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关注并星标CPHI制药在线摘要:建立克拉霉素微生物限度检查方法。根据试验结果,克拉霉素对细菌抑菌作用强,特别是金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌,必须采用均质袋并通过薄膜过滤法去除克拉霉素的抑菌作用,各试验菌的回收率达到50%以上。该方法可用于克拉霉素微生物限度检查。 克拉霉素为属大环内酯类抗生素,对革兰阳性菌,部分革兰阴性菌及支原体有抑制作用,临床主要用于抗感染治疗。《中国药典》2020年版规定,1105非无菌产品微生物限度检查:微生物计数法用于检查非无菌制剂及其原辅料等是否符合相应的微生物限度标准。本文采用五种菌作为阳性对照菌,测其回收率,建立克拉霉素微生物限度检查方法。 1.试验材料和仪器 1.1供试样品:克拉霉素,批号:A、B、C 1.2培养基:胰酪大豆胨琼脂培养基,批号:20220614,厂家:青岛日水生物技术有限公司;沙氏葡萄糖琼脂培养基,批号:20221125,厂家:青岛日水生物技术有限公司;胰酪大豆胨液体培养基,批号:202308703,厂家:青岛高科技工业园海博生物技术有限公司;沙氏葡萄糖液体培养基,批号:20210914,厂家:青岛日水生物技术有限公司;pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液,批号:20230323,厂家:青岛日水生物技术有限公司;0.9%无菌氯化钠溶液:批号:2304011301,厂家:石家庄四药有限公司。 1.3试验菌种:金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、铜绿假单胞菌[CMCC(B)10104]、枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63501]、白色念珠菌[CMCC(F)98001]、黑曲霉[CMCC(F)98003]。 1.4仪器:鑫贝西生物安全柜BSC-1500ⅡA2-X;永生生化培养箱SHH-500L。 2.需氧菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证 克拉霉素为抗生素类药物,具有较强的抑菌活性,根据《中国药典》2020年版1105非无菌产品微生物限度检查,本品采用薄膜过滤法进行试验。 2.1菌液制备 取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至胰酪大豆胨液体培养基中,33℃培养18~24h;取白色念珠菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖液体培养基中,23℃培养2~3d。上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的菌悬液。取黑曲霉的新鲜培养物接种至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基,经23℃培养5~7d,加入3~5mL含0.05%(mL/mL)聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液,将霉菌孢子洗脱,然后吸出孢子悬液至无菌试管内,用含0.05%(mL/mL)聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的菌悬液。各试验菌的接种量不大于100cfu。 2.2供试液的制备 取供试品10g,加入pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液至100ml,制成10-1供试液。取10-1供试液10ml,加入pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液至100ml,制成10-2供试液,取10-1供试液10ml,加入pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液至100ml,制成10-3供试液。 