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感谢关注转发,欢迎学术交流请点击此处链接观看CyberSAR系统详细使用教程瞬时受体电位 A1(TRPA1)是一种电压依赖性、配体门控的离子通道,其激活与多种疼痛状况有关。临床前研究已经证明TRPA1受体在急性、炎症和神经性疼痛动物模型中的作用。TRPA1拮抗剂GRC-17536(Glenmark公司)的临床研究已证实其在疼痛性糖尿病神经病变患者上具有疗效。因此,TRPA1是镇痛药物的潜在靶点。采用高通量筛选(HTS)命中在人和啮齿动物TRPA1均具有活性的化合物15,对其芳香片段、连接基团和环己基片段分别进行SAR研究,发现一种新型的血脑屏障通透性TRPA1拮抗剂(化合物18,BAY-390),该拮抗剂目前正作为开源的探针分子使用。本文梳理了BAY-390的设计策略与优化路线,可为类似项目结构优化提供宝贵经验。图1. BAY-390的优化过程瞬时受体电位 A1(TRPA1)是一种电压依赖的配体门控通道,可渗透一价和二价阳离子。TRPA1在外周和中央神经系统中均有表达,也在胶质细胞,免疫细胞,血管内皮,屏障组织,肺细胞,关节细胞和癌细胞中表达。RPA1通过直接或间接,内源性或外源性,非反应性配体等多种方式激活,并受pH和/或温度的变化影响。内源性介质,如氧化脂质、前列腺素、代谢物和反应分子(即过氧化氢),可在体外激活TRPA1,从而启动Ca2+信号。TRPA1与多种病理疾病有关,如疼痛性疾病、皮肤病、肺部疾病、泌尿生殖系统疾病和胃肠道疾病。特别是,TRPA1受体在急性痛觉、慢性炎症性和神经性疼痛中的作用被广泛研究。TRPA1基因的功能获得突变被证明是导致家族性发作性疼痛综合征的原因。临床研究证明TRPA1拮抗剂2(GRC-17536)对患有疼痛性糖尿病神经病变患者有疗效。在一项I期研究中,TRPA1拮抗剂GDC-0334能够减少TRPA1激动剂诱导的皮肤血流量、疼痛和瘙痒。近年来,多种化学结构分子被鉴定为TRPA1拮抗剂(图2),这些化合物有些具有显著的物种差异,有些物理化学性质,如溶解性、代谢稳定性和血脑屏障通透性等不足,导致仅有少数化合物进入了临床研究。近日JMC报道了有关TRPA1拮抗剂的研究工作。研究人员采用高通量表型筛选方法,命中了化合物15,对该分子进行针对不同的位点开展SAR研究,获得双重抑制人及啮齿动物TRPA1的先导化合物18。采用位置突变的方法,发现化合物18的结合位点在TRPA1的位点1a。化合物18不仅具有良好的药理性质,并且在多种疼痛及炎症模型上显示出体内药效活性。设计和优化过程总结如下:图2. 文献中报道的TRPA1拮抗剂Hit发现研究人员用重组表达人TRPA1和遗传编码钙指示剂GCaMP6的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞进行Ca2+内流检测。针对包含400万个化合物的结构库进行高通量筛选,旨在识别具有可口服等特性的新型TRPA1拮抗剂。其中,化合物15在人类(hTRPA1 IC50=14nM)和啮齿动物(rTRPA1 IC50=1370nM)TRPA1上均具有较高活性(表1)。SAR研究化合物15包含非对映异构体(未知比例),具有合适的亲脂性(log D 4.1),但结构中的硝基结构不利于成药。因此,针对硝基进行修饰(表1):(1)F原子取代硝基后,分离对映体,只有一种对映体((rac)-16)与15几乎等效;(2)Cl或氰基的引入导致活性下降;(3)供电子基团,如甲基(24c)、对甲氧基(24d)或酰胺(24e)的引入,导致完全失去活性;(4)间位F(24f)及氰基(24g)取代,邻对位双F(24h)导致活性明显降低。说明苯环上引入取代基的耐受性较差。