作者:严家新
目前丽沙病毒属的病毒,即(经典)狂犬病毒和狂犬病毒相关病毒,总共发现有大约18种,可细分为三个系统群(phylogroups)。现有狂犬病毒疫苗是用(经典)狂犬病毒(RABV)制备的,只能针对系统群1的病毒提供较好的免疫保护作用,而对系统群2和3的病毒则效果可能不佳。为了确保人类完全免除所有类型狂犬病毒的危害,有必要开发广谱狂犬病疫苗,能针对各种类型的狂犬病毒都发挥免疫保护作用。由于基因1型狂犬病毒(RABV)以外的17种丽沙病毒绝大多数都以蝙蝠为宿主,目前已知它们对人的危害很罕见,所以长期以来对此类疫苗研发的需求和动力不足,因而经费来源有限,进展缓慢。美国宾州费城的杰弗逊大学和美国CDC的研究人员曾合作在广谱狂犬病毒疫苗研究方面取得重要进展,他们的研究论文于2020年7月21日发表在《Cell Reports (细胞报告)》杂志上,本博客当年曾作过介绍(见相关博文)。
美国费城杰弗逊大学的研究人员在本月10日的《Viruses(病毒)》杂志上又发表论文介绍他们在此项研究中的最新进展。现将这篇新论文的主要内容进行摘译。
摘要:
除(经典)狂犬病毒(RABV)外,世界范围内还发现了大约16种类似狂犬病毒的丽沙病毒。已经描述了与经典狂犬病无关的人类死亡,但病例数量未知,而且这些丽沙病毒引起人类疾病的可能性是不可预测的。目前的狂犬病疫苗可能不能预防某些不同的丽沙病毒,如莫克拉(Mokola)病毒(MOKV)或拉各斯(Lagos)蝙蝠病毒(LBV)。因此,需要一种更广谱的丽沙病毒疫苗。在本文中,我们评估了一种新型的丽沙病毒疫苗,该疫苗使用了一种减毒的RABV载体,其中含有嵌合RABV糖蛋白(G),其中MOKV的抗原位点1取代了狂犬病毒的相应位点(RABVG-cAS1)。利用重组疫苗对小鼠进行免疫,并与同类疫苗进行免疫应答分析。我们的研究结果表明,疫苗RABVG- cAS1具有免疫原性,并诱导了针对RABV G和MOKV G的高滴度抗体。不同丽沙病毒的攻毒研究表明,用MOKV G的相应位点取代RABV G的单个抗原位点,比同源RABV疫苗有显著改善,并能同时预防RABV、伊尔库特病毒(IRKV)和MOKV。这种抗原表位嵌合的策略为构建广谱丽沙病毒疫苗铺平了道路,从而可安全地对抗由这些病毒引起的疾病。
1.前言
丽沙病毒属于丽沙病毒科的丽沙病毒属。除经典狂犬病毒(RABV)外,在非洲、亚洲、澳大利亚和欧洲还发现了来自狂犬病毒属的另外大约16种病毒。这些病毒在遗传上存在差异,具有不同的抗原性,可分为三个系统群:系统群I、系统群II和一个未分类的群[1 - 3]。尽管它们的基因和抗原性不同,但所有丽沙病毒都能在人类中引起致命疾病,症状与狂犬病相似。
狗仍然是人类暴露于经典RABV的主要原因,特别是在犬类疫苗接种计划没有有效执行的地区,如亚洲和非洲。据世界卫生组织(WHO)估计,每年约有5.9万人死于狂犬病,其中40%为15岁以下儿童[4]。
北美为根除狂犬病所做的密集努力取得了成功,导致每年的人类死亡人数减少[2]。然而,典型的狂犬病仍然存在于野生动物中,如浣熊(Procyon lotor)、臭鼬(Mephitis)、豺(Canis)、狐狸(Vulpes)和蝙蝠(Chiroptera),并且在南美洲发现了RABV的新谱系,扩大了储存宿主的名单。美国疾病预防控制中心最近报告称,2009年至2018年,在10例狂犬病病例中,有7例是死于蝙蝠介导的狂犬病[5]。
