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阿尔茨海默病（AD）是一种多见于老年人的神经系统退行性疾病。正如影视作品中所描述的这样，随着疾病的进展，患者逐渐忘记周围的人，忘记自己引以为傲的过去，失去丰沛的感情，最终丧失生活能力。 阿尔茨海默病（AD）是一种多见于老年人的神经系统退行性疾病。正如影视作品中所描述的这样，随着疾病的进展，患者逐渐忘记周围的人，忘记自己引以为傲的过去，失去丰沛的感情，最终丧失生活能力。 而有这样一类人群：APOE4基因的携带者，他们患AD的风险更高，发病也更早 [1]。 长期以来，人们对APOE4基因做了大量研究，尝试揭开APOE4推动AD发生发展的秘密。但既往研究大都局限于某一种细胞或者某一条通路，让我们无法对APOE4与AD病理进程的关系建立完整的概念。 近期，来自美国加利福尼亚大学的黄亚东教授团队的一项研究，通过记录小鼠大脑内单细胞核转录组学变化，发现敲除神经元内APOE4基因可改善Tau蛋白介导的胶质细胞激活，神经系统脱髓鞘改变和神经元死亡等一系列病理损伤[2]。研究成果发表在《自然•衰老》上。 文章首页截图 APOE有三种等位基因，其中APOE4可以大大提高患AD的风险，而APOE2正相反，可以降低AD的发病风险。APOE3被称为野生型，对AD风险增加或减少无明显作用[3]。 为了研究APOE4的作用，研究者们将表达loxP序列的人APOE3和APOE4基因的小鼠，与神经元特异性启动子Syn1-Cre小鼠杂交，得到了可以在神经元内特异性敲除APOE基因的小鼠。 在此基础上，研究者们将上述模型鼠与Tau蛋白病理模型鼠PS19杂交，得到了四种转基因小鼠模型：PS19-fE3，PS19-fE3/Syn1-Cre，PS19-fE4，PS19-fE4/Syn1-Cre。这样就可以在神经元内存在或不存在APOE基因的情况下观察Tau蛋白病理变化。 接下来，研究者们在小鼠10月龄时对海马中Tau蛋白病理进行了检测，实验结果表明，表达APOE4的小鼠海马区域有大量的磷酸化Tau蛋白和神经元纤维缠结。在神经元内特异性敲除APOE4后，磷酸化Tau蛋白的水平下降了81%，含有纤维缠结的神经元数量也明显降低了（P=0.0103）。 通过在小鼠右侧海马注射表达P301S突变Tau蛋白的慢病毒载体，研究者们观察到表达APOE4的小鼠左侧海马Tau蛋白病理阳性的神经元数量增加，在神经元内敲除APOE4后有明显改善（P<0.0001）。说明APOE4在Tau蛋白异常磷酸化，Tau蛋白聚集，和Tau蛋白在神经元间传播过程中全部发挥了作用。 图a，b: PS19-fE4小鼠中磷酸化Tau和神经纤维缠结较PS19-fE3小鼠明显增加，在神经元中敲除APOE4后下降。图c，d：在右侧海马注射P301S Tau表达载体后，fE4小鼠左侧海马人源性Tau蛋白和磷酸化Tau蛋白均高于敲除组。图e.f：APOE4存在时海马中不可溶性磷酸化Tau蛋白增加。 Tau蛋白病理与AD的进展密切相关，那么，如果在神经元内特异性敲除APOE4是否能改变这一进程呢？ 研究者们对此一一进行了解答。首先，研究发现PS19-fE4小鼠海马区发生了神经退行性改变,这一组小鼠的海马体积显著缩小，海马CA1区和齿状回的厚度明显变薄，神经元凋亡标志物Caspase-3剪切体表达明显升高（P<0.0001），这说明神经元出现了严重的死亡情况。 而PS19-fE3，PS19-fE3/Syn1-Cre和PS19-fE4/Syn1-Cre三组小鼠均未出现明显的神经元死亡情况，说明上述神经退行性改变是由于APOE4存在引起的。 图a，b: PS19-fE4小鼠海马体积减小，齿状回厚度降低，敲除神经元APOE4后恢复。图c，d：PS19-fE4小鼠海马出现神经脱髓鞘改变和神经元过度兴奋，敲除神经元APOE4后恢复。 在髓鞘损伤的检测中也有类似的发现。 研究人员检测了PS19-fE4小鼠海马区髓鞘损伤情况和髓鞘修复情况。结果发现APOE4存在的情况下小鼠髓鞘受损严重。在海马区特异性敲除APOE4后，髓鞘受损情况和损伤修复情况均恢复到了与PS19-fE3小鼠相似的水平。 除此之外，研究者们还发现与PS19-fE3小鼠相比，PS19-fE4小鼠CA1-CA3环路过度兴奋，小胶质细胞和星形胶质细胞明显激活。APOE4敲除后这两种现象都得到了缓解。 由此可见，神经元内APOE4的敲除减缓了Tau蛋白病理状态下的神经元死亡、神经系统脱髓鞘改变和神经元功能的改变。 通过上述结果，我们不难发现，神经元内APOE4的存在不仅影响了神经元本身，还影响了胶质细胞。