类器官替代动物实验的第一步：成功构建类器官培养体系

2023-02-23

临床研究

2023年1月10日，《science》期刊发布重磅消息，针对新药或仿制药的临床试验，FDA不再强制要求提供动物试验相关测试数据（点击“阅读原文”）。虽未完全禁止动物试验，但FDA允许药物开发商使用替代方法来研究新药的安全性和有效性。在这众多的替代方法中，类器官成为“新晋之星”。虽然业内对于类器官替代动物实验的看法褒贬不一，但关于类器官的研究仍然开展地如火如荼。根据最新的PubMed检索数据，输入关键词“organoid”，可以看到约20,000+篇可参考文献。即使针对特定的类器官，相关的文章至少也有几十篇。面对如此众多的文章，如此不尽相同的复杂培养体系，如何快速精准地走出第一步即成功构建类器官培养体系显得尤为重要。近岸蛋白可提供一系列经过类器官培养验证的细胞因子，利用自己的类器官平台，对因子进行验证并整理出“可执行”的类器官培养protocol。（扫描下方二维码，免费申领）。今天先带大家来了解一下类器官培养中必不可少的细胞因子-Wnt蛋白。一、类器官与Wnt信号通路类器官是由多能干细胞（PSC）或成体组织干细胞（ASCs）建立的三维结构。类器官体外培养系统包括一个自我更新干细胞群，可分化为多个器官特异性的细胞类型，与对应的器官拥有类似的空间组织并能够重现对应器官的部分功能。从类器官的定义中可以看到，体外类器官的产生离不开干细胞的生长、发育、成熟。而经典的Wnt信号通路—Wnt/β-catenin 途径调控着干细胞的多能分化、器官的发育和再生。Wnt信号是一种重要的干细胞信号通路，参与多种细胞类型的分化，包括心肌细胞和肠上皮细胞。二、Wnts支持类器官培养（1）肠道类器官2009年是类器官领域革命性的一年，类器官研究界的先驱Hans Clever及其团队Sato 等人从小鼠小肠隐窝分离出单个Lgr5+干细胞，在体外基质膜提取物（3D支撑作用）存在的培养环境中，通过加入表皮生长因子（EGF）、骨形态发生蛋白拮抗剂（Noggin）、Wnts及R-Spondin1（Wnt信号激活）等细胞因子，培养后可观察到小肠绒毛-隐窝结构，成功构建了体外肠类器官。这些类器官是空心小球，内部具有完整的肠道上皮结构，而且含有所有种类的肠上皮功能细胞，包括肠上皮细胞、肠内分泌细胞、杯状细胞、潘氏细胞和 Lgr5+ 干细胞[2]。图1 单个Lgr5+干细胞连续培养生长状态（number：days）[2]（2）心脏类器官Hofbauer等[3]成功开发了hiPSC细胞来源的心脏类器官。通过加入心脏发育的关键信号通路因子（Activin、BMP、FGF、retinoic acid和Wnt），使hiPSC细胞来源的心脏类器官经历图形化和形态发生以形成空腔，这种类器官分化出单独的心肌层和内皮层，并与迁移和分化的心外膜相互作用，从而模拟早期的心腔发育。自组织心脏类器官可以展示心肌、内皮和心外膜等部位形态发生及细胞分化的过程，为研究人类心脏发生和先天性心脏病的发生机制提供了一个强有力的系统。图2 第7.5天的心脏类器官冷冻切片，显示了腔体和CM特异性标记物TNNT2的表达[3]（3）其他类器官除肠道类器官和心脏类器官外，Wnts还支持很多其他类器官类型被成功建立，包括胃类器官[4]、肝脏类器官[5]等。三、Wnt3a蛋白 Wnt家族是一个高度保守，富含半胱氨酸的巨大的分泌蛋白家族，对正常发育过程很重要。目前发现的Wnt分泌蛋白有两种类型，其一是依赖β-catenin的经典Wnt信号通路，而Wnt 3a是经典Wnt信号通路的主要配体。Wnt3a通过Frizzled（FZD）受体家族和LRP5/6共受体发出信号，以调节基因表达和多种细胞行为[6]。近岸蛋白可以提供高纯度，高活性，低内毒素的Wnt3a V3蛋白（货号：C22R），并在类器官平台验证其促进类器官生长的功能。产品特点：（1）高纯度、高活性（2）低内毒素（＜10EU/mg，低于行业平均水平）（3）高批间一致性（4）不含载体蛋白（5）现货供应（6）多种包装规格任意挑选：10ug、50ug、500ug、1mg数据展示：（1）产品活性Measured by its ability to induce Topflash reporter activity in HEK293T human embryonic kidney cells.The ED50 for this effect is 71.45 ng/ml.（2）小鼠肠道类器官培养体系的建立Mouse intestinal organoids were cultured with EGF (Cat#C029), Wnt3a (Cat#C22R), Noggin (Cat#C028) and R-spondin 1 (Cat#CX83). After five days of culture, the organoids showed good morphology and germination rate.（3）小鼠胃类器官培养体系的建立Mouse Gastric organoids were cultured with EGF (Cat#C029), Wnt3a (Cat#C22R), Noggin (Cat#C028) , R-spondin 1 (Cat#CX83) and FGF-10 (Cat#CR11). The organoids showed good morphology.（4）经验证如下因子：IGF1（#C023), Wnt3a (#C22R), R-spondin 1 (Cat#CX83), FGFb (#C046), FGF8b (#C798), FGF10 (#CR11), Shh (#C089) and Noggin (Cat#C028)可成功用于人垂体瘤类器官培养体系的建立。近岸蛋白提供类器官体外培养所需的各种低内毒素细胞因子：近岸蛋白可提供经验证的“类器官培养protocol”，助您快速成功建立类器官培养体系，扫描下方二维码，即可免费申领！参考文献[1] Bouffi C, et al. In vivo development of immune tissue in human intestinal organoids transplanted into humanized mice. Nat Biotechnol. 2023 Jan 26.[2] Sato T, et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 2009 May 14;459(7244):262-5. [3] Hofbauer P, et al. Cardioids reveal self-organizing principles of human cardiogenesis. Cell. 2021 Jun 10;184(12):3299-3317.e22.[4] Bartfeld S,et al. In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection. Gastroenterology. 2015 Jan;148(1):126-136.e6.[5] Jeong J, et al. Elimination of Reprogramming Transgenes Facilitates the Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells into Hepatocyte-like Cells and Hepatic Organoids. Biology (Basel). 2022 Mar 23;11(4):493.[6] Nusse R et al. Wnt/β-catenin signaling, disease, and emerging therapeutic modalities. Cell (2017) .识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。