去除化合物(rac)-16上的偕二甲基,然后分离单一异构体,得到对人类和大鼠TRPA1活性(hTRPA1 IC50=4.0nM,rTRPA1 IC50=24nM)均明显提高的17(表2)。化合物17的立体化学性质与16a相反,但log D(3.8)改善不明显。进一步对17进行结构修饰:(1)将苯环变为Cl-噻吩27a,对hTRPA1活性相似,但rTRPA1下降。(2)将苯环变为极性杂环(27b−h),导致TRPA1活性下降,且rTRPA1活性下降更明显;(3)将亚甲基连接基团变为O(31)或NH(18,BAY-390),活性高效且亲脂性(logD分别为3.5和3.0)略低于早期化合物。采用圆二色谱(VCD)测定18的绝对立体构型为R,R-构型,该分子表现出更好的溶解度;(4)对化合物18进一步改构,如N上烷基化(32a和32b)或环化(32e和32f),导致活性降低。结合位点研究目前缺乏TRPA1与小分子结合的结构信息,研究人员对hTRPA1进行突变,比较前期发表的不同结构类型的化合物与突变和野生型hTRPA1蛋白结合的研究。图3显示的是化合物4的冷冻电镜(cryoEM)结构。F909T和T874V突变体被称为结合位点1a;M911A突变接近F909,为结合位点1b;N855S突变和G238K/N249S/K270N突变分别为结合位点2和3。图3. TRPA1拮抗剂的结合位点瞬时转染上述突变体及野生型,采用基于荧光的FLIPR钙离子检测,比较目前报道的活性分子对突变型和野生型的活性。如表3所示,大于3倍的变化被认为是显著的,具体分析如下:(1)化合物BAY-390、3、4、5、10和13对T874V和F909T突变体显示活性的显著变化,表明它们结合在TRPA1的位点1a;(2)化合物6对M911A突变体活性差别较小,可能需要双突变(M911A/M912A)才能看到显著的效果;(3)化合物1和2对N855S突变活性发生显著变化,证实了它们与位点2的结合;(4)测试的化合物均未受到G238K/N249S/K270N突变的影响,说明这些化合物都没有结合在位点3;(5)化合物14和7对任何突变体都没有活性损失,化合物14被推测与蛋白内半胱氨酸共价结合,化合物7的结合未知。所述突变研究的结果与已发表的数据一致,表明BAY-390与1a位点结合。BAY-390药理性质评价化合物BAY-390在大鼠肝细胞中的体外代谢稳定性为中等水平(Clblood 2.4 [L/h/kg]),但其具有高渗透性和低外排(CaCo-2A−B:293nm/s;efflux ratio=0.6),合适的溶解度和口服暴露量。在多种动物模型中表现出了良好的疗效,最低暴露量(fu%rat=0.6)均高于体外IC50。BAY-390药效性质评价BAY-390减弱肉桂醛(CA)诱导的大鼠的伤害行为在大鼠足底注射TRPA1激动剂CA会导致TRPA1介导的伤害性反应,其特征是强烈的退缩和舔舐行为(图4A)。使用这种动物模型可以直接研究TRPA1介导的反应,并评估TRPA1拮抗剂的靶向效应。BAY-390口服剂量分别为3、10和30 mg/kg,显示显著减少退缩的数量和舔爪的时间(图4A),从而证实了BAY-390在体内抑制TRPA1激活的能力。给药1h后的游离血浆浓度(3、10和30mg/kg对应浓度为10、35和115nM)达到了体外IC5016nM)。图4. BAY-390在大鼠体内疼痛模型中的药理疗效。(A)肉桂醛(CA)诱导的伤害行为;(B)完全弗氏佐剂(CFA)诱导的炎症性疼痛;(C,D)脊神经结扎(SNL)引起的神经性疼痛BAY-390减少完全弗氏佐剂(CFA)诱导的大鼠炎症性疼痛在大鼠足底注射CFA可引起炎症性疼痛。这种外周炎症性疼痛模型的特征是产生机械性疼痛,可用于评估化合物的镇痛和抗炎作用。如图4B所示,口服BAY-390,在给药2h及4h后,10和30mg/kg给药组均显著减少机械性疼痛。