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中文摘要目的 评价重组流感病毒H7N9血凝素(hemagglutinin,HA)亚单位疫苗在动物中的免疫效果。 方法 利用杆状病毒系统表达分泌型的HA片段,单独或联合Al(OH)3佐剂腹腔注射免疫BALB/c小鼠后,对小鼠进行H7N9毒株的攻击。分析重组H7N9 HA(rH7HA)的免疫保护效果。结果 rH7HA加Al(OH)3佐剂与rH7HA单独免疫相比,在血清中诱导了更高的IgG滴度。最高剂量(1.500 μg)rH7HA加佐剂组诱导IgG滴度达215,单独诱导IgG滴度达213,但两者之间差异无统计学意义,说明免疫小鼠的rH7HA量达到1.5 μg即能够对同源病毒的感染提供保护。结论 杆状病毒系统表达的分泌型HA通过腹腔注射能够保护小鼠抵抗致死性剂量的同源病毒的感染。正文自2013年以来,已有数起H7N9禽流感病毒家庭群集感染病例报告,引起5次局部流行[1]。H7N9的血凝素(hemagglutinin,HA)、神经氨酸酶片段分别来自于H7N3及野生禽类和家禽类共同来源的多株H2N9和H11N9 [2]。HA是中和抗体的主要靶点,基于其结构和抗原性的不同可分为18个亚型(H1—H18)[3]。由于HA头部区的序列和抗原性易发生变异,因此大部分HA头部结构域特异性抗体仅对一种或少数几种亚型的HA产生保护作用[4]。研究表明,HA在没有跨膜区域的情况下仍然可以维持三聚体构象[5]。为应对流感病毒的抗原漂移,疫苗株必须每年更换,安全、快速的重组蛋白技术随之成为疫苗开发的热点。动物模型研究表明,从重组杆状病毒系统中纯化的重组蛋白和病毒样颗粒能够诱导显著的免疫应答[6]。本研究目的是利用杆状病毒表达系统,通过Sf9细胞表达H7N9的分泌型HA并鉴定,以BALB/c小鼠为动物模型,腹腔注射重组H7N9 HA(rH7HA)或rH7HA辅以佐剂免疫小鼠,评价免疫应答情况和对小鼠的保护效果。1材料与方法1.1材料Sf9细胞购自美国Invitrogen公司,H7N9病毒保存于上海生物制品研究所有限责任公司第四研究室;载体质粒pFastBacHTA、感受态细菌DH10α购自日本TAKARA公司,感受态细菌DH10BacTM购自美国Invitrogen公司。无特定病原体级6~8周龄BALB/c雌性小鼠,体质量~18 g,购自上海市计划生育科学研究所实验动物经营部,许可证号:SCXK(沪)2018-0006。限制性内切酶(KpnⅠ、NotⅠ)购自美国New England Biolabs公司,2 kb DNA Ladder、1 kb DNA Ladder、Prestained Protein Ladder、氨苄青霉素、庆大霉素、卡那霉素、四环素购自生工生物工程(上海)股份有限公司(上海生工),PureLinkTM Hipure Plasmid Midiprep Kit购自美国Invitrogen公司,BCA蛋白质定量检测试剂盒购自美国Thermo公司,CpG佐剂由上海生工合成,辣根过氧化物酶(horeradish peroxidase,HRP)标记的山羊抗小鼠IgG和山羊抗兔IgG购自美国Southern Biotech公司,AF488标记山羊抗小鼠IgG购自北京全式金生物技术股份有限公司;PCR System 9700 PCR仪购自美国Applied Biosystems公司,AKTA explorer 100购自美国GE公司。