近年来,越来越多的丽沙病毒被发现可引起人类致命性脑炎,如2000年发现的澳大利亚蝙蝠丽沙病毒[6,7],2006年发现的南非杜文哈格(Duvenhage)病毒[8],2019年发现的俄罗斯IRKV病毒[9],2022年发现的欧洲蝙蝠1型丽沙病毒[10],以及2014年和2006年分别发现的南非莫克拉(Mokola)病毒和拉各斯( Lagos)蝙蝠病毒[11 - 13]。暴露于丽沙病毒后,病毒在暴露部位感染组织,然后通过周围神经系统逆行转运,最终到达中枢神经系统(CNS)并引起脑脊髓炎。在人类中,该疾病通常以非特异性症状(发烧、不适和头痛)开始,随后是焦虑和躁动。当病毒到达中枢神经系统时,它以一种称为离心扩散的现象在周围神经系统中向外扩散,通过神经到达唾液腺等组织,直到整个神经系统衰竭,导致瘫痪和快速死亡[14]。
目前获得许可的狂犬病疫苗在适当的情况下对传统的RABV有效。对于暴露前,在第0、7天和第21或28天接种疫苗,而暴露后的接种计划则在5剂或4剂之间变化[15,16]。狂犬病疫苗保护的相关性取决于靶向病毒表面糖蛋白(RABV G)的中和抗体水平[17]。
狂犬病毒独特的表面RABV G是中和抗体的唯一靶点,人们一直在研究其在融合前后的晶体结构,并确定其抗原位点I、II、III、IV和一个次要的抗原位点“a”[18 - 20]。抗原位点1 (AS1)是一个线性表位,可利用单克隆抗体(mAb) CR57结合RABVG的六个残基KLCGVL (226-231位)进行鉴定[20,21]。其他抗原位点是具有构象且不连续的。丽沙病毒糖蛋白具有57%-78%的相似性[19,22],影响了RABV接种后对非经典狂犬病毒的丽沙病毒的交叉保护。既往研究表明,狂犬病疫苗对中和效价在0.5国际单位[IU]以上的RABV具有保护作用,对其他具有不同中和抗体效价截断点的系统群1的丽沙病毒也具有交叉保护作用[20]。然而,目前的RABV疫苗对来自系统群2的丽沙病毒,如MOKV或属于未分类系统群的非常不同的丽沙病毒,不能诱导中和抗体,也不能提供保护作用[23-25]。
当前的狂犬病疫苗的这一局限性,以及非狂犬病毒丽沙病毒的不断出现[3,26],强调了存在尚未经评估的危险,以及需要一种能够预防由丽沙病毒属的多种病毒引起的人类狂犬病的更广谱有效的丽沙病毒疫苗。之前,我们的实验室设计了一种广谱丽沙病毒疫苗,其中RABV G和MOKV G之间的结构域被交换,产生了嵌合的RABV G,但是使用含有嵌合G的疫苗接种会损害对系统群1中其他丽沙病毒的保护,这导致我们试图重新设计疫苗,以更好地提供针对系统群I的保护[1]。利用结构生物学的最新进展和RABV G和MOKV G的结构[18,19,27],我们的论文提出了一种新的基于RABV G的疫苗,其中包含嵌合AS1的“RABVG- cAS1”,其中来自MOKV G的单个AS1被引入RABV G,取代了真实的AS1。
4.讨论
结构生物学及其相关工具的迅速发展,包括计算生物学、X射线晶体学和单克隆抗体图谱(mapping),已经解析了许多病毒的糖蛋白结构,导致了疫苗开发方法的革命[37]。在本文中,我们提出了一种针对狂犬病毒的下一代疫苗。特别关注狂犬病毒的AS1和莫科拉病毒糖蛋白,以设计和开发嵌合RABV-cAS1疫苗。RABV-cAS1针对系统群I和II狂犬病毒的多种病毒株具有保护作用,同时不会影响对RABV的免疫原性和保护能力。