2.3薄膜过滤法(常规方法) 2.3.1试验组:取10-2供试品10ml,分别加入各试验菌(不超过100cfu)混匀,进行薄膜过滤,再用0.1%蛋白胨水溶液冲洗3次,每次冲洗量为100ml。 2.3.2菌液组:以稀释剂代替供试液,按试验组操作加入各试验菌。 2.3.3供试品对照组:取10-2供试品10ml,以稀释剂代替菌液同试验组操作。 2.3.4试验菌回收率的计算: 回收率=[(试验组菌落数-供试品对照组菌落数)/菌液组菌落数]×100% 2.3.5结果判断:试验菌回收率不低于50%,符合验证试验,可按照此方法进行需氧菌、霉菌和酵母菌的微生物计数,若试验菌回收率低于50%,应消除供试品的抑菌性,并重新进行方法实验。 2.3.6克拉霉素通过薄膜过滤法,需氧菌总数检查试验菌回收率结果,见表1;霉菌和酵母菌总数检查试验菌回收率结果,见表2。 表1 需氧菌总数检查方法试验菌回收率(薄膜过滤法) 表2 霉菌和酵母菌总数检查方法试验菌回收率(薄膜过滤法) 由表2所示,白色念珠菌、黑曲霉的回收率均大于50%,此方法适用于霉菌和酵母菌计数,但是由表1可以看出,虽然白色念珠菌、黑曲霉的回收率均大于50%,而金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的回收率为0%。由此可见,克拉霉素对细菌有较强的抑菌作用,应建立新的方法消除供试品的抑菌活性,并重新进行试验。 2.4薄膜过滤法(采用高稀释级别供试液并采用不同冲洗量) 2.4.1试验组:取10-3供试品10ml,加入试验菌(不超过100cfu)混匀,进行薄膜过滤,采用0.1%蛋白胨水溶液冲洗,每次冲洗量为100ml,总冲洗量分别为300ml、500ml、800ml。 2.4.2菌液组、供试品对照组均同法操作。 2.4.3克拉霉素薄膜过滤法(采用高稀释级别供试液并采用不同冲洗量),细菌试验菌回收率结果,见表3。 表3细菌试验菌回收率(采用高稀释级别供试液并采用不同冲洗量) 由表3所示,采用最高的稀释级别10-3供试液10ml进行薄膜过滤,冲洗量为300ml,铜绿假单胞菌的回收率在50%以上;而总冲洗量为800ml时,金黄色葡萄球菌回收率仅为20.6%,枯草芽孢杆菌的回收率为40.5%,仍低于50%,需要重新建立方法进行验证。由此可见,克拉霉素对细菌抑菌作用强,特别是金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌。 2.5薄膜过滤法(采用均质袋) 2.5.1供试液的制备:取供试品10g,加入pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液至100ml,并置含滤网的均质袋中,使分散均匀,制成10-1供试液。取10-1供试液10ml,加入pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液至100ml,制成10-2供试液。依上述方法制成10-3供试液。 2.5.2试验组:取10-3供试品10ml,加入500mlpH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液,再分别加入试验菌(不超过100cfu)混匀,进行薄膜过滤,再用0.1%蛋白胨水溶液冲洗3次,每次冲洗量为100ml。 2.5.3菌液组、供试品对照组均同法操作。 2.5.4克拉霉素通过薄膜过滤法(采用均质袋),需氧菌总数检查方法试验菌回收率结果,见表4。 表4需氧菌总数检查方法试验菌回收率(薄膜过滤法采用均质袋) 由表4所示,采用均质袋,联合薄膜过滤法,各试验菌的回收率均高于50%,说明此方法消除供试品的抑菌活性,因此可采用均质袋并通过薄膜过滤法进行克拉霉素的需氧菌计数。 3.