2受体的结合。COVID-19 circRNA疫苗可以在细胞中连续表达6天，而自配方mRNA疫苗的表达仅持续2天。 使用T4 dt内含子剪接方法进行RNA环化会导致“剪接疤痕”序列的产生，不同序列长度导致不同的拓扑结构。研究发现，circRNA的组成元素和组成对翻译效率有影响，其中载体拓扑结构、非翻译区（UTR）和IRES起着最关键的作用。通过对不同剪接疤痕、5'UTR、3'UTR和IRES序列的实验比较，使用50 nt长的剪接疤痕序列和eIF4G招募适配体Apt-eIF4G序列作为5'UTR，全长HBA1序列作为3'UTR，以及野生型iCVB3序列作为IRES构建的circRNA在翻译效率上显著提高，并能在293T细胞中连续蛋白表达长达7天。相比之下，线性mRNA疫苗仅实现了3天的连续蛋白表达，且表达量低于circRNA疫苗。上述研究表明，circRNA疫苗不仅具有更强的免疫原性，而且比自配方线性mRNA疫苗的蛋白表达时间更长。因此，在低剂量下，circRNA疫苗可能引发更强的免疫反应。 circRNA疫苗通过IRES介导的翻译途径翻译成蛋白。与线性mRNA疫苗类似，circRNA疫苗也在体内翻译成蛋白以诱导强大的体液免疫和有效的细胞免疫，其中脂质体等可能在疫苗佐剂中发挥作用。一些研究表明，circRNA疫苗可以比线性mRNA疫苗更长时间地翻译成蛋白，甚至长达约7天。机制可能是circRNA的封闭特性理论上可以防止它们被通常从5'或3'端降解线性RNA的外切核酸酶降解。然而，目前还没有关于circRNA疫苗在体内如何降解的研究，它也可能通过microRNA介导的、m6A介导的、RNase L介导的或其他生物合成circRNA的降解途径进行降解。 与肽疫苗、灭活病毒疫苗和重组蛋白疫苗相比，circRNA疫苗可以有效诱导T细胞免疫。DNA疫苗必须进入细胞核才能转录成mRNA，这给身体带来一些风险，而circRNA疫苗则不需要。发表的研究表明，与线性mRNA疫苗相比，circRNA疫苗可以更长时间地翻译成蛋白，表明它具有更好的稳定性。 circRNA和线性mRNA疫苗之间有一些明显的区别。例如，circRNA和线性RNA在体内的降解方式不同。此外，circRNA疫苗主要使用IRES介导的翻译途径，而线性mRNA疫苗使用5'帽子（m7GpppN）结构介导的翻译途径。因此，circRNA和线性mRNA疫苗通过不同的转录启动复合体翻译成蛋白，涉及不同的启动因子。明显的不同是，circRNA疫苗不需要任何修饰，因为环形结构不易被外切核酸酶降解，而线性mRNA疫苗需要伪尿苷修饰、5'帽子结构和3'聚（A）结构。 5.circRNA疫苗生产工艺概述 目前，circRNA疫苗的工业化生产尚未成熟，大多数处于小规模研究阶段。可以参考线性mRNA疫苗的生产工艺。主要区别在于环化过程和相关杂质的去除。circRNA疫苗的工业化生产可能通过以下过程实现：(1) 以质粒为模板，通过体外转录合成线性RNA分子；(2) RNA环化；(3) 使用递送系统如脂质纳米颗粒（LNPs）进行疫苗封装。因此，获取高质量的质粒至关重要。质粒的工业化生产过程目前已接近成熟阶段，包括发酵、细菌收获、裂解、澄清、超滤和浓缩以及色谱纯化等步骤。在色谱纯化步骤中，添加不同类型的填料材料可以去除RNA、微量杂质和内毒素，以获得高纯度的超螺旋质粒。获得的质粒随后经过单一限制性内切核酸酶切割以实现线性化，并进行色谱以去除酶和盐。通过体外转录合成线性RNA分子。然后，使用DNase I去除反应产物中的DNA模板，并通过超滤纯化RNA产品。线性RNA分子随后进行环化，这是circRNA疫苗制备过程中的关键步骤。目前，内含子剪接法在工业化circRNA疫苗生产中作为环化方法最具前景，因为不需要添加酶。T4 RNA连接酶的连接也可以在工业化circRNA生产中使用；然而，在环化长度大于2000 bp的RNA分子时，其RNA环化效率显著降低。此外，还需要额外的步骤来去除T4 RNA连接酶。综合考虑各种因素，T4 RNA连接酶连接被认为在工业化生产中不适合RNA环化，而内含子剪接更为合适。环化反应的产物包括杂质，如线性RNA前体和剪接后的RNA序列。去除未成功环化的线性RNA前体分子是circRNA疫苗生产面临的难题，因为线性RNA前体和相应的circRNA分子之间的分子量相似。