干货分享 | 对流扩散膜吸附器连续多柱捕获单克隆抗体

2024-06-11

抗体药物偶联物引进/卖出

摘要：下游处理是单克隆抗体（mAbs）连续制造中的瓶颈。为了克服产量限制，研究了两种不同的连续工艺，这些工艺采用了一种新型的对流扩散蛋白A膜吸附器（MA）：快速循环并行多柱色谱（RC-PMCC）工艺和快速循环模拟移动床（RC-BioSMB）工艺。首先，进行了突破曲线实验，以研究流速对mAb动态结合能力的影响，并计算装载步骤的持续时间。此外，为了应对由于膜污染导致的压力增加，开发了定制的控制软件，以实现自动化的MA交换，从而实现稳健、不间断和连续的处理。两种工艺均以0.61克/升含mAb的滤液进行了为期4天的操作，并对工艺性能、产品纯度、生产率和缓冲液消耗进行了比较。mAb的回收率约为90%，RC-PMCC工艺的生产率为1010克/升/天，RC-BioSMB工艺的生产率为574克/升/天。同时，两种工艺都实现了与工艺相关的杂质的高去除率，而RC-BioSMB工艺的缓冲液消耗更低。最后，计算了不同大小的灌注生物反应器在合适MA尺寸下的可实现生产率，以证明这两种工艺都有潜力在高达2000升的生物反应器体积上以制造规模运行。 1.引言目前，mAb制造商面临着对mAbs需求的增加和与低成本生物仿制药的日益激烈的竞争。因此，研发重点从批次处理转移到半连续或连续制造工艺，这些工艺提供了多种优势，如提高生产率、减少缓冲液消耗、提高产品质量、减少设备占地面积和降低生产成本。通过封闭系统操作降低生物负荷污染的风险、显著减少或消除停留时间以及减少生物反应器中的停留时间以最小化酶促或化学产品降解，从而提高产品质量。如今，mAbs正在使用中国仓鼠卵巢（CHO）细胞的灌注生物反应器中连续生产。含mAb的渗透液（滤液）使用切向流（TFF）或交替切向流过滤（ATF）从生物反应器中连续移除。产生的含mAb渗透液的体积以每天每生物反应器工作体积添加的培养液体积表示，即所谓的每天的容器体积（VVD），范围在1到3 VVD之间。由于改进的细胞系开发导致mAb滴度增加，制造瓶颈从上游转转移到下游处理。在下游工艺中，由于蛋白A配体对单克隆抗体（mAbs）具有高选择性和高结合亲和力，蛋白A亲和色谱法是捕获mAbs的首选方法。同时，大多数与工艺相关的杂质，如宿主细胞蛋白（HCP）和DNA，不会被保留，而是通过柱子流出。因此，使用蛋白A亲和色谱法可以实现高纯度，并且可以减少下游处理步骤的数量。然而，由于树脂成本高昂，蛋白A色谱法是下游过程中最昂贵的色谱类型和单元操作。为了解决下游处理瓶颈问题，引入了各种多柱色谱（MCC）工艺概念，例如BioSMB、CaptureSMB、Step-SMB、顺序MCC或周期性逆流色谱（PCC），以实现更有效的树脂利用、更高的生产率和比单柱批次处理工艺缓冲液更低的消耗。在分离单克隆抗体时，通常在捕获步骤中使用装填了固定在多孔树脂珠上的蛋白A配体的柱子。使用膜吸附器（MAs）可以避免填充床柱的生产率低的缺点。MAs的主要优点是溶质质量传递是通过对流进行的。因此，流速不影响分离性能，MAs可以在比填充床柱更高的流速下操作。与填充床柱相比，MAs还有几个额外的优点，如设备成本更低、压力降更低、无固定相压缩以及减少沟槽效应。 2.工艺概念 2.1.RC-PMCC 在RC-PMCC工艺中，2个MA并行操作（图1）。当第一个MA正在装载时，第二个MA经历洗涤、洗脱、再生和平衡步骤（图1a）。当第一个MA装载完毕且第二个MA准备好装载时，MA进行切换。第一个MA进行洗涤、洗脱、再生和平衡，而第二个MA进行装载（图1b）。当两个MA都完成装载、洗涤、洗脱、再生和平衡操作时，一个周期就完成了。 2.2.RC-BioSMB工艺 RC-BioSMB是一个循环工艺，使用3个MA（图2）。两个MA串联连接并进行装载，而第三个MA进行洗涤、洗脱、再生和平衡（图2a）。当系列中第一个MA的装载完成后，这个MA断开连接，并执行洗涤、洗脱、再生和平衡。