BAY-390逆转大鼠脊神经结扎(SNL)神经性疼痛模型中机械异常性疼痛从SNL手术后的第15天到第24天,连续10天,给药BAY-390(p.o., b.i.d),2小时后进行疼痛测试(图4C)。口服90mg/kg的BAY-390,6天后开始产生明显影响(p<0.05),10天后能够持续保持(p<0.05)(图4D)。先导化合物进一步优化BAY-390的苯胺类代谢物可能会有遗传毒性(Ames)风险,因此进行进一步SAR优化(表4):(1)氰基(34b)取代导致了活性的丧失;(2)Cl原子(34a)取代具有很好的耐受性;(3)取代基位置的变化都降低活性,特别是对rTRPA1;(4)34e具有良好的hTRPA1和中等rTRPA1活性,代谢稳定性(Clblood 2.3 [L/h/kg])也与BAY-390相当,但PK研究显示暴露量(fu%rat=0.36)降低;(5)34f和34g对rTRPA1活性显著下降;(6)吡啶(34d)等杂环的引入耐受性较差(hTRPA1 IC50=440nM,rTRPA1 IC50=6300nM)。结论采用高通量筛选方法,获得Hit化合物15(hTRPA1 IC50=14nM,rTRPA1 IC50=1370nM)。优化活性和理化性质,成功获得先导化合物18(BAY-390),该分子在炎症和神经性疼痛的体内模型中具有良好的药效,适合作为体外和体内探针来研究TRPA1在啮齿类动物临床前模型中发挥的中枢和外周作用。BAY-390已被提供给SGC联盟,供更广泛的科学研究使用。文章来源doi.org/10.1021/acs.jmedchem.2c01830请点击此处链接观看CyberSAR系统详细使用教程药渡Cyber平台整合药物设计思想,挖掘了文献及专利报道的活性结构,通过Cyber平台可以方便快速获得研发人员兴趣靶向结构,以供开拓思路,就TRPA1抑制剂举例如下:1.进入CyberSAR首页,在靶点下拉项中,输入“TRPA1”,选中关联“TRPA1 (Homo sapiens)”搜索TRPA1相关靶点信息。2.在靶点界面选中“化学空间”选项标签下级联“聚类空间”选项卡,可以将CyberSAR平台收录的文献和专利具有关于TRPA1相关实验测试活性的分子以“分子母核聚类“的形式展示。3. 在靶点界面选中“试验数据”选项,可以看到TRPA1靶点分子的活性数据。4.单击分子结构,可见感兴趣分子进一步扩展信息。5.单击“骨架相似“选项卡或者”预测靶点“选项卡,还可以进一步提供结构的衍生类型,可下载进行分子学习。登录方式CyberSAR在电脑浏览器端登录网址:https://data.pharmacodia.com/cybersar/,欢迎猛烈试用。请点击此处链接观看CyberSAR系统详细使用教程如需进一步沟通,请扫码添加微信联系药渡赵博士或药渡CyberSAR沟通群。
口服生物可利用的、可逆的FXIa抑制剂作为新型抗凝血药物,具有较高的安全性和效果,特别适合慢性血栓性疾病的治疗。拜耳公司公开了开发口服FXIa抑制剂Asundexian的优化过程。该化合物首先通过基于结构的设计获得初始Hit化合物3经过替代高能量水分子、优化亲和力、预组织构象、填充额外亲脂口袋、减少代谢软点、掩盖极性氢等方式调整亲和力和每日一次口服给药所需的DMPK,最终获得临床候选化合物Asundexian。Asundexian目前已进入多个III期临床试验,用以治疗房颤和缺血性卒中,展现出广阔的应用前景。本文梳理了Asundexian的设计策略与优化路线,可为类似项目结构优化提供宝贵经验。Fig1. Asundexian的优化过程心脑血管疾病的发病率不断上升,临床上对药物的需求也日益增长。相较于现有药物,FXIa抑制剂能够通过靶向作用体内的凝血途径,从而避免对止血功能产生影响,可是更为安全有效的抗凝血剂。