那么在整个海马区域，是不是所有细胞都受到了这种影响，共同推动了神经退行性改变的进展呢？ 接下来的实验中，研究者们对PS19-fE3，PS19-fE4，PS19-fE4/Syn1-Cre三组小鼠海马区的细胞进行了单细胞核转录组分析，根据不同的细胞标记基因表达水平变化，将整个海马区的细胞分成了34个类群。 根据每群细胞在三组小鼠中数量占比的不同，研究者们将在PS19-fE4小鼠中显著增加的细胞群定义为神经元APOE4介导的疾病相关(nE4-DA)细胞群。 图a: 单细胞核转录组分析将海马细胞分为34个亚群。图b: 三组小鼠中不同亚群细胞中APOE表达情况。图c：疾病相关神经元中高表达和低表达的基因。图d：PS19-fE4/Syn1-Cre小鼠与PS19-fE4小鼠相比疾病相关神经元中基因表达的变化情况。 在对这些特殊细胞群进行基因表达分析时，研究人员有了令人兴奋的发现。 不论什么种类的细胞中，nE4-DA细胞群均高表达Hspa8，Hsp90aa1，Hsp90ab1，Calm1，Calm2，Nrgn和Ubb这几种基因。 不仅如此，通过对PS19-fE4/Syn1-Cre小鼠的nE4-DA细胞群进行分析，研究者们发现清除神经元中的APOE4基因后，上述基因表达量降低了。这说明APOE4的清除不仅改变了nE4-DA细胞群的数量，还改变了nE4-DA细胞群的基因表达。这些在APOE4存在情况下高表达的基因，可能就是解开APOE4致病机制之谜的关键。 总的来说，本研究重点关注了神经元中APOE4对Tau蛋白病理的推动作用，发现神经元中特异性敲除APOE4可以使海马中的病理性Tau蛋白含量下降81%。尽管神经元中的APOE4如何介导其它细胞的病理变化还有待探索，但本文已经为我们提供了很有利的证据。如果能够找到安全稳定的方法特异性敲除神经元中的APOE4基因，也许能够降低这类人群的患病风险。 参考文献： [1] Corder EH, Saunders AM, Strittmatter WJ, et al. Gene dose of apolipoprotein E type 4 allele and the risk of Alzheimer's disease in late onset families. Science. 1993;261(5123):921-923. doi:10.1126/science.8346443 [2] Koutsodendris, N., Blumenfeld, J., Agrawal, A. et al. Neuronal APOE4 removal protects against tau-mediated gliosis, neurodegeneration and myelin deficits. Nat Aging (2023). https://doi-org.libproxy1.nus.edu.sg/10.1038/s43587-023-00368-3 [3] Shi Y, Yamada K, Liddelow SA, et al. ApoE4 markedly exacerbates tau-mediated neurodegeneration in a mouse model of tauopathy. Nature. 2017;549(7673):523-527. doi:10.1038/nature24016

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）又称老年性痴呆，是一种进展性神经变性疾病，是近乎三分之二痴呆患者的病因。淀粉样蛋白β(Aβ)沉积形成神经斑块(NP)是阿尔茨海默病(AD)的标志。衰老、中风、糖尿病等主要非遗传危险因素促进了AD的发病，但机制尚不明确。此外，NP形成的机制还不清楚。既往研究表明凝聚素 (clusterin, CLU) 的失调与 AD 发病机制有关。CLU 是一种分泌蛋白，主要在大脑的星形胶质细胞中合成，敲除CLU能够显著减少NP的形成，但我们仍不知晓其具体机制。2022年9月23日，Signal Transduction and Targeted Therapy在线发表了首都医科大学王喆、宋伟宏及济宁医学院吴伊丽共同通讯的研究文章“Clusterin transduces Alzheimer-risk signals to amyloidogenesis”，揭示了CLU通过调控淀粉样蛋白的形成，影响阿尔兹海默症的发生/发展，为我们防治阿尔兹海默症提供了新的思路。