同时，第二个和第三个MA串联连接，原料装载到第二个MA（图2b）。当第二个MA装载完毕后，它断开连接，第三个和第一个MA串联连接。原料装载到第三个MA，而第二个MA进行洗涤、洗脱、再生和平衡（图2c）。当第一个MA完成所有工艺步骤（装载、洗涤、洗脱、再生和平衡）时，一个周期就完成了。 3.材料与方法 3.1. mAb和原料准备中国仓鼠卵巢（CHO）细胞在20升波纹混合生物反应器（Biostat® RM, Sartorius）中以灌注模式培养，工作体积为10升，使用商业无血清培养基培养7天。生物反应器袋（Flexsafe® RM Bag, Sartorius）底部集成了1.2微米的膜，用于将细胞与含mAb的培养基分离。收获的滤液在培养后储存在-20°C，并在实验前解冻。解冻后，使用Sartopore® GF+ (Sartorius)和Sartopore® 2 XLG (Sartorius)过滤器对滤液进行无菌过滤。 3.2.分析方法为了量化单克隆抗体（mAb）及其聚集体，使用了Yarra 3 μm SEC-3000（Phenomenex）尺寸排阻色谱（SEC）柱和Vanquish Flex系统（ThermoFisher Scientific）(表1)。 3.3.单MA动态结合能力的测定使用ÄKTA Avant系统（Cytiva）进行突破曲线实验以确定动态结合能力，该系统配备了两个UV池（在280 nm处测量吸收）、一个电导探头、一个pH探头以及一个温度控制的分液收集器。在不同装载流速下进行突破曲线实验的操作参数总结在表2中。通过将收集到的分数中的mAb浓度与原料中的mAb浓度相除，计算每个分数中的相对mAb浓度（c/c0）。为了在分析过的分数之间插值突破曲线，使用了MATLAB®（R2023a, Mathworks）的interp1函数。这些突破曲线被用来确定不同流速下的动态结合能力（DBC）。因此，使用以下方程计算了10%突破时的DBC（DBC10%）： 3.4.使用MA进行mAb的连续蛋白A捕获 RC-PMCC和RC-BioSMB工艺运行了4天。通过连接一个含有mAb滤液的10升袋子来供应原料，这个袋子每24小时更换一次。RC-PMCC和RC-BioSMB实验的操作参数总结在表3中。 4.结果与讨论 4.1.不同流速下单个MA的突破曲线在工艺设计中，通过在不同流速下使用单个MA进行突破曲线实验，确定了RC-PMCC和RC-BioSMB的流速和步骤持续时间。得到的突破曲线，将相对mAb浓度（c/c0）表示为流出体积和时间的函数，分别在图3a、b中展示。突破曲线的形状随着流速的变化而变化，在较高流速下变得更平缓（图3a），这表明存在扩散质量传递。突破曲线实验的结果被用来确定RC-PMCC和RC-BioSMB工艺的装载步骤的持续时间。对于RC-PMCC工艺，选择了11.9分钟的装载持续时间，这对应于在5 MV/min时DBC10%的80%，以避免在装载过程中mAb的损失。 RC-BioSMB工艺的装载步骤持续时间是使用单个MA在5 MV/min和2.5 MV/min流速下获得的mAb突破曲线，按照Gjoka等人（2015）描述的程序计算的。根据获得的突破曲线，𝑡1=34.3分钟是达到第二个MA的DBC10%的时间，𝑡2=27.5分钟是达到第二个MA的DBC10%的80%的时间（见图4）。在RC-BioSMB工艺中，装载持续时间由 𝑡2 定义。在装载时间 𝑡2 期间总共加载的mAb质量（𝑚TL）可以根据以下公式计算： 4.2.RC-PMCC和RC-BioSMB工艺的自动MA更换操作使用表3中列出的操作参数，连续的RC-PMCC和RC-BioSMB工艺配备了自动MA更换功能，并运行了4天。使用定制的控制软件自动更换超出设定压力限制的MA。在RC-PMCC工艺中，装载和洗涤步骤的压力限制均设为3.8巴。对于RC-BioSMB工艺，装载步骤的压力限制设为3.8巴，洗涤步骤为1.9巴。