根据中国药物临床试验登记与信息公示平台官网公示,拜耳(Bayer)已登记两项关于口服FXIa抑制剂Asundexian(BAY2433334)的国际多中心(含中国)III期临床研究,针对的适应症分别为预防房颤患者卒中或体循环栓塞,以及预防患有急性非心源性栓塞型缺血性脑卒中或高风险短暂性脑缺血发作患者的缺血性脑卒中。近日JMC报道了有关Asundexian发现工作。研究人员通过基于蛋白质结构的从头设计确定了微摩尔级别的Hit。继续优化平衡效价和吸收,改善代谢稳定性、细胞色素P450相互作用谱和临床DMPK,验证了其药理学功能。整体设计方案贯穿了化合物构象行为和官能团行为的设计思想,保证官能团与目标蛋白的强相互作用,刚化FXIa预组织构象保持重要氢键作用,优化合适的低极性表面,实现效价和吸收的平衡。设计和优化过程总结如下part.01Hit发现研究人员最初对Bayer AG内部包含430万种化合物的数据库进行高通量筛选未得到有效Hit,转而采用SBDD方法进行从头设计可逆,靶向活性位点的化合物。受BMS2007年发表的四氮唑化合物启发,定义口服FXIa抑制剂重要相互作用:(1)亲脂性芳香基团(最好是氯芳基取代基)占据S1口袋;(2)羰基占据氧阴离子孔(OAH),并可与Lys192和Gly193的主链NH基团形成一个或两个强氢键;(3)强氢键受体作用于S1口袋边缘Gly216的主链NH;(4)强氢键供体(如NH基团)作用于捕获水分子(位于Leu39和Ser195之间);(5)Linker携带中性或酸性官能团,能够接受两个氢键(来自Tyr143和另一捕获水分子)(6)由于这个设计概念涉及相对较多的极性官能团,期望使用亲脂性Linker连接。Fig2. FXIa口服抑制剂的重要相互作用以杂芳香核为中心进行枚举,经过对接、能量评价,获得化合物3,具有微摩尔效价,对其他丝氨酸蛋白酶(如凝血酶、FXa、胰蛋白酶)具有良好的选择性(所有IC50均大于50μM)。Fig3. 苗头化合物3及其作用模式part.02Lead寻找使用表征配体结合口袋内容纳估计结构和能量的分子动力学方法watermap,计算底物结合口袋中的水分子的作用能和熵变,寻找能量贡献位点(S1>S2>S1`>S1边缘>EBP)。为了提高化合物3的效力,邻位取代P1氯芳基额外填充EBP和S1`。并通过预组织吡啶酮和氯芳基环之间的二面角来进一步提高药效。研究人员提出,这个由FXIa共晶的3的这个二面角理想角度为-66°。目标设定为探索由一个或两个非氢原子组成的相对较小的,极性不太强的取代基占据EBP,经枚举对接排序,结果表明o-CN为局部最优。S1`口袋的能量不利的水分子,以亲脂性基团取代,化合物效力增加了10倍以上。探索C5取代基,旨在与主链Gly216形成相互作用,枚举各种取代基与EBP组合,计算排序。Cl取代物通过构象限制效价提高6倍。通过引入OCH3提供与Gly216主链形成氢键,效价提高29倍。化合物24,FXIa效价IC50为2nM,clogD7.5为1.6,性质良好,接下来优化人血浆抗凝活性。进一步探索P1`基团,引入甲氧乙基取代基,醚氧与Ser195捕获水分子的额外氢键作用,抗凝血活性有所增加,整合入环醚,提高了溶解度。在这个过程中化合物34被认为是综合性质最好的化合物,被用于首次人体研究评估,然而,化合物34口服暴露量和人类半衰期的不达预期。推测需要修改其羧酸部分。part.03P2`的调整由于中心酰胺键NH与Leu39通过水介导形成的相互作用必不可少,必须保持此苯胺结构;为了避免潜在毒性,需使用Ames阴性苯胺;并保证同时与His38、Arg37D和Tyr143形成氢键。枚举一系列非酸性P2`基团。用FEP+计算结合自由能,化合物43二氢吲唑啉酮满足条件,但tPSA高,Caco-2实验中几乎没有渗透性,并且显示高外排。将二氢吲唑啉酮改成氨基甲酰基(其中NH2一个氢参与分子内氢键,掩盖极性)或其他非酸性P2`衍生物提高了渗透性,但大鼠体内清除率较高,需要改善。