我们证明,作为一个线性抗原位点[19,21],AS 1(222至252位)是两种不同丽沙病毒(RABV和MOKV)之间替代的功能选择,同时保持重组病毒稳定的复制。先前的研究也试图使用不同的方法开发广谱丽沙病毒疫苗,例如利用活载体表达丽沙病毒糖蛋白,利用多种疫苗结构,以及利用重组狂犬病毒表达丽沙病毒糖蛋白或单一嵌合糖蛋白[29,38]。使用重组狂犬病毒和重组痘苗病毒表达狂犬病毒糖蛋白的活载体策略可能因安全性问题而难以获准用于人体 [38, 39]。建议使用多种疫苗构建体,但这种策略对于低收入和中等收入国家来说成本较高 [40, 41]。最近,一种编码两种G蛋白(RABV G和MOKV G)的重组狂犬病毒导致病毒生长速度降低,并观察到G蛋白的不稳定性 [29]。因此,研究人员基于一种相关的弹状病毒(Rhabdovirus)—口蹄疫病毒在融合前和融合后的结构,创建了一种由MOKV G和RABV G组成的单个嵌合体G [42]。其中,携带嵌合体G的RABV之一(LyssaVax)表现稳定,而另一株则表现出低效的病毒传播和低感染性病毒滴度 [29]。
Fisher等人通过鼻内攻击测试了LyssaVax针对rRABV和rMOKV两种活病毒的保护能力。虽然这种途径是人工的,与自然的狂犬病感染途径不同,但它们对rRABV和rMOKV具有良好的保护作用[29]。同一组研究了LyssaVax对来自系统群I和II的一组LyssaVax病毒产生的血清学模式,但不包括系统群III。虽然LyssaVax可以刺激VNA(病毒中和抗体)滴度来对抗系统群II病毒,但研究表明,它在刺激VNA对抗系统群I中的非RABV病毒,尤其是IRKV和Duvenhage病毒(DUVV)的能力有所下降[29]。Fisher等人的研究确实表明,他们用于开发疫苗的“结构域(domain)”策略减少了一些针对系统群I中不同的丽沙病毒的VNAs的损失。通过在RABV- G载体疫苗中插入一个单一抗原侧面(MOKVG AS1),我们假设在保持对RABV的免疫原性的同时,扩展了对MOKV的免疫原性。本研究显示对MOKVG和RABVG均有较高的IgG滴度。同时,ELISA法对狂犬病免疫小鼠血清观察到异种抗原之间存在交叉反应,与既往研究所显示的相同[29];这些抗体并未介导VNAs(病毒中和抗体)。
我们还假设,与标准疫苗相比,嵌合抗原位点(222-252位)可以提供更广谱的保护,抵御各种丽沙病毒的攻击,同时仍然保持类似的针对经典狂犬病的保护。RABV-cAS1显示了MOKV的AS1在维持针对系统群I的VNA的同时引发针对系统群II病毒的中和抗体的潜力。
这些结果与其他研究一致,这些研究表明每个抗原位点在产生中和抗体时具有特异性。我们的研究结果证实了基于AS1的疫苗方法能够产生持续的免疫应答和特异性中和抗体[43-45]。
在我们的研究中,我们证明了RABV- cAS1 能够产生针对系统群I中两种不同病毒(RABV和IRKV)的中和抗体,而且没有显著差异。通过我们的新方法,这似乎是对嵌合LyssaVax疫苗的重大改进,因为Fisher等人先前发表的尝试表明,在有佐剂和没有佐剂的情况下,LyssaVax丧失了针对IRKV产生VNA的刺激作用[26]。这可能与用于创建嵌合G的设计有关,其中RABVG的抗原位点的更多抗原部分被牺牲。值得注意的是,参与保护的抗原位点并不一定对所有的丽沙病毒都相同。