背景肿瘤微环境 (TME) 是肿瘤发生、发展、反应和抗肿瘤治疗的重要因素,在肿瘤的预后和抗肿瘤药物作用等方面起着重要作用;肿瘤微环境中的免疫环境也受到热门的关注,例如在进行抗肿瘤药物开发时,常常会开发靶向免疫检查点的药物,一旦成功,通常可以产生持久的抗肿瘤效应。图1.免疫细胞对肿瘤微环境的影响 图源:Anderson NM, Simon MC. The tumor microenvironment. Curr Biol. 2020 Aug 17;30(16):R921-R925. PMID: 32810447肿瘤免疫疗法的出现改变了传统的癌症治疗模式,研究并鉴定免疫检查点抑制剂疗效相关的生物标志物尤为迫切和重要。多重免疫组化技术 (mIHC)能够在同一组织切片中同时评估多种生物标志物的表达情况,可作为肿瘤免疫和生物标志物研究的有力工具。多重免疫组化(mIHC)技术顾名思义,多重免疫组化技术可以在一张组织切片上进行多重生物标志物检测的技术,主要利用不同标记物标记的抗体识别组织切片上的靶蛋白,再通过不用的实验平台或者专业仪器实现图像的采集与分析。由于获得的生物学信息众多,不仅可以对组织细胞原位靶标类别、组分、表达量等信息进行分析,还可以研究各靶标相互作用的空间位置信息, mIHC 技术在肿瘤微环境,肿瘤异质性及肿瘤发生发展等研究中均能发挥重要。技术优势✔多靶标同时检测与分析,同步揭示原位表达量及定位情况✔易于对空间位置信息进行分析,可区分细胞亚群并分析细胞社群关系✔实验材料抗体选择可以不用考虑不同种属搭配,降低选择难度✔分析灵活,多靶标染色结果可自由组合进行分析,也可单独拆分信号代表性技术01TSA技术TSA 技术即酪酰胺信号放大技术(Tyramide signal amplification),其主要原理是酪胺(Tyramide)的过氧化物酶反应(酪胺盐在 HRP 催化H202下形成共价键结合位点),产生大量的酶促产物,该产物能与周围的蛋白残基(包括色氨酸、组氨酸和酪氨酸残基)结合,使得蛋白样品与荧光素稳定结合,该方法可在一张组织切片上实现7-9种靶标的标记。图2.TSA技术染色原理图源https://www.dxy.cn/bbs/newweb/pc/post/42436215TSA 技术利用循环染色的方式实现多重荧光标记,酪胺荧光素与靶蛋白的结合是共价结合,而一抗与靶蛋白之间的结合是非共价结合。利用这一特点,采用微波加热的方式可以去除已经结合的一抗,第一轮的一抗二抗被洗脱,荧光标记的酪胺仍附着在靶标周围。检测第二个靶标时,相当于全新的一轮标记,无需考虑第二轮的二抗是否与第一轮的抗体产生种属交差。只需变化不同荧光标记的酪胺即可实现多个靶标的标记,因此即便选择同一种属的抗体,也不会影响实验结果。图3.人扁桃体组织TSA技术染色结果 anti-PD1 (ab237728; orange; Opal™520), anti-PDL1 (ab237726; green; Opal™540), anti-CD68 (ab192847; yellow; Opal™570), anti-CD3 (ab16669; red; Opal™620), anti-Ki67 (ab16667; light blue; Opal™650) and anti-PanCK (ab7753; grey; Opal™690); DAPI (dark blue).02成像质谱流式成像质谱流式(Imaging Mass Cytometry,IMC)创新性的使用金属标签抗体(主要是镧系金属)标记单细胞悬液或者组织切片样本,以质谱作为检测手段,从根本上解决了传统荧光标记技术由于光谱叠加导致的串色问题,可以实现数十种抗体标记物检测,可以对样本的细胞亚群和功能进行全面和精细的分析。图4.质谱流式成像技术原理及工作流程图源:Marion Le Rochais .Application of High-Throughput Imaging Mass Cytometry Hyperion in Cancer Research. Front. Immunol.13, 1664-3224(2022)成像质谱流式用的抗体是镧系金属元素及其同位素标记的标签抗体,使用金属元素进行标记的优点是:01在细胞内含量少,不会引起高的背景噪音干扰。