生物制品下游病毒清除：当下与未来

2022-12-21

摘要：除病毒过滤是生物制药生产过程的一个重要方面，确保了生物制药的安全性。该过滤基于分子大小排阻机制，将病毒（如大小为18-26 nm的细小病毒），从生物制品（如大小为~12 nm的单克隆抗体）中分离出来。通常来说除病毒过滤可以去除4个log10的病毒并且可以保证较好的回收率。本文综述了过滤器形态、进料溶液组成和高通量病毒过滤性能等关键因素，主要关注病毒去除效率的log降，还讨论了流动中断和蛋白质污染问题，以及将来亟需改进的方面。生物制品包括单克隆抗体、双特异性抗体等通常是由动物细胞系培养而获得的治疗性抗体，在细胞培养以及下游纯化生产过程中极易受到病毒的污染，严重影响生物制品的安全性。为了保证生物制品的安全性，相关指导原则要求下游纯化过程中至少用两种正交方法清除病毒:（1）使用化学灭活方法：低pH值孵育或者加有机溶剂（2）物理法：除病毒纳滤法。其中除病毒纳滤法是一种稳健的、基于大小的病毒去除策略，可以有效的去除脂包膜和非脂包膜病毒，及时是对于较难去除的鼠细小病毒(MVM)，采用一步除病毒纳滤，仍然可以获得4个log降，同时除病毒纳滤法不会破坏生物制品的结构具有较好的普适性。当然，在下游工艺中使用病毒过滤器之前，所有病毒过滤器都必须通过病毒去除、泄漏、蛋白质传输、生物安全等完整性测试。然而，即使遵循了所有严格的验证程序，在病毒过滤过程中仍然可能发生病毒突破和产品损失，导致产品安全和经济问题。本文聚焦于除病毒纳滤的机制，重点关注影响病毒过滤的关键因素，目前局限性以及未来发展方向。1. 除病毒纳滤机制如图一所示，除病毒纳滤主要依据尺寸排阻机制，病毒被保留在过滤器病毒保留区，而生物制品则能通过过滤器，并保持95%以上的收率。与此同时，在过滤的过程中病毒与过滤器的静电作用和疏水作用也对除病毒纳滤有着较大的影响。通常来说在pH高于病毒PI(等电点)是，病毒带负电，低于PI时带负电，因此应该选择合适的缓冲buffer 的pH从而促进病毒吸附在滤膜表面。疏水相互作用是病毒可被吸附到病毒过滤器表面的另一种机制在病毒过滤过程中，病毒的疏水部分与过滤器表面倾向于优先相互作用，这可以增强病毒与过滤器之间的吸附，从而提高性能。因此，了解病毒、过滤器表面和蛋白质之间的疏水相互作用可以有助于更高的病毒去除和更大的蛋白质传质。图1. 除病毒纳滤机理图2. 影响病毒清除性能的因素：2.1 滤膜孔隙形态通常来说除病毒纳滤膜的孔径分布（PSD）要小于超滤膜的PSD，从而得以稳定的去除生物制品中存在的病毒。此外，病毒过滤器中的微小缺陷可在过滤过程中导致严重的病毒突破。为了研究PSD对病毒去除性能的影响，在之前的研究中，通过使用各种分析方法，如葡聚糖筛分、液-液压孔法(LLP)和金纳米颗粒(GNP)保留试验，来探究了商用病毒过滤器的PSD。通过测定PSD，评估病毒保留行为，以充分了解病毒去除机制。通过使用不同大小的葡聚糖(500 kDa和2000 kDa)和两种不同的商业病毒过滤器(Ultipor®DV20和Viresolve®PRO)评估了商业病毒过滤器的PSD。结果显示不同的筛分系数基于膜的取向，表明在进料侧和密集渗透测是一个多孔区域。此外，有研究使用液-液压孔法（LLP）研究表明除病毒纳滤膜的病毒保留区PSD较窄，模型病毒的LRV（log降）值较高。2.2 料液的组成成分影响除病毒纳滤膜LRV变化的化学因素有溶液的pH值、离子强度、蛋白质类型以及各种添加剂的存在。多项研究表明，在不同的pH值和离子强度条件下，某些过滤器的LRV是不同的，表明料液化学组成对病毒去除的重要性。表1总结了影响病毒去除性能的化学因素。如表中所示，在不同离子强度和料液件下，具有GNP的1 g/L人IgG溶液的滤液通量下降行为不同，表明这些条件可以显著影响病毒过滤过程。具体来看，在pH 4.0条件下带相反电荷的病毒(即MVM)和模型过滤器，在较低的离子强度下显示出较高的LRV值，而pH8.0时病毒和膜过滤器均带负电，则需要较高的离子强度才能显示出较高的LRV值。此外，蛋白质的类型以及添加剂也会影响病毒清除效果，例如，人细小病毒B19在planovat15n过滤器中的滞留随着白蛋白向外转移，表明病毒-蛋白质相互作用改变了病毒的滞留行为。表1 不同化学因素对病毒过滤的影响2.3 流量中断：压力释放在大规模生产的除病毒纳滤过程中，为了提高产品的收率，在样品过滤完成后，通常会更换缓冲液进行顶洗，因此在工艺过程中会发生因流量中断而导致的系统减压。有研究表明在过滤过程中发生系统减压，有可能会造成病毒穿透，造成产品污染。几位研究人员专注于确定压力释放过程中影响LRV的主要因素。他们改变了操作条件，如施加压力、减压速度、溶液粘度和流体中断时间。结果表明在较低的压力下(<70%的供应商推荐的最大压力)，流体流动中断3分钟，导致噬菌体PP7和MVM的LRV下降。此外，有研究通过改变溶液的pH值、电导率、蛋白质结合能力和过滤器的类型进行了实验。结果，低蛋白质结合能力，低浓度或完全缺乏蛋白质，导致LRV在压力释放后急剧衰减。另外，当pH值为4.9且离子浓度较低时，使用Viresolve®NFP过滤器减压后LRV降低几乎可以忽略不计。这一结果可以用等电点ΦX−174和膜的zeta电位来解释，二者的电荷在pH 4.9时相反。因此，病毒与膜的相互作用增强，能够克服压力释放过程中LRV的降低。因此，尽管由于压力释放时病毒保留行为会发生变化，但可以调整过滤器或者料液条件（pH，cond），以减轻负面影响。3. 除病毒纳滤局限和未来目前除病毒纳滤是生物制品下游工艺中去除病毒的有效手段可以应用于下游纯化的各个阶段，然而目前商业化的除病毒过滤器的有效性，需要低通量操作在恒定通量模式，一定程度上限制了病毒过滤效率。此外，对于高浓度蛋白制剂来说，既要保证病毒没有任何突破，同时还能够实现高通量，高收率是一件十分有挑战的，因为，高蛋白浓度的溶液粘度高，过滤过程中会产生严重的蛋白污染和浓度极化效应，对病毒去除性能造成重大负面影响。此外，在长期操作过程中，中间体或产物可能发生聚合作用，影响产品质量。因此，开发下一代病毒过滤工艺的尤其是针对高浓度蛋白制剂的除病毒纳滤膜是十分重要的。参考文献：Dongwoo Suh, Mina Kim, Changha Lee & Youngbin Baek (2022): Virus filtration in biopharmaceutical downstream processes: key factors and current limitations,Separation & Purification Reviews, DOI: 10.1080/15422119.2022.2143379