研究人员已报告使用色谱法从环化产物中去除线性RNA前体分子和其他杂质。在实验室规模生产阶段，可以尝试使用高效液相色谱（HPLC）或RNase R消化来去除线性RNA前体和其他杂质。然而，由于成本高昂，RNase R目前不适合用于大规模生产。随着RNA环化效率的提高，杂质含量减少，提高环化效率可能是简化纯化过程的可行方法。先前的研究表明，在最终浓度为50 mM Tris-HCl、10 mM MgCl2和1 mM DTT的缓冲溶液中进行环化时，可以有效地提高RNA环化效率，pH值为7.5。最后，circRNA被封装在递送系统中，如脂质纳米颗粒（LNPs），然后进行填充和封盖，形成最终的疫苗产品（图4）。值得注意的是，circRNA疫苗配方过程不需要添加5'帽子和3'聚（A）尾，或从反应产物中去除酶。 图 4: 环状RNA疫苗生产的流程图 6.circRNA疫苗质量控制的考虑 目前，已有两款COVID-19线性mRNA疫苗上市；然而，这些疫苗的质量控制过程相对成熟。世界卫生组织（WHO）发布了关于评估用于预防传染病的信使RNA疫苗质量、安全性和有效性的监管考虑的指导文件。此外，美国药典会议（USP）开发了mRNA疫苗质量分析程序，中国国家药品监督管理局药品审评中心（CDE）发布了预防COVID-19 mRNA疫苗的药物研究技术指导原则（试行）。考虑到circRNA疫苗的特性，现有的mRNA疫苗、其他类型疫苗和核酸治疗剂的指导文件可能作为制定circRNA疫苗质量控制过程的参考（补充材料表1）。 circRNA依赖于IRES或m6A修饰进行翻译启动。由于其独特的闭环结构，circRNA对常规途径的降解有抵抗力，这消除了在circRNA疫苗配方中使用的RNA分子中5'帽子和3'聚（A）尾结构的需求。因此，circRNA疫苗不需要5'帽子和3'聚（A）尾相关的质量控制。 从环状RNA疫苗（circRNA vaccines）的独特特性中衍生出的核心质量属性（CQAs）相关的质量控制项目必须得到强调。环化率是环状RNA疫苗最重要的CQA，以往的研究中通过毛细管电泳（CE）和高效液相色谱（HPLC）进行测量。环状RNA序列的准确性也应该基于测序方法进行测量。然而，环状RNA疫苗的过程与线性mRNA疫苗不同，因为环状RNA在测序前需要内切酶切割以打开环。在RNA环化过程中，单链RNA（内含子序列）可能会脱落，一部分线性RNA前体最终可能保持未环化状态。研究人员已经报告了使用CE和HPLC来确定环状RNA疫苗纯度。如果采用T4 RNA连接酶进行环状RNA的制备，还必须对疫苗产品中残留的T4 RNA连接酶含量进行质量控制，这可以通过酶联免疫吸附测定（ELISA）进行测量。当使用RNase R去除线性RNA前体分子时，也需要对残留的RNase R含量进行质量控制，这也可以通过ELISA进行测量。目前，特定的抗原-抗体结合方法，如ELISA，被采用来测量mRNA疫苗中残留的双链RNA（dsRNA）含量，主要使用的是抗dsRNA J2抗体。然而，旨在确定环状RNA是否可以直接结合抗dsRNA J2抗体或干扰抗dsRNA J2抗体与dsRNA结合的研究尚未报告。因此，在采用ELISA测量环状RNA疫苗中残留的dsRNA含量之前，必须进行样本适用性研究。 7. 环状RNA疫苗的展望 环状RNA疫苗可能成为应对未来新出现的大流行传染病或常见病毒疾病的有力工具，并可能发展成为肿瘤治疗疫苗。因此，全球的生物制药公司和研究团队已经将相当大的关注和研究努力转移到环状RNA疫苗的开发上。目前，由于研发、生产、质量控制和安全等方面的问题，环状RNA的研究仍处于临床前阶段。最近，研究人员提出了一个数字设计（QbDD）的质量蓝图，以支持快速的RNA疫苗工艺开发、制造和供应。因此，QbDD概念应该被纳入环状RNA疫苗的开发、生产和质量控制中。新环状RNA疫苗相关方法的开发和验证应该基于美国药典（USP）最近发布的《分析程序生命周期》第<1220>章和国际药品技术要求协调会（ICH）发布的《分析程序验证》Q2和《分析程序开发》Q14草案指南中规定的特定要求，目前公众正在对此进行评论。此外，还需要分析目标概况（ATP）、风险分析和识别、CQAs的确认、实验设计、过程控制和使用中监测。 环状RNA疫苗各个方面的未来方向如下： 研发：线性mRNA疫苗表现出“自我佐剂”效应。