图5显示了在4天工艺时间内，MA在装载和洗涤步骤中记录的压降。在RC-PMCC工艺开始时，装载步骤记录的压降大约为0.7巴（图5a）。由于在装载步骤中两个MA串联连接，RC-BioSMB工艺记录了一个较高的起始压降，为1.7巴（图5b）。因此，初始压力与设定压力限制之间的差异在RC-BioSMB工艺中较低，这要求更频繁地更换MA以避免超出压力限制。在两种工艺中，一旦MA的压降超过限制值并持续10秒，就会自动用新的未使用过的MA进行更换。这种自动更换机制确保了连续、稳健的运行，无需手动中断更换MA。在整个4天的工艺中，记录的压力数据显示，两种工艺均能够保持稳定的操作，且没有因超出压力限制而导致的中断。这证明了所开发的自动控制软件在维持连续工艺稳定性方面的有效性。通过自动更换MA，可以最大限度地减少因膜污染导致的性能下降，确保整个工艺周期内保持较高的mAb产量和质量。在RC-BioSMB工艺与RC-PMCC工艺相比，导致RC-BioSMB工艺在进行MA更换之前的运行时间减少。尽管在超出设定压力限制时更换了MA，但压降并未恢复到初始压力。这可能是由于流程路径和MA在流程时间内由于微生物污染而发生堵塞，因为实验设置是非无菌的。因此，随着时间的推移，MA更换前的周期数减少。然而，在两种工艺中，洗涤步骤中MA的起始压降是相同的（图5c,d）。在图5的第二个y轴上，显示了工艺期间使用的MA的累积数量。红线指示了整个流程时间使用的MA数量。需要注意的是，RC-BioSMB工艺每个周期和每个MA的装载量比RC-PMCC工艺高出1.7倍（表3）。因此，RC-BioSMB工艺中的MA在再生之前可能也比RC-PMCC工艺中的MA暴露于更多的杂质。与流程和产品相关的杂质可能不可逆地结合在膜表面，导致孔隙堵塞。在RC-PMCC工艺中，首次MA更换在78.7小时（197个周期）后启动，随后在88.0小时（图5a,c）后更换了第二个MA。在RC-BioSMB工艺的操作过程中，第一个MA在61.2小时（61个周期）后更换，随后在73.4小时和90.6小时后分别更换了另外两个MA（图5b,d）。总的来说，RC-PMCC使用了4个MA，而RC-BioSMB工艺使用了7个MA。然而，两种工艺都在首次MA更换前运行了2天（RC-BioSMB）和3天（RC-PMCC）。这证明了RC-PMCC和RC-BioSMB用于连续、不间断捕获工艺的潜力，可以持续数天。 4.3.RC-PMCC和RC-BioSMB工艺性能比较对RC-PMCC和RC-BioSMB工艺在mAb产量、mAb聚集、去除与工艺相关的杂质、生产率和缓冲液消耗等方面进行了比较。这些比较的结果在以下子部分中展示。 4.3.1.mAb产量和mAb聚集图6a、b分别展示了使用RC-PMCC和RC-BioSMB工艺在4天整个工艺时间内每天收集的洗脱池（产品）的mAb产量和mAb聚集。在4天的工艺过程中，未观察到mAb产量的显著变化。RC-PMCC工艺的平均mAb产量为90% ± 2%，而RC-BioSMB工艺为88% ± 3%。尽管两种工艺的mAb产量非常相似，但RC-BioSMB洗脱池中的平均mAb浓度（3.82 g/L）高于RC-PMCC工艺洗脱池中的浓度（2.33 g/L）。这是因为RC-BioSMB工艺中每个MA加载的mAb质量比RC-PMCC工艺高。需要注意的是，在两种工艺中，由于死体积与固定相比率大，洗脱体积都较高，且在洗脱步骤中离开MA的总体积被收集。可以通过在洗脱步骤中实施峰值分数收集来获得更高的mAb浓度。图6c、d分别展示了RC-PMCC和RC-BioSMB工艺在第2个工艺日的原料和洗脱池的示例SEmAb图。mAb的保留时间为7.8分钟。聚集的mAb分子比mAb单体大，因此保留时间更短。使用mAb峰面积和保留时间小于7.8分钟的峰的总面积。保留时间比mAb长的峰与与工艺相关的杂质相关，例如HCP和DNA。