而荧光流式会面临样本自发荧光的干扰;02不会影响细胞正常的生理功能;03ICP 质谱装置分辨率高,彼此信号无干扰,无需通过计算补偿。目前用来标记抗体的商品化金属标签抗体有 180 多种,如果所需标记的靶点没有已经标记好的抗体,需要自行购买相应靶标的无载体抗体与 Maxpar® X8 试剂盒进行抗体标记后,再进行相关实验。图5. MaxPar® X8试剂盒进行抗体金属标记过程图源:Maxpar Antibody Labeling User GuidePhenoCycler-FusionPhenoCycler 解决方案(原 CODEX®)核心原理是利用特异性寡核苷酸“条形码标签”(Barcode)标记对抗体进行标记后进行组织成像。成像所需的荧光染料和 Barcode 互补的寡核苷酸序列特异性结合,首轮加入的荧光染料会收获第一轮染色结果,多轮 Barcode 的加入收集染色图片,最终可实现 100 种或更多蛋白指标的同时检测及分析。图6. PhenoCycler 工作原理及流程图源:https://www.akoyabio.com近期Akoya Biosciences首次展示在PhenoCycler-Fusion 单细胞原位空间组学分析系统上获得的全新的整张组织片上 103 个标志物的数据集,揭示了基于癌症特征的 103 个标志物的抗体组合如何在口咽鳞状细胞癌样本中揭示独特的免疫、代谢和应激特征。图7.Akoya-Abcam 单细胞原位 103 个标记物空间表型数据海报图源:Abcam 公众号获得可靠的超多重单细胞原位空间组学分析数据的关键因素之一是所用 DNA Barcode 偶联抗体的特异性和灵敏度。在这项对人口咽鳞状细胞癌样本的 103 重单细胞原位空间表型分析中,52 个需要做偶联的靶点抗体中,有 39 个来自 Abcam 重组 RabMAb 兔单抗。Abcam为多重成像实验提供高品质产品Abcam 针对多种 mIHC 平台 (如循环染色、质谱成像流式、GeoMx®DSP)均有经过验证的高特异性重组抗体,无载体抗体及直标一抗等产品提供,可以为关键靶点在肿瘤微环境 (TME) 中的多重成像提供支持,多方面保证多重组化实验的顺利开展。Abcam多重组化产品系列一10000 多种经 IHC 验证的目录产品和部分循环染色技术验证的抗体。Abcam多重组化产品系列二超过 4000 种经 IHC 验证的无载体抗体,适用于基于寡核苷酸(InSituPlex®,CODEX®,GeoMx®DSP等技术)或者金属原子偶联抗体(IMC™)的超多重染色方案。Abcam多重组化产品系列三经 IHC 验证的直标一抗,在需要检测两到三个靶标时,可以考虑使用直标一抗进行染色,该方案中使用直标一抗可以简化实验环节,无需使用荧光二抗。 欢迎至 Abcam 官网搜索多重组化产品信息向上滑动查看参考文献[1]Zou W. Immunosuppressive networks in the tumour environment and their therapeutic relevance. Nat Rev Cancer,5(4):263-274(2005)[2]Leone, R.D., Powell, J.D. Metabolism of immune cells in cancer. Nat Rev Cancer 20, 516–531 (2020).[3] Topalian S L, Drake C G, Pardoll D M. Immune checkpoint blockade: a common denominator approach to cancer therapy. Cancer Cell. 2015;27(4):450-461[4]Hanahan D, Weinberg R A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell,144(5):646-674(2011).