part.04再次调整P1`调节代谢稳定性研究分子在大鼠和人肝细胞中的代谢发现,P1`是代谢软点,采用保持P1`小,减少代谢位点的策略优化得到乙基取代。part.05再次调整EBP提升效力根据体内药理学对单一立体异构体的效价目标为个位数纳摩尔级别,aPTT实验中延长血浆凝固时间,实验体积下,EC50<50μM。调节理化性质放弃了P2`羧酸,P1`烷基醚的扩展,再次调整效力的空间只剩EBP。选取五元杂芳基进行探索,希望通过调整C5,N4调整提高效力维持渗透。枚举组合,计算FEP+排序。测试后分析SAR,得出五元杂环以卤素原子取代后,卤素与Gly218主链NH形成氢键;杂芳环上邻三唑提升氢键强度。EBP最好的片段为1,2,3-三氮唑-1-基。part.06P2`再评价和candidate选择确定氯、三氟甲基或二氟甲基取代基的三唑为EBP首选,甲基或乙基小烷基是P1`的有利选项之后,再次优化P2`。尝试了不同取代考量CYP3A4抑制、Ames测试、外排、代谢稳定性等原因确定F取代的氨基甲酰基为最优片段。最后的修饰周期设计了3*3矩阵:CHF2、CF3、Cl;Me、Et、n-Pr;确定80(Asundexian)为候选化合物。临床候选物Asundexian的结合特征Fig4. Asundexian的结合特征P1氯芳基与Tyr228形成π-阳离子相互作用,取代能量不利的水分子;中心酰胺NH形成水介导的氢键;末端P2酰胺一个氢与Tyr143的酚羟基之间形成氢键;酰胺羰基与Arg37D形成一个氢键,与His414形成水介导的氢键;取代三氮唑的一个氟与Gly218形成氢键;乙基指向S1 '口袋形成亲脂作用;甲氧基氧和Gly216之间形成氢键;吡啶酮羰基与OAH中Gly193, Ser195形成氢键。Fig5. Asundexian的优化过程对Asundexian的深入评价显示,在缓冲液中测试IC50=1.0 nM和在人血浆中接触激活后测试IC50=0.14 μM,对FXIa具有有效的可逆抑制作用。Asundexian抑制FXIa最接近的同源物人血浆钾激肽,缓冲液中的IC50值为6.7 nM,人血浆中的IC50值为1.23 μM。Asundexian对与止血系统相关的丝氨酸蛋白酶,包括FVIIa、FIXa、FXa、FXIIa、凝血酶、尿激酶、组织纤溶酶原激活剂、活化蛋白C或纤溶蛋白,以及其他与口服给药途径相关的潜在重要蛋白酶,如胰蛋白酶、凝乳胰蛋白酶和钙脱蛋白(凝乳胰蛋白酶C),显示出超过1000倍的良好选择性。在人血浆中加入Asundexian后,aPTT实验的凝血时间延长,EC150为0.20 μM(以最终检测体积150 μL计算),以血浆浓度(50 μL)计算EC150为0.61 μM。家兔、犬、小型猪和豚鼠血浆样品的aPTT均有延长,EC150值分别为4.5、4.8、1.5和6.4 μM,而小鼠和大鼠血浆样品(EC150>30 μM)的凝血时间未见延长。在体内,通过多种血栓形成模型测定了Asundexian的抗血栓作用。在FeCl2诱导的兔颈动脉损伤模型中,与对照动物相比,剂量依赖性地减少血栓重量,在最高剂量下以预防方式静脉注射,几乎完全减少了血栓重量,ED50为380 mg/L。而在同时进行的耳出血时间测量中,未观察到影响。当Asundexian与抗血小板药物(阿司匹林和替格瑞洛)联用时,这种不增加出血时间的强抗血栓疗效得到了证实,并得到了静脉血管(FeCl2诱导的家兔颈静脉损伤)和动静脉分流模型研究的支持。当以PEG/乙醇/水溶液的10和30 mg/kg剂量家兔口服给药时,分别使血栓重量减少30%和91%。对于早期化合物,可逆的和时间依赖性的CYP抑制是一个至关重要的参数。Asundexian对CYP1A2、CYP2A6、CYP2B6、CYP2C19、CYP2E1、CYP2J2和CYP3A4活性的影响不超过最高测试浓度(IC50>41 μM)。