控制菌检查方法的验证 3.1供试液的制备:取供试品10g,加入pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液至100ml,并置含滤网的均质袋中,使分散均匀,制成10-1供试液。 3.2试验组:取10-1供试品10ml,加入500mlpH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液,再加入大肠埃希菌(不超过100cfu)混匀,进行薄膜过滤,再用0.1%蛋白胨水溶液冲洗3次,每次冲洗量为100ml,抽滤,取滤膜至400ml胰酪大豆胨液体培养基,33℃培养18~24小时,依法检查。 3.3阳性对照组:取不超过100cfu大肠埃希菌至400ml胰酪大豆胨液体培养基中,依法检查。 3.4阴性对照组:以稀释剂代替供试液照相应的控制菌检查法检查。 3.5试验结果:试验组、阳性对照组检出大肠埃希菌,阴性对照组未检出大肠埃希菌。 4 结果 根据上述试验结果,克拉霉素的微生物限度检查采用下列方法,取供试品10g,加入pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液至100ml,并置含滤网的均质袋中,使分散均匀,制成10-1供试液,依次制成10-2、10-3供试液,需氧菌总数:取10-3供试品10ml,加入500mlpH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液,进行薄膜过滤,再用0.1%蛋白胨水溶液冲洗3次,每次冲洗量为100ml;霉菌和酵母菌总数:取10-2供试品10ml,进行薄膜过滤,再用0.1%蛋白胨水溶液冲洗3次,每次冲洗量为100ml;控制菌检查:取10-1供试品10ml,加入500mlpH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液,进行薄膜过滤,再用0.1%蛋白胨水溶液冲洗3次,每次冲洗量为100ml,取滤膜至400ml胰酪大豆胨液体培养基,依法检查大肠埃希菌。 5 讨论 微生物的生长受许多因素的影响,特别的药品中污染的微生物。一些药物自身具有抑菌作用,因此建立其微生物限度检查方法时,应考虑采用适合的方法消除供试品的抑菌活性。克拉霉素对细菌具有较强的抑菌作用,本文试验供试品制备时,采用含滤网的均质袋,使药品分散均匀,吸取供试液加入到稀释剂中,再进行薄膜过滤,并冲洗,联合作用下去除了克拉霉素的抑菌活性,提高了克拉霉素微生物污染菌的检出。 参考文献 [1] 中国药典[S].四部,2020;通则1105、1106 [2] 杨薇. 盐酸西替利嗪片微生物限度检查方法的建立[J].中国保健营养,2017, 27(17);116-117作者简介:@昔年,检验员,从事药品检验工作六年,对工作积极热情,期待自己能在本职岗位不断进步,放光发热。智药研习会12月线上课程报名来源:CPHI制药在线声明:本文仅代表作者观点,并不代表制药在线立场。本网站内容仅出于传递更多信息之目的。如需转载,请务必注明文章来源和作者。投稿邮箱:Kelly.Xiao@imsinoexpo.com▼更多制药资讯,请关注CPHI制药在线▼点击阅读原文,进入智药研习社~
中文摘要目的 实验室确认静注巨细胞病毒人免疫球蛋白(pH4)(human cytomegalovirus immunoglobulin for intravenous injection,CMV-IVIG)抑制巨细胞病毒(cytomegalovirus,CMV)感染的有效性。方法 分别通过免疫荧光染色和细胞病变实验测定CMV-IVIG抑制CMV的即早基因1表达和致细胞病变能力,确认CMV-IVIG有效性。结果 即早基因1表达量与病变细胞数量随着制品稀释倍数的增加而增加;27倍稀释的CMV-IVIG可抑制90.77%~95.85%的CMV感染力;103倍稀释的CMV-IVIG可抑制>90%的细胞病变。结论 CMV-IVIG中的中和抗体能特异性中和CMV,阻止CMV感染细胞,且具有良好的量效关系。正文巨细胞病毒(cytomegalovirus,CMV)是疱疹病毒科β属的DNA病毒[1],在发展中国家成年人中感染率可达100%[2]。