如图6a、b所示，在4天的工艺过程中，RC-PMCC和RC-BioSMB工艺中mAb聚集体的比例均保持在1%以下。 4.3.2. 去除与工艺相关的杂质为了比较使用RC-PMCC和RC-BioSMB工艺获得的mAb的纯度，研究了HCP和DNA这两种与工艺相关的杂质的去除情况。在图7a（RC-PMCC）和图7b（RC-BioSMB）中，展示了每种工艺每天的原料和洗脱池中的HCP含量。在整个工艺过程中，洗脱池中的HCP含量几乎没有变化。在RC-PMCC（图7a）和RC-BioSMB（图7b）工艺中，洗脱池中的HCP含量降低到<337 ± 16 ppm（原料中平均HCP含量约为1.83×10^5 ± 3.67×10^4 ppm）。这对应于平均HCP去除3.0 ± 0.2 LRV，证明了在4天的工艺时间内HCP的稳健去除。在图7c（RC-PMCC）和图7d（RC-BioSMB）中，展示了不同工艺的原料和洗脱池中的DNA含量，以及使用公式（4）计算的去除DNA的LRV。在所有工艺日中，通过RC-PMCC（图7c）和RC-BioSMB（图7d）工艺获得的合并洗脱分数中，DNA含量恒定在<3.0 ± 0.3 ppm（原料中平均DNA含量为6.7×10^3 ± 1.1×10^3 ppm）。实现了平均3.6 ± 0.2 LRV的去除。需要注意的是，尽管RC-BioSMB工艺中每个MA的装载量高于RC-PMCC工艺（表3），但HCP或DNA的去除没有显著差异。总之，两种工艺在产品质量和纯度方面显示出相等的工艺性能。尽管存在膜污染，但在所有4个工艺日中，洗脱池中的mAb产量和与工艺相关的杂质含量保持一致，证明了RC-PMCC和RC-BioSMB工艺的稳健性。 4.3.3.生产率和缓冲液消耗在图8a中，计算了RC-PMCC和RC-BioSMB在1天、2天、3天和4天工艺时间内的生产率。在长达2天的工艺时间内，生产率保持恒定，RC-PMCC比RC-BioSMB工艺的生产率高出1.5倍。这是因为两种工艺使用的初始MA数量不同。RC-PMCC工艺使用2个MA操作，而RC-BioSMB工艺使用了3个MA。在达到压力限制需要更换MA时，观察到生产率下降。这在RC-PMCC工艺中在第4天首次观察到，在RC-BioSMB工艺中在第2天观察到。因此，优化再生和清洁程序以及无菌处理变得至关重要，以延长MA更换的时间。在图8b中，比较了RC-PMCC和RC-BioSMB工艺在4天工艺后的生产率和缓冲液消耗。尽管在4天的工艺时间内两种工艺几乎纯化了相同数量的mAb，RC-PMCC工艺使用了4个MA，而RC-BioSMB工艺使用了7个MA。因此，RC-PMCC工艺的生产率为1010 ± 28 g/L/d，比RC-BioSMB工艺的生产率574 ± 21 g/L/d高出1.76倍。尽管RC-PMCC工艺的生产率高于RC-BioSMB工艺，但RC-PMCC工艺的缓冲液消耗（1.78 ± 0.05 L/g）比RC-BioSMB工艺（1.08 ± 0.04 L/g）高出1.65倍。也就是说，因为在两种工艺中洗涤、洗脱、再生和平衡步骤中使用了相同的缓冲液体积（表3），而RC-PMCC工艺中每个MA加载的mAb质量比RC-BioSMB工艺低。只要RC-PMCC工艺的初始MA数量低于RC-BioSMB工艺，RC-PMCC工艺的生产率就会高于RC-BioSMB工艺。当原料中mAb浓度较高，装载步骤的持续时间比洗涤、洗脱、再生和平衡的时间更短时，这种情况可能会改变。因此，为了确保RC-PMCC工艺的连续装载，可能需要使用额外的MA。 4.4.不同生物反应器尺寸和VVD下的RC-PMCC和RC-BioSMB的生产率在本节中，评估了RC-PMCC和RC-BioSMB工艺与不同尺寸生物反应器结合使用的情况。通过计算两种工艺在不同生物反应器尺寸、VVDs和商业可获得的膜体积下的生产率。计算了1至2000升（假设90%的工作体积）的生物反应器尺寸和1至3 VVDs，以及1.2、10、75、200和800毫升MV的MA尺寸。