衰老是阿尔兹海默病的关键危险因素，而既往发现糖尿病患者更容易患上阿尔茨海默病，但这两个危险因素是通过何种机制导致阿尔兹海默病还不清楚。近年来，陆续有学者发现血浆CLU浓度与AD患者脑萎缩、疾病严重程度及临床进展相关，衰老和糖尿病等AD危险因素是否通过CLU影响AD的发展进程呢？研究人员通过免疫荧光实验检测3个月和18个月野生型小鼠的大脑中CLU的表达情况，发现在3个月时，CLU仅在脑干神经元中表达，而在18个月小鼠大脑中，CLU大量聚集在皮质神经元中，同时，通过注射胰岛素受体抑制剂S961构建2型糖尿病模型小鼠，同样发现皮质神经元大量表达CLU。在衰老（a）和2型糖尿病模型（b）小鼠中，CLU大量聚集在皮质神经元中更令人惊奇的是，在中风（包括缺血性卒中和出血性卒中）、单纯疱疹病毒（HSV）感染模型中，CLU在神经元和受损区域的细胞外区域表达均显著上升，而中风和HSV感染同样是AD发病的危险因素。在缺血(MCAO)、乳酸处理（模拟中风酸性环境）、出血和HSV感染的模型小鼠大脑中，CLU在神经元和细胞外区域上调在多种AD危险因素的作用下，CLU都表现出脑内神经元表达的增加，那CLU表达上升会带来什么影响呢？研究者接下来利用syn-1启动子，特异性地在APP/PS1模型小鼠神经元中过表达人源CLU（hCLU），发现小鼠生存率显著降低，旷场实验是经典的情绪相关行为学检测实验，实验显示hCLU过表达加重了APP/PS1模型小鼠的抑郁/焦虑表现。（左）神经元中过表达hCLU降低了AD模型小鼠的生存率（右）hCLU加重了AD模型小鼠的抑郁/焦虑表现细胞外沉积大量淀粉样蛋白斑(又称神经斑块)是 AD 最公认的神经病理学特征之一。Aβ42被证明为高度疏水易于聚合,其自我聚合形成的寡聚体对 AD 神经元具有强烈的神经毒性。syn1-hCLU（神经元特异地过表达人源CLU）可以使小鼠脑内淀粉样蛋白积聚增多，并且神经斑块的面积也随之增大。syn1-hCLU促进淀粉样蛋白的形成和神经斑块面积的增大Aβ主要是由淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein, APP)被β分泌酶和γ分泌酶剪切产生的。APP是一种广泛存在于神经元的跨膜糖蛋白，其中Aβ产生的经典途径是先由β分泌酶水解产生C99，再由γ分泌酶水解产生淀粉样蛋白。淀粉样蛋白的产生途径前面已经证明了CLU可以促进淀粉样蛋白的形成，但其中的分子机制还仍未清楚，所以研究者猜测CLU可以调控γ-分泌酶的活性，从而影响后者对C99的水解，正如期待中的一样，GSI（γ-分泌酶抑制剂）阻断了hCLU促进Aβ形成的作用。hCLU通过介导γ-分泌酶活性促进Aβ形成进一步通过IP实验，研究者证明了CLU可以结合C99的近膜螺旋(JH)结构域，竞争性抑制JH结构域对γ-分泌酶的阻断作用，从而活化了γ-分泌酶，实现对C99的水解。CLU与C99的JH结构域强烈结合，从而解除对γ-分泌酶的抑制AD 患者的脑神经细胞凋亡率要比正常人的高 40 倍左右，凋亡的神经元细胞遗骸会成为淀粉样蛋白的安家之所，从而形成神经斑块，因此神经细胞凋亡可能是中枢神经系统衰退的主要原因之一。通过免疫荧光实验，研究者发现过表达hCLU的神经元表现出NeuN信号的减少甚至完全消失，同时细胞凋亡信号显著增强，提示CLU可能通过凋亡参与了神经斑块的形成。过表达hCLU的神经元表现出凋亡增加使用DNase-1诱导细胞凋亡，再通过Triton X-100处理凋亡细胞，这是一种非离子型表面活性剂，可以破坏蛋白质与脂质间的相互作用，但并不使蛋白变性，也不破坏蛋白与蛋白间的连接，能够保留蛋白质的天然构象。通过质谱分析蛋白质沉淀物，发现其中含有大量神经斑块，而且CLU在其中的含量也显著增加。DNase-1诱导细胞凋亡后，CLU在神经斑块中的含量增加根据这一结果，研究团队提出了CLU依赖性Aβ沉积在凋亡细胞表面的模型，为AD患者脑内神经斑块的形成机制提供了新的解释方式。Aβ依赖CLU沉积在凋亡细胞表面，从而形成神经斑块总的来说，这项研究表明AD的主要风险因素会使CLU表达上调，CLU通过结合C99的JH结构域，活化γ-分泌酶，从而促进Aβ生成，同时，由于CLU在凋亡细胞中的积聚，Aβ可以通过CLU沉积在凋亡细胞的表面，从而促进神经斑块的形成。本研究首次揭示了CLU 促进淀粉样蛋白和神经斑块形成的分子机制，为临床治疗AD提供了重要的参考依据。文章链接：https://www-nature-com.libproxy1.nus.edu.sg/articles/s41392-022-01157-x