虽然通常呈隐性感染,但当机体免疫功能低下时,病毒可被激活而发生显性感染[3]。孕妇初次或复发CMV感染引起新生儿宫内感染或围产期感染侵袭胎儿,是导致先天畸形的重要原因之一[4]。目前尚无治疗CMV感染疾病的特效药物,由于抗CMV抗体可以保护特定人群抵抗CMV感染疾病[5-9],因此,目前使用抗病毒药物或联合抗病毒药物和静注巨细胞病毒人免疫球蛋白(human CMV immunoglobulin for intravenous injection,CMV-IVIG)(pH4)预防和治疗 CMV感染疾病[10]。成都蓉生药业有限责任公司(成都蓉生)研制的CMV-IVIG(pH4)系从健康人血浆中筛选含高效价CMV中和抗体(CMV neutralizing antibody,CMV-NA)的血浆,采用成都蓉生分离工艺和成品配方,经两步病毒灭活(低pH孵放和纳米膜过滤)制备的特异性CMV-IVIG冻干制剂,供静脉输注。输注后可迅速提高患者血浆中CMV-NA水平,理论上可通过CMV-NA与CMV中的抗原结合,阻止病毒侵入健康细胞并清除CMV,起到预防和治疗CMV感染及相关性疾病的作用。由于人CMV种属特异性高,难以建立动物模型,因此本品未能做动物实验以验证其药效,只能选择体外药效实验,而离体人源组织和器官珍贵难觅,且涉及伦理规范,我们选择用正规商业来源的敏感人源细胞进行了药效学实验研究。CMV基因组复制缓慢,基因表达具有严格的时相性。即早基因(immediate early gene,IE)1在感染后3 h开始在细胞核中表达,6 h后即可被检出;而CMV晚期基因的转录和翻译发生在感染后的36~48 h[11]。因此,采用免疫组织化学法可使感染CMV的细胞核特异性着色。1材料与方法1.1材料1.1.1 实验样品 成都蓉生研制的6批CMV-IVIG(pH4):V002、V003、V004、V005、V006、V007为2种规格,浓度相同,装量不同,其中V002、V004、V006 为20 000 U(25 ml)/瓶,V003、V005、V007为40 000 U(50 ml)/瓶,制品的纯度分别为98.3%、98.1%、98.3%、98.4%、98.2%、98.4%;分子大小分布分别为99.2%、99.2%、99.1%、99.2%、99.1%、99.1%。复溶后用维持液(含2%胎牛血清的MEM培养基)根据不同实验特点稀释成不同稀释倍数(IE1表达量抑制实验样品:128、256、512······4 096倍;细胞病变实验样品:1 000、1 050、1 100······1 350倍)溶液待用。1.1.2 细胞和病毒株 MRC-5人胚肺成纤维细胞、CMV均购自美国典型培养物保藏中心。1.1.3 主要试剂 MEM基础培养基购自美国Life Technologies公司,胎牛血清购自浙江天杭生物科技股份有限公司,生物素化抗鼠IgG购自美国Jackson ImmunoResearch公司,亲和素化链霉抗生物素蛋白和TrueBlue显色剂购自美国KPL公司,抗CMV IE1单克隆抗体购自美国Merck Millipore公司。1.1.4 主要设备 BSC-1500Ⅱ A2-X生物安全柜购自济南鑫贝西生物技术有限公司,XDS-1B倒置显微镜购自重庆光电仪器有限公司,GL-99T Ⅰ型体视显微镜购自桂林桂光仪器有限公司。1.2方法1.2.1 IE1表达量抑制实验 CMV-IVIG与中和用CMV等量混和,每个浓度样品2个复孔,37 °C、5%CO2中和1 h。然后加入MRC-5细胞于37 ℃、5%CO2培养16~18 h。同时设阳性对照(维持液代替CMV-IVIG)和阴性对照(维持液代替CMV-IVIG和病毒)。经过细胞固定、封闭及加抗CMV IE1单克隆抗体、生物素化抗鼠IgG、亲和素化链霉抗生物素蛋白,最后显色。显色后在体视显微镜下采集各孔图像,用克隆计数软件计数每孔的特异性着色细胞核。