这种效应的过量或不足都不利于诱导高水平的体液免疫和有效的细胞免疫。环状RNA可以激活RIG-I和PKR细胞信号传导途径，这也提供了一种自我佐剂效应。因此，设计和优化环状RNA疫苗以适当激活自我佐剂效应对于增强疫苗效果至关重要。RNA环化是环状RNA疫苗配方过程中的关键阶段，环化效率是疫苗生产能力的主要决定因素，高环化效率有利于后续的纯化过程。环状RNA疫苗的组成元素和组成的设计和优化，或开发新的RNA环化方法，是提高环化效率的有效途径。根据已发表的研究，过量的RNA序列长度会影响环化效率。因此，在设计和优化目标片段长度时，必须注意不要影响目标蛋白或RNA环化效率的免疫原性。环状RNA疫苗与mRNA疫苗不同，因为它们具有环状结构，不同的目标序列可能表现出不同的构象。环状RNA的这些特性可能影响RNA环化效率，需要在研发阶段进行充分探索。内含子序列在RNA环化反应中起着关键作用。因此，内含子序列的优化是疫苗开发阶段的必要步骤。外显子长度影响I型内含子自剪接的环化效率，这也需要在疫苗开发过程中优化外显子序列长度。选择有效的IRES结构元件非常重要，因为它是环状RNA疫苗蛋白质翻译的主要决定因素。最近，据报道，DeepCIP作为世界上第一个环状RNA IRES预测工具，可以预测更适合环状RNA的IRES，以便环状RNA能够适应不同的场景，如疫苗和抗癌治疗。环状RNA需要传递系统进行封装以形成疫苗。LNP目前是环状RNA的主要传递系统。开发靶向LNP可能有助于增强疫苗保护效果。或者，研究工作可以致力于开发新的、更有效的传递系统以替代LNP。例如，一些早期研究已经探索了使用外泌体和铁蛋白作为传递系统。 生产：可以尝试优化反应条件以实现增强的环化效率。在实验室条件下，使用环化的RNA重新执行环化步骤有助于提高环化效率。因此，可以尝试开发再环化过程，并将该过程纳入疫苗生产。环状RNA与相应的线性RNA前体分子在分子量上的相似性为从疫苗产品中清除线性RNA前体带来了困难。目前，主要采用色谱法进行纯化；然而，缺乏报告说明其纯化效果是否足以满足生产需求。 质量控制：如前所述，环状RNA与相应的线性RNA前体分子的分子量相似。因此，在CE或HPLC确定RNA环化率时，这两种类型的RNA分子表现出接近的峰出现时间。因此，很难有效地区分两者。应进一步优化实验条件以满足测量要求。未来可能还需要国家和区域性的dsRNA参考标准，参考标准制备过程中应综合考虑dsRNA碱基序列、序列长度、5'-末端的磷酸基团数量和碱基修饰等因素。 安全性：生物体内含有大量的环状RNA，它们在调节基因转录、表达和细胞信号传导途径中发挥重要作用，某些环状RNA能够表达蛋白质。外源性环状RNA是否干扰体内自然发生的环状RNA的生物学功能尚不清楚。残留的线性RNA前体分子可能会因激活过度的先天免疫反应而引起更强的不良反应。环状RNA疫苗含有残留的dsRNA含量。由于接种mRNA疫苗后发生的心肌炎与疫苗中的dsRNA残留有关，需要进一步研究以确定环状RNA疫苗是否可能引起心肌炎。 为了推动人用及兽用疫苗行业交流，共同探讨该领域的最新研发进展、产业化现状及未来发展趋势，生物制品圈联合四叶草会展将于2024年8月16日-17日在苏州共同举办“第三届新型疫苗研发峰会”。诚邀全国相关领域专家、学者和企业家共享学术盛会。现将有关事宜通知如下。 名称：2024第三届新型疫苗研发峰会 时间：2024年8月16-17日（周五-周六） 地点：苏州（酒店定向通知） 主办单位：四叶草会展、生物制品圈 媒体支持：药时空、抗体圈、细胞基因研究圈 会议费用：点击二维码即可查询。 报名方式：扫描下方二维码→ 填写表格 → 报名成功（报名志愿者，免交报名费，承担一定工作任务）！ 转发分享福利：疫苗研发企业、科研院校和监管机构人员，前30位报名人员转发分享会议信息可免费参会（不含餐饮）报名后，扫描下方二维码加工作人员微信后，发送截图即可。 组委会获得报名信息后，根据报名信息进行初筛，并进一步与报名者沟通确认，实现精准邀请，最终有机会进入大会微信群（严格审核通过）。 大会日程 已经确定的报告人 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 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