1.2重组质粒及重组杆状病毒质粒构建将目的基因H7N9毒株HA的胞外段与线性化的pFastBacHTA载体连接后形成重组质粒pFastBacHTA-sHA,转入含穿梭质粒Bacmid的感受态DH10BacTM中,通过抗性和蓝白斑筛选,白斑为外源基因插入到杆状病毒基因组中得到的重组杆状病毒质粒Bacmid-sHA。外送上海生工测序。1.3重组杆状病毒扩增将Bacmid-sHA转染到Sf9细胞中,5 d后收集上清得到P1代病毒,P1代杆状病毒感染Sf9细胞进行病毒扩增72 h后收获P2代病毒,以此类推收获P3代重组杆状病毒。1.4细胞间接免疫荧光染色收集质粒转染或接种杆状病毒的6孔板细胞上清,6孔板中已经贴壁的细胞用PBS浸洗,用70%乙醇4 ℃固定30 min,PBS浸洗,用PBS+0.5% Triton X-100(PBST)室温通透20 min,PBS浸洗,加入小鼠抗HA抗体,37 ℃孵育1 h, PBS浸洗3次,每次5 min,晾干,加入AF488标记的山羊抗小鼠IgG(1:100—1꞉500稀释)。37 ℃孵育45 min,于显微镜下观察。1.5重组蛋白的鉴定收获重组杆状病毒感染的P3代Sf9细胞上清,经12% SDS-PAGE分离后,电转至聚偏氟乙烯膜,封闭1 h;将膜从封闭液中转至兔抗HA单克隆抗体(1:5 000稀释),4 ℃孵育过夜;PBST洗涤3次,加入HRP标记的山羊抗兔IgG(1:5 000稀释),室温孵育1 h;PBST洗涤3次,显影观察。1.6重组蛋白免疫效果评价rH7HA免疫剂量分为0.015、0.150、1.500 μg,单独或辅以0.5 mg/ml Al(OH)3佐剂腹腔注射免疫小鼠2次,间隔3周,每次免疫后收集血清,ELISA检测抗体滴度。用抗体稀释液将血清26~217倍稀释,加入包被2 μg/ml的H7N9裂解疫苗过夜后的96孔板中,37 ℃孵育1 h,加入100 μl/孔1:4 000稀释的HRP标记山羊抗鼠IgG,37 ℃孵育30 min,加入显色液避光5 min,读数。1.7同源病毒感染后肺匀浆的病毒滴度检测将Mardin-Darby犬肾(Mardin-Darby kanine kidney,MDCK)细胞接种于96孔板中,37 ºC、5% CO2孵育24 h。取各组小鼠的肺匀浆,用病毒培养液连续进行10倍稀释至10-1—10-8,加入终浓度5 μg/ml TPCK-胰蛋白酶。MDCK细胞用PBS洗3遍,接种各个稀释度的病毒液,每孔100 μl,每稀释度4个复孔,最后1列做阴性对照,于35 ℃湿盒中孵育1 h,之后每孔补加100 μl病毒稀释液,每日观察细胞病变。待细胞病变停止发展时(通常72~96 h),检测每个稀释度病毒的红细胞凝集滴度,利用Spearman-Karber法计算TCID50。1.8攻毒实验小鼠按照60 mg/kg麻醉剂量进行腹腔麻醉,酌情增加剂量,待小鼠进入深麻状态,两侧鼻孔交替滴加20 μl 10倍半数致死量A/Shanghai/02/2013(H7N9)(疫苗株NIBRG-267的鼠肺适应株)病毒液,使其完全吸收。1.9统计学分析用GraphPad Prism 6.0软件分析实验数据,用t检验比较实验组间以及实验组和对照组间结果,P<0.05为差异有统计学意义。2结果2.1质粒鉴定抽提H7N9的基因组RNA,通过试剂盒逆转录为cDNA,以cDNA为模板,进行目的基因的扩增,用1%的琼脂糖凝胶鉴定,rH7HA的基因大小约1 600 bp,与预期一致。将目的基因与线性化的载体pFastBacHTA连接后形成重组杆状病毒质粒,测序结果表明目的基因序列正确。