RABV疫苗在系统群I内可出现交叉保护;然而,保护水平是不明确的,可能取决于高水平的 G特异性抗体[46 - 48]。我们的发现与其他研究结果一致,表明现有狂犬病疫苗对IRKV的保护作用最小[48,49]。这种有限的保护最可能的解释是系统群I丽沙病毒内部的抗原变异,因为IRKV与欧洲蝙蝠丽沙病毒和杜文海格(Duvenhage)病毒的关系比与狂犬病毒(RABV)的关系更密切[1,50]。RABV与IRKV的比较表明,抗原位点 I、II和 III 不同,而抗原位点 IV 则完全保守[49,51]。
虽然本文的交叉保护评价仅限于IRKV,但与其他蝙蝠相关的丽沙病毒相比,该丽沙病毒在各种研究中显示出最高的致病性,这解释了为什么现有的基于 RABV的生物制剂对IRKV的攻击只具有部分保护作用[49,51]。此外,在祖先水平上,IRKV、RABV、ABLV、ARAV、BBLV、KHUV、DUVV、EBLV-1和EBLV-2病毒都被归类为一组(系统群I),这表明这些病毒之间应该存在血清学交叉反应[24,50]。其他研究将系统群I分为两个主要世系(lineages):一个包括IRKV、EBLV-1和DUVV,另一个世系包括古北区(Palearctic)(ARAV、BBLV、KHUV和EBLV-2)、澳大利亚(ABLV)、东方(GBLV)和美洲(RABV)丽沙病毒物种[52]。
有趣的是,用RABV-cAS1疫苗免疫的小鼠对wt(野生型)IRKV具有完全的保护作用,而用RABV疫苗免疫的小鼠的保护作用有限。一方面,AS1含有一个具有关键残基LCGV的线性表位,负责CR57和62071-3 mAbs的结合。IRKV AS1与RABV AS1的比对显示IRKV丢失了V230。这种氨基酸变化可能改变单克隆抗体在该线性表位内的结合,扰乱中和作用并限制针对IRKV的保护。最近的研究支持了我们的发现,表明RABV疫苗在动物模型中对IRKV并不完全有效[49,51]。与RABV相比,AS1如何提高针对IRKV的保护尚不清楚。RABV、IRKV和MOKV AS1的计算机分析表明,IRKV AS1与RABV AS1的同源性为64.5%,而与MOKV AS1的同源性为61.3%。然而,IRKV AS1有两个残基R245和D247与MOKV AS1共享,而与RABV-cAS1不共享(补充图S3)。为了证实这一点,未来对这两个残基的分析可能会更好地理解通过MOKV AS1获得的保护。
我们的研究结果强调,虽然MOKV免疫的小鼠得到了充分的保护,但RABV-cAS1疫苗可提供40%的保护,比狂犬病疫苗有显著提高,而狂犬病疫苗对MOKV没有保护作用。这些发现与先前的研究一致,证实RABV疫苗不能针对系统群II的丽沙病毒提供保护[24,25,53]。虽然对wt MOKV的保护只是部分的,但我们认为这与疫苗接种程序无关。需要强调的是,RABV-cASI疫苗的灭活和佐剂添加,采用的是5µg的TLR-4激动剂合成的单磷酰脂质A (Monophosphoryl Lipid A,MPLA),3D (6A)-PHAD (PHAD),制备成含2%角鲨烯(squalene)的油乳剂(SE)。最近对狂犬病载体疫苗的研究表明,使用PHAD-SE作佐剂的灭活疫苗明显改善了疫苗引起的免疫应答[32-34]。