对CYP2C8(IC50=3.6 μM)、CYP2C9(IC50=17 μM)、CYP1A1(IC50=13 μM)和CYP2D6(IC50=19 μM)有较弱抑制。此外,Asundexian与NADPH补充的人肝微粒体预孵育(30 min)后,仅对CYP3A4的抑制效力略有增加(IC50=17 μM)。在人肝细胞中进一步研究,未观察到对CYP3A4抑制剂量依赖性。在Caco-2细胞肠吸收模型中,Asundexian表现出高通透性[Papp(A−B)=143 nm/s]和中等流出比7。使用平衡透析法3H标记原药测定血浆中游离Asundexian,在大鼠(2.4%)、猴(6.2%)和人(6.4%)血浆中游离中等,犬(10%)和家兔(14%)血浆中游离率较高。雄性Wistar大鼠和雌性beagle犬经静脉(0.3 mg/kg)和口服(1.0 mg/kg)给药后,Asundexian显示低清除率(大鼠0.46 L/h/kg,犬0.19 L/h/kg),高分布体积(大鼠0.76 L/kg,犬1.80 L/kg),中高生物利用度(大鼠60%,犬97%)。part临床I期实验结果Asundexian显示出一致的PK/PD关系,药效学参数(如抗凝血活性(aPTT)和FXIa抑制活性呈剂量依赖性变化,而出血时间在所有剂量组中一致,与安慰剂相似。没有观察到临床相关的出血事件或对出血时间的影响。在单剂量和多剂量人体药代动力学研究中,Asundexian暴露量呈剂量依赖性,口服生物利用度高,经速释片给药后,几何平均消除半衰期约为14 - 17小时。因此,Asundexian是一种有潜力日给药一次的临床候选化合物,在房颤患者PACIFICAF18(NCT04218266)、非心源性卒中患者PACIFIC-STROKE19(NCT04304508)和急性心肌梗死患者PACIFIC-AMI 20(NCT04304534)三个II期剂量研究中研究了其有效性和安全性。目前,正在进行房颤患者以及非心源性缺血性卒中或高风险瞬时缺血性发作患者中预防卒两项OCEANIC III期研究,涉及多达30,000例患者(OCEANIC-AF和OCEANIC-STROKE),以验证Asundexian的有效性和安全性。美国食品和药物管理局(FDA)已批准Asundexian作为非心脏栓塞性缺血性中风患者二级预防的潜在治疗药物的快速通道资格。文章来源:doi.org/10.1021/acs.jmedchem.3c00795药渡cyber平台整合药物设计思想,挖掘了文献及专利报道的活性结构,通过cyber平台可以方便快速获得研发人员兴趣靶向结构,以供开拓思路,就FXIa抑制剂举例如下:1进入CyberSAR首页,在靶点下拉项中,输入“FA”,选中关联“FA11(Homo sapiens)”搜索FXIa相关靶点信息。2在靶点界面选中“化学空间”选项标签下级联“原始结构视图”选项卡,可以将CyberSAR平台收录的文献和专利具有关于FXIa相关实验测试活性的分子以“研发阶段时光轴“的形式展示。其中绿色字体高亮的”数据挖掘“即为潜力Hit。3可见FXIa抑制剂中处于早期研发的深度挖掘数据计408条。4单击分子结构,可见感兴趣分子进一步扩展信息。5单击“骨架相似“选项卡或者”预测靶点“选项卡,还可以进一步提供结构的衍生类型,可下载进行分子学习或者认知发散。登录方式CyberSAR在电脑浏览器端登录网址:https://data.pharmacodia.com/cybersar/,欢迎猛烈试用。如需进一步沟通,请扫码添加微信联系药渡赵博士或药渡CyberSAR沟通群。
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100 项与 Arkansas Central Primary Care, Pllc 相关的转化医学