所有1至3 VVDs的原料中mAb浓度假定为0.61克/升。此外，假定工艺时间为4天，所需MA的总数与使用1.2毫升MV的MA进行的实验相同。为了在所有生物反应器尺寸和VVDs下实现相同的mAb产量、去除与工艺相关的杂质和生产率，应使用相同的MA装载流速。然而，这是不可能的，因为只有具有预定义MV的膜才可用。因此，为了处理来自不同尺寸生物反应器的原料流，选择MA使得装载流速接近但不超过在RC-PMCC和RC-BioSMB实验中使用的5 MV/min。对于更高的流速，预计会有更高的压降和更低的DBC10%，显著降低工艺性能和生产率。图9a展示了不同生物反应器尺寸和VVDs选择的MA尺寸。如图9b所示，在大多数情况下，计算出的装载流速低于5 MV/min。在较低的流速下，DBC10%（图4）更高；因此，应该能够实现使用5 MV/min获得的产量。然而，较低流速对由于流变条件改变而导致的膜污染的影响，以及由于停留时间增加可能导致的更高mAb聚集，可能对膜污染和工艺性能产生负面影响。因此，低于5 MV/min流速的展示结果具有一定的不确定性。图9c、d显示了RC-PMCC和RC-BioSMB工艺的生产率作为生物反应器尺寸和VVD的函数。对于特定的生物反应器尺寸和VVD组合，使用了图9a中展示的MA尺寸。与第4.3.3节的结果类似，RC-PMCC（图9c）比RC-BioSMB（图9d）工艺计算出更高的生产率。需要注意的是，由于预定义的可用MA尺寸，当装载流速低于5 MV/min时，生产率较低。这表明对于特定的生物反应器尺寸，MA相对于装载流速过大。或者，可以并行操作多个较小的MA以提高生产率，并实现5 MV/min的装载流速。然而，这种方法需要多个单元或更复杂的工艺设置，增加了硬件成本。如果工艺时间延长到超过4天，由于MA更换频率的增加，生产率可能会下降。优化再生和清洁程序将有助于延长MA更换前的工艺时间。深入了解不同装载流速对mAb产量、去除与工艺相关的杂质、生产率和污染的影响，对于评估不同规模下RC-PMCC和RC-BioSMB的工艺性能是必要的。另一方面，本研究的结果展示了两种工艺在不同规模上进行连续mAb捕获工艺的潜力。 5.结论本研究首次介绍了两种连续的单克隆抗体(mAb)捕获工艺，即RC-PMCC和RC-BioSMB工艺，它们是使用新型对流扩散膜吸附器(MA)操作的。两种工艺均在定制的控制软件控制下运行了4天，以实现在膜污染和孔堵塞情况下MA的自动更换。在1.25至10 MV/min的流速下，MA的mAb动态结合能力(DBC10%)被确定在37.6至58.0 mg/mL之间，与在更长停留时间下的树脂DBC10%相似。因此，可以选择5 MV/min的装载流速，以同时实现高DBC10%和高装载流速。工艺的日常性能在mAb产量、mAb聚集体以及去除与工艺相关的杂质HCP和DNA方面进行了比较。两种工艺均实现了约90%的高mAb产量，HCP含量降低至<337 ± 16 ppm（RC-PMCC工艺的LRV为3.1 ± 0.7，RC-BioSMB工艺的LRV为3.2 ± 0.2），DNA含量降低至<3.0 ± 0.3 ppm（RC-PMCC工艺的LRV为3.5 ± 0.8，RC-BioSMB工艺的LRV为3.9 ± 3.8）。同时，mAb聚集体的比例非常低(<1%)。尽管本研究展示了两种基于MA的高通量捕获工艺的设计和实施，但对污染机制和清洁策略的进一步研究可能会进一步提高生产率、mAb产量和纯度。文章链接： https://analyticalsciencejournals-onlinelibrary-wiley-com.libproxy1.nus.edu.sg/doi/full/10.1002/bit.28695 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。