此外,我们在死于疾病的小鼠死后脑组织中发现了MOKVG,但在存活的小鼠中却没有。目前还不清楚疫苗是否能够阻止病毒进入大脑,或者在病毒进入大脑后将其清除。攻击后症状数据显示,经RABV-cAS1免疫的小鼠和经鼻注射wtMOKV的小鼠出现毛发皱褶、嗜睡和体重减轻,但未观察到瘫痪。当对照组在第9天至第10天被安乐死时,两只幸存的老鼠不符合安乐死标准,并在第11天开始恢复。根据图8K所示脑组织的RT-PCR结果,在同一组的三只安乐死小鼠的脑组织中发现了wt MOKV病毒,而在这两只幸存者的脑组织中没有发现。因此,我们推测病毒到达大脑,然后小鼠仍然可能康复,特别是因为wt MOKV攻击是在鼻内进行的。这条途径被证明是快速的,并确保通过嗅觉和三叉神经通路渗透大脑而感染[54-56]。
狂犬病感染后康复是可能的,在人类临床感染和小鼠、狗、雪貂和兔子等动物的实验感染中都有报道[57 - 59]。一旦病毒进入CNS(中枢神经系统),它就会脱离体液免疫反应的保护,除非抗体能够穿过BBB(血脑屏障)。既往研究发现康复与BBB通透性和抗体在脑脊液中的存在相关[59 - 61]。根据已发表的数据,T细胞的活性可以抑制狂犬病毒的复制[62,63],但通过B细胞浸润穿过BBB而产生狂犬病毒特异性抗体对于消除狂犬病毒至关重要[17,61,64]。在正常情况下,BBB阻止血液中的细胞和因子与CNS中的细胞和因子之间的接触。在从CNS组织清除减毒狂犬病毒的过程中,BBB向液相标记物开放,但不向大分子开放。这可能允许神经血管系统中的免疫细胞检测在CNS中产生的化学引诱剂(chemoattractants),并沿着BBB的梯度向上移动到感染组织[61,64]。这些发现与我们的数据一致:狂犬病感染可能在病毒到达CNS组织后仍然得到恢复。
我们的研究提出了一种开发广谱丽沙病毒疫苗的新方法。然而,这项研究有一些局限性。由于MOKV不通过肌肉内途径致病,因此MOKV攻击是通过鼻内途径进行的,这是一种人工途径,由于其靠近CNS,增加了导致严重疾病的风险。此外,由于血清数量有限,我们知道能用于进行交叉保护试验的非狂犬病丽沙病毒的数量有限,而我们认为阈值的确定才能有助于更深入的了解。针对系统群II的其他丽沙病毒拉,例如拉各斯蝙蝠病毒和希莫尼(Shimoni)蝙蝠病毒的保护研究,可能会揭示使用相同的攻击途径具有更好的保护作用,从而能更好地进行数据比较。
重要的是,尽管这种方法新颖,但对系统群I和II的完全保护尚未实现,而且必须扩展到系统群III。开发广谱丽沙病毒需要一种新的策略,在生产稳定的重组病毒和具有丽沙病毒属代表的更广谱抗原的嵌合单糖蛋白之间取得平衡。
5.结论
由于迫切需要一种广谱丽沙病毒疫苗,本研究提出了一种创新的广谱丽沙病毒疫苗策略,将RABVG的抗原位点1替换为MOKVG的抗原位点1。在保持嵌合RABV- G的功能及其对RABV的保护能力的同时,嵌合疫苗能够提供针对IRKV(系统群I中的一种远缘丽沙病毒)的完全保护,以及对MOKV(系统群II中的一种远缘丽沙病毒)的部分保护。
我们的研究是朝着有效的广谱丽沙病毒疫苗迈出的第一步,该疫苗可预防由多种丽沙病毒引起的狂犬病等疾病,目前尚无疫苗或其他对策可供使用。
参考文献:
Ben Hamed, S.; et al., Toward the Development of a Pan-Lyssavirus Vaccine. Viruses 2024, 16, 1107.
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