2.2重组杆状病毒质粒鉴定将pFastBacHTA-sHA转移载体转入含穿梭质粒Bacmid的DH10BacTM感受态中,经过2次蓝白斑筛选,获得阳性克隆,用M13通用引物对阳性和阴性对照质粒进行PCR,初步验证转座是否成功。阳性克隆目的条带大小约3 800 bp,阴性对照条带大小约300 bp,测序结果正确。2.3间接免疫荧光检测将处于对数生长期的Sf9细胞接种于6孔板中,以感染复数0.5接种重组杆状病毒,留1孔接种野生型杆状病毒作为阴性对照,于27 ℃孵箱中培养72 h后,间接免疫荧光检测结果如图1。2.4蛋白表达鉴定用蛋白印迹法检测P3代细胞上清,同时使用HA特异性抗体和抗组氨酸一抗检测(图2)。rH7HA在Sf9昆虫细胞中可以正常表达,并且组氨酸标签蛋白也正常表达,HA特异性抗体检测证明,表达的蛋白在目的蛋白大小位置。2.5rH7HA在BALB/c小鼠体内的免疫原性用低(0.015 μg)、中(0.150 μg)、高(1.500 μg)3个剂量rH7HA单独或辅以Al(OH)3佐剂间隔3周免疫小鼠2次,对照组给予PBS,在初次和2次免疫2周后分别取血检测小鼠体内IgG抗体滴度。结果(图3)显示,2次免疫后低、中、高剂量组及相应含佐剂组诱导产生血清抗体IgG滴度较初次免疫后均增加,且差异有统计学意义(t值分别为5.66、10.00、8.50、5.00、6.37、8.50,P值均<0.05)。但高剂量rH7HA辅以佐剂组(215)和无佐剂组(213)诱导的IgG滴度间差异无统计学意义。2.6rH7HA免疫对同源病毒感染的保护为了验证rH7HA和Al(OH)3佐剂效果,2次免疫后2周,用20 μl的10倍半数致死量A/Shanghai/02/2013(H7N9)滴鼻攻毒小鼠,每组9只,攻毒后小鼠的存活率见图4A,体质量减少情况见图4B。结果显示,通过腹腔注射免疫,单独高剂量和高剂量组辅以佐剂都能提供完全的保护,体质量下降幅度基本一致,小鼠体质量第7天开始恢复,中剂量组辅以Al(OH)3佐剂提供了部分保护,小鼠体质量减少超过20%,说明中剂量rH7HA即使加了Al(OH)3佐剂也不能提供完全保护。2.7同源病毒感染后的肺匀浆病毒滴度为分析rH7HA免疫后提供的保护作用,同时检测了接种小鼠感染同源病毒后第3天肺部病毒滴度情况,结果见图5。低剂量组及低剂量+佐剂组与对照组间差异均无统计学意义,肺部病毒滴度较高;中剂量(t=13.82)、中剂量+佐剂(t=16.31)与对照组间及高剂量(t=10.58)、高剂量+佐剂组(t=12.17)与对照组间差异均有统计学意义(P<0.001),中剂量和高剂量组间(t=4.26)及中剂量+佐剂和高剂量+佐剂组间(t=5.10)差异也均有统计学意义(P<0.05);高剂量组及高剂量+佐剂组肺部病毒滴度均较低。肺部病毒滴度的实验结果与保护率结果相符。3讨论在突发流感病毒大流行时,通常以依赖和不依赖鸡胚的两种方式生产的疫苗来应对,疫苗辅以佐剂可以减少疫苗抗原剂量和增强其免疫原性。H7N9流感病毒感染可导致人类死亡,需要一种较高免疫原性的疫苗来预防病毒感染。本研究通过杆状病毒系统表达rH7HA并对其免疫原性进行研究,提供了一种新的候选H7N9疫苗。目前有报道的H7亚型疫苗,无论是鸡胚或细胞来源的重组蛋白还是减毒流感活病毒,均是低免疫原性的,需要佐剂来增强其免疫原性[7]。铝佐剂是首个被美国FDA批准用于人用疫苗的经典佐剂。研究表明,铝佐剂能激活Th2细胞分泌IL-4,诱导MHC-Ⅱ类分子的表达,进而产生体液免疫应答[8]。