降低感染力程度(%)=100-样品孔平均核着色个数÷病毒孔平均核着色个数×1001.2.2 细胞病变实验 CMV-IVIG与同体积的CMV于37 ℃、5%CO2中和1 h后,加入 MRC-5细胞于37 ℃、5%CO2培养48 h,设阳性对照(维持液代替CMV-IVIG)和阴性对照(维持液代替CMV-IVIG和病毒),在倒置生物显微镜下观察MRC-5细胞的致细胞病变程度,记录观察结果。2结果2.1IE1表达量抑制实验结果同体积的不同稀释倍数CMV-IVIG在加入相同量的CMV后,残留病毒数不同,残留病毒感染细胞后在细胞核内表达的IE1数量也不同,经染色后计数结果也不同。稀释倍数越高,特异性着色的细胞核越多,即IE1表达越多,见图1。随着CMV-IVIG稀释倍数的增加,降低病毒感染力的程度减小,病毒感染力增强(IE1表达越多)。在128倍稀释度时,能降低约93%的病毒感染力,而在4 096倍稀释度时50%样品降低病毒感染力的能力已降到0,见表1。2.2细胞病变实验结果同体积的不同稀释倍数的CMV-IVIG能中和的同体积病毒液中的病毒数不同,残存的病毒导致的MRC-5细胞病变的范围程度也不同。随着CMV-IVIG稀释程度的增加,相同体积样品内含有的CMV-NA量也减少,而致细胞病变的程度增加,说明CMV-NA能特异性有效阻止CMV感染细胞,避免细胞发生病变(图2、3)。3讨论目前全球仅有CytoGam®和Cytotect®品牌的CMV-IVIG应用于欧美市场,且已上市多年,国内至今仍无同类产品上市。为了在实验室确认成都蓉生研制的CMV-IVIG产品对CMV的有效性,我们用CMV敏感的MRC-5细胞开展了本研究。从两方面进行试验设计:(1)CMV感染MRC-5细胞数小时后会在细胞核内大量表达IE1,通过组织化学染色使病毒感染的细胞核出现特异性着色现象,且1个着色细胞核代表1个感染并表达IE1细胞[12]。将系列稀释的CMV-IVIG分别与CMV悬液混和,再感染MRC-5细胞。感染细胞培养后,通过对感染细胞中的染色颗粒的计数测定中和后的残留病毒IE1的表达能力。(2)CMV感染MRC-5细胞,在细胞内的繁殖过程引起细胞肿胀变形,由细长梭形变为球形(巨细胞),即细胞病变。将系列稀释的CMV-IVIG分别与CMV悬液混和,然后感染MRC-5细胞。感染后的细胞经过培养,在倒置显微镜下观察残余病毒引起的致细胞病变程度。IE1表达量抑制实验结果中,随着CMV-IVIG稀释倍数的增加,相同体积样品内含有的CMV-NA量也减少,IE1表达越多,即病毒感染力越强,CMV-IVIG 能降低病毒感染力的程度越小,在128倍稀释时,杀灭了绝大部分病毒(平均93%),而在4 096倍稀释时50%样品已无降低病毒感染力能力(IE1表达与阳性对照一致)。细胞病变实验结果显示,随着制品稀释程度的增加,致细胞病变的程度也在增加,说明CMV-NA能特异性有效阻止CMV感染细胞,避免细胞发生病变。成都蓉生研制的CMV-IVIG标示效价单位为可以直接有效中和活病毒的中和抗体效价单位,而非对应病毒抗原片段的抗体总量。我们的体外药效学研究结果显示:产品所含有的特异性中和抗体能有效中和病毒,阻止CMV感染细胞;中和病毒的能力与CMV-IVIG中的中和抗体含量呈正相关,具有良好的量效关系。基于上述结果,该产品应具有相应的临床药效。作者刘波1 吴强2 张航3 李小姣3 李伟4 杨春4 吴佳君5 秦婷婷51成都蓉生药业有限责任公司质量检定部,成都 610219;2成都蓉生药业有限责任公司生产管理部,成都 610219;3北京天坛生物制品股份有限公司科研管理部,北京 100024;4成都蓉生药业有限责任公司血液制品研发部,成都 610219;5成都蓉生药业有限责任公司科研质量部,成都 610219通信作者:秦婷婷,Email:1590825@qq.com引用本文:刘波, 吴强, 张航, 等. 静注巨细胞病毒人免疫球蛋白(pH4)体外药效学研究 [J]. 国际生物制品学杂志, 2023, 46(2): 61-64. DOI: 10.3760/cma.j.cn311962-20220628-00036
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