杆状病毒由于其生物安全性高、克隆容量大、细胞毒性低,易于操作和生产,已成为一种有前途的疫苗载体和基因载体。流感病毒HA是一种三聚体分子,是流感病毒表面糖蛋白,具有较强的免疫原性,是疫苗研制开发的主要靶蛋白。杆状病毒感染昆虫细胞表达HA,具有避免与活流感病毒接触、生产快速、产量丰富等优点,被广泛应用于流感亚单位疫苗生产[9-10]。Pushko等[11]和Krammer等[12]均证明杆状病毒系统表达的低聚和三聚HA疫苗同样具有有效的保护作用。考虑到HA三聚体的结构,需要引入一段维持三聚体结构的序列来取代HA的跨膜区和胞内区,以使表达的HA维持天然构象并且增强免疫原性,但该序列对HA来说是外源引入的,将其作为疫苗会有新的风险。与之相比,胞外段的HA避免了这些安全问题。Flublok疫苗即是利用杆状病毒系统在昆虫细胞中表达的HA,其结构与野生型流感病毒的HA相似,是美国FDA批准的第一种重组HA流感疫苗,用于成年人预防流感。通过模拟流感病毒抗原漂移设计的Flublok疫苗,可以预防突然出现的新型流感[6]。本研究利用杆状病毒系统成功构建和表达了分泌型HA,但还需进一步摸索HA亚单位疫苗的详细工艺,以达到产量最大化。腹腔注射rH7HA免疫BALB/c小鼠后,能够增强诱导特异性IgG抗体的产生。通过检测小鼠肺内病毒滴度发现,与对照组相比,高剂量组小鼠可成功对抗流感病毒的感染,提示用达到一定剂量的rH7HA免疫小鼠,即使不辅以佐剂,针对致死剂量的同源病毒攻击也能提供完全的保护。杆状病毒表达系统表达分泌型的HA单体,具有简便、产量丰富、纯度较高、免疫原性和活性较强等优点,是有前途的流感疫苗候选抗原表达系统。在应对季节性流感时,使用基于杆状病毒系统表达的分泌型HA单体也能及时生产与其HA相匹配的有效亚单位疫苗。作者杨雪 许文婷 姜凤婷 罗剑 陈则上海生物制品研究所有限责任公司第四研究室,上海 200051通信作者:罗剑,Email:rojjer2009@hotmail.com;陈则,Email:chenze2005@263.net引用本文:杨雪,许文婷,姜凤婷,等. 杆状病毒系统表达的重组H7N9血凝素亚单位疫苗的免疫保护效果 [J]. 国际生物制品学杂志, 2022, 45(2): 76-80. DOI: 10.3760/cma.j.cn311962-20210830-00048《国际生物制品学杂志》为中华医学会系列杂志,创刊于1978年10月,目前由中华人民共和国国家卫生健康委员会主管、中华医学会和上海生物制品研究所有限责任公司主办。现任主编李秀玲,编委团队共75人,审稿专家101人。本刊重点介绍国内外生物制品学领域的新进展、新动态、新技术和新成就,设有述评、综述、论著、短篇论著、病例报告、学习交流、国际会议介绍等栏目。投稿流程:登录中华医学会杂志社远程稿件管理系统http://cmaes.medline.org.cn,选择《国际生物制品学杂志》进行投稿。识别微信二维码,添加生物制品圈小编,符合条件者即可加入微信群!请注明:姓名+研究方向!版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的,且明确注明来